JPH03505522A - 放射線／微生物による生物検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物検定の分野、特に放射線技術又はレーデ−技術を°指紋付は１能を 与える独特の遺伝子工学処理細圃と組み合せて使用して色々な環境媒体中の毒物 を同定し、その濃度を測定する検定に関する。

化学技術によって開発され、人類の利益に資することが意図された生成物が癌発 生の劇的増加の原因となったり、遺伝的健康の長期衰退を引き起こすだろうとい う懸念は古くから社会の色々な階層の中にあった。

突然変異を誘発したり、癌ｔ−発生させたりすることができる天然及び人工毒物 について水、土壌、空気及び食物のような環境媒体を効率的かつ正確に監視する 能力は従って公衆衛生において最も重大な科学的要件の１つである。

分析化学の諸方法、例えばガスクロマトグラフィー、質倉分光分析法及び高圧液 クロマトグラフィーが空気、水又は土壌の各試料を試験するのに有効である。し かし、試料の調製が複雑であシ、また個々の化学物質又は化学物質群の同定及び 定量について異なる検定法を開発しなければならない。更に、１つの化学物質が 存在するという情報とその濃度はその細胞毒又は遺伝子毒の活性を示すものでは ない。これらの試験はヒトの存在に対して合理的な危険評価を行うために生物学 的悪影響が強いか、弱いか、あるいは試料中に存在するかどうかさえ示さない。

発癌物質についての最も広く用いられた細菌試験系３４７−３４９（１９７４） 。アメス検定は逆突然変異に頼るものであるので、突然変異体・デオキシリボ核 酸（ＤＮＡ）遺伝子座は突然変異を起してその野生型配置に戻らなければならな いか、又は抑制されなければならない。従って、このＤＮＡの変化を行うことが できない化学的突然変異原は検出されない。研究者はＯの試験には他の欠点があ ること、具体的に言うと信頼性があり、かつ再現性がある試験管内活性化系を作 る手段を欠くという欠点及び癌に至る可能性がある突然変異性の事象を検出する 手段を欠くという欠点乞認めている。フェルフナ−（Ｆｅｌｋｎｅｔ）のＭｉｃ ｒｏｂｌａｌ　ＴｏｓＬｅｒｓ：Ｐｒｏｂｊ、ｎｇ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｒ ｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、　１７７　（１９８１）。

フェルフナ−は１９７１年に、並立１玉　ｘ−２Σ力」−ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　５ｕｂＬｉｌｌｉｓ）の通常形質転換性菌株は強い突然変異誘発性剤及び発癌 性剤である４−ニトロキノリン−１−オキシド（４ＮＱ○）に短時間暴露するこ とによって回収されるが、−刃組換え及び／又は暗修復不能の他の菌株は回収さ れないＣとを発見した。この回収能又は回収不能は４　ＮＱＯと細胞のＤＮＡと の複合化によるデノボデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成の遮断と直接相関するこ とが見い出された。ロームバツノ・・ニー・ディー（Ｌｏｕｍｂａｃｈ、　Ａ、 Ｄ、）及びフェルフナ−・アイ・シー・の、Ｌ立１已ｘ−ｆ乱１ヱの正常菌株及 び修復欠失菌株中での４−ニトロヤノリンー１−オキシドとＤＮＡとの複合体の 形成、ＭｕｔａＬ、　Ｒｅｓ、、　１５　：　２３’３−２４５（１９７２）。

Ｃの研究の産物はある特定の化学構造は対応する特定の生物学的機能を持つとい う発見であった。この原理に基づいて１つの化学物質の生物学的系、例えば二立 り三　立ヱ二二ｌ細菌に対する影＃を検定済み細胞の形態変化によつＣ求めるこ とができる。

フェルフナ−は１９８１年に彼の初期の研究から導ひかれた原理に基づいて数百 のバチラススデチリスの突然変異体を収集することから微生物による生物検定を 開発した。これらの選択された菌株はそれらを特定の化学物質群、毒素及び放射 線の影響に対して非常に敏感にする特異な遺伝的欠損金付っていた。均一にする こと全可能にするために、これらの菌株から得た突然変異体遺伝子を組換え技術 で野生型（正常）バチラス　スデチリス菌株の同一クローンに導入された。しか して、単一の特性（遺伝子）又は限定された遺伝子の組みでしか異ならない大量 の菌株が産生された。構成菌株は従って同質遺伝子である、即ち単一の定義され た遺伝子以外は同一である。

懸濁液において、及び鏡検法、分光写真法及びコロニー数又は細胞数の計測のよ うな常用の細菌学的方法を用いることによって、４−ニトロキノリン−１−オキ シドのような化学的毒物は細胞分裂を阻害し、細胞の膨潤を誘発し、そして二二 之五　スデチリスのＤＮＡへの結合及びそのＤＮＡにダメージを与えることの結 果として細胞の破壊を引き起す可能性があることが実証された。ロームパツノ・ 及びフェルフナ−の、バチテズＬ左ニュ五の正常及び修復欠失菌株中での４−ニ トロΦノリンー１−オキシド複合体の形成、　Ｍｕ　ｔａ　＊　、二。

多くの化学物質群の分子相互作用のみならず上記のパラメーターも毒性のあるど のような検定化学物質についても特異な応答パターンを示す、フェルフナ−の突 然変異体菌株の証拠となった。フェルフナ−の、発癌原／突然変異原をスクリー ンするバチラス　スデチリΔ系の開発；　ＤＮＡ損傷及び突然変異検定Ｍｉｃｒ ｏｂｉａｌＴｅｓｔｅｒｓ　；　ＰｒｏｂｉｎｇＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｒｃｉ ｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　、　　８９−１２０（１９８１）；ソング（Ｓｏｎｇ）の 、フロコウムアリール発癌原／突然変異原の光活性化及び核酸とのそれらの相互 作用、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅ５ｔｅｒｓ　：　Ｐｒｏｂｉｎｇストレーシス （３ｔｒｅｉｐｓ）の、化学的発癌原の活性中間代謝物のための細歯性突然変異 モニターズ：突然変かしながら、常用のプレート法及び液体法に依存する。

この方法は遺伝予電の応答を監視する許容できる方法トシテ米国エンピロンメン タル・プロテクション・エージエンシー・オフィス・オデ・ベステイシド・プロ グラム−ガイドラインズ（ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅ　Ｒｎｖｉｒｏｎ −ｍｅｎｂａｌ　　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　　Ａｇｅｎｃｙ　　０ｆｆｉｃｅ　 　ｏｆ　　ＰｅｓｔｉｃｉｄｅＰｒｏｇｒａｍ　Ｇｕｉｃｌｅｌｉｎｅｓ）の下 で許容できるとみなされたけれども、その方法は感度、特異性及び現に要求され ている生物検定系を可能にする速度を欠くものであった。

１９７０年代の初期にワイアツ）　（Ｗｙａｂｂ）及び共同研究者はレーザー光 散乱性生物検定法を発見した。細菌の生理学的方法、そして間接的には暴露され た細菌集団の形態に影響を及ぼすかもしれない化合物を含有する水性試料を接種 するのに指数生長相細菌培養が用いられた。散乱光の強度変化についてプロット は散乱角の関数として誘導された。初期の器機使用法はまわシに平行光電増倍検 出器を回転させている、円弧の中心に試料含有キューペットを置くことに基づく ものであった。相対散乱強度の変化を散乱角の関数として示すグラフは示差光散 乱（ＤＬＳ　）パターンと称された。

細限全使用する生物検定は１９７３年５月１日発行のワイアットの米国特許第３ ，７３０，８４２号明細書及び１９７８年７月１８日発行のワイアットの米国特 許第４，１０１．３８３号明細書に開示される。これらの特許明細書には、試験 細菌に由来する試験示差散乱パターンを使用し、次いでそれらパターンを対照細 菌のパターンと比較することによって細菌感度又は抗生物質に対する感受性ｆ： １ｍ１１定する方法が開示される。いずれの文献も潜在的な細胞毒又は遺伝予電 活性を有する毒物をスクリーンし、あるいは毒物を同定、定量することができる 手段を与えるパターンを作り出すことを示すものではない。

１９８５年９月１７日発行のワイアントの米国特許第４，５４１，７１９号明細 書には、散乱した放射線を細菌のような微粒子により十分に定義された２つの散 乱角で測定するレーデ−装置が開示される。細菌の毒性応答は平均散乱強度を平 均することによって測定される。発明者としてワイアットの名が挙げられている 他の特許に、ワイアットの米国特許第４．６９３，６０２号明細書、フィリップ ス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）の米国特許第４．６１６，９２７号明細書、ワイアソト の米国特許第４．６２１，０６３号、同第４．５４８，５００号、同第４．４９ ０，０４２号、同第４，１７３，４１５号、同第３．９２８，１４０号、同第３ ，７７０，３５１号、同第３．７５４，８３０号及び同第３，６２４，８３５号 明細書がある。これらの特許は微粒子を特徴付けるための種々の方法と装置に関 する。

他の生物検定は１９７３年１月２日に発行されたビー　ン（Ｂｅａｎ）の米国特 許第３，７０８，４０２号及び１９７７年１２月６日に発行されたビーンの米国 特許第４．０６１，５４３号明細書にある。Ｏれらの分献には毒性又は遺伝子毒 性を検定することができ、あるいは試験化学物質を同定することができる方法又 は装置は開示されない。

１９８１年１１月１０日に発行さｔ’Ｌ　ｆｃ　シ’）　−（Ｔｈｉｌｌｙ）胞 を試験化学物質に暴露し、プリン類似体の存在下でプレート（ｐｌａシｅ）する 、細菌の細胞中での突然変異誘発検定が開示される。この方法は常用のブレーテ ィング技術に左右され、またある種の特定の化学物質類に対して感度を欠くとい う同じ問題及び実験室の要件が避けられない。

発明の要約 従って、本発明の主たる目的は、化学物質の水準が急性中毒症状を出すには低過 ぎるが、毒性応答又は損傷が何年も慢性的な暴露を受は友後で現われるかもしれ ない環境中の化学物質からの毒性応答を速やかに検出し、測定する生物検定法及 び同装置を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、同質遺伝子の１−復突然変異体とパテラス　スプチ リスの野生型菌株を使用する化学試剤のための特異な示差光散乱（ＤＬＳ）パタ ーンを提供することである。

本発明の更にもう１つの目的は、バチラス　Ｌヱ二ＩＪ　２菌株から特定の化学 物質群に対して応答パターンを確立するのに必要とされる最小の群、即ち１アイ ンセツ）　（１ｓｏｓｅ　ｂ）”を選び出すことである。

本発明は、更にもう１つの目的として、選択された細菌の毒性応答を記録し、Ｏ れらの応答を、これら細菌の既知化学物質に対する応答と比較する手段を提供す るものである。

本発明のもう１つの目的は、遺伝子毒性応答がこの技術状態における他の突然変 異誘発検定によっては検出が困難であったか、不可能でさえあった化合物の毒性 応答を評価する手段を確立することである。

本発明は、これらの細菌を同定済み化学物質によシ処理して毒性をスクリーンし 、かつ試料を同定、定量するときに作シ出されるＤＬＳパターンを１つの基準と して提供するという更に他の目的を有する。

本発明の更に他の目的は、検定細菌に対して害がなく、かつ細菌と混合したとき 光学的に明澄で、そのため放射線が容易に通ることができ、かつ散乱を検出する ことができる、被試験水不溶性試料を可溶化するための媒体を提供することであ る。

本発明の更にもう１つの目的は、ある特定の被試験化学物質類を細菌の細胞で吸 収できるように代謝活性化することを提供することである。本発明の以上の、及 び他の目的はある特定の遺伝子修復機能を欠く細菌のバチラス　スデチリヌ同質 遺伝子菌株、及び示差光散乱性レーデ−系を用いて有毒化学物質に対する特異な 応答を監視することが可能である、修復が効率的な菌株を得ることによって達成 される。これらの応答は次に、例えば急性中毒効果又は遺伝子毒性効果を決定す るために記録される。応答指数として計算されたこれらの数値は次にこれら細菌 菌株の同定済み化学物質試剤に対する既知応答と比較される。この方法はまた被 試験化学物質の存在を定量的に査定することができることを理解しなければなら ない。

本明細書に示される詳細な説明を添は図面と共に考察すると、本発明の開示され た態様のよシよい理解が得られるだろう。この説明において参照数字は図面に説 明されるものと同じ部分について用いられる。

図面の簡単な説明 第１図は請求される発明の方法と装置の模式図である。

第２ａ〜２ｄ図は検定細菌をある特定濃度の４−二トロキノリンーＮ−オキシド （’　４　ＮＱＯ’　）に暴ＩＫｆるときに作シ出される示差光散乱パターンで ある。

第３ａ及び３ｂ図は検定細菌をある特定濃度のＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−トコ −ニトロン−キナジン（’ＭＮＮ（）“）に暴露するときに作シ出される示差光 散乱パターンである。

第４ａ〜４ｄ図は検定細石をある特定濃度のベンゾ（ア）ｔジンに暴露するとき に作ｐ出される示差光散乱ノぐターンである。

第５ａ〜５ｄ図は検定細菌をある特定濃度のリンゾーンに暴露するときに作り出 される示差光散乱パター第１図は試料’！ｉ−請求される発明に従って生物検定 する請求される装置を模式説明するものである。Ｏの生物検定はレーデ−系のよ うな放射線源４よ構成る。好ましい態様において、この放射線源はワイアットの 米国特許第４，５４１，７１９号明細書に開示されるもののようなレーデ−系を 使用し、そしてこれは２つの検出器列に対して面偏光される単色の可視線又は赤 外線を生成させるレーデ−を含む。このレーデ−系は１５個の特異な角度で１秒 当り１２００回の測定を行うことができる。この生物検定は更にバチラス　スプ チリス突然変異体２の１つの同質遺伝子セットを含む。レーデ−は細菌２を懸濁 して含有するキューベット１を照射する。これらの細菌は光を示差的に散乱させ るものである。レーデ−ビームの示差光散乱（ＤＬＳ）　６は角度の関数として の散乱光強度として検出される。１つの態様において、検出器５はそのＤＬＳを 検出し、その信号を記録器７に送る。記録器は散乱強度のプロットをグラフの形 で記録する。もう１つの、俤様において、コンピューター８のような分析装置が 検出器５からデーターを直接受は取る。

散乱光の強度変化はＤＬＳパターンと称され、細菌集　　　　。

団の大きさの分布ばかりでなく細菌の平均の大きさと構造にも依存性である。懸 濁液のＤＬＳパターンは多くの粒子の存在のし方、それらの大きさ、形状及び粒 子の分布を示す。従って、細菌が細胞の収縮、拡大、分裂又は溶解を受けるなら ば、　ＤＬＳパターンは未処理細菌の対照パターンからシフトする。細菌数（ｃ ｏｕｎｂ）はＤＬＳパターンの高さの測度、即′ｃ）最高点として表わされる。

１つのサンプルＤＬＳパターンのピークのシフトは対照パターンと比較しての形 態変化の程度を示す。

ＤＬＳパターンは機械の読取υ性について磁気記録デジタル形を取るＯともでき るし、あるいは散乱強度のパターンを目で読取シ可能なａｍとして表わすような グラフの形で記録することもできることを理解すべきである。

検出器５からのデーターを記録器７に送らない場合にデーターの記入と計算を容 易にするために、デシタル化用のタブレット（図示せず）金円いて各パターンの 曲線をトレースし、同時にＸ座標とＸ座標の連続し九ｆｌｌｔ、れをコンピュー ター８のような分析装置に送る。

説明したように、デジタル化器の使用は集積レーザ−コンピユー系を用いて系に 入る入力をはるかに速やかにし、かつ入力エラーの可能性を避けるようにするこ とによって省くことができる。各態様を第１図に擬似模型の線の接続で示す。

好ましい態様においてはコンブニーター８である分析装置は対照の試料と比較さ れるＤＬＳのシフトと細菌数の変化を表わす応答指数の必要とされる計算を行う 。

導びかれた指数は毒性応答の即時予備表示、ＤＮＡ損傷（遺伝子毒性）の潜在性 及び化合物の同定のためのベチラス　１ユ王細菌の１アイソセツト１の同定にお ける助けとなる。

化学物質試料の濃度は所定の試料に対する細菌による応答レベルで測定される。

生物検定のために選ばれる細菌のセットは各々１つの性質でしか異ならず、そし てそれは、毒性の機構のために、それら細菌をして他のセットの構成細菌よシ敏 感にする。従って、−指絞１即ち各化学物質に特異なフロフィールが構成細菌の 示差応答から作られる。これらの指絞ｔ−”記録すること（ｓｃｏｒｉｎｇ）　 ’によって、生物検定は試験化学物質を同定し、試験化学物質の濃度を査定し、 そして試験化学物質が急性又は慢性毒性であるかどうかを査定するためのデータ ーを与える。

本発明のもう１つの態様では、同定済み試料の生物検定用のＤＬＳパターンと計 算済み応答指数を記憶するライプラリ−９が与えられる。試料のＤＬＳ　ｔ−記 憶されたパター７と比較することによって試料の毒性をスクリーンし、試料の同 定及び／又は定量を行うことができる。

完全な検定の所要時間は約６０〜６６分でちゃ、化学物質試料が存在しない場合 は未処理細菌の所要時間は２度割る。しかし、個々の試料は水性試料中の化学物 質の濃度を測定するのに１分画シ１試料の割シで分析することができる。

細菌 バイオアッセイに使用される細菌は単一種、　ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕＭｉｌｉｓ であシ、これは従来バイオアッセイに使用される他の細菌よシ多くの利点を有す る。第一に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｕｉｌｉｓは最も広く研究されかつ遺伝 学的に地図化されたダラム陽性菌である。　Ｈｅｎｎｅｒ、　Ｄ、Ｊ、及びＨｏ ｃｈ、　Ｊ、Ａ、　Ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　Ｃｈｒｏｍ ｏｓｏｍｅ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｏｖ　４４　：　５７−８２　（１９８０）。

それ故に、これらの生物の形態学、生化学、遺伝学及び生理学は完全に判ってい る。この細菌の形態学的特徴はまたバイオアッセイの感度と再現性の要件に容易 に適応される。その休止形では、Ｅｌａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓは不定 期間の間熱、乾燥又は他の悪い効果に耐えながら遺伝的に変化せずに生存できる 胞子として存在する。

植物細胞としてこの細菌は対数成長相聞に約２６分で急速に分割して二つになシ 、そしてグラム陰性菌、二す二ｙ稔−士一覧工仄■巴ｒ　ｓ、　ｕ三及び４小、 ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉより化学毒物に対してごの段階でずつとよシ感受性で ある。

その適応状態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂシ１ｌｉｓはＤＮＡのような巨大 分子を容易に叡込みそして従来の組換えＤＮＡ技術を介して同−又は他の種のメ ンバーから誘導される遺伝子を一体化できる。

バイオアッセイは遺伝的に同一であるか、又はその作用条件に対して化学的に損 傷されたＤＮＡを修復する独特な酵素修復プロセス又はセント中で一つ又はそれ 以上の遺伝的ブロックを除いて、アイソジェニックであるＢａｃｉｌｌｕｓ　５ ｕｂｔｉｌｌｕ、ｓ突然変異体を使用する。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＬｉｌｌｕｓのアイノゾｘ　＝　７クセツトの中で異 なる組換え（Ｒｅｃ−）　、切除（ｅｘｅ−）、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ−）　、 又は胞子（ｃ復（５ｐｐ−）修復ステップに欠ける菌株が選択される。これらの 菌株は修復ステップの−含む。このグループ中の突然変異体はそれ故に代謝毒性 又は遺伝的毒性（ｇｅｎｏ　Ｌｏｎｉ　ｃ　）活性又はナノモル又はプノグラム 濃度で広範囲の化学物質に対してより感受性である。

これらの方法で多くの１６復プロセス及び多くの酵素ステップがあるので、一定 の化学品がアインゾエニツク突然変異体の特定のもののみに影響して独特なりＬ Ｓは種々の化学突然変異源によジ処理することによシ発現された。例えば、ニト ロソファニシン、強力な変異誘発化学品は細菌の遺伝的構成を変化するために使 用されそしてトリメンプリムはチミンを供給しなければＤＮＡを合成できない変 異体形のため選択される。

Ｆｅ１ｋｎｅｒにより分離された１グループからの変異体をこの文献に論議され るように、従来の遺伝子分析によシ独特なチミン遺伝子欠失がこの細菌の染色体 のどこに位置するか決定された。続いて、紫外光及び発癌性化学品４−ニトロキ ノリン−１−オキシドに異常に感受性である変異体が上リメンプリム処理を使用 することによって分離された。、Ｆｅ１ｋｎｅｒ、　１．Ｃ，ｌ５ｏｌａｔｉｏ ｎａｎｄ　　ＣｈａｒａｃＬｅｒｌｚａＬｌｏｎ　　ｏｆ　　Ｔｈｙｚ工ｎＬｅ ｓｓ　　Ｍｕｔａｔａｎｔｓ　　　ｆｒｏｍＵＩＬｒａｖｉｏｌｅＬ−８ｅｎｓ ｉｂｉｖｅ　　Ｂａｃｉｌ’ｌｕｓ　　ｓｕＭｉｌｉｓ　　５ＬｒｄｉｎｓＪ、 　　Ｂａｃｂｅｒｉｏｌ、　　１　０４　　：　　１　０３０−１０５２（１９ ７０）、。

ＦＨ２００６−７と名けけられたこの菌株は変異体が遺伝的組換えを行なうこと ができなくするチミン座位に遺伝的にリンクした遺伝子゛突然変異金有するＯと が判った。この変異体からの遺伝子は下記の遺伝子型を有するＦＨ２００６−７ 系統が生ずるように、ＤＮＡ分離、取込みそして一体化によシ親の１野生型口萌 株に移された： （１）　　　ｔｒｐ−、ｔｈｙ−、ｈｃｒ−、ｒｅＣ−（２１ｔｒｐ”、Ａｈｙ −１ｈｃｒ−１ｒｅｃ−（３）　ｔｒｐ”、　ｔｈｙ　＋、　ｈｃｒ−１ｒｅｃ −型２及び３はＤＮＡ損傷を検出するｈｃｒ−及びｒｅｃ−突然変異を分析する ために適した変異体である。通常の遺伝エンジニアリング技術により構成される これらの細菌は天然に発生せず又は生存する細菌単離物で生ずる。

このバイオアッセイで使用される１９の菌株の中で、Ｔｒａｖｓｆｏｒｍａｂｉ ｏｎ　　ｏｆ　　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　　５ｔ ｒａｉｎｓｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ｂｇ　ｄｅｏｘｙｒｉ ｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　、　Ｐｒｏｃ。

変異体の残りはこの系統から白米するが、しかし１６：１６５（１９７２）及び Ｔａｎｏｏｘａ　Ｈ，Ｍｕｔａｔ。

される変異株は下記のものによシ供される教示及びそＯに引用される参照文献に 従って従来の遺伝的エンジニアリング及び変換技術の適用を介して得られる；Ｈ ｅｎ１１　ｅ　ｒ　、Ｄ　、Ｊ−及びＨｏｃｈ、　Ｊ、Ａ、、　Ｔｈｅ　Ｂａｃ ｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　Ｒｅｖ、　４４　：　５７−８２　（１９Ｆ３　（３）　；　Ｌａｕ、ｍｂａ ｃｈ、　Ａ−Ｄ−＋　Ｆｅ１ｋｎｅｒ、　１．Ｃ，。

Ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ　　ｏｆ　　ａ　　４−　ｎｉしｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ −１−ｏｔｉｄｅｃｏｍｐｌｅｘ　　ｉｎ　　ｎｏｒｍａｌ　　ａｎｄ　　ｒｅ ｐａｉｒ　　ｄｅｆｉｃｉｅｚし　ｓ　ｂｒａｉｎｓｌ、Ｃ，ｒ　　　ｌ５ｏｌ ａしｉｏｎ　　ａｎｄ　　ＣｈａｒａｃｂｅｒｉｚａＬｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｔｈ ｙｍｉｎｌｅｓｓ（１９７０）　；　Ｆｅ１ｋｎｅｒ、　工、Ｃ６，Ｋａｄｌｕ ｂａｒ、　Ｆ、。

これらの突然変異体のサブセットとして定義されるアイソセットは試験される試 料に対する応答を定めるために必要な最小数を構成する。分別生存試験から得ら れたデー！及びスポットアッセイから得られたデータは放射線バイオアッセイに より一定の化合物を確定するアイソセットを含むためどのＢ、　５ｕｂｔｉｌｉ ｓ菌株を選択すべきかを決定するために使用された。

「−− バイオアッセイに使用されるべきアイソセットメンバー全選択するために一定の 化学試料と共にスポット試験を用いてアイソジェニック突然変異体を予備スフ１ 、Ｃ，ｉｎ　Ｍｅｄｉｎｅ、Ａ、、及びＡｎｄｅｒｓｏＨ、Ｗ、　、　ｅｄｓ　 、　Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉｎｇｓ　　ｏｆ　　　ｔｈｅ　　Ｎａｔ；１ｏｎａｌ　 　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　　ｏｎ　　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅ ｅｒｉｎｇ、　Ａ、ｍ、　Ｓｏｃ、　Ｃ１ｖｉｌ　Ｅｎｇ、、　Ｎ、Ｙ、第２０ ４−２０９頁（１９８３）に開示される方法に従ってＤＮＡ損傷試験を行なう。

約１　×１０７の洗浄しｆｃ胞子を含むディスクから又は胞子形成斜面培養から １龍白金耳蓋でＢｒａｉｎ　ｆ（ｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　（ＢＨｒ）プロ ス５　ｍｌの中に各突然変躾体を接種しそして１６時間３７４９℃でふりまぜに よシ培養した。この培養を０／ｎと名けけた。

１關の接種ループ金剛いて、代破活性化を得るために、ラット肝マイクロシーム 分画（Ｓ−９）で予備培養した又はしなかったアッセイ化学品１０μ／：を含有 する感応ディスクに対して培養寒天上に。／ｎ培養からの接種物を放射状に縞を つけた。３７から６９℃で培養後に、周辺から成長阻害の距離（朋）をバーニア キャリパ−（ＭａｎｏｓＬａシ）ｆ用いて測定する。変動する濃度のアッセイ物 質が使用される場合には、対応する変異体からのデータを使用して、濃度依存成 長阻害曲線を作成できる。特定の化学品は代謝活性化なしにアッセイ細菌に容易 取込１れない。Ｓ−９分画と名付けられた肝マイクロシームはＡｒｏｃｌｏｒ　 ｉ　２５４　（ＬｉｔシｏｎＢｉｏｎｅＬｉｅｓ、　ＣｈａｒｌｅＳシＯｎ、ｓ ｃ　１９４０５　）で誘発されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製 された。このＳ−９分画は２５−２８■／　ｍｌのタンパク質濃度を有するＫ　 Ｃｊホモシエネートとして調製された。この分画はマイクロシーム状又はボスト −マイクロシーム状でアりそして組織の由来によって限定されないことが了解さ 多くの前変異誘発物質／発癌物質は水不溶性である。

それ故に、試験化学品がアッセイ細菌及び親水性Ｓ−９分画と混合できるように ゛カフテール“が得られ、これによシ放射線源と前記の細菌によシ散乱される放 射線のＤＬＳパターンを発生するその性能の干渉を最小にする。この゛カフテー ルゝは水性アッセイ混合物の中に導される前にジメチルスルホンオキシド（ＤＭ ＳＯ）　１エタール又はアセトンを使用する他の公知法により容易に再啓化され なかった水性システムに化学品を可溶化する利点を有する。更に、この°カフテ ール“はアッセイ細菌に無毒性であシそしてＳ−９分画酵素が試験化学品を代謝 することを許す。バイオアッセイの好適具体例は商品名”Ｃ０ＲＥＸＩＴ　７６ ６４０ｉｌ　Ｄｉｓｐｅｒｓａｎｌ；’（Ｅｘｘｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　 Ｃ１ａｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｙ）として販売される分散剤及び商品名’ＥＭ ＴＪＬＰＨＯＲＥＬ　−６２０”　（ＧＡＦＣＯｒｐ、１４０　Ｗｅｓｔ　５　 ｉ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｎｓｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ。

１００２Ｃ１）として販売される非イオン性界面活性剤を使用する。’Ｃ０ＲＥ ＸＩＴ’分散剤と“ＥＭｔＪＬＰＨＯｌ−界面活性剤の両方は現在では容易に入 手可能でありそして一般に化学者及び商業上のニーデーに公知である。これらの 各々の化学組成は各所有者会社によシ業務秘密として保持されている。

この’　ＥＭＴＪＬＰＨＯＲ’界面活性剤はポリオキシレート化植物油である。

２５°Ｃでこれは１，０４から１．０５の比重と６００かう１，０００　ｃｐｓ の粘度を有する透明な淡褐色の液体である。２５°Ｃで、水に容易に溶解性であ シそしてその中和価は０．５最大値である。論議されるように、この組成物がＢ ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｂｉｌｉｕｓに無毒性であることそして試験されるべき 化学品試料、細菌及び親水性Ｓ−９分画と混合される時に、代謝活性化が必要で おるとしても、透過するレーデ−放射線の性能又は散乱する放射線の強度に干渉 しない透明な懸濁液を生ずるのでこの組成物が選択される。

”ｃｏ部ＸＩＴ７６６４’は淡コハク色とアルコール臭を有する界面活性剤エス テルである。１５．６℃で、これは１．０３の比重、８．５９の密度及び２９の 粘度を有する。０れは新しい水と海７ＫＫ可溶性でろりそして炭化水素に分散で きる。論議されるように、これは細菌に無毒性であシそして曇ることなく細菌の 水性懸濁液と混合することができそして懸濁液に透過するレーデ−放射線の性能 に干渉しないので、この化合物は１カクテールーの成分として選択された。

放射線源 バイオアッセイの放射線源はＷｙａＬｔの米国特許第４．５４１，７１９号に開 示されるようなレーデ−である。

この装置は１５の角度位置で散乱強度を記録し、屈折率、寸法及び形状間の関係 を測定することができる。

更に、リードヘッドは陽極処理され、シールされそしてレーザーヘット並びに集 積回路板に直接に結合さ札一体化光学ベンチ及び検知素子のための接地された封 入体を供する。バイオアッセイの好適具体例で使用されるレーず−の仕様書は下 記の通シである：光源：　５　ｍＷ　Ｈｅ−Ｎｅし〜デー、λ＝　６３２．８　 ｎｍ平面偏光 同時にモニタされる角度：　１５　＠　０−２　＜　Ｓｉｎ　Ｏ／２　＜０．０ ５のステップで０．９ コンピュータインターフェイス：１６−チャンネルにインターフェイスされたパ ラレルアナログ出力、１２ビツトＡ／Ｄプログラムできるマルチプレクサ データ回収：１２，５００変換／秒−２５，０００変ル宰シングルパーティクル 測定：濃度＜５Ｘ１０　５／ｍ１寸法（屈折率に応じて）０．６から５０μｍ検 知器二ビルトイン増幅器金有するトランスインピーダンスホトダイオード 検知器出力ダイナミックレンジ：０−１０Ｖダイナミックレンジ：１０４ 直線性：±０．１％ 暗流ノイズ：±０．２　ｍＶ このレーザー装置はバイオアッセイの好適具体例の一部を含むが、本発明の目的 の可能な何れのレーザー装置も含まれることは了解されるべきである。

放射線バイオアッセイ例： ４−二□トロキノリンー１４−オキシド（’　４．ＮＱＯ’　）、Ｎ〜メチル− Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロンークアニシン（’　ＭｋＪＮＧ　’　）　、ベンゾ （ａ）ピレン（“Ｂ（ａ）ｆ）、及び’　Ｌｉｎ＋１ａｎｅ　’　（１ｒ　２　 ｒ　３　＋　４　、５　、６−ヘキサクロロシクロヘキサン）のバイオアッセイ のための例ヲ示す。化学品４　ＮＱＯ及びＭＮＮＧは変Ａ誘発源及び細菌に対す るＤｊｔｌＡ損傷剤として十分に確立されそして水溶性であシ、発癌活住金誘発 する直接作用の遺伝的毒性化学品でろる。化学品Ｂ（ａ）Ｐは水性系に不溶性で ちる周知の前発癌物質／変異誘発源であシそして求電子性となりかつＤＮＡ損傷 又は変異誘発応答を引起こすためにはラット肝マイクロシーム分画（Ｓ−９）Ｋ よる代謝活性化を必要とする。’　Ｌｉｎｄａ−１ｅ　ｌは現在の変異誘発アッ セイによシその遺伝的毒性能力を検定するには難しい化学品である。

好適具体例によりバイオアッセイ全行なうために下記の手順に従う。

１、　適当なりａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕＭｉｌｉｓ菌株と脱水した成長培地を含む 親液性化錠剤″ヲ水含有セルに入れる。下記に示した例に記載した必要濃度で細 菌細胞の懸濁液も使用できる。

２、約３７から３８°Ｃに予め加温しておいた培養室に接穐したセルを入れそし て約１時間から１時間半培養を続けて“アッセイ準備状態°に培養を確立する。

６、　各アッセイ有機体に対して一対のセルを使用してセルの中に試験又は対照 の物質を入れる。試験物質を有しない負の対照とその応答が決定されている濃度 で確認された毒性化学品を有する正の対照が含まれる。

４、　このセルを３７−３９℃で６分間培養しそして各セルで５０回の最小値を 読む（試料当シ全読示時間は６０秒である）。

５．５７−３９°Ｃでの培養を６０から７０分続けそして各セルで５０回の最小 値會再び読む。

６、各試料をスコアし、そして細菌の応答を評価する。

貴　細菌は親液性化植物細胞又はカプセル化の胞子でもよい。しかしながら、胞 子を使用する時には、この形はその安定性の故に好適であり、これは培養前に８ から１０分間６０℃熱シヨツクを加えねばならない。

別の手順は下記の通りである。

１、　水溶液で試料全可溶化する。水不溶性試料に対して十分量の９カクテール Ｉを使用（７て試料の沈殿を阻止する。

２、可溶化した試料から連続的な希釈を作る。

３゜　水を含有するセルに細菌胞子と脱水した栄養培地を含有するカプセルを加 える。

４、細菌を含有するセルに測定量の各可尋化試料希釈を加えそしてインキュベー タ中のセルｅ３７−３９℃におく。試験物質を有しない負の対照とその応答が決 定されている濃度で毒性化学品を有する正の対照を含有させる。

５．０．６及び６６分で試料を読んで各希釈に対してパーティクルの数の増加で 示される相対成長をフォローする。

６６　　各試料希釈と対照をスコアする。

７゜　このスコアデータを公知の化合物のスコアデータと比較してマツチする応 答ｆｏフィルを決定する。

８、公知の線量応答曲線から濃度を決定する。試料が未知である場合には、マツ チする化学品応答全探してその同一性と濃度を決定する。

負の対照は４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド又は４−ニトロキノリン−１−オ キシドに露出された細菌の対照試料を含みそして正の対照はベンゾ（ａ）ビラン に露出でれた細菌金言むことは了解される。

バイオアッセイに対して濃度で適切な細菌細胞の培養は２０分間Ｂｒａｉｎ　Ｈ ｅａ、ｒＬ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　（ＢＨＩ）プロス１ゴ中のＢａｃｉｌｌｕｓ　 ５ｕｂＬｉｌｉｓのヒートショツキング菌株を含む。０．２　（、Ａ、）　５４ ０の吸光度が得られるまで余分のプロスを加える。細菌成長が０．５のＡ（５４ ０）に到達するまで約２時間の間培養を３７−３９℃に保つにの密度に達するた めよシ長い時間を必要とする培養はバイオアッセイに適していると思われない。

好適であることが判った培養はＢＨＩグロスで０．３ＯＡ（５４０）に希釈され て約２×１０’細菌／ゴを生ずる。セルアッセイに必要な量で希釈された時にＯ れらの細胞は１０６細笛／ＩＩＬ／の細胞濃度を生ずる。

／ｎｌの最終濃度で４　ＮＱＯ’ｉ検定した。これらのアッセイの各々に対する ＤＬＳパターンは第２ａ図から第２ｄ図を構成する。

菌株６及び１１を用いて３．６μｇ／ｌの最終濃度でＭＮＮＧを検定し九。こｎ らのアッセイの各々に対するＤＬＳパターンは第３ａ図及び第６図を構成する。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＬｉｌｉｓ菌株ＦＨ２００６−７（１０）及び１１を 使用して５３．６μｇ／ゴ及び１０７μｇ／ｒｄの最終濃度でＬｉｎｄａｎｅを 検定した。Ｏれらのアッセイの各々に対するＤＬＳパターンは第５ａ図から第５ ｄ図を構６７から６９°Ｃで脱イオン水１３．６ｆｆｌ／’に含有するねじキャ ップ管に細菌０．３　ｍｌ及び試験化学品Ｑ、ｉｉ／をピペットで入れる。この 管を徐々に反転して、その内容物をセルの中に注入する。このセルをレーデ−で 照射しそして散乱した光の強度を測定しかつスコアした。

次に約１時間３７−３９°Ｃでこのセルを培養しそして同様に照射する。脱イオ ン水中の細菌の負の対照をまた同時に検定して各菌株に対する基線値を供する。

またアッセイ期間中成長を支持する十分な脱水したＢＨＩを有する親液性化細菌 を使用してこの方法を実施した。セルからの読みを得るのに必要な液体の総量は １０ゴである。そル故に、約３．４ｍ／の容量の液体がセル培地に再水和する。

培養時間は変更されないままであり、そして照射は１５分間隔で行なわれる。

２、代謝活性化と共にバイオアッセイ（予備培養）−化合物及び＃Ｂ菌菌性イソ セット ：ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＬｉ１ｉｓ菌株１１及びＴＫＪ６３２１（１９）を使 用して１５．１及び７．６　ｐｇ／　ｍｌの最終濃度でＢ（ａ）Ｐを検定した。

方法： 犬ぎなキャップは試験管に’Ｃ０ＲＥＸＩＴ”及び’ＥＭＵＬＰＨＯＲ”各ｈＱ 、５ｍｌ、適尚な濃度でＢ（ａ）Ｐ　、　Ｓ　−９分１．１ｌｊＯ，５ｍ／及び 細菌０．３ゴをピペットで入れた。３７℃に予め加温した脱イオン水で容量ｔ１ ４ｍｔｖｃｍ節した。試験されるべき試料と同一の比率によシ’　Ｃ０ＲＥＸＩ Ｔ　’、“ＥＭＴＪＬＰＨＯＲ’　、　Ｓ　−９分画及び脱イオン水を含有する 各菌株に対する対照管ｔ−調製した。この管を約１時間ふシまぜ水浴で培養した 。培養後に、内容物をセルに注　　　　“入しそして散乱された強度を測定しか つスコアし、これらの読みは前記のようにゼロ及び６０分で得られる。

親液性化細菌と成長培地を使用する時には、前記の細菌のより小さい容量を使用 して試験化学品で細菌を処理する前に１時間で所望の初期濃度を得る。

’Ｃ０ＲＥＸＩＴ’　、　’ＥＭＩＪＬＰＨＯＲ’及びＳ−９分画の容量は各々 試料５　ｍｌ当り約１８０μｇである。

３、代謝活性化と共にバイオアッセイ（セル培養）−化合物及び細厘アインセッ ト： Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂＬｉｌｉｓ菌株１１及びＴＫ、Ｔ　６３２１　（１９ ）を使用して１５．１及び７．６　μｇ　／　ｍｌ　ｃＤ最終１度でＢ（ａ）Ｐ を検定した。このアッセイによシ生じたＤＬＳパターンは第４ａ　−４ｄ図を構 成する。

方法： 細菌とＳ−９分画の水性培養混合物の中に導入した時にＢ（ａ）Ｐの沈殿を阻止 するように十分な容量のＣｏｒｅｘｉ　ｔを走査セルの中にピペットで入れた。

３７℃に予め加温した脱イオン水１４ｍ１の総量でＳ−９分画０．５ｄと細ｇｏ 、３ｍｌと共にセルの中に°Ｃ０ＲＢＸＩＴ’−Ｂ（ａ）Ｐ混合物を導入した。

各菌株に対する同時の対照管をまた調製した。前記のようにセルを読みそして散 乱した強度をゼロと６０分でスコアした。

別法では、Ｓ−９分画と細菌の添加の前に、　’　Ｃ０ＩＸｒＴ　−’ＥＭＵＬ ＰＨＯＲ’及び水の水性カクテールｔ−調製する。従って、’　ＥＭＵＬＰＨＯ Ｒ’及び’Ｃ０ＲＥＸＩＴ’各ｋ　１８０．μｇを脱イオン水苔５ゴに加えそし て混合する。アッセイの時に、１０６細菌／　ｍｌの細胞濃度を得るのに必要な 適当量の親液性化細菌と培地と共にＳ−９分画１８０μｔを加える。

応答評価： バイオアッセイのスコアリング技術は細菌数の関数としてＤＬＳパターンの高さ 及び化学品試料パターンと対照Ｅ料パターンのピークのシフトの量を測定して細 菌の寸法と形状の形態学的変化の程度を決定する。得られた指標は毒性応答、Ｄ ＮＡ損傷（遺伝的毒性）能力の直接の予備表示を供し、そして化合物確定のため アイソセットを確認する。

各パターンの高さの測定は細菌数の指示を供し、それ故に埠性の重要なインジケ ータである。

形態学的変化の確定のためスコアリング技術を開発する際に、パター７の開始か らその最後まで閉じたインターバルで連続している関数があることに注目された 。弓形を形成し、そしてＸ軸上の各点と関係づけられる二つの隣接点間の各ライ ン部分はパターン上の一点のみである。ディジタル化タブレットを使用して、す べての隣接点間の距離の合計がパターンの長さに近似するように十分に多数の点 を得ることが可能である。

これは曲線の弓形長さとして定義された。弓形長さのパリアンスは細菌形態学に おけるパリアンスと対応し、特にこれは個々の細胞寸法に関連する。一定の濃度 で化学品による一定の処理に対する応答を単純化するために、３デイゾツトを使 用するシステムを開発し、その各々が応答に対するインジケータである。この応 答の性質は細菌集団に関する効果の型式の関数としてパターン変位の高さと方向 によシ１から４の数値に割り当てられる。一連の処理を表示するため、基線対照 試料の数置化とパターンを測定した。続く処理及び対照の試料を基線応答に比較 した。

指標計算： 下記のＪＡ序で四つのパターンをディジタル化した二〇及び６０分で対照：０及 び６０分で処理した試料。

順次に各パターンに対して、弓形曲線として曲線上の隣接の点間の距離を計算す ることによって応答指標を決定した。細菌数指標に対してすべての座標の対の平 均Ｙを計算した。ｔ　Ｏａ時で対照を基線対照として表示した。他の曲線の各々 に対して、パターンの平均Ｙと基線パターンの平均Ｙ間の百分率変化を計算した 。

第４番目Ｙ指標に対して、Ｙ百分率変化１−５で割り、そしてこの変化が正であ る場合には１を加えた。変化が負である場合には１を引いた。最終整数値を保っ た。

試験パターンの弓形長さと基線パターンの弓形長さ間の百分率変化を計算した。

第４番目弓形指標を決定するため、弓形百分率変化を５で割り、変化が正の場合 には１を加えた。変化が負である場合には、１を引いた。整数値を保った。

ＰＲＩ指標で左から右へ、三つのディジットの各々はパターンの第４番目指標に よシ下記の表から得られ、参照として０時での対照及び第１デイジントとして６ ０分で対照で開始する。

ディジット対デイゾットベースによって行なわれる生物学的解釈は下記の通りで ある： ′１″は細面の寸法の同時の減少（正のシフト）と共に細菌数の正の増加、及び 非毒性応答を示す。

°２°は寸法で同時の増加（負のシフト）と共に細菌数で正の増加、及び最小の 毒性応答を示す。

“６″は寸法で同時の増加（負のシフト）と共に細菌数で減少、及び毒性と致死 の応答を示す。

°４″は寸法で同時の減少（正のシフト）と共に細菌数で減少、及び毒性と致死 の応答を示す。

指標化パターンの各々に対する第６の応答は第２応答指標を第４番目弓形指標と 掛けるＣとによって得られた。第２応答指標（ＳＲＩ）はすべての組合わされた 指標化パターンに対する第３指標の合計の計算により決定された。計算のこの方 法をアッセイから得られた下記のデータにより例示するニ ア１２．０２０６４．ＯＮ／Ａ　　Ｎ／、Ａ　　Ｎ／Ａ　　Ｎ／Ａ９７４．７２ ２１７．６３６．８９７．４４　　８　　２　　１６６９７．４２０１３．９− ２．０５２．４３　−１　−１　　１８２４．６２０３０．５１５．８１−１− ６３　４　−１　　−４　　１３　　ＥＳ２１３２のＰＲＩの解釈は６６分の対 照は正常の成長を示し、従って第１のディジットとして数１である。０時で処理 試料は寸法増加を伴って細菌数の減少を示し、従って第２デイジツトとして数３ である。６６分で処理試料は寸法増加を伴って細菌数の増加を示し、従って第３ デイゾツトで数２である。

ＰＲＩの二つの極端な例が１６３と１３４である。これらの例は細菌が回復する ことができない即時に毒性の応答である。１３３ＰＲＩは細胞拡大を示し、そし て１４４　ＰＲＩは細胞収縮を示し、両方とも回復する細胞の欠陥に結び付くが 、異なる作用機構による。何れのＰＲＩの第１デイジツトにおいて３又は４があ ることは細菌調節培養が正常な成長を示していないのでＯのアッセイが無効であ るＣとを意味する。

スクリーニングスコアＳは対照細菌に比較して細菌成長又は試験試料中の細菌に よる阻害の正確な測定値を供する。これはＤＬＳ配置スコアに関して定義されそ して従来の研究によシ実施された。Ｗｙａ、ｔｂ、　Ｐ、Ｊ、。

Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｅ、Ｔ、、　５ｃｈｅｒ、’　Ｍ、Ｇ、、　Ｋａｈｎ、　 Ｍ、Ｒ，、及びＡｌｅｎ、　Ｅ、Ｈ，、Ｊ、Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏｏ、ｄ　Ｃｈｅ ｍ、　２５　：　１０８０（１９７７）　；　Ｗｙａ、ｅｂ、　Ｐ、Ｊ、　５ａ ｂｅｒ、　Ｍ、Ｇ−、及びＰｈ１ｌｌｉｐｓ、　　　Ｄ、Ｔ、、　　　Ｊ、Ａｇ ｒｊ、ｃ、　　Ｆｏｏｄ　　Ｃｂ、ｅｍ、　　　２　５　　：　　１　　０　３ 　　ｔT （１９７７）。従って １０　（Ｄｂｃ／　３００　）　−１０（Ｄａ／３００）Ｓ＝３ＱＱｌｏｇ １０　（Ｄｂｃ１５００　）　−１０（Ｄｔ／３００）にでＤｂｃはアッセイプ ロス（対照）に対してアッセイプロスプラス細菌のＤＬＳ変位であシ、ＤＣはそ れ自体に対する対照ブランクの変位であり（背景干渉がない時には０）、Ｄｂｔ は対照に対してアッセイプロスプラス細菌中の試験物質の変位であシ、そしてＤ しは対照ブランクに対してアッセイプロス中の試験物質の変位である。この等式 はデータの対数のＤＬＳパターンを線形に戻して変換し、このため背景が減ぜら れ、そしてそれ故に通常の対数形に変換される。この等式は試験細菌に関して対 照細菌の１０倍増加に対して３００の係数を生ずる。

検定した試料に指標計算を適用すること：すべての図面において、未処理″０′ ０″対照は実線（−）で表わされ、１時間未処理対照は点線１−ｊ、’Ｄ’Ｑ間 処理試料は広く間隔を置いた破線（−−−−−）そして１時間処理試料は狭い間 隔を置いた破線（−−−ｊで表わされる。

１〇一時間及び１時間試料の平均Ｙ値から細胞数の増加がすべての未処理対照で 起こったことは明らかである。第２ａ図及び第２ｂ図から、４．２μｇ　／　ｍ ｌ及び２．１μｇ　／　ｍｌの４　ＮＱＯは増加した弓形長さ及び負の時間°０ ′対照の光散乱角度に対して左へ移行する曲線を引起こしたことは明らかである 。相対強度はｌｏｔから１時間間隔へ少なく増加した。第２Ｃ図から８，５μｇ ／ｒｎｌの４　ＮＱＯは弓形長さの減少及び負の時間′０゜対照の光蔽乱角度に 対して左へ曲線移行を引起こしたことは明らかである。しかしながら、４．２μ ｇ／ｍ／では、弓形長さの変化は大したことなくそして光散乱角度に対する曲線 移行は僅かによシ大きい角度の方向である。

応答指標計算を適用する際に、下記の解釈を行なうことができる。

４．２及び２．１μｇ／ｍｌで菌株６は各々１３２及び１６１０ＰＲＩ値を有し た。４．２μｇ　／　ｍ／レベルでは、即時ノ毒性及び致死の効果が°０゛０゛ で見られた。この細菌はカウントが６０分で増加したので若干の回復を示し７＋ 、、。しかしながら、細菌は拡大したままであった７２．１μｇ　／　ｍ／レベ ルでは、即時の毒性及び致死の効果がｌ　０１時間で見られた。しかしカウント は増大しそして細胞は６０分で正常な寸法であった。しかしながら、４．２μｇ 　／　ｍｌは菌株１１に悪い影響を与えた。これらのデータによシ、菌株１１が よう高い用量レベルで処理された時でさえ、菌株１１は菌株６よｆｉ４ＮＰ。

の効果に対して更に屈折性であるＣとが示される。かぐして、遺伝的毒性表示が 第１応答レベルで表わされる。

ＭＮＮＧ　ＤＬＳ毒性応答： 第６ａ図及び第３ｂ図は菌株６　（ｒｓｃＥ４）及び１１（１６８野生型）の各 々に対するＤＬＳ応答パターンを示す。ｌＯ°時聞及び１時間試料の平均Ｙ値か ら、細胞数の増加がすべての未処理対照で生じたことは明らかである。第３ａ図 から、５−６　Ａｇ　／　ｍｌのＭＮＮＯが負の時間°０°対照の光散乱角度に 対して、増大した弓形長さ及び左への曲線移行を引起こしたＣとが明らかである 。相対強度は負の対照が“０゛から１時間間隔で行なったものより少なく増大し た。第６ｂ図から、３．６μｇ　／　ｍｌのＭＮＮＧは弓形長さで減少を引起Ｃ さながったが、この弓形長さ増加は負の対照よシ僅かに小さかったことが明らか である。光散乱角度に対する曲線移行はよｐ大きい価度の方向であシ、殆ど負の 時間ジＯ”対照に近似する。

応答指標の計算全適用すＳと、下記の解釈を行なうことができる。３．６　Ａｇ 　／　ｒｎ、ｌで昭９．６は１３２のＰＲＩ値を有１〜、”００時間で即時の毒 性及び致死の効果を示す。カラ；・トが６０分で増加したのでこの細菌は若干の 回復を示１，４た。しかしながら、細菌は拡大したままであった。　３．６　Ａ ｇ　／　ｍｌの濃度で菌株１１は１１１のＰＲＩ値を有し、従って即時又は処理 に続いて６０分間にわたる何れかで表わされる化合物関連毒性を示さない。これ は第１応答レベルで表わされる遺伝毒性応答である。更に、菌株６及び１１に対 するＳＲＩ値は各衿・−３及び１９であった。菌株乙の負の第２応答は菌株１１ の正のＳＲＩに比較した時に、遺伝的毒性効果があることを示し、これは野生型 （菌株１１）により修復できるがＲｅ（−突然変異体（菌株）ではできなりつを 示す。”０１時間及び１時間試料の平均Ｙ値から、細胞数の増加はすべての未処 理対照で生じたことが明らかである。第５ａ図及び第５ｂ図から、１０７μｇ／ 　ｍｌ及び５３−６　ｐｇ／　ｒｎｌ　ｏ　Ｌｉｎｄａｎｅは負の時間ｌＯ″対 照の光散乱角度と比較すると、減少した弓形長さ及び左への曲線移行を最初に引 起こした０とが明らかである。しかしながら、より低いレベルでは、６０分で正 の移行が見られた。相対強度はよシ高いレベルで′Ｏ”から１時間間隔へ実質上 変化しなかった。しかしながら、よう低い濃度で増加が見られた。第５ｃ図及び 第５ｄ図から、両方の濃度のＬｉｎｅｌａｎｅが弓形長さで初期減少及び負の時 間ｔ　Ｏｅ対照の光散乱角度と比較して左への曲線移行を引起こしたことは明ら かである。しかしながら、この弓形長さは増加しそして散乱角度は負の時間１０ １対照に対して右へ移行した。しかしながら、この弓形長さは増加しそして１時 間後散乱角度は負の時間１０１対照に対して右へ移行したゆ応答指標計算を適用 すると、下記の解釈を行なうことができる。１０７及び５３６６μｇ／ゴで菌株 １０は各々２２２及び１３１のＰＲＩ値を有した。１０７μｇ／−レベルでは、 毒性及び持続された効果（細胞拡大）が見られた。しかしながら、５５．６μｇ ／ｍ／レベルでは、細菌は６０分後に回復した。菌株１１は両方の濃度で１３１ のＰＲＩ値を有した。これは両方のレベルで、細胞致死及び拡大が生じたが、成 長で生ずる完全な回復及び通常の寸法への復帰は１時間で起こることを示す。

菌株１０はＬｆｎｄａｎｅのよシ高い濃度で菌株１１よシ僅かに多く影響される が、ＰＲＩ値での差は毒性評価を行なう際に有用であると思われない。しかしな がら、このＳＲＩ値は菌株１０と１１でかなシ異なっていた。

１０７　ｔｔｇ、　／ｍ９及び５３．６　Ａｇ　／　ｍｔで菌株１０に対するＳ ＲＩ値は各々−１９及び７であった。ＩＣｌ７μｇ／Ｗ及び５６．６μｇ　／　 ｍｌの両方で菌株１１に対してＳＲＩ値は１０であった。菌株１１ではなく菌株 １０で見られるこの用量関連ＳＲＩ傾向はより高い用量レベルで負のＳＲＩ値に 示されるように、この化学品の遺伝的毒性効果を示す。正のＳＲＩ値に示される ように、両方の濃度で菌株１１は遺伝的損傷を修復しそして正常に分裂すること かできる。菌株１０は５６．６μｇ／ゴのよシ低い濃度でのみ遺伝的損傷を疹復 しそして正常に分裂することができる。

これらのＭ果から、第１Ｎｉ胞擁性は三つのディジット数により表わされること が明らかである。変異体と野生型の細菌の第１応答を使用１−て、柩めて毒性で あるＭＮＮＧ及び４　ＮＰＯのような化合物はまた遺伝的毒性として確定できる 。Ｓ−９分画で活性化された時にＥ（ａ）Ｐのような化合物は第１応答レベルの みを使用することにより遺伝的毒性であることを示すことができない。しかしな がら、遺伝的毒性は第２応答を計算するＯとによう決定できる。遺伝的毒性が他 の現今の変異誘発アッセイ技術を用いて検出することが難しい又は不可能でさえ ありたＬｉｎｄａｎｅのよりな他の化合物がその第２応答指標を計算することに よって放射線／微生物によシ容易に検出される。

かくして、本発明のすべての具体例は放射線バイオアッセイのための独特な装置 と方法を供することが判るであろう。本発明の好適具体例を開示したが、本発明 の精神と範囲は単に請求項により限定されるべきではなく、その理由は開示した 具体例の多くの変型が当業者により当然思い浮ばれるであろうからであることは 了解されるべきでちる。

浄書（内容に変更なし） 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 相対強度 手続補正書（自発）

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）１つの試料により処理された、形態変化した検定細菌から散乱放射線 を発生させる手段；（ｂ）該散乱放射線を検出する手段及び検出された散乱放射 線を代表するパターンを作り出す手段を含んで成る、細菌の形態変化を測定する ことによる試料の生物検定装置。
2. ２．（ｃ）細菌が同定済み、試料に暴露されたときに作り出される少なくとも１ つの基準パターンを有する基準の手段；及び （ｄ）該基準パターンを、作り出された該パターンと比較して該試料を同定、定 量する手段を更に含む、請求の範囲第１項に記載の装置。
3. ３．該細菌がバチラススプチリス；バチラススプチリスの同質遺伝子突然変異体 菌株；ｒｅｃＡ１、ｒｅｃＡ８、ｒｅｃＢ２、ｒｅｃ　Ｃ５　ｒｅｃＤ３，ｒｅ ｃＥ４，ｒｅｃＱ１３，ｍｃ−１，ｍ４５，Ｔ−１，ＴＫＪ８２０１，ｈｃｒ− ＴＫＪ８２０６，ＦＨ２００６−７，ＨＪ１５，ＴＫＪ５２１１，ＴＫＪ６３２ １，ＨＳ　１０１，１６８及び１６８（野生型）より成る群から選はれるバチラ ススプチリス菌株より成る群から選択される、請求の範囲第２項に記載の装置。
4. ４．該検定細菌が突然変異体菌株のサブセットを含み、該サブセットは該試験化 学物質に対する応答を定義するのに必要とされる最小の数である、請求の範囲第 ２項に記載の装置。
5. ５．該検出手段が対照試料について及び試験試料について時間ゼロと少なくとも １つの選択された時間間隔とにおいて散乱放射線の強度を検出する手段を含んで 成る、請求の範囲第１項に記載の装置。
6. ６．散乱角を示すｘ軸と相対散乱強度を示すｙ軸とに該パターンをプロットする 手段； 該パターンの高さを測定し、そして少なくとも１つのパターンピークのシフトを 計算することによつて該パターンを評価する手段； 該評価手段は該パターンについてｘ座標とｙ座標を描く手段を含むものであり、 ここで該ｘ軸は該細菌の数に相当し、またｙ軸は該細菌の大きさと形状の形態変 化に相当するものであり； そのカーブの弧の長さを隣り合うｘ座標間の距離を合計することによつて求める 手段； 該パターンの全ての座標対について平均のＹ値を計算する手段； 対照パターンの平均Ｙ値と試料のパターンの平均Ｙ値との間のパーセント変化率 を計算する手段；該Ｙパーセント変化率を５で割ることによつて四次のＹ指数を 求め、そして該変化率が正である場合は１を加え、また該変化率が負である場合 は１を減する手段； 該対照パターンの弧長と該試料パターンの弧長との間のパーセント変化率を計算 する手段；該弧長パーセント変化率を５で割ることによつて四次の弧指数を求め 、そして該変化率が正である場合は１を加え、また該変化率が負である場合は１ を減する手段；及び 次表 ▲数式、化学式、表等があります▼ （表中、 “１”は該細菌の大きさの同時減少と非毒性応答に対応する、細菌数における正 の増加を示し；“２”は大きさの同時増加と最小毒性応答に対応する、細菌数に おける正の増加を示し； “３”は大きさの同時増加と致死毒性応答に対応する、細菌数における減少を示 し； “４”は大きさの同時減少と致死毒性応答に対応する、細菌数における減少を示 す。） に従つて第一応答指数の数字を出す手段を含む、請求の範囲第５項に記載の装置 。
7. ７．該四次Ｙ指数に該四次弧指数を乗じることによつて該パターンの第三応答指 数を計算する手段を更に含む、請求の範囲第５項に記載の装置。
8. ８．該パターンの第二応答指数を、それらの第三応答指数を全ての指数化された パターンについて合計することによつて計算する手段を更に含む、請求の範囲第 ５項に記載の装置。
9. ９．該パターン形成手段が、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドに暴露される細 菌の対照試料についてパターンをプロットすることによつてネガティブ対照を描 く手段及びベンゾ（ア）ピレンに暴露される細菌の対照試料についてパターンを プロットすることによつてポジティブ対照を描く手段を含んで成る、請求の範囲 第１項に記載の装置。
10. １０．該細菌を後ミクロソームフラクション又はミクロソームフラクションで処 理することによつて代謝を通じて該検定細菌を活性化する手段を更に含む、請求 の範囲第１項に記載の装置。
11. １１．該試料が水不溶性の試料であり、そして界面活性剤手段と分散剤手段を更 に含み、それによつて懸濁している該水不溶性試料を可溶化し、かつ該懸濁液の 実質的な光学的明澄性を維持する、請求の範囲第１項に記載の装置。
12. １２．該試料を“エマルフオア（ＥＭＵＬＰＨＯＲ）ＥＬ−６２０”のようなポ リオキシエチル化植物油及び“コレキシツト（ＣＯＲＥＸＩＴ）７６６４”油性 分散剤のような分散剤で可溶化する、請求の範囲第１項に記載の装置。
13. １３．該放射線発生手段が単色レーザーである、請求の範囲第１項に記載の装置 。
14. １４．（ａ）１つの試料により処理された、形態変化した検定細菌から散乱放射 線を発生さぜ；そして（ｂ）該散乱放射線を検出し、検出された散乱放射線を代 表するパターンを作り出す 工程を含んで成る、細菌の形態変化を測定することによる試料の生物検定法。
15. １５．細菌を同定済み試料に暴露することにより作り出される少なくとも１つの 基準パターンを有する基準の手段を用意し； 該基準パターンを該形成パターンと比較して、該試料を同定、定量する際の助け となす工程を更に含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．該検定細菌及び該試料を （ａ）該試料を可溶化し； （ｂ）該可溶化試料の連続稀釈液を調製し；（ｃ）該検定細菌を少なくとも１つ の明澄な光学キユペットに加え；そして （ｄ）測定されたある量の各可溶化試料稀釈液を該細菌を含有する該キユペット に与える 工程を実施することによつて調製する、請求の範囲第１４項に記載の方法。
17. １７．該試料及び該細菌を約３７〜３９℃の範囲の温度でインキュベートする、 請求の範囲第１４項に記載の方法。
18. １８．該検定細菌がバテラススプチリス；バチラススプチリスの同質遺伝子突然 変異体菌株；又はｒｅｃＡ１、ｒｅｃＡ８、ｒｅｃＢ２，ｒｅｃＣ５，ｒｅｃＤ ３，ｒｅｃＥ４，ｒｅｃＱ１３，ｍｃ−１，ｍ４５，Ｔ−１，ＴＫＪ８２０１， ｂｃｒ−９，ＴＫＪ８２０６，ＦＨ２００６−７，ＨＪ１５，ＴＫＪ５２１１， ＴＫＪ６３２１，ＨＡ１０１，１６８，及び１６８（野生型）より成る群から選 ばれるバチラススプチリス菌株より成る群から選択される、請求の範囲第１４項 に記載の方法。
19. １９．該検定細菌が突然変異体菌株のサブセットであり、該サブセットは該試験 化学物質に対する応答を定義するのに必要とされる最小の数である、請求の範囲 第１４項に記載の方法。
20. ２０．該検出工程が対照試料の、及び１つの試験試料の、時間ゼロと少なくとも １つの選択された時間間隔とにおいて散乱放射線の強度を検出することを含む、 請求の範囲第１４項に記載の方法。
21. ２１．該パターン形成工程が散乱角を示すｘ軸と相対散乱強度を示すｙ軸とに該 パターンをプロツトすることを含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。
22. ２２．該パターンについてｘ座標とｙ座標を描き、ここで該ｘ軸は該細菌の数に 相当し、また該ｙ軸は該細菌の大きさと形状の形態変化に相当するものであり； 該パターンの弧の長さを隣り合うｘ座標間の距離を合計することによつて求め、 該パターンの全ての座標対について平均のＹ値を計算し； １つの基準パターンについての平均Ｙ値と該パターンについての該平均Ｙ値との 間のパーセント変化率を計算し； 該Ｙパーセント変化率を５で割ることによつて四次のＹ指数を求め、そして該変 化率が正である場合は１を加え、また該変化率が負である場合は１を減じ；該基 準パターンの弧長と該パターンの弧長との間のパーセント変化率を計算し； 該弧長パーセント変化率を５で割ることによつて四次の弧指数を求め、そして該 変化率が正である場合は１を加え、また該変化率が負である場合は１を減じ；そ して 次表 ▲数式、化学式、表等があります▼ （表中、 “１”は該細菌の大きさの同時減少と非毒性応答に対応する、細菌数における正 の増加を示し；“２”は大きさの同時増加と最小毒性応答に対応する、細菌数に おける正の増加を示し； “３”は大きさの同時増加と致死毒性応答に対応する、細菌数にむける減少を示 し； “４”は大きさの同時減少と致死毒性応答に対応する、細菌数における減少を示 す。） に従つて第一応答指数の数字を出す 工程を更に含む、請求の範囲第１５項に記載の方法。
23. ２３．該四次Ｙ指数に該四次弧指数を乗じることによつて該パターンの第三応答 指数を計算する工程を更に含む、請求の範囲第２２項に記載の方法。
24. ２４．該パターンの第二応答指数を、それらの第三指数を全ての指数化されたパ ターンについて合計することによつて計算する工程を更に含む、請求の範囲第２ ２項に記載の方法。
25. ２５．該試料が水不溶性であり、そして界面活性剤手段及び分散剤手段を用いる ことによつて懸濁している該水不溶性試料を可溶化し、かつ該懸濁液の実質的な 光学的明澄性を維持する工程を更に含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。
26. ２６．該可溶化工程が“エマルフオアＥＬ−６２０”のようなポリオキシエチル 化植物油及び“コレキシツト７６６４”油性分散剤のような分散剤手段の使用を 含む、請求の範囲第２５項に記載の方法。
27. ２７．該放射線発生工程の放射線が単色レーザーによつて与えられる、請求の範 囲第１４項に記載の方法。
28. ２８．４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシドに暴露される細菌の対照試料について カーブをプロットすることによつてネガティブ対照を描き；そしてベンゾ（ア） ピレンに暴露される細菌の対照試料について該カーブをプロットすることによつ てポジティブ対照を描く 工程を更に含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。
29. ２９．該細菌をミクロソームフラクション又は後ミクロソームフラクションで処 理することによつて代謝を通じて該検定細菌を活性化することを含む、請求の範 囲第１４項に記載の方法。
30. ３０．各々形態変化により、化学物質の暴露、及び該変化を記録、表示する手段 に対して独特に応答し得る、複数のバチラススプテリス細菌。
31. ３１．界面活性剤及び分散剤を含んで成る、検定細菌と混合されたとき光学的に 明澄であり、かつ該検定細菌に対して害がない、化学物質の試料を可溶化するた めの組成物。
32. ３２．水不溶性試料を“コレキシツト７６６４”油性分散剤及び“エマルフオア ＥＬ−６２０”非毒性界面活性剤と混合する工程を含んで成る、放射線生物検定 において使用するための光学的に明澄な媒体を提供する方法。