【発明の詳細な説明】
一般にサイクロデキストリン グルカノトラン
スフエラーゼ生産菌として、バチルス
（Bacillus）属やクレブシラ（Klebsiella）属の細
菌などが用いられてきた。しかし、その生産は微
量で、かつ不安定であり、また培地中に含まれる
きよう雑物が多く、サイクロデキストリン グル
カノトランスフエラーゼの分解精製が困難であつ
た。本発明者らは、バチルス・マセランス
Bacillus maceransのサイクロデキストリン グ
ルカノトランスフエラーゼ構造遺伝子をバチル
ス・ズブチリス内でクローン化することに成功
し、この変異株を培養したところ、安定に短時間
でサイクロデキストリン グルカノトランスフエ
ラーゼを生産させることができたものである。本
発明は、バチルス・マセランス由来のサイクロデ
キストリン グルカノトランスフエラーゼをコー
ドするDNAを組込んだプラスミドを導入したバ
チルス・ズブチリスを培養し、培養物からサイク
ロデキストリン グルカノトランスフエラーゼを
採取することを特徴とするサイクロデキストリン
グルカノトランスフエラーゼの製造法である。
本発明に用いるサイクロデキストリン グルカ
ノトランスフエラーゼを生産するバチルス・ズブ
チリスは次のようにして創製することができる。
サイクロデキストリン グルカノトランスフエ
ラーゼ遺伝子の調製は次のようにする。
バチルス・マセランスIAM 1243株はサイクロ
デキストリン グルカノトランスフエラーゼを菌
体外に分泌する細菌として知られている。本菌体
からSaito、Miura法（Saito、H.and Miura、
K.、Biochem.Biophys.Acta、72、619、（1964））
により染色体DNAを調製する。これを制限酵素
Sau3AIで部分分解し、分解物からシヨ糖密度勾
配超遠心法により約2kb以上の染色体DNA断片
を分離する。
別に、フアージγD69DNAを制限酵素BamHI
で切断し、これに先の染色体DNA断片を混合し、
更にT4DNAリガーゼを添加して、連結処理をす
る。この処理液を用いてイン ビトロパツケイジ
ング法（Horn、B.、Methods in Enzymology、
68、299、（1979））によりλフアージ粒子を形成
し、このλフアージ粒子をエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）SM 32の培養菌懸濁液に添
加してサイクロデキストリン グルカノトランス
フエラーゼ生産能を保有する特殊形質導入フアー
ジを得る。得られた特殊形質導入フアージ粒子よ
り、サイクロデキストリン グルカノトランスフ
エラーゼ遺伝子を含むλフアージDNAを調製す
る。このDNAを制限酵素Sau3AIで部分分解し、
プラスミドpUB110の制限酵素BamHI切断部分
にT4リガーゼを用いて結合し、ハイブリツド
プラスミド混合物を得る。この混合物を用いてバ
チルス・ズブチリスヘプロトプラスト形質導入法
（Chang、S.and Cohen、S.N.、Mol.Gen.Genet.
168、111、（1979））により形質転換する。形質転
換株の中からカナマイシン耐性（10μｇ／ml）か
つサイクロデキストリン グルカノトランスフエ
ラーゼ活性のある株を選択する。この菌株を培養
し、培養菌体からプラスミドpDS10を得た。
プラスミドpDS10のフイジカルマツプ（制限酵
素切断地図）は第４図に示した通りであり、白ぬ
きの部分はベクターpUB110由来、黒塗りの部分
は染色体切断部分で、このクローン化された切断
片の大きさは約2.2kbである。ここに得られる形
質転換体はサイクロデキストリン グルカノトラ
ンスフエラーゼを菌体外に安定によく分泌する優
れた変異バチルス・ズブチリスである。本菌はバ
チルス・ズブチリスNA64−pDS10（FERMP−
7959）として微工研に寄託されている。
この変異バチルス・ズブチリスはサイクロデキ
ストリン グルカノトランスフエラーゼの生産性
において、全く新規であり、サイクロデキストリ
ン グルカノトランスフエラーゼの工業生産上極
めて有用である。
本発明においては、この変異バチルス・ズブチ
リスを液体培養して目的とするサイクロデキスト
リン グルカノトランスフエラーゼを製造する。
培地としては、バチルス・ズブチリスの培養に
用いられるものであればいずれでもよいが、炭素
源としては澱粉、液化澱粉、グウコース、グリセ
リン、糖蜜、廃糖蜜などがあり、窒素源としては
各種蛋白分解物、大豆粉、肉エキス、ペプトン、
尿素、硝酸塩、アンモニウム塩、酵母エキス、コ
ーンステイープリカーなどがあり、その他ビオチ
ンなどの栄養素や微量金属などが適宜使用され
る。
培養は37℃で通気かくはんによつて行われる。
12〜20時間の培養によつて培地中のサイクロデキ
ストリン グルカノトランスフエラーゼは最大蓄
積量を示すので、この時点で培養を終了し、培養
液を遠心分離して菌体を除去する。
得られた培養ろ液は、塩析、透析、イオン交換
樹脂、アフイニテイクロマトグラフ処理等一般的
酵素精製法によりサイクロデキストリン グルカ
ノトランスフエラーゼを単離することができる。
次に、本発明を実施例及び試験例により詳しく
説明する。
創製例
変異バチルス・ズブチリスの創製
バチルス・マセランスIAM1243株をフスマ培
地（６％フスマ抽出液、0.5％マルト エキスト
ラクト、0.5％イースト エキストラクト、0.5％
ポリペプトン、0.05％塩化カルシウム）で48時間
培養し、遠心分離にて集菌、洗浄し、得られた菌
体からSaito、Miuraの方法（Saito、H.and
Miura、K.、Biochem.Biophys.Acta、72、619、
（1964））によつて染色体をDNAを分離し、これ
をトリス塩酸・EDTA緩衝液に溶解し、制限酵
素Sau3AI（宝酒造社製品）を添加して、37℃で部
分分解した後、分解物からシヨ糖密度勾配超遠心
法で約2kb以上の染色体断片を分離、取得した。
用いたフアージベクターλD69（東京大学医科学
研究所より分譲）の概略開裂地図は第１図に示し
たが、このフアージλD69は38.8kbで制限酵素
BamHIによつて１個所切断されるものである。
BamHIで１箇所切断したλD69と前期のバチル
ス・マセランスIAM1243株から得られた約2kb以
上の染色体断片を混合し、T4DNAリガーゼを添
加して連結処理した（Weiss、B.、Sablon、A.
J.、Live、T.R.、Fareed、G.C.and
Richardson、C.C.、J.Biol.Chem.、243、4543、
（1968））。処理液を、イン ビトロ パツケイジ
ング キツト（宝酒造社製品）に添加して、イン
ビトロ パツケイジング法（Horn、B.、
Methods in Enzymology、68、299、（1979））
により当該DMAをフアージ粒子に導入した。こ
のフアージ粒子をエシエリヒア コリSM32の菌
体懸濁液に添加し、１％可溶性澱粉、1.2％の寒
天を含むλ培地（バクトトリプトン10ｇ、
NaCl2.5ｇを水１に溶解）に添加して35℃で培
養し、出現したプラークにヨウ素液を噴霧して、
ヨウ素反応を起こさなかつたフアージをサイクロ
デキストリン グルカノトランスフエラーゼ生産
フアージとして分離することができた。
得られたサイクロデキストリン グルカノトラ
ンスフエラーゼ生産フアージを単離し、これをエ
シエリヒア・コリSM32とともにλ培地で37℃で
培養した。培養液を遠心分離して宿主菌体を除
き、ポリエチレングリコールを加えてフアージ粒
子を凝集させたのち、遠心分離によつてフアージ
粒子を集め、新規なフアージを得た。このフアー
ジをλCDと名づけた。
このフアージ粒子を、50％ホルムアミドを含む
フアージ懸濁用緩衝液に対して透析し、λCDフ
アージDNAを得た。フアージλCDDNAは49.8kb
の大きさで、そのフイジカルマツプ（制限酵素切
断地図）を第２図を示す。ここで白ぬきの部分は
ベクターλD69由来で、黒塗りの部分は染色体断
片部分である。各略記号はすべて制限酵素であ
る。
このフアージλCDDNAを 32Pでラベルし、バ
チルス・マセランスIAM1243株染色体DNA、エ
シエリヒヤ・コリSM32株染色体DNAおよびα
−アミラーゼ高生産株バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）NA64染色体DNAのそれぞ
れのEcoRI分解物とサザンハイブリダイゼーシヨ
ン（Southern、E.M.、J.Mol.Biol.、98、503、
（1975））を行つたところ、エシエリヒヤ・コリ、
バチルス・ズブチリス染色体DNAとは全くハイ
ブリダイズしなかつたが、バチルス・マセランス
IAM1243株の染色体DMAとは２箇所で特異的に
ハイブリダイズしており、クローン化した遺伝子
はバチルス・マセランスIAM1243株由来である
ことが確かめられた。
ここに得られたλCDフアージDNAをトリス塩
酸・EDTA緩衝液に溶解し、制限酵素Sau3AI
（宝酒造社製品）を添加し、37℃で部分分解し、
37℃で部分分解した。分解物からシヨ糖密度勾配
超遠心法で約2kb以上の染色体断片を分離、取得
し、プラスミドpUB110を用いて再クローン化を
図つた。
再クローン化に用いたプラスミドpUB110の概
略開裂地図は第３図に示すが、このプラスミド
pUB110は4.5kbでカナマイシン耐性（Kmr）を
有し、制限酵素BamHIによつて１箇所切断され
るものである。
Bam HIで１個所切断したpUB110と前記の
λCDフアージから得られた約2kb以上の染色体断
片を混合し、T4DNAリガーゼを添加して連結処
理した。この処理液を用いてバチルス・ズブチリ
スNA64株を宿主とするプロトプラスト形質転換
法（Chang、S.、Cohen、S.N.、Mol.Gen.
Genet.、168、111、（1979））を行い、当該プラス
ミドを導入した。
得られた形質転換処理菌体を選択培地である可
溶性澱粉１％、カナマイシン100μｇ／ml、寒天
0.8％を含むDM3倍地（５％バクトカザミノ酸
100ml、1Mクエン酸ナトリウム（PH7.3）500ml、
3.5％リン酸水素二カリウム50ml、1.5％リン酸二
水素カリウム50ml、10％酵母エキス50ml、20％グ
ルコース25ml、IM塩化マグネシウム20ml、２％
牛血清アルブミン５mlを混合）に添加して37℃で
培養し、カナマイシン耐性株を得た。このカナマ
イシン耐性株をカナマイシン10μｇ／ml、１％可
溶性澱粉を含むLG倍地（バクトトリプトン10ｇ、
酵母エキス５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース２ｇを１
の水に溶解）にて37℃で24時間培養し、培養液
中のサイクロデキストリンの有無をペーパークロ
マトグラフイーおよび高速液体クロマトグラフイ
ーによつて調べた。
ペーパークロマトグラフイーは培養液をｎ−ブ
タノール／ｎ−プロパノール／水（３／５／４）
の溶媒系で60℃、２回上昇展開を行つたのち、90
％アセトンのヨウ素溶液にペーパークロマトグラ
ムを浸してサイクロデキストリンの呈色を検索
し、発色したものをサイクロデキストリン グル
カノトランスフエラーゼ分泌株として分離するこ
とができた。
得られたサイクロデキストリン グルカノトラ
ンスフエラーゼ生産菌株を単離し、これをカナマ
イシン10μｇ／mlを含むLG培地で37℃で培養し、
培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体
からアルカリ抽出法（Birnboim、H.C.and
Doly、J.、Nucleic Acids Res.、７、1513、
（1979））によつてプラスミドを分離、探索して新
規なプラスミドを得た。このプラスミドをプラス
ミドpD10と名づけた。
プラスミドpDS10は6.7kbの大きさで、そのフ
イジカルマツプ（制限酵素切断地図）を第４図に
示す。ここで白ぬきの部分はベクターpUB110で
由来で、黒塗りの部分は染色体断片部分であり、
各略記号はすべて制限酵素である。
試験例 １
サイクロデキストリン グルカノトランスフエ
ラーゼの生産
バチルス・ズブチリスNA64−pDS10をカナマ
イシン10μｇ／mlを含むLG培地を用い、500ml容
の坂口フラスコに100ml分注し、37℃で30時間振
とう培養した。その間培養物を１mlずつ採取し
て、培地中のサイクロデキストリン グルカノト
ランスフエラーゼの活性を測定した。
第５図は、サイクロデキストリン グルカノト
ランスフエラーゼ活性の経時的変化を示すもので
ある。ここでＡは菌の生育、Ｂはサイクロデキス
トリン グルカノトランスフエラーゼ活性を示し
ている。
第５図から明らかなように、サイクロデキスト
リン グルカノトランスフエラーゼ活性は培養後
12時間で最高値に達する。
実施例
LG培地の組成
バクトトリプトン 10ｇ
酵母エキス ５ｇ
NaCl ５ｇ
水 １
カナマイシン 10mg
バチルス・ズブチリスNA64−pDS10（FERMP
−7959）を上記培地100mlを入れた500ml容坂口フ
ラスコ２本に接種し、37℃で一液振とう培養し、
種培養液を得た。
前記と同じ組成の培地20を入れたジヤーフア
ーメンターに種培養液200mlを添加し、37℃で15
時間通気かくはん培養した。得られた培養液を遠
心分離することにより菌体を除き培養ろ液19を
得た。
この培養ろ液に200ｇのトウモロコシ澱粉を加
え、５℃で一晩かくはんしてサイクロデキストリ
ン グルカノトランスフエラーゼを吸着させた。
澱粉を１の33％エタノールで洗浄し、ガラスフ
イルターで減圧ろ過してエタノール溶液を除い
た。
澱粉を１の蒸留水に懸濁し、50℃で15分かく
はんして酵素の脱着を行つた。
澱粉をろ別し、１ｍＭ塩化カルシウムを含む
0.05M酢酸緩衝液（PH6.0）で平衡化したDEAE−
セルロースカラムを用いてカラムクロマトグラフ
イーを行つた。溶出は同緩衝液を用い、０〜
0.5M食塩の濃度勾配法にて行つた。活性の有る
区分を集め、コロジオンバツグで１ｍＭ塩化カル
シウム溶液中にて透析し、蛋白濃度３〜４％にま
で濃縮した。
この濃縮酵素液に１ｍＭ塩化カルシウムを含む
飽和硫安溶液を滴下した。約0.1飽和でわずかに
白濁したので、少量の１ｍＭ塩化カルシウム溶液
を加えて透明にして３〜５℃で放置した。４週間
後に結晶をガラスフイルター上に取り出し、１ｍ
Ｍ塩化カルシウム溶液で洗浄した後、結晶を集め
て１ｍＭ塩化カルシウム溶液中に懸濁して凍結
し、精製酵素とした。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Generally, bacteria of the genus Bacillus and Klebsiella have been used as cyclodextrin glucanotransferase producing bacteria. However, its production was small and unstable, and the medium contained many impurities, making it difficult to degrade and purify cyclodextrin glucanotransferase. The inventors have discovered that Bacillus macerans
We succeeded in cloning the cyclodextrin glucanotransferase structural gene of Bacillus macerans in Bacillus subtilis, and when we cultured this mutant strain, we were able to stably produce cyclodextrin glucanotransferase in a short period of time. This is what was created. The present invention involves culturing Bacillus subtilis into which a plasmid containing DNA encoding cyclodextrin glucanotransferase derived from Bacillus macerans is introduced, and collecting cyclodextrin glucanotransferase from the culture. This is a unique method for producing cyclodextrin glucanotransferase. Bacillus subtilis that produces the cyclodextrin glucanotransferase used in the present invention can be created as follows. The cyclodextrin glucanotransferase gene is prepared as follows. Bacillus macellans strain IAM 1243 is known as a bacterium that secretes cyclodextrin glucanotransferase to the outside of the bacterial body. Saito, Miura method (Saito, H. and Miura,
K., Biochem.Biophys.Acta, 72, 619, (1964))
Prepare chromosomal DNA by This restriction enzyme
Partially digest with Sau3AI, and separate chromosomal DNA fragments of approximately 2 kb or more from the digested product using sucrose density gradient ultracentrifugation. Separately, extract Phage γD69 DNA with the restriction enzyme BamHI.
, mix this with the previous chromosomal DNA fragment,
Furthermore, T4 DNA ligase is added to perform the ligation process. Using this treatment solution, the in vitro packaging method (Horn, B., Methods in Enzymology,
68, 299, (1979)) to form λ phage particles, and the λ phage particles were added to a culture suspension of Escherichia coli SM 32 to increase the ability to produce cyclodextrin glucanotransferase. Obtain specialized transducing phages containing From the obtained special transduction phage particles, λ phage DNA containing the cyclodextrin glucanotransferase gene is prepared. This DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI,
The hybrid is ligated to the restriction enzyme BamHI cut portion of plasmid pUB110 using T4 ligase.
Obtain a plasmid mixture. This mixture was used for Bacillus subtilis heprotoplast transduction (Chang, S. and Cohen, SN, Mol. Gen. Genet.
168, 111, (1979)). Among the transformed strains, a strain having kanamycin resistance (10 μg/ml) and cyclodextrin glucanotransferase activity is selected. This strain was cultured, and plasmid pDS10 was obtained from the cultured cells. The physical map (restriction enzyme cleavage map) of plasmid pDS10 is shown in Figure 4, where the white part is derived from vector pUB110, the black part is the chromosomal cut part, and the size of this cloned cut fragment. is approximately 2.2kb. The transformant obtained here is an excellent mutant Bacillus subtilis that can stably secrete cyclodextrin glucanotransferase outside the bacterial cell. This bacterium is Bacillus subtilis NA64-pDS10 (FERMP-
7959) and has been deposited with the Institute of Fine Technology. This mutant Bacillus subtilis is completely new in terms of productivity of cyclodextrin glucanotransferase, and is extremely useful for industrial production of cyclodextrin glucanotransferase. In the present invention, the target cyclodextrin glucanotransferase is produced by culturing this mutant Bacillus subtilis in liquid. Any medium used for culturing Bacillus subtilis may be used; carbon sources include starch, liquefied starch, glucose, glycerin, molasses, blackstrap molasses, etc., and nitrogen sources include various protein decomposition products. , soy flour, meat extract, peptone,
Examples include urea, nitrates, ammonium salts, yeast extract, and cornstarch liquor, and other nutrients such as biotin and trace metals are used as appropriate. Cultivation is carried out at 37°C with aeration.
Cyclodextrin glucanotransferase in the medium reaches its maximum accumulation after 12 to 20 hours of culture, so the culture is terminated at this point and the culture solution is centrifuged to remove bacterial cells. From the obtained culture filtrate, cyclodextrin glucanotransferase can be isolated by general enzyme purification methods such as salting out, dialysis, ion exchange resin, and affinity chromatography. Next, the present invention will be explained in detail using Examples and Test Examples. Creation example Creation of mutant Bacillus subtilis Bacillus macerans strain IAM1243 was grown in bran medium (6% bran extract, 0.5% malt extract, 0.5% yeast extract, 0.5%
Polypeptone, 0.05% calcium chloride) was cultured for 48 hours, collected by centrifugation, washed, and the obtained bacterial cells were collected using the method of Saito and Miura (Saito, H. and
Miura, K., Biochem.Biophys.Acta, 72 , 619,
(1964)) was used to separate chromosome DNA, dissolve it in Tris-HCl/EDTA buffer, add restriction enzyme Sau3AI (Takara Shuzo Co., Ltd.), partially degrade it at 37°C, and then remove the degraded product from the DNA. Chromosome fragments of approximately 2 kb or more were isolated and obtained using sucrose density gradient ultracentrifugation. The schematic cleavage map of the used phage vector λD69 (provided by the Institute of Medical Science, the University of Tokyo) is shown in Figure 1.
It is cut at one place by BamHI. λD69 cut at one site with BamHI was mixed with a chromosome fragment of approximately 2 kb or more obtained from early stage Bacillus macerans strain IAM1243, and ligated by adding T4 DNA ligase (Weiss, B., Sablon, A.
J., Live, TR, Fareed, GCand
Richardson, C.C., J.Biol.Chem., 243 , 4543,
(1968)). The treatment solution was added to an in vitro packaging kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) to perform the in vitro packaging method (Horn, B.,
Methods in Enzymology, 68 , 299, (1979))
The DMA was introduced into the phage particles. The phage particles were added to a bacterial cell suspension of Escherichia coli SM32, and a lambda medium containing 1% soluble starch and 1.2% agar (10 g of Bactotryptone, 10 g of Bactotryptone,
2.5g of NaCl dissolved in 1 part of water) was incubated at 35°C, and the iodine solution was sprayed on the plaques that appeared.
Phage that did not undergo an iodine reaction could be isolated as cyclodextrin glucanotransferase producing phages. The resulting cyclodextrin glucanotransferase producing phages were isolated and cultured with Escherichia coli SM32 in lambda medium at 37°C. The culture solution was centrifuged to remove host cells, polyethylene glycol was added to aggregate the phage particles, and the phage particles were collected by centrifugation to obtain new phages. This phage was named λCD. The phage particles were dialyzed against a phage suspension buffer containing 50% formamide to obtain λCD phage DNA. Phage λCDDNA is 49.8kb
The physical map (restriction enzyme cleavage map) is shown in Figure 2. Here, the white part is derived from vector λD69, and the black part is a chromosome fragment. All abbreviations are restriction enzymes. This phage λCDDNA was labeled with 32P , and Bacillus macerans strain IAM1243 chromosomal DNA, Escherichia coli strain SM32 chromosomal DNA and α
−EcoRI-digested products of high amylase producing strain Bacillus subtilis NA64 chromosomal DNA and Southern hybridization (Southern, EM, J.Mol.Biol., 98 , 503,
(1975)), Esierhija Koli,
It did not hybridize at all with Bacillus subtilis chromosomal DNA, but Bacillus macerans
It specifically hybridized with the chromosome DMA of strain IAM1243 at two locations, and it was confirmed that the cloned gene was derived from Bacillus macerans strain IAM1243. The obtained λCD phage DNA was dissolved in Tris-HCl/EDTA buffer, and the restriction enzyme Sau3AI was added.
(Takara Shuzo product), partially decomposed at 37℃,
Partially decomposed at 37°C. A chromosomal fragment of approximately 2 kb or more was isolated and obtained from the digested product using sucrose density gradient ultracentrifugation, and recloned using plasmid pUB110. A schematic cleavage map of plasmid pUB110 used for recloning is shown in Figure 3.
pUB110 is 4.5 kb, has kanamycin resistance (Km r ), and can be cut at one site with the restriction enzyme BamHI. pUB110 cut at one site with Bam HI and the chromosome fragment of about 2 kb or more obtained from the λCD phage described above were mixed and ligated by adding T4 DNA ligase. Protoplast transformation method using Bacillus subtilis strain NA64 as a host using this treatment solution (Chang, S., Cohen, SN, Mol.Gen.
Genet., 168 , 111, (1979)), and the plasmid was introduced. The resulting transformed cells were mixed with selective media of 1% soluble starch, 100 μg/ml of kanamycin, and agar.
DM3 medium containing 0.8% (5% Bactocazamino Acid
100ml, 1M sodium citrate (PH7.3) 500ml,
3.5% dipotassium hydrogen phosphate 50ml, 1.5% potassium dihydrogenphosphate 50ml, 10% yeast extract 50ml, 20% glucose 25ml, IM magnesium chloride 20ml, 2%
(mixed with 5 ml of bovine serum albumin) and cultured at 37°C to obtain a kanamycin-resistant strain. This kanamycin-resistant strain was grown in LG medium containing kanamycin 10 μg/ml, 1% soluble starch (Bactotryptone 10 g,
5g of yeast extract, 5g of NaCl, 2g of glucose in 1
(dissolved in water) at 37°C for 24 hours, and the presence or absence of cyclodextrin in the culture solution was examined by paper chromatography and high performance liquid chromatography. For paper chromatography, the culture solution is n-butanol/n-propanol/water (3/5/4).
After two upward developments at 60°C in a solvent system of 90
A paper chromatogram was immersed in a % acetone iodine solution to search for the coloration of cyclodextrin, and those that developed color were able to be isolated as cyclodextrin glucanotransferase-secreting strains. The obtained cyclodextrin glucanotransferase producing strain was isolated and cultured at 37°C in LG medium containing 10 μg/ml of kanamycin.
The culture solution was centrifuged to collect bacteria, and after washing, the isolated bacteria were extracted using an alkaline extraction method (Birnboim, HCand
Doly, J., Nucleic Acids Res., 7 , 1513.
(1979)), the plasmid was isolated and searched, and a new plasmid was obtained. This plasmid was named plasmid pD10. Plasmid pDS10 has a size of 6.7 kb, and its physical map (restriction enzyme cleavage map) is shown in FIG. Here, the white part is derived from vector pUB110, and the black part is the chromosome fragment part.
All abbreviations are restriction enzymes. Test Example 1 Production of cyclodextrin glucanotransferase 100 ml of Bacillus subtilis NA64-pDS10 was dispensed into a 500 ml Sakaguchi flask using LG medium containing 10 μg/ml of kanamycin, and cultured with shaking at 37°C for 30 hours. . During this time, 1 ml of the culture was collected and the activity of cyclodextrin glucanotransferase in the medium was measured. FIG. 5 shows changes over time in cyclodextrin glucanotransferase activity. Here, A indicates bacterial growth and B indicates cyclodextrin glucanotransferase activity. As is clear from Figure 5, the cyclodextrin glucanotransferase activity was
It reaches its maximum value in 12 hours. Example Composition of LG medium Bactotryptone 10g Yeast extract 5g NaCl 5g Water 1 Kanamycin 10mg Bacillus subtilis NA64-pDS10 (FERMP
-7959) was inoculated into two 500 ml Sakaguchi flasks containing 100 ml of the above medium, cultured in one solution with shaking at 37°C,
A seed culture solution was obtained. Add 200 ml of seed culture solution to a jar fermenter containing 20 mL of medium with the same composition as above, and incubate at 37℃ for 15 minutes.
Cultured with aeration and agitation for hours. The resulting culture solution was centrifuged to remove the bacterial cells and a culture filtrate 19 was obtained. 200 g of corn starch was added to this culture filtrate and stirred overnight at 5°C to adsorb cyclodextrin glucanotransferase.
The starch was washed with 33% ethanol (1) and filtered under reduced pressure through a glass filter to remove the ethanol solution. Starch was suspended in distilled water (1) and stirred at 50°C for 15 minutes to desorb the enzyme. Starch is filtered out and contains 1mM calcium chloride.
DEAE− equilibrated with 0.05M acetate buffer (PH6.0)
Column chromatography was performed using a cellulose column. The same buffer was used for elution, and the elution was carried out from 0 to
The concentration gradient method using 0.5M sodium chloride was used. The active fractions were collected and dialyzed in a 1mM calcium chloride solution using a collodion bag, and concentrated to a protein concentration of 3-4%. A saturated ammonium sulfate solution containing 1 mM calcium chloride was added dropwise to this concentrated enzyme solution. At about 0.1 saturation, the mixture became slightly cloudy, so a small amount of 1mM calcium chloride solution was added to make it clear, and the mixture was allowed to stand at 3-5°C. After 4 weeks, the crystals were taken out on a glass filter and 1 m
After washing with M calcium chloride solution, the crystals were collected, suspended in 1 mM calcium chloride solution, and frozen to obtain purified enzyme.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図はフアージλD69のフイジカルマツプ
（制限酵素切断地図）、第２図はフアージλCDの
フイジカルマツプ、第３図はプラスミドpUB１
１０のフイジカルマツプ、第４図はpDS１０のフ
イジカルマツプをそれぞれ示している。第５図は
試験例におけるサイクロデキストリン グルカノ
トランスフエラーゼ活性の経時変化および菌の生
育を示すグラフである。
Figure 1 is the physical map of phage λD69 (restriction enzyme cleavage map), Figure 2 is the physical map of phage λCD, and Figure 3 is the plasmid pUB1.
Figure 4 shows the physical map of pDS10. FIG. 5 is a graph showing changes over time in cyclodextrin glucanotransferase activity and bacterial growth in test examples.