JPH0361427B2 - - Google Patents
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Description
本発明は発酵性を有する生きた酵母細胞、特に
サツカロミセス層に属する酵母と、その酵母細胞
に本来存在しないか或いは期待する効果に十分な
量が存在しない酵素との共固定化物に関する。更
に、本発明は発酵性を有する生きた酵母細胞とそ
れに結合した活性のある酵素より成る共固定化物
の製造に関する。 また、本発明はこの酵素と酵母の共固定化物を
生物工学的反応、特にアルコール発酵を行うため
に使用することに関する。 人類は数千年前より発酵性酵母をアルコール飲
料の製造のために利用している。その際に使用す
る酵母の酵素は原料を構成する単一又は幾つかの
成分（例えばビール麦芽汁（beerwort）ブドウ
液（grapemust）、醸造用麦芽汁
（distillerymash）等に含まれる発酵性糖類）を
分解し、少くともその一部分をエチルアルコール
に変換する役割を果している。エチルアルコール
は古来よりのやゝぜいたくな食品としての意義に
加えて化学原料や内燃機関の燃料としての重要性
が増している。 不幸にして、使用される酵母は求められたすべ
ての反応を行うに十分な酵素を保有しているとは
限らない。例えばワイン酵母は蛋白質分解活性が
不十分なので発酵液中の蛋白質は少しゝか分解さ
れない。このため発酵液が泡立つたりワインの清
澄化や安定化に少なからず困難がもたらされる。
それを避けるには例えばベントナイトやその他の
精製剤（例えばゲラチンやシリカゲル）を加える
以外に方法はない。 現在に至るまでサツカロミセス・セレビシエー
（Saccharomyces cerevisiae）タイプの通常の醸
造用酵母や、上面発酵ビール酵母では多くの醸造
原料に含まれる三糖類、ラフイノースを発酵しつ
くす（attenuate）ことはできない。それはその
ような酵母にはα−ガラクトシダーゼ（メリビア
ーゼ）が欠除しているためでラフイノーズの３分
の１だけが発酵され、ビール麦芽汁や糖蜜中に存
在するラフイノースの残り３分の２を構成するメ
リビオースは資化されずに残つてしまう、従つて
アルコールの収量は理論的に可能な値よりも低
い。 下面或いは上面発酵ビール酵母（サツカロミセ
スウバルム（uvarum）又はカールスベルゲンシ
ス（carlsbergensis）及びサツカロミセス・セレ
ビシエー）を用いて醸造を行う際の難点はこのタ
イプの酵母が本来β−グルカナーゼを持たないた
めβ−グルカンが遊離し、ビールの過を困難に
することである。 同様な状況はワイン酵母（サツカロミセス・セ
レビシエー、サツカロミセス・バヤヌス）でペク
チナーゼが欠除していることによつてもしばしば
起つている。 発酵に使用している酵母に含まれないすべての
酵素を発酵液に添加する事についてはすでに先行
技術が存在し、少くとも先行技術によつて示唆さ
れている。例えばビールのグルカンを十分に分解
させるために可溶性のβ−グルカナーゼが使用さ
れている。ワインの製造には可溶性のペクチナー
ゼが既に使用されている。しかしながら、このよ
うな方法の難点は、でき上つた飲料（例えばビー
ル、ワイン）に酵素蛋白が含まれてしまうことで
ある。可溶性酵素を使用することの欠点としては
例えば果実汁（ぶどう汁）を溶性ペプシンで発酵
する場合のように消泡効果が不十分になるという
事もある。 先行技術に属する固定化酵素を使用する場合は
最終製品（例えばビールやワイン）に酵素蛋白を
含まないようにする事ができる。しかしながら、
そのような固定化酵素を酵母と共に発酵液に加え
た場合でも撹拌機を用いて強力な撹拌を行わない
限り、醗酵性酵母によつて分解できない物質を急
速に分解するという目的を達成することはではな
い。従つて、既知の固定化物を有効に利用する為
には余分な技術経費が必要となり多くの困難が生
じ、多くの工場（醸造所、蒸留酒製造所、ワイン
製造所）では実施することは不可能である。時に
は有害な副作用、例えば望ましくない酸素供給に
よる酵母の生育過剰のために不可能となる。 その他に、Y.Takasakiの業績によつて酵素を
微生物の細胞に結合できることが既に知られてい
る、米国特許Nr.3950220およびAgr.Biol.
Chem.38、1081−1082（1974）にこの問題につい
ての詳細が記されている。Takasakiの方法はカ
ビに適して居り、発酵性酵母細胞には適していな
い。その理由はその方法では細胞の発酵酵素系
が、完全に不活化してしまうからである。更にそ
の方法の欠点は、１個の細胞に比較的少い酵素蛋
白しか結合しないため、このような製品の酵素比
活性が低すぎるということである。 最後に述べた酵素−細胞−共固定化物に於て酵
素の結合量が少いという欠点は、B.Ha¨gerdalお
よびK.Mosbach（Abstraets for the Food
Process Engrieering Congress、HelsinKi1979）
の新しい方法で改善することができる。その方法
によれば、β−グルコシダーゼを含むアルギン酸
ゲルによつて細胞を包み込んでしまうのである。
この方法は生きた発酵性酵母にも有効であろうが
酵素と酵母より成る大きな粒子が生ずるという欠
点も持つている。その結果発酵される培地（マツ
シユ、麦芽汁、ぶどう液及びそれ等に類するも
の）中に於て酵母細胞が通常有している浮遊性が
失われ醗酵力がかなり低下することになる。更に
欠点として相対的に厚い酵素−アルギン酸層が醗
酵性物質の酵母細胞内への透過を妨げ、透過性に
対する抵抗が増大することが挙げられる。 対象となる酵母が、本来含まないか、又は期待
している効果に十分な量を含まない酵素を以下に
述べるような方法で、酵母の発酵性を保つたまゝ
発酵性酵母細胞と結合することができれば技術的
及び経済的に大きな利益が生ずることが今や明ら
かとなつた。 本発明による製品は凝集した形体ではなく単個
細胞とした発酵性酵母細胞と一種又は数種の酵素
の共固定化物である。第１図にそのような共固定
化物の基本構造及びその製造工程が図示してあ
る。 本発明によれば、発酵性酵母細胞は少なくとも
部分的には脱水されることが必要であり、それを
結合しようとする一種又は数種の酵素を含む水溶
液中に添加する。 酵母細胞は水分を吸収して膨潤し、酵素分子は
酵母細胞上に留まることになる。引続いて酵母の
発酵性を失活させない酵素沈殿剤を加えることに
より、酵素は酵母細胞に付着し更に酵素の架橋剤
を添加することによつて酵素分子はしつかりと相
互に結合し、本発明による発酵性酵母との共固定
化物を形成する。更に酵素沈殿剤の添加により酵
素層にとり囲まれた酵母細胞の大部分が相互に付
着して大きな団塊を形成することなく個々に離れ
るという効果を有している。 少くとも部分的に脱水した酵母細胞が得られて
いない場合には活性乾燥酵母の製造法として知ら
れている方法（例えばドイツ特許2515029に記載
された真空乾燥法に従つて）によつて調整するこ
とができる。 細胞内より少くとも部分的に水分を取り除くに
適した方法としては、高い浸透圧を有る物質の溶
液（例えば塩類、糖、グリセリン）の利用も知ら
れている。細胞を高い浸透圧を有する溶液内に入
れると細胞内の水は周囲の溶液中へ取り出され
る。周囲の溶液を分離すれば、細胞は部分的に脱
水された出発原料として酵母酵素共固定化物の製
造に適したものとなる。 本発明によれば、多少なりとも脱水された酵母
細胞は酵素の水溶液中に入れられるこれを行うに
際して、酵素溶液の水分量は酵母細胞が水を再吸
収することによつて細胞間にはほとんど水が残ら
ないように計算することが必要である。必要な水
分量は予備実験によつて定めることができる。水
を完全に吸収した酵素細胞の水分含量は70〜75％
と推定される。酵母細胞が酵素溶液中で水を再吸
収する間に酵素は酵母細胞によつて吸い取られ、
その細胞表層に付着することになる。 酵母細胞は一般的に再水和（rehydratizing）
（再湿潤）する際に低温シヨツクに対する感受性
が高く乾燥度が強い程そういう傾向のあることが
知られている。従つて再水加を行う際には酵素の
水溶液を約30℃〜40℃に加温して行うことが望ま
しい。 必要によつては、ドイツ特許2531800やドイツ
特許2435226等に示されているように、細胞の発
酵性に対する傷害から保護して再水加を行えるよ
うな保護剤と混合することもできる。 酵母細胞への再水加の後、酵素分子を最後の堅
固な結合、或いは架橋の段階まで細胞の表層に定
着させ更に細胞粒子の凝集を防ぐために酵素沈殿
剤の添加は架橋剤の添加と同時又は直前に行う。
この目的のためにはタンニンの0.5〜５％の水溶
液を使用することが好ましい。一般に酵素の沈殿
化に使用される有機溶剤（例えば、アセトン、ｉ
−プロパノール、およびその他）は酵母の発酵性
をかなり減少させるか完全にそれを破壊し、更に
酵母細胞に対し強力な脱水効果を発揮することに
より細胞表層からそこに付着した酵素層を脱落さ
せるので不適当である。 架橋剤としては、例えばジイソシアネート、グ
ルタールジアルデヒド、へキサメチレンジアミン
又はヘキサメチレンテトラミン等の一般に知られ
た２官能基又は多官能基化合物を使用することが
できる。 グルタールジアルデヒドは水溶液として反応液
中の濃度１〜10％で使用するのが好ましい。架橋
反応は数分から数日間、好ましくは１〜５時間、
20〜30℃で行われる。その際に反応液は例えば撹
拌又は振盪によつて多少動揺させることが望まし
い。架橋反応が完了した時にその生成物は通常洗
滌された後湿潤状態又は必要があれば乾燥状態で
使用される。 第１表は本発明に於ける酵母細胞と酵素の組合
せの例及びその経済的な技術分野に於ける利用の
可能性を示している。 サツカロミセス・セレビシエーやサツカロミセ
ス・バヤヌス等のワイン酵母とペプシンの結合は
特に好ましいことが示された。驚くべきことに本
発明による共固定化物は蛋白質に富んだブドウ液
（must）に於て発泡のない発酵を可能にした。こ
れは同量の可溶性ペプシンと同量の通常の酵母を
使用したのでは起らない事である。 更に本発明による製品の使用により、発酵は促
進されワインの自己清澄化が速やかとなり、清澄
剤の使用を節約することができる。
サツカロミセス層に属する酵母と、その酵母細胞
に本来存在しないか或いは期待する効果に十分な
量が存在しない酵素との共固定化物に関する。更
に、本発明は発酵性を有する生きた酵母細胞とそ
れに結合した活性のある酵素より成る共固定化物
の製造に関する。 また、本発明はこの酵素と酵母の共固定化物を
生物工学的反応、特にアルコール発酵を行うため
に使用することに関する。 人類は数千年前より発酵性酵母をアルコール飲
料の製造のために利用している。その際に使用す
る酵母の酵素は原料を構成する単一又は幾つかの
成分（例えばビール麦芽汁（beerwort）ブドウ
液（grapemust）、醸造用麦芽汁
（distillerymash）等に含まれる発酵性糖類）を
分解し、少くともその一部分をエチルアルコール
に変換する役割を果している。エチルアルコール
は古来よりのやゝぜいたくな食品としての意義に
加えて化学原料や内燃機関の燃料としての重要性
が増している。 不幸にして、使用される酵母は求められたすべ
ての反応を行うに十分な酵素を保有しているとは
限らない。例えばワイン酵母は蛋白質分解活性が
不十分なので発酵液中の蛋白質は少しゝか分解さ
れない。このため発酵液が泡立つたりワインの清
澄化や安定化に少なからず困難がもたらされる。
それを避けるには例えばベントナイトやその他の
精製剤（例えばゲラチンやシリカゲル）を加える
以外に方法はない。 現在に至るまでサツカロミセス・セレビシエー
（Saccharomyces cerevisiae）タイプの通常の醸
造用酵母や、上面発酵ビール酵母では多くの醸造
原料に含まれる三糖類、ラフイノースを発酵しつ
くす（attenuate）ことはできない。それはその
ような酵母にはα−ガラクトシダーゼ（メリビア
ーゼ）が欠除しているためでラフイノーズの３分
の１だけが発酵され、ビール麦芽汁や糖蜜中に存
在するラフイノースの残り３分の２を構成するメ
リビオースは資化されずに残つてしまう、従つて
アルコールの収量は理論的に可能な値よりも低
い。 下面或いは上面発酵ビール酵母（サツカロミセ
スウバルム（uvarum）又はカールスベルゲンシ
ス（carlsbergensis）及びサツカロミセス・セレ
ビシエー）を用いて醸造を行う際の難点はこのタ
イプの酵母が本来β−グルカナーゼを持たないた
めβ−グルカンが遊離し、ビールの過を困難に
することである。 同様な状況はワイン酵母（サツカロミセス・セ
レビシエー、サツカロミセス・バヤヌス）でペク
チナーゼが欠除していることによつてもしばしば
起つている。 発酵に使用している酵母に含まれないすべての
酵素を発酵液に添加する事についてはすでに先行
技術が存在し、少くとも先行技術によつて示唆さ
れている。例えばビールのグルカンを十分に分解
させるために可溶性のβ−グルカナーゼが使用さ
れている。ワインの製造には可溶性のペクチナー
ゼが既に使用されている。しかしながら、このよ
うな方法の難点は、でき上つた飲料（例えばビー
ル、ワイン）に酵素蛋白が含まれてしまうことで
ある。可溶性酵素を使用することの欠点としては
例えば果実汁（ぶどう汁）を溶性ペプシンで発酵
する場合のように消泡効果が不十分になるという
事もある。 先行技術に属する固定化酵素を使用する場合は
最終製品（例えばビールやワイン）に酵素蛋白を
含まないようにする事ができる。しかしながら、
そのような固定化酵素を酵母と共に発酵液に加え
た場合でも撹拌機を用いて強力な撹拌を行わない
限り、醗酵性酵母によつて分解できない物質を急
速に分解するという目的を達成することはではな
い。従つて、既知の固定化物を有効に利用する為
には余分な技術経費が必要となり多くの困難が生
じ、多くの工場（醸造所、蒸留酒製造所、ワイン
製造所）では実施することは不可能である。時に
は有害な副作用、例えば望ましくない酸素供給に
よる酵母の生育過剰のために不可能となる。 その他に、Y.Takasakiの業績によつて酵素を
微生物の細胞に結合できることが既に知られてい
る、米国特許Nr.3950220およびAgr.Biol.
Chem.38、1081−1082（1974）にこの問題につい
ての詳細が記されている。Takasakiの方法はカ
ビに適して居り、発酵性酵母細胞には適していな
い。その理由はその方法では細胞の発酵酵素系
が、完全に不活化してしまうからである。更にそ
の方法の欠点は、１個の細胞に比較的少い酵素蛋
白しか結合しないため、このような製品の酵素比
活性が低すぎるということである。 最後に述べた酵素−細胞−共固定化物に於て酵
素の結合量が少いという欠点は、B.Ha¨gerdalお
よびK.Mosbach（Abstraets for the Food
Process Engrieering Congress、HelsinKi1979）
の新しい方法で改善することができる。その方法
によれば、β−グルコシダーゼを含むアルギン酸
ゲルによつて細胞を包み込んでしまうのである。
この方法は生きた発酵性酵母にも有効であろうが
酵素と酵母より成る大きな粒子が生ずるという欠
点も持つている。その結果発酵される培地（マツ
シユ、麦芽汁、ぶどう液及びそれ等に類するも
の）中に於て酵母細胞が通常有している浮遊性が
失われ醗酵力がかなり低下することになる。更に
欠点として相対的に厚い酵素−アルギン酸層が醗
酵性物質の酵母細胞内への透過を妨げ、透過性に
対する抵抗が増大することが挙げられる。 対象となる酵母が、本来含まないか、又は期待
している効果に十分な量を含まない酵素を以下に
述べるような方法で、酵母の発酵性を保つたまゝ
発酵性酵母細胞と結合することができれば技術的
及び経済的に大きな利益が生ずることが今や明ら
かとなつた。 本発明による製品は凝集した形体ではなく単個
細胞とした発酵性酵母細胞と一種又は数種の酵素
の共固定化物である。第１図にそのような共固定
化物の基本構造及びその製造工程が図示してあ
る。 本発明によれば、発酵性酵母細胞は少なくとも
部分的には脱水されることが必要であり、それを
結合しようとする一種又は数種の酵素を含む水溶
液中に添加する。 酵母細胞は水分を吸収して膨潤し、酵素分子は
酵母細胞上に留まることになる。引続いて酵母の
発酵性を失活させない酵素沈殿剤を加えることに
より、酵素は酵母細胞に付着し更に酵素の架橋剤
を添加することによつて酵素分子はしつかりと相
互に結合し、本発明による発酵性酵母との共固定
化物を形成する。更に酵素沈殿剤の添加により酵
素層にとり囲まれた酵母細胞の大部分が相互に付
着して大きな団塊を形成することなく個々に離れ
るという効果を有している。 少くとも部分的に脱水した酵母細胞が得られて
いない場合には活性乾燥酵母の製造法として知ら
れている方法（例えばドイツ特許2515029に記載
された真空乾燥法に従つて）によつて調整するこ
とができる。 細胞内より少くとも部分的に水分を取り除くに
適した方法としては、高い浸透圧を有る物質の溶
液（例えば塩類、糖、グリセリン）の利用も知ら
れている。細胞を高い浸透圧を有する溶液内に入
れると細胞内の水は周囲の溶液中へ取り出され
る。周囲の溶液を分離すれば、細胞は部分的に脱
水された出発原料として酵母酵素共固定化物の製
造に適したものとなる。 本発明によれば、多少なりとも脱水された酵母
細胞は酵素の水溶液中に入れられるこれを行うに
際して、酵素溶液の水分量は酵母細胞が水を再吸
収することによつて細胞間にはほとんど水が残ら
ないように計算することが必要である。必要な水
分量は予備実験によつて定めることができる。水
を完全に吸収した酵素細胞の水分含量は70〜75％
と推定される。酵母細胞が酵素溶液中で水を再吸
収する間に酵素は酵母細胞によつて吸い取られ、
その細胞表層に付着することになる。 酵母細胞は一般的に再水和（rehydratizing）
（再湿潤）する際に低温シヨツクに対する感受性
が高く乾燥度が強い程そういう傾向のあることが
知られている。従つて再水加を行う際には酵素の
水溶液を約30℃〜40℃に加温して行うことが望ま
しい。 必要によつては、ドイツ特許2531800やドイツ
特許2435226等に示されているように、細胞の発
酵性に対する傷害から保護して再水加を行えるよ
うな保護剤と混合することもできる。 酵母細胞への再水加の後、酵素分子を最後の堅
固な結合、或いは架橋の段階まで細胞の表層に定
着させ更に細胞粒子の凝集を防ぐために酵素沈殿
剤の添加は架橋剤の添加と同時又は直前に行う。
この目的のためにはタンニンの0.5〜５％の水溶
液を使用することが好ましい。一般に酵素の沈殿
化に使用される有機溶剤（例えば、アセトン、ｉ
−プロパノール、およびその他）は酵母の発酵性
をかなり減少させるか完全にそれを破壊し、更に
酵母細胞に対し強力な脱水効果を発揮することに
より細胞表層からそこに付着した酵素層を脱落さ
せるので不適当である。 架橋剤としては、例えばジイソシアネート、グ
ルタールジアルデヒド、へキサメチレンジアミン
又はヘキサメチレンテトラミン等の一般に知られ
た２官能基又は多官能基化合物を使用することが
できる。 グルタールジアルデヒドは水溶液として反応液
中の濃度１〜10％で使用するのが好ましい。架橋
反応は数分から数日間、好ましくは１〜５時間、
20〜30℃で行われる。その際に反応液は例えば撹
拌又は振盪によつて多少動揺させることが望まし
い。架橋反応が完了した時にその生成物は通常洗
滌された後湿潤状態又は必要があれば乾燥状態で
使用される。 第１表は本発明に於ける酵母細胞と酵素の組合
せの例及びその経済的な技術分野に於ける利用の
可能性を示している。 サツカロミセス・セレビシエーやサツカロミセ
ス・バヤヌス等のワイン酵母とペプシンの結合は
特に好ましいことが示された。驚くべきことに本
発明による共固定化物は蛋白質に富んだブドウ液
（must）に於て発泡のない発酵を可能にした。こ
れは同量の可溶性ペプシンと同量の通常の酵母を
使用したのでは起らない事である。 更に本発明による製品の使用により、発酵は促
進されワインの自己清澄化が速やかとなり、清澄
剤の使用を節約することができる。
【表】
以下の例により本発明を説明するが、本発明の
範囲を限定するものではない。 例 １ ダルムシユタツトのプレザー酵母製造所製の新
鮮な圧搾パン酵母14ｇを1.4ｇの粉末状ソルビト
ールと共に15分間撹拌した。その間に酵母は細胞
内の水分（細胞内より）が細胞間空間（細胞の間
の空間）へ移ることによつて部分的に脱水され
た。次に酵母を吸引過機によつて吸引してソル
ビトールの添加によつて生じた液体の大部分を除
去した。 脱水工程の後に酵母には水分が47％しか残ら
ず、乾燥物質が53％となつた。上述の脱水物とは
別に名古屋（Nagoya）（日本）の天野
（Amano）製薬株式会社から市販されている“セ
ルラーゼAP3”というセルロース分解酵素0.5ｇ
を室温にて５mlの脱イオン水に溶解した。この酵
素溶液中に前述の部分的に脱水した圧搾酵母の全
量を撹拌しつゝ加えた。撹拌は酵母が十分に水分
を再吸収して懸濁液となる迄15分間続けた。次に
これを25℃に温め２％タンニン溶液20mlと25％グ
ルタールジアルデヒド溶液0.1mlを加えた。アル
デヒドを添加後、反応物はエルレンマイヤーフラ
スコ中で25℃４時間振盪した。その後生成された
酵素−酵母−共固定化物を十分に水洗した。 この共固定化物の発酵性を調べるためにこれを
50ml容の発酵容器に移し、１ｇのセロビオース
0.1ｇのKH2PO4を加えPHを5.0に調整した。発酵
容器を30℃に加温してCO2の発生を測定した。
CO2の発生は１時間後に30ml、２時間後に80ml、
３時間後に140mlであつた。このような強力な
CO2の発生は本発明による共固定化物が通常のパ
ン酵母では全く発酵されないセロビオースを十分
に発酵することを示すものである。 例 ２ 0.5の下面酵母の粘稠液（サツカロミセス・
ウバルム）に100mlのグリセリンを加えて30分間
撹拌した。 次に、上澄液を吸引過機によつて除去した。
得られた酵母の残渣は水分49％乾燥物質51％を含
んでいた。この圧搾され、部分脱水された生酵母
をアミログルロシダーゼと共固定化してビール麦
芽汁の発酵に用いることを試みた。 名古屋（日本）の天野製薬株式会社より市販さ
れているアミログルコシダーゼ（グルコアミラー
ゼ）“グルコザイム8000”の0.5ｇを室温にて５ml
の脱イオン水に溶解した。この酵素溶液に10ｇの
圧搾部分脱水したビール酵母を撹拌しつゝ加え
た。 撹拌を15分間継続した後、１％タンニン溶液20
mlと25％グルタールジアルデヒド溶液0.15mlを加
えた。これをエルレンマイヤーフラスコ中にて25
℃２時間振盪し、生成された酵素−酵母−共固定
化物を十分に水洗した。最後に過剰な水は吸引
過機にて除去した。 見かけ上の発酵限界はビール工場に於て作られ
たうすい麦芽汁を用いていわゆる“ノルマーレン
メートデ”（標準法）（パウロウスキー−シルド
Pawlowski−Schild：デイー・ブラウテクニシ
エンウンターズ−フングスメトーデン
Diebrautechnischen untersuchungsmethoden
S.165−167、８アウフラーゲ、フエルラーク カ
ール、ニユールンべルグ）と呼ばれている方法に
従つて求められる。部分的に脱水した麦芽汁を用
いる場合は、見かけ上の発酵限界は80％であつた
が酵母とアミログルコシダーゼの共固定化物を用
いると102％であつた。このように共固定化物に
よりダイエツトビールに特徴的な値が得られた。 例 ３ 東京（日本）の東京田辺（Tokyo Tanabe）
株式会社より“ガランターゼ”という名で市販さ
れているアスペルギルス・ニガーのカビラクター
ゼ0.5ｇを５mlの脱イオン水に溶解した。次にそ
の溶液は35℃に加温し、ビーレフエルド
（Bielefeld）のドクトルエツカー（Dr.Oetker）
社より市販されている乾燥パン酵母２ｇを撹拌し
つゝ加えた。15分間撹拌することによつて乾燥酵
母は水分を再吸収して懸濁された。この酵母を25
℃まで冷却し、２％タンニン溶液10ml、25％グル
タールジアルデヒド0.05ml、及び25mgのヘキサメ
チレンテトラミンを加えた。 次にそれをエルレンマイヤーフラスコ中にて25
℃の水浴中で２時間振盪した。得られたラクター
ゼ−酵母−共固定化物を脱イオン水にて十分に洗
滌した。0.1％のクエン酸ソーダを加えてPH4.5に
調整した５％ラクトース溶液100ml中にてこの共
固定化物は30℃にて30分間に130ml、60分間に210
mlのCO2を発生した。 このようにしてこの共固定化物は通常のパン酵
母で発酵性のない、ラクトースをかなり発酵し得
ることが示された。 例 ４ 2000FIP単位／ｇの市販のブタペプシン（メル
ク社、ダルムシユタツト、商品番号No.7190）0.5
ｇを６mlの脱イオン水に溶解した。ペプシンを溶
解後、溶液を38℃に加温し、市販の乾燥ワイン酵
母“イルガフエルムCM”（出願人の市販品）２
ｇを撹拌しつつ添加した。15分間撹拌することに
よつて乾燥酵母は凝固することなく水分を再吸収
した。この粘稠な酵母の菌体を25℃に冷却し１％
タンニン溶液20mlと25％グルタールジアルデヒド
溶液0.1mlを加えた。反応物全体をエルレンマイ
ヤーフラスコ中にて25℃２時間振盪し、生成した
ペプシン−ワイン酵母−共固定化物を水道水で十
分に洗滌した。 このペプシン−ワイン酵母−共固定化物の全量
を10の新鮮なシリヴアナー（Silvaner）ブドウ
液に加えて20℃で発酵を開始させた。これと平行
して、ペプシンと共固定化さていない“イルガフ
エルム”乾燥ワイン酵母２ｇに38℃で水分を再吸
収させたものを、同一のシリヴアナー
（Silvaner）ブドウ液10に加えた。本発明によ
る共固定化物を用いた発酵では泡立ちはその最盛
期でも１cm以下であつたが、対照では殆ど発酵液
の容積に等しい泡立ちがあつた。 更にこの発明の共固定化物の有利な点はブドー
液の発酵が速くなることである。第２図はこの事
実を明確にしている。更に、本発明による製品を
用いた場合、ワインの自己清澄化が起り、更に精
製を行わなくても（例えばベントナイト、ゲラチ
ン、シリカゾルによつて）蛋白質の安定化したワ
インが得られた。この事は過したワインを60℃
で24時間加熱した後に20℃に冷却すると、本発明
の生成物で製造したワインは完全に清澄を保つの
に対し、対照のワインは強い混濁を示すことによ
つて明らかに示された。
範囲を限定するものではない。 例 １ ダルムシユタツトのプレザー酵母製造所製の新
鮮な圧搾パン酵母14ｇを1.4ｇの粉末状ソルビト
ールと共に15分間撹拌した。その間に酵母は細胞
内の水分（細胞内より）が細胞間空間（細胞の間
の空間）へ移ることによつて部分的に脱水され
た。次に酵母を吸引過機によつて吸引してソル
ビトールの添加によつて生じた液体の大部分を除
去した。 脱水工程の後に酵母には水分が47％しか残ら
ず、乾燥物質が53％となつた。上述の脱水物とは
別に名古屋（Nagoya）（日本）の天野
（Amano）製薬株式会社から市販されている“セ
ルラーゼAP3”というセルロース分解酵素0.5ｇ
を室温にて５mlの脱イオン水に溶解した。この酵
素溶液中に前述の部分的に脱水した圧搾酵母の全
量を撹拌しつゝ加えた。撹拌は酵母が十分に水分
を再吸収して懸濁液となる迄15分間続けた。次に
これを25℃に温め２％タンニン溶液20mlと25％グ
ルタールジアルデヒド溶液0.1mlを加えた。アル
デヒドを添加後、反応物はエルレンマイヤーフラ
スコ中で25℃４時間振盪した。その後生成された
酵素−酵母−共固定化物を十分に水洗した。 この共固定化物の発酵性を調べるためにこれを
50ml容の発酵容器に移し、１ｇのセロビオース
0.1ｇのKH2PO4を加えPHを5.0に調整した。発酵
容器を30℃に加温してCO2の発生を測定した。
CO2の発生は１時間後に30ml、２時間後に80ml、
３時間後に140mlであつた。このような強力な
CO2の発生は本発明による共固定化物が通常のパ
ン酵母では全く発酵されないセロビオースを十分
に発酵することを示すものである。 例 ２ 0.5の下面酵母の粘稠液（サツカロミセス・
ウバルム）に100mlのグリセリンを加えて30分間
撹拌した。 次に、上澄液を吸引過機によつて除去した。
得られた酵母の残渣は水分49％乾燥物質51％を含
んでいた。この圧搾され、部分脱水された生酵母
をアミログルロシダーゼと共固定化してビール麦
芽汁の発酵に用いることを試みた。 名古屋（日本）の天野製薬株式会社より市販さ
れているアミログルコシダーゼ（グルコアミラー
ゼ）“グルコザイム8000”の0.5ｇを室温にて５ml
の脱イオン水に溶解した。この酵素溶液に10ｇの
圧搾部分脱水したビール酵母を撹拌しつゝ加え
た。 撹拌を15分間継続した後、１％タンニン溶液20
mlと25％グルタールジアルデヒド溶液0.15mlを加
えた。これをエルレンマイヤーフラスコ中にて25
℃２時間振盪し、生成された酵素−酵母−共固定
化物を十分に水洗した。最後に過剰な水は吸引
過機にて除去した。 見かけ上の発酵限界はビール工場に於て作られ
たうすい麦芽汁を用いていわゆる“ノルマーレン
メートデ”（標準法）（パウロウスキー−シルド
Pawlowski−Schild：デイー・ブラウテクニシ
エンウンターズ−フングスメトーデン
Diebrautechnischen untersuchungsmethoden
S.165−167、８アウフラーゲ、フエルラーク カ
ール、ニユールンべルグ）と呼ばれている方法に
従つて求められる。部分的に脱水した麦芽汁を用
いる場合は、見かけ上の発酵限界は80％であつた
が酵母とアミログルコシダーゼの共固定化物を用
いると102％であつた。このように共固定化物に
よりダイエツトビールに特徴的な値が得られた。 例 ３ 東京（日本）の東京田辺（Tokyo Tanabe）
株式会社より“ガランターゼ”という名で市販さ
れているアスペルギルス・ニガーのカビラクター
ゼ0.5ｇを５mlの脱イオン水に溶解した。次にそ
の溶液は35℃に加温し、ビーレフエルド
（Bielefeld）のドクトルエツカー（Dr.Oetker）
社より市販されている乾燥パン酵母２ｇを撹拌し
つゝ加えた。15分間撹拌することによつて乾燥酵
母は水分を再吸収して懸濁された。この酵母を25
℃まで冷却し、２％タンニン溶液10ml、25％グル
タールジアルデヒド0.05ml、及び25mgのヘキサメ
チレンテトラミンを加えた。 次にそれをエルレンマイヤーフラスコ中にて25
℃の水浴中で２時間振盪した。得られたラクター
ゼ−酵母−共固定化物を脱イオン水にて十分に洗
滌した。0.1％のクエン酸ソーダを加えてPH4.5に
調整した５％ラクトース溶液100ml中にてこの共
固定化物は30℃にて30分間に130ml、60分間に210
mlのCO2を発生した。 このようにしてこの共固定化物は通常のパン酵
母で発酵性のない、ラクトースをかなり発酵し得
ることが示された。 例 ４ 2000FIP単位／ｇの市販のブタペプシン（メル
ク社、ダルムシユタツト、商品番号No.7190）0.5
ｇを６mlの脱イオン水に溶解した。ペプシンを溶
解後、溶液を38℃に加温し、市販の乾燥ワイン酵
母“イルガフエルムCM”（出願人の市販品）２
ｇを撹拌しつつ添加した。15分間撹拌することに
よつて乾燥酵母は凝固することなく水分を再吸収
した。この粘稠な酵母の菌体を25℃に冷却し１％
タンニン溶液20mlと25％グルタールジアルデヒド
溶液0.1mlを加えた。反応物全体をエルレンマイ
ヤーフラスコ中にて25℃２時間振盪し、生成した
ペプシン−ワイン酵母−共固定化物を水道水で十
分に洗滌した。 このペプシン−ワイン酵母−共固定化物の全量
を10の新鮮なシリヴアナー（Silvaner）ブドウ
液に加えて20℃で発酵を開始させた。これと平行
して、ペプシンと共固定化さていない“イルガフ
エルム”乾燥ワイン酵母２ｇに38℃で水分を再吸
収させたものを、同一のシリヴアナー
（Silvaner）ブドウ液10に加えた。本発明によ
る共固定化物を用いた発酵では泡立ちはその最盛
期でも１cm以下であつたが、対照では殆ど発酵液
の容積に等しい泡立ちがあつた。 更にこの発明の共固定化物の有利な点はブドー
液の発酵が速くなることである。第２図はこの事
実を明確にしている。更に、本発明による製品を
用いた場合、ワインの自己清澄化が起り、更に精
製を行わなくても（例えばベントナイト、ゲラチ
ン、シリカゾルによつて）蛋白質の安定化したワ
インが得られた。この事は過したワインを60℃
で24時間加熱した後に20℃に冷却すると、本発明
の生成物で製造したワインは完全に清澄を保つの
に対し、対照のワインは強い混濁を示すことによ
つて明らかに示された。
第１図は本発明の共固定化物の基本構造および
その製造工程を（Ａは部分的に脱水された酵母細
胞＋水溶液中の酵素；Ｂは水分を再吸収し酵素を
吸着した細胞＋酵素沈殿剤中の架橋剤：Ｃは酵素
と結合した細胞を表わす）、第２図は本発明の共
固定化物を用いた場合の効果を示す。
その製造工程を（Ａは部分的に脱水された酵母細
胞＋水溶液中の酵素；Ｂは水分を再吸収し酵素を
吸着した細胞＋酵素沈殿剤中の架橋剤：Ｃは酵素
と結合した細胞を表わす）、第２図は本発明の共
固定化物を用いた場合の効果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵素又は酵素の混合物を発酵性を有する生き
た酵母に被覆して結合させた、酵母と酵素との共
固定化物。 ２ 酵素と酵母とをそれ自体公知の架橋剤によつ
て結合させた、特許請求の範囲第１項の共固定化
物。 ３ グルタールジアルデヒドによつて結合させ
た、特許請求の範囲第１項または第２項のいずれ
か一つの共固定化物。 ４ 酵母として、サツカロミセス・セレビシエー
又はサツカロミセス・バヤヌス種のワイン酵母を
使用し、そして酵素としてペプシンを使用した、
特許請求の範囲第１項〜第３項の何れか一つの共
固定化物。 ５ 酵母の単個細胞の大部分が酵素又は酵素の混
合物によつてとりかこまれている、特許請求の範
囲第１項の共固定化物。 ６ 酵素又は酵素の混合物を発酵性を有する生き
た酵母に被覆して結合させた、酵母と酵素の共固
定化物の製造方法であつて、酵母細胞を完全に又
は部分的に脱水した後に、酵素の水溶液によつて
再水和し、更に酵母細胞の発酵性を損わないよう
な酵素沈澱剤を加え、最後にそれ自体公知の架橋
剤を加えることよりなる製造方法。 ７ 酵母としてサツカロミセス・セレビシエー又
はサツカロミセス・バヤヌスを使用し、そして酵
素としてペプシンを使用する、特許請求の範囲第
６項の方法。 ８ 再水和を酵素水溶液によつて行い、水分量を
酵母細胞によつて殆ど完全に吸収される量にす
る、特許請求の範囲第６項又は第７項の何れか一
つの方法。 ９ 約30〜40℃に加温した酵素溶液によつて再水
和を行う、特許請求の範囲第６項より第８項まで
の何れか一つの方法。 １０ タンニンを酵素沈澱剤として使用する、特
許請求の範囲第６項の方法。 １１ 架橋剤としてグルタールジアルデヒドを使
用する、特許請求の範囲第６項の方法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DE19803021629 DE3021629A1 (de) | 1980-06-09 | 1980-06-09 | Coimmobilisate aus gaerfaehigen hefen mit angekoppelten enzymen sowie ihre herstellung und anwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5763091A JPS5763091A (en) | 1982-04-16 |
| JPH0361427B2 true JPH0361427B2 (ja) | 1991-09-19 |
Family
ID=6104192
Family Applications (1)
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| EP (1) | EP0041610B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5763091A (ja) |
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| DE (2) | DE3021629A1 (ja) |
| GB (1) | GB2077291B (ja) |
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| DE3301992A1 (de) * | 1983-01-21 | 1984-07-26 | Boehringer Ingelheim KG, 6507 Ingelheim | Permeabilisiertes schimmelpilzmycel mit intaktem immobilisiertem glucoseoxidase-katalasesystem sowie dessen herstellung und anwendung |
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-
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- 1981-06-02 US US06/269,475 patent/US4459312A/en not_active Expired - Fee Related
- 1981-06-05 GB GB8117242A patent/GB2077291B/en not_active Expired
- 1981-06-08 CA CA000379191A patent/CA1169373A/en not_active Expired
- 1981-06-08 JP JP56087979A patent/JPS5763091A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS49110885A (ja) * | 1973-03-07 | 1974-10-22 |
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| GB2077291B (en) | 1984-04-26 |
| EP0041610A2 (de) | 1981-12-16 |
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