JPH0365959B2 - - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は細菌ルシフエラーゼによる過酸化水素
の定量法に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to a method for quantifying hydrogen peroxide using bacterial luciferase.
（従来技術）
一般に臨床検査法で普及している生体成分の定
量法は、各種オキシダーゼを利用して過酸化水素
を生成させ、過酸化水素に発色剤の共存下、ペル
オキシダーゼを作用させ、その発色強度を測定し
て、生体成分の定量を行なう。ところが、この発
色法（吸光法）では、試料から生成する過酸化水
素の濃度は10-6Mが限度であり、これ以下の濃度
のものを測定することは難しい。(Prior art) A method for quantifying biological components, which is generally popular in clinical testing methods, uses various oxidases to generate hydrogen peroxide, and peroxidase is allowed to act on the hydrogen peroxide in the presence of a coloring agent to develop the color. The intensity is measured to quantify biological components. However, with this color method (absorption method), the concentration of hydrogen peroxide generated from the sample is limited to 10 -6 M, and it is difficult to measure concentrations lower than this.
蛍光法では、発色法による感度よりも増大させ
ることができるが、濁度の影響を受けるなどの欠
点を有する。 Although the fluorescence method can increase the sensitivity more than the color method, it has drawbacks such as being affected by turbidity.
またルミノール反応、ルシゲニン反応などの化
学発光法では、10-8M程度の過酸化水素を定量す
ることができるが、これを臨床検査に応用した場
合、試料としての血清、尿などの中の妨害物質の
影響を受け、感度は著しく低下することが知られ
ている。 In addition, chemiluminescence methods such as luminol reaction and lucigenin reaction can quantify approximately 10 -8 M hydrogen peroxide; It is known that sensitivity decreases significantly due to the influence of substances.
従来、生物発光においては細菌ルシフエラーゼ
を用いてNADH又はNADPHを定量すること、
及びNAD、NADPを定量すること、さらにはホ
タルルシフエラーゼを用いてATPを定量するこ
とは知られているが、過酸化水素を定量すること
は知られていなかつた。 Conventionally, in bioluminescence, bacterial luciferase is used to quantify NADH or NADPH,
It is known to quantify NAD, NADP, and ATP using firefly luciferase, but it has not been known to quantify hydrogen peroxide.
（発明の目的）
本発明者等はこれらの事情を考慮して、過酸化
水素の定量法において、検出感度の増大、サンプ
ルの少量化、従来測定不能な血中物質の測定実現
をはかるため種々鋭意検討したところ、細菌ルシ
フエラーゼによる生物発光法では血清、尿中の妨
害物質の影響を比較的受けにくいことを見出し、
本発明に到達した。(Purpose of the Invention) Taking these circumstances into consideration, the present inventors have developed various methods for quantifying hydrogen peroxide in order to increase the detection sensitivity, reduce the amount of sample, and measure blood substances that could not be measured conventionally. After extensive research, we discovered that the bioluminescence method using bacterial luciferase is relatively unaffected by interfering substances in serum and urine.
We have arrived at the present invention.
（発明の構成）
すなわち本発明は(i)過酸化水素を含有する試料
にアルキルアルコールの存在下、カタラーゼを作
用させ、(ii)生成するアルデヒドに水およびNAD
又はNADPの存在下、ホルムアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ又はアルデヒドデヒドロゲナーゼを作
用させ、(iii)生成するNADH又はNADPHにFMN
の存在下、NADH−FMNオキシドレダクター
ゼ、NADPH−FMNオキシドレダクターゼ又は
ジアホラーゼを作用させ、(iv)生成するFMNH2に
炭素原子数８〜14の直鎖アルデヒドおよび酸素の
存在下、細菌ルシフエラーゼを作用させ、(v)生成
する発光活性を測定することにより、試料中の過
酸化水素を定量することを特徴とする細菌ルシフ
エラーゼによる過酸化水素の定量法である。(Structure of the Invention) That is, the present invention (i) causes catalase to act on a sample containing hydrogen peroxide in the presence of an alkyl alcohol, and (ii) injects water and NAD into the generated aldehyde.
or in the presence of NADP, act formaldehyde dehydrogenase or aldehyde dehydrogenase, and (iii) add FMN to the generated NADH or NADPH.
(iv) act on the generated FMNH 2 with bacterial luciferase in the presence of a linear aldehyde having 8 to 14 carbon atoms and oxygen; (v) A method for quantifying hydrogen peroxide using bacterial luciferase, which is characterized by quantifying hydrogen peroxide in a sample by measuring the luminescent activity produced.
次に本発明方法をアルキルアルコールとしてメ
タノールを使用した場合(A)、エタノールを使用し
た場合(B)を化学式にて説明する。 Next, the method of the present invention will be explained using chemical formulas in the case (A) where methanol is used as the alkyl alcohol and the case (B) where ethanol is used as the alkyl alcohol.
(A)
H2O2＋CH3OHカタラーゼ
―――――――→
HCHO＋2H2O …(1)
HCHO＋NAD（Ｐ）+＋H2Oホルムアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ
――――――――――――――――――――――→
HCOOH＋NAD（Ｐ）Ｈ …(2)
NAD（Ｐ）Ｈ＋FMNNAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクタ
ーゼ
NAD（Ｐ）Ｈ＋FMNNAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクタ
ーゼ
―――――――――――――――――――――――――
→
NAD（Ｐ）+＋FMNH2 …(3)
FMNH2＋RCHO＋O2細菌ルシフエラーゼ
―――――――――――――――→
hν＋FMN＋RCOOH＋H2O …(4)
(B)
H2O2＋C2H5OHカタラーゼ
―――――――→
CH3CHO＋2H2O …(5)
CH3CHO＋NAD（Ｐ）+＋H2Oアルデヒドデヒド
――――――――――――――→
ロゲナーゼCH3COOH＋NAD（Ｐ）Ｈ …(6)
NAD（Ｐ）Ｈ＋FMNNAD−FMNオキシドレダクターゼ
――――――――――――――――――――――→
又はジアホラーゼNAD（Ｐ）+＋FMNH2 …(7)
FMNH2＋RCHO＋O2細菌ルシフエラーゼ
―――――――――――――――→
hν＋FMN＋RCOOH＋H2O …(8)
（式中、RCHOは炭素原子数８〜14の直鎖ア
ルデヒドを示し、RCOOHは該アルデヒドから酸
化反応により生成する対応するカルボン酸を示
す。）
すなわち本発明(A)ではまず過酸化水素にメタノ
ールの存在下、カタラーゼを作用させ、ホルムア
ルデヒドを生成する。生成したホルムアルデヒド
に水およびNAD又はNADPの存在下、ホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、NADH
又はNADPHを生成する。生成したNADH又は
NADPHにFMNの存在下、NADH−FMNオキ
シドレダクターゼ又はNADPH−FMNオキシド
レダクターゼまたはジアホラーゼを作用させ、
FMNH2を生成する。生成したFMNH2は炭素原
子数８〜14の直鎖アルデヒドおよび酸素の存在
下、細菌ルシフエラーゼを作用させて発光させ
る。次いで発光活性を常法に従い測定する。(A) H 2 O 2 + CH 3 OH catalase――――――――→ HCHO + 2H 2 O …(1) HCHO + NAD (P) + + H 2 O formaldehyde dehydrogenase―――――――――――――― ――――――――→ HCOOH+NAD(P)H …(2) NAD(P)H+FMNNAD(P)H-FMN oxidoreductase NAD(P)H+FMNNAD(P)H-FMN oxidoreductase―――――― ――――――――――――――――――――
→ NAD(P) + +FMNH 2 …(3) FMNH 2 +RCHO+O 2Bacterial luciferase――――――――――――――→ hν+FMN+RCOOH+H 2 O …(4) (B) H 2 O 2 +C 2 H 5 OH catalase――――――――→ CH 3 CHO＋2H 2 O …(5) CH 3 CHO＋NAD(P) + +H 2 O aldehyde dehyde――――――――――――→ Logenase CH 3 COOH+NAD(P)H…(6) NAD(P)H+FMNNAD−FMN oxidoreductase――――――――――――――――――――→ Or diaphorase NAD(P) + +FMNH 2 … (7) FMNH 2 + RCHO + O 2 Bacterial luciferase――――――――――――――→ hν + FMN + RCOOH + H 2 O … (8) (In the formula, RCHO is a linear aldehyde with 8 to 14 carbon atoms (RCOOH represents the corresponding carboxylic acid produced from the aldehyde through an oxidation reaction.) That is, in the present invention (A), hydrogen peroxide is first treated with catalase in the presence of methanol to produce formaldehyde. Formaldehyde dehydrogenase is applied to the generated formaldehyde in the presence of water and NAD or NADP, and NADH
Or generate NADPH. generated NADH or
Acting NADH-FMN oxidoreductase or NADPH-FMN oxidoreductase or diaphorase on NADPH in the presence of FMN,
Generate FMNH2 . The generated FMNH 2 is activated by bacterial luciferase in the presence of a linear aldehyde having 8 to 14 carbon atoms and oxygen to emit light. Next, luminescent activity is measured according to a conventional method.
本発明(B)ではまず過酸化水素にエタノールの存
在下、カタラーゼを作用させ、アセトアルデヒド
を生成する。生成したアセトアルデヒドに水およ
びNAD又はNADPの存在下、アルデヒドデヒド
ロゲナーゼを作用させ、NADH又はNADPHを
生成する。生成したNADH又はNADPHにFMN
の存在下、NADH−FMNオキシドレダクターゼ
又はNADPH−FMNオキシドレダクターゼを作
用させ、FMNH2を生成する。生成したFMNH2
は炭素原子数８〜14の直鎖アルデヒドおよび酸素
の存在下、細菌ルシフエラーゼを作用させて発光
させる。次いで発光活性は常法に従い、例えば発
光測定装置を用いてその発光ピーク値を測定す
る。 In the present invention (B), first, catalase is allowed to act on hydrogen peroxide in the presence of ethanol to generate acetaldehyde. Aldehyde dehydrogenase is applied to the generated acetaldehyde in the presence of water and NAD or NADP to generate NADH or NADPH. FMN to generated NADH or NADPH
In the presence of , NADH-FMN oxidoreductase or NADPH-FMN oxidoreductase is activated to generate FMNH 2 . Generated FMNH2
In the presence of a linear aldehyde having 8 to 14 carbon atoms and oxygen, bacterial luciferase is activated to emit light. Next, the luminescence activity is determined by a conventional method, for example, by measuring the luminescence peak value using a luminescence measuring device.
本発明における過酸化水素を含有する試料と
は、過酸化水素そのもの、又は生体試料、例えば
血液又は尿中の成分、例えば尿酸、コレステロー
ル、グルコース、クレアチニン、ポリアミン、コ
リン、ピルビン酸、乳酸、グリセロール、アミノ
酸等から生成した過酸化水素を含む試料をいう。 In the present invention, a sample containing hydrogen peroxide refers to hydrogen peroxide itself, or components of a biological sample, such as blood or urine, such as uric acid, cholesterol, glucose, creatinine, polyamine, choline, pyruvic acid, lactic acid, glycerol, A sample containing hydrogen peroxide produced from amino acids, etc.
本発明において使用するアルキルアルコールと
しては、メタノール、エタノール、プロパノール
等の炭素原子数１〜３のアルキルアルコールがあ
る。通常0.1〜10Mの濃度である。 Examples of the alkyl alcohol used in the present invention include alkyl alcohols having 1 to 3 carbon atoms such as methanol, ethanol, and propanol. Usually the concentration is 0.1-10M.
本発明において使用するカタラーゼとしては動
物肝臓、腎臓、赤血球、微生物由来のものがあ
る。 The catalase used in the present invention includes those derived from animal liver, kidney, red blood cells, and microorganisms.
本発明において使用するNADとは、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドの略語であり、そ
の使用濃度は通常0.1〜10mMである。 NAD used in the present invention is an abbreviation for nicotinamide adenine dinucleotide, and the concentration used is usually 0.1 to 10 mM.
本発明において使用するNADPとは、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドフオスフエート
の略語であり、その使用濃度は通常0.1〜10mM
である。 NADP used in the present invention is an abbreviation for nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, and its concentration is usually 0.1 to 10mM.
It is.
本発明において使用するホルムアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼとしては、ウシ肝臓、酵母、細菌シ
ユードモナス由来のものがあり、通常、終濃度が
100〜１単位／mlである。 Formaldehyde dehydrogenase used in the present invention includes those derived from bovine liver, yeast, and the bacterium Pseudomonas, and usually has a final concentration of
100-1 unit/ml.
本発明において使用するアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼとしては動物肝臓および酵母由来のものが
選ばれ、NAD、NADPに対して特異性をもつも
のが望ましい。使用する濃度は通常、終濃度が
100〜１単位／mlである。 The aldehyde dehydrogenase used in the present invention is selected from those derived from animal liver and yeast, and preferably has specificity for NAD and NADP. The concentration used is usually determined by the final concentration.
100-1 unit/ml.
本発明において使用するFMNとは、フラビン
モノヌクレオチドの略語であり、使用する濃度は
通常濃度１〜10μMである。 FMN used in the present invention is an abbreviation for flavin mononucleotide, and the concentration used is usually 1 to 10 μM.
本発明において使用するNADH−FMNオキシ
ドレダクターゼとは、発光細菌ビブリオーハーベ
イより得られるもので、NADHとFMNに対し高
い特異性を有している。該酵素はJablonskiと
Deluca（Biochem.162932−2936、1977）および
WatanabeとHastings（Mol.Cell.Biochem.44、
181−187、1982）により精製することができる。
その使用量は通常10〜0.001単位／mlである。 The NADH-FMN oxidoreductase used in the present invention is obtained from the luminescent bacterium Vibrio harveyi and has high specificity for NADH and FMN. The enzyme is Jablonski and
Deluca (Biochem.162932−2936, 1977) and
Watanabe and Hastings (Mol. Cell. Biochem. 44 ,
181-187, 1982).
The amount used is usually 10 to 0.001 units/ml.
本発明において使用するNADPH−FMNオキ
シドレダクターゼとは同じく発光細菌ビブリオー
ハーベイより得られるもので、製法は上記文献に
記載される方法に従う。その使用量は通常10〜
0.001単位／mlである。 The NADPH-FMN oxidoreductase used in the present invention is also obtained from the luminescent bacterium Vibrio harveyi, and the production method follows the method described in the above-mentioned literature. Its usage is usually 10~
It is 0.001 unit/ml.
本発明において使用する炭素原子数８〜14の直
鎖アルデヒドとしては、例えばオクチルアルデヒ
ド、ノニルアルデヒド、デシルアルデヒド、ウン
デシルアルデヒド、ドデシルアルデヒド、トリデ
シルアルデヒド、テトラデシルアルデヒドなどが
ある。 Examples of the linear aldehyde having 8 to 14 carbon atoms used in the present invention include octylaldehyde, nonylaldehyde, decylaldehyde, undecylaldehyde, dodecylaldehyde, tridecylaldehyde, and tetradecylaldehyde.
本発明において使用する細菌ルシフエラーゼは
発光細菌ビブリオーハーベイ、フオトバクテリウ
ム−フイシヤライ、フオトバクテリウム−フオス
フオレウム、フオトバクテリウム−レイオグナシ
の菌体より得られる粗酵素を精製して用いること
ができる。使用する濃度範囲としては通常100〜
5μｇ／mlである。 Bacterial luciferase used in the present invention can be used by purifying crude enzymes obtained from the cells of the luminescent bacteria Vibrio harveyi, Photobacterium phischialei, Photobacterium phosporeum, and Photobacterium leiognathii. The concentration range used is usually 100~
It is 5 μg/ml.
本発明において使用するジアホラーゼとしては
大腸菌、酵母、動物臓器より得られるものがあ
る。使用濃度範囲としては通常、終濃度10〜１単
位／mlである。 Diaphorases used in the present invention include those obtained from Escherichia coli, yeast, and animal organs. The concentration range used is usually a final concentration of 10 to 1 unit/ml.
本発明において緩衝液としてはPH6.5〜8.0の範
囲のものを使用する。特に0.05〜0.2Mのリン酸
緩衝液又はグツドバツフアー類が好ましい。ジア
ホラーゼを使用するとき、ピロリン酸緩衝液を用
いることも可能である。 In the present invention, the buffer used has a pH in the range of 6.5 to 8.0. Particularly preferred are 0.05-0.2M phosphate buffers or gum buffers. When using diaphorase, it is also possible to use a pyrophosphate buffer.
本発明方法は４つの酵素反応を一段階で、又は
二段階以上に分けて行なつてもよい。例えば前記
本発明方法(A)では反応式(1)〜(4)を一段階で行なつ
てもよいし、反応式(1)、(2)と反応式(3)、(4)を分け
て二段階で行なつてもよい。 In the method of the present invention, the four enzymatic reactions may be carried out in one step or divided into two or more steps. For example, in the method (A) of the present invention, reaction formulas (1) to (4) may be carried out in one step, or reaction formulas (1) and (2) and reaction formulas (3) and (4) may be performed separately. It may be done in two steps.
発光強度の測定法としては通常の方法に従う。
例えば反応開始試薬として過酸化水素を反応系に
最終的に加えて反応を開始させ、その発光強度を
ルミフオトメーターTD4000（ラボ・サイエンス
社製）を用いて、発光強度の増加（速度）の変化
を時間に対して読取る方法がある。また別法とし
て発光強度のピークを記録してもよい。 A conventional method is used to measure the luminescence intensity.
For example, hydrogen peroxide is finally added to the reaction system as a reaction initiating reagent to start the reaction, and the luminescence intensity is measured using a Lumiphotometer TD4000 (manufactured by Labo Science). There is a way to read against time. Alternatively, the peak of luminescence intensity may be recorded.
（発明の効果）
本発明では細菌ルシフエラーゼを利用して過酸
化水素を血中物質の妨害を受けることなく、安定
的に定量することができる。特に過酸化水素濃度
10-9Mの低濃度まで測定可能であり、化学発光法
より高感度である。しかも中性附近で危険のない
薬剤を使用して過酸化水素を測定するこができ
る。また本発明方法では、過酸化水素と同時に
NADH又はNADPHも同じ系で定量できる。す
なわちNADH又はNADPHを従来の吸光法や蛍
光法ではなし得なかつた高感度に測定することが
できる。(Effects of the Invention) In the present invention, hydrogen peroxide can be stably quantified using bacterial luciferase without being interfered with by blood substances. Especially hydrogen peroxide concentration
It can measure concentrations as low as 10 -9 M, and is more sensitive than chemiluminescence. Moreover, hydrogen peroxide can be measured using near-neutral and non-hazardous chemicals. In addition, in the method of the present invention, hydrogen peroxide and
NADH or NADPH can also be quantified using the same system. That is, NADH or NADPH can be measured with a high sensitivity that could not be achieved using conventional absorption methods or fluorescence methods.
（実施例） 次に本発明を実施例により詳細に説明する。(Example) Next, the present invention will be explained in detail with reference to examples.
実施例 １
反応における試薬の終濃度が以下の通りである
次の試薬を調製した。Example 1 The following reagents were prepared in which the final concentrations of the reagents in the reaction were as follows.
1000単位／ml カタラーゼ
0.6M メタノール
0.3単位／ml
ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ
0.01164単位／ml
NADH−FMNオキシドレダクターゼ
300μM NAD
2.5μM FMN
0.002％ デシルアルデヒド（＊１）
96.5μｇ／ml ルシフエラーゼ
0.1M リン酸緩衝液（PH7.0）
（＊１）0.1Mリン酸緩衝液100mlに0.02％デシ
ルアルデヒドおよび溶解剤として0.5％牛血清、
0.05％トリトンＸ−100を添加して調製した。1000 units/ml Catalase 0.6M Methanol 0.3 units/ml
Formaldehyde dehydrogenase 0.01164 units/ml
NADH-FMN oxidoreductase 300μM NAD 2.5μM FMN 0.002% Decylaldehyde (*1) 96.5μg/ml Luciferase 0.1M phosphate buffer (PH7.0) (*1) 0.02% decylaldehyde in 100ml of 0.1M phosphate buffer and 0.5% bovine serum as lytic agent,
Prepared by adding 0.05% Triton X-100.
上記試薬0.9mlに濃度既知の過酸化水素0.1mlを
添加し、23℃、60秒、反応させて発光させ、ルミ
フオトメーターTD4000（ラボ・サイエンス社製）
にて発光強度を測定した。第１図に発光強度の増
加を時間当りの最大勾配（発光速度の微分に相
当）とちして過酸化水素濃度に対してプロツトし
た。 Add 0.1 ml of hydrogen peroxide of known concentration to 0.9 ml of the above reagent, react at 23°C for 60 seconds to emit light, and use a Lumiphotometer TD4000 (manufactured by Labo Science).
The luminescence intensity was measured. In FIG. 1, the increase in luminescence intensity is plotted against the hydrogen peroxide concentration as the maximum slope per hour (corresponding to the differential of the luminescence rate).
第１図から明らかなように、過酸化水素濃度
10-9〜10-7Mの低濃度において、発光強度は直線
関係をもつて定量される。 As is clear from Figure 1, hydrogen peroxide concentration
At low concentrations of 10 -9 to 10 -7 M, the emission intensity is quantified with a linear relationship.
参考例 １
細菌ルシフエラーゼが化学発光法（ルミノール
−ペルオキシダーゼ系）に比べて、血清の影響を
受けにくいことを示す。Reference Example 1 This shows that bacterial luciferase is less affected by serum than the chemiluminescent method (luminol-peroxidase system).
(1) 反応における試薬の終濃度が以下の通りであ
る次の試薬を調製した。(1) The following reagents were prepared with the final concentrations of the reagents in the reaction as shown below.
11.64ミリ単位／ml
NADH−FMNオキシドレダクターゼ
96.5μｇ／ml 細菌ルシフエラーゼ
0.002％ デシルアルデヒド
2.5μM FMN
0.1M リン酸緩衝液（PH7.0）
上記試薬に種々の濃度に稀釈した管理血清を添
加し、次いで2.5×10-7MNADHを添加して発光
強度を測定した。その結果を第２図に示す。11.64 millimeters/ml
NADH-FMN oxidoreductase 96.5μg/ml Bacterial luciferase 0.002% Decylaldehyde 2.5μM FMN 0.1M phosphate buffer (PH7.0) Control serum diluted to various concentrations was added to the above reagents, and then 2.5×10 -7 MNADH was added and the luminescence intensity was measured. The results are shown in FIG.
第２図から明らかなように、細菌ルシフエラー
ゼによるNADH測定系では血清の影響を濃度
１／100容まで受けない。 As is clear from Figure 2, the NADH measurement system using bacterial luciferase is not affected by serum up to a concentration of 1/100 volume.
(2) ルミノール化学発光における反応試薬の終濃
度が以下の通りである次の試薬を調製した。(2) The following reagents with the final concentrations of reaction reagents for luminol chemiluminescence were prepared as follows.
２×10-7M ルミノール
10単位／ml ペルオキシダーゼ
0.1M ホウ酸緩衝液（PH8.0）
上記試薬に種々の濃度に稀釈した管理血清およ
び終濃度110-7M過酸化水素を添加して、発光強
度を測定した。その結果を第３図に示す。2×10 -7 M Luminol 10 units/ml Peroxidase 0.1 M borate buffer (PH8.0) Control serum diluted to various concentrations and hydrogen peroxide at a final concentration of 110 -7 M were added to the above reagents to generate luminescence. The strength was measured. The results are shown in FIG.
第３図から明らかなように、ルミノール−ペル
オキシダーゼ系では血清の影響を強く受ける。 As is clear from FIG. 3, the luminol-peroxidase system is strongly influenced by serum.
第１図は過酸化水素濃度（Ｍ）と発光強度増加
の時間当りの最大勾配（発光強度Io）との関係を
示す。第２図は添加した血清稀釈倍率と細菌ルシ
フエラーゼの発光強度（Io）との関係を示す。第
３図は添加した血清稀釈倍率とルミノール−ペル
オキシダーゼ系による化学発光強度との関係を示
す。
FIG. 1 shows the relationship between the hydrogen peroxide concentration (M) and the maximum slope of luminescence intensity increase per time (luminescence intensity Io). FIG. 2 shows the relationship between the dilution ratio of added serum and the luminescence intensity (Io) of bacterial luciferase. FIG. 3 shows the relationship between the dilution ratio of added serum and the chemiluminescence intensity due to the luminol-peroxidase system.
Claims (1)
コールの存在下、カタラーゼを作用させ、(ii)生成
するアルデヒドに水およびNAD又はNADPの存
在下、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ又はア
ルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、(iii)生成す
るNADH又はNADPHにFMNの存在下、
NADH−FMNオキシドレダクターゼ、NADPH
−FMNオキシドレダクターゼ又はジアホラーゼ
を作用させ、(iv)生成するFMNH2に炭素原子数８
〜14の直鎖アルデヒドおよび酸素の存在下、細菌
ルシフエラーゼを作用させ、(v)生成する発光活性
を測定することにより、試料中の過酸化水素を定
量することを特徴とする細菌ルシフエラーゼによ
る過酸化水素の定量法。1 (i) Catalase is allowed to act on a sample containing hydrogen peroxide in the presence of an alkyl alcohol, (ii) formaldehyde dehydrogenase or aldehyde dehydrogenase is made to act on the generated aldehyde in the presence of water and NAD or NADP, (iii) ) In the presence of FMN in the generated NADH or NADPH,
NADH-FMN oxidoreductase, NADPH
- Let FMN oxidoreductase or diaphorase act, (iv) generate FMNH 2 with 8 carbon atoms.
Peroxidation by bacterial luciferase, characterized by quantifying hydrogen peroxide in a sample by allowing bacterial luciferase to act in the presence of ~14 linear aldehydes and oxygen, and (v) measuring the luminescent activity produced. Hydrogen quantitative method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7476684A JPS60218070A (en) | 1984-04-12 | 1984-04-12 | Quantitative determination of hydrogen peroxide by bacterial luciferase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7476684A JPS60218070A (en) | 1984-04-12 | 1984-04-12 | Quantitative determination of hydrogen peroxide by bacterial luciferase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60218070A JPS60218070A (en) | 1985-10-31 |
| JPH0365959B2 true JPH0365959B2 (en) | 1991-10-15 |
Family
ID=13556727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7476684A Granted JPS60218070A (en) | 1984-04-12 | 1984-04-12 | Quantitative determination of hydrogen peroxide by bacterial luciferase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60218070A (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02234698A (en) * | 1989-03-08 | 1990-09-17 | Toyobo Co Ltd | Detecting method of dna probe by bacterium-luciferase system |
-
1984
- 1984-04-12 JP JP7476684A patent/JPS60218070A/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60218070A (en) | 1985-10-31 |
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