HUT56189A - Biological testing apparatus and method for detecting toxic materials by means of measuring of the morphologic variations of the bacteriums - Google Patents
Biological testing apparatus and method for detecting toxic materials by means of measuring of the morphologic variations of the bacteriums Download PDFInfo
- Publication number
- HUT56189A HUT56189A HU263589A HU263589A HUT56189A HU T56189 A HUT56189 A HU T56189A HU 263589 A HU263589 A HU 263589A HU 263589 A HU263589 A HU 263589A HU T56189 A HUT56189 A HU T56189A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sample
- scheme
- index
- bacteria
- response
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 34
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 title description 9
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 title description 9
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 title description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 58
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 44
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 24
- 230000008791 toxic response Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 58
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 50
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 37
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 28
- YHQDZJICGQWFHK-UHFFFAOYSA-N 4-nitroquinoline N-oxide Chemical compound C1=CC=C2C([N+](=O)[O-])=CC=[N+]([O-])C2=C1 YHQDZJICGQWFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- KWVPFECTOKLOBL-KTKRTIGZSA-N 2-[(z)-octadec-9-enoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCCO KWVPFECTOKLOBL-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 claims description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 6
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 5
- 125000005605 benzo group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 5
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 5
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 5
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 3
- 239000003924 oil dispersant Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 abstract description 17
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 3
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000001370 static light scattering Methods 0.000 description 38
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N gamma-hexachlorocyclohexane Natural products ClC1C(Cl)C(Cl)C(Cl)C(Cl)C1Cl JLYXXMFPNIAWKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 11
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 11
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 11
- JLYXXMFPNIAWKQ-GNIYUCBRSA-N gamma-hexachlorocyclohexane Chemical compound Cl[C@H]1[C@H](Cl)[C@@H](Cl)[C@@H](Cl)[C@H](Cl)[C@H]1Cl JLYXXMFPNIAWKQ-GNIYUCBRSA-N 0.000 description 10
- 229960002809 lindane Drugs 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 8
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 7
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 7
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 7
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 5
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 5
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- -1 DNA Chemical class 0.000 description 3
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 3
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 3
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008794 genotoxic response Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010953 Ames test Methods 0.000 description 2
- 231100000039 Ames test Toxicity 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 150000001204 N-oxides Chemical class 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003570 air Substances 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N trimethoprim Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 IEDVJHCEMCRBQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001082 trimethoprim Drugs 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009118 appropriate response Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013479 data entry Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000001853 liver microsome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003640 procarcinogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical class N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0227—Investigating particle size or size distribution by optical means using imaging; using holography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/02—Investigating particle size or size distribution
- G01N15/0205—Investigating particle size or size distribution by optical means
- G01N15/0211—Investigating a scatter or diffraction pattern
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
- G01N2021/4704—Angular selective
- G01N2021/4711—Multiangle measurement
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya biológiai vizsgáló berendezés és eljárás, közelebbről sugárzás- vagy lézer-technikát és genetikailag megváltoztatott baktériumokat kombináltan alkalmazó vizsgálat a különböző környezeti közegekben lévő toxikus anyagok azonosítására és koncentrációjának meghatározására.
Különböző társadalmi szinteken már régen figyelmeztettek arra, hogy az emberiség javára szánt vegyipari termékek felelősek lehetnek a rákos megbetegedések számának drámai emelkedéséért, és a genetikus egészség hanyatlását okozhatják hosszú távon. A környezeti közegekben - például vízben, talajban, levegőben és élelmiszerben a mutagenezis vagy karcinogenezis kiváltására képes természetes vagy ember-készitette toxikus anyagok hatékony és pontos nyomonkövetése ezért a közegészségügy szempontjából a legfontosabb tudományos követelmény.
A levegő, viz és talajminták vizsgálatára különféle analitikai kémiai módszerek - például gázkromatográfia, tömegspektroszkópia és nagynyomású folyadékkromatográfia - állnak rendelkezésre. Azonban a minta komplex volta miatt különféle vizsgálatokat kell kifejleszteni az egyes vegyszerek és vegyszer-csoportok azonosítására és mennyiségi meghatározására. Továbbá, egy vegyszer jelenlétéből és koncentrációjából még nem lehet következtetni annak citotoxikus vagy genotoxikus aktivitására. Ezek a vizsgálatok nem jelzik, hogy egy káros biológiai hatás erős, gyenge, vagy egyáltalán jelen van-e egy mintában, hogy az ember szempontjából megbízható értékelést végezhessenek a veszélyeztetettségről .
A karcinogének vizsgálatára legelterjedtebben használt bakteriális teszt-rendszer az Ames-teszt /Ames, Mutat. Rés. 31,
347-349 (1974)J, amelyben hisztidin-igényes auxotróf Salmonella typhimuriumot használnak. Mivel az Ames-teszt reverz mutáción alapul, egy mutáns dezoxiribonukleinsav (DNS) locusznak vissza kell mutálódni vad-tipusu konfigurációjába, vagy szupresszálódnia kell. így azok a kémiai mutagének, amelyek nem tudják a DNS-ben ezt a változást kiváltani, nem detektálhatók. A kutatók ennek a vizsgálatnak más hiányosságait is felismerték, közelebbről, nem lehet megbízható és reprodukálható in vitro aktiváló rendszert létrehozni, és nem lehet bizonyos rákot okozó mutációs eseményeket detektálni /T'elkner: Microbial Testers: Probing Chemical Carcinogenesis, 177 (1981)_/.
Felkner 1971-ben felfedezte, hogy a közönséges, transzformálható Bacillus subtilis törzsek az erős mutagén és karcinogén hatású 4-nitro-kinolin-l-oxid (4NQ0) rövid időn áti hatása után regenerálódnak, mig a rekombinációra és/vagy sötét javitás-ra (dark repair) képtelen más törzsek nem. A regenerálódási képesség vagy képtelenség közvetlen összefüggésben volt a de novo DNS-szintézis blokkolásával a sejt DNS-ének 4NQC-vel való komplexálódása révén /Laumbach A.D., Felkner I.C.: Formation of 4Nitroquinoline-l-oxide Complex with DNA in Normál and Repair Deficient Strains of Bacillus subtilis, Mutat. Rés. 15, 233-245 (1972)/· A fenti kutatómunka eredményeként felfedezték, hogy bizonyos kémiai szerkezetek megfelelő, különleges biológiai funkcióval rendelkeznek. Ennek az elvnek alapján, egy vegyszer biológiai rendszerre - például Bacillus subtilis baktériumra - kifejtett hatását a vizsgált sejt morfológiai változása alapján lehet azonosítani.
Felkner 1981-ben a korábbi munkájából származó elv alapján *·· · · · ·· ·· • · · · « • · · · · · · ···»··«
- 4 többszáz Bacillus subtilis mutánsból álló gyűjteményből kifejlesztett egy mikrobás biológiai vizsgálatot. Ezek a kiválogatott törzsek egyedi genetikai hibákkal rendelkeznek, amely következtében igen érzékenyek specifikus kémiai vegyületcsoportok, toxinok és sugárzás hatására. Az egységesség kialakítására a fenti törzsekből származó mutáns géneket rekombinációs eljárással a vad tipusu (normális) Bacillus subtilis törzs azonos kiónjaiba vitte be. Az igy előállított Bacillus subtilis törzsek egymástól csak egyetlen tulajdonságban (génbai) vagy csak néhány génben különböztek. A csoport törzsei ezért izogének, azaz egyes meghatározott gének kivételével azonosak.
Folyékony szuszpenzióban, szokásos bakteriológiai módszerekkel -például mikroszkópia, spektrográfia és telep- vagy sejtszámlálás - kimutatták, hogy a kémiai mérgek - például a 4-nitro-kinolin-l-oxid - a sejtosztódást képesek leállítani, a sejt felduzzadását indukálják, és a Bacillus subtilis DNS-éhez való kötődésük és annak károsodása következtében a sejt szétesését váltják ki ZLaumbach és Felkner, Formations of a 4-nitroquinoline-loxide complex in normál and repair deficient strains of Bacillus subtilis, Mutat. Rés. 15, 233-245 és 16, 44 (1972^/. A Felkner-féle mutáns törzsekben dokumentálták a fenti jellemzőket, valamint sok kémiai vegyületcsöpört molekuláris kölcsönhatásait, amelyek egyedülálló válasz-sémát mutattak minden megvizsgált vegyületre, amely toxikus volt /Felkner, Development of a Bacillus subtilis system to screen carcinogens/mutagens; DNA-damaging and mutation assays, Microbial Testers: Probing Chemical Carcinogenesis, 89-120 (1981); Són, Photoactivation of furocoumaryl carcinogens/ mutagens and their interactions with nucleic acids, Microbial • · · ·
- 5 Testers: Probing Chemical Carcinogenesis, 35-66 (1981); és Streips, Bacterial Mutation Monitors fór active metabolites of chemical carcinogens: Bacillus subtilis assay fór mutation and DNA repair, Microbial Testers: Probing Carcinogenesis, 131-143 (1981)_7· Ez a vizsgálati módszer azonban a hagyományos lemez- és folyadék-módszerektől függ. Noha az Amerikai Egyesült Államok Környezetvédelmi Ügynökségéhez tartozó Office of Pesticide Program Guidelines ezt a módszer elfogadhatónak tartotta a genotoxikus válaszok kimutatására, a módszer nem érzékeny, nem specifikus és nem olyan gyors, mint amit egy modern biológiai vizsgálati módszertől elvárunk.
Az 1970-es évek elején Wyatt és munkatársai felfedeztek egy 1ézerfény-szóródásos biológiai vizsgálati módszert.
Exponenciális szaporodási fázisban lévő baktérium-tenyészetekkel oltották be a baktériumok fiziológiai folyamatait, és ezen keresztül a kezelt baktériumok morfológiáját feltehetőleg befolyásolni képes vegyületeket tartalmazó vizes oldatokat. A szórt fény intenzitásának változását a szórási szög függvényében ábrázolták. A kezdeti berendezésekben a mintát tartalmazó küvettát egy körív középpontjába helyezték, amely körül egy párhuzamositott fénysokszorozó detektor forgott. A relatív szórt fény intenzitás változását a szórási szög függvényében ábrázoló grafikont differenciális fényszórási (üLS) sémának nevezték.
Baktériumokat alkalmazó vizsgálati módszereket ismertet Wyatt 3 730 842 (1973, 05. 01.) és 4 101 383 (1978. 07. 18.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásában is.
A fenti szabadalmi leírásokban a baktériumok antibiotikumokkal szembeni érzékenységének és fogékonyságának meghatározására szol···« · · * · ·· • · · · · · • · · * · · · • ··«··» gálő eljárásokban meghatározzák a kezelt baktériumokból származó DLS sémákat, majd összehasonlítják azokat a kontroll baktériumokkal kapott sémákkal. Nem utalnak azonban arra, hogy ez a séma alkalmas lenne potenciális citotoxikus vagy genotoxikus aktivitású mérgező anyagok kimutatására, vagy lehetővé tenné a mérgező anyagok azonosítását és mennyiségének meghatározását. Wyatt 4 541 719 (1985- 09. 17.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásából ismert egy lézer-berendezés, amely a mikrorészecskék, például baktériumok által szórt sugárzást két jól meghatározott szórási szögben méri. A baktériumok toxikus válaszát a fő szórt intenzitások átlagolásával mérik. Wyatt további szabadalmi leírásaiban a mikrorészecskék jellemzésére szolgáló készülékeket és eljárásokat ismertet (4 693 602, 4 616 927, 4 621 063, 4 548 500, 4 490 042, 4 173 415, 3 928 140, 3 770 351, 3 754 830 és 3 624 835 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások).
Biológiai vizsgálati módszereket ismertet még Beán is (3 708 402 és 4 061 543 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások). A fenti irodalmi helyek egyikén sem ismerte’tnek azonban olyan készüléket vagy eljárást, amely alkalmas a toxicitás vagy genotoxicitás mérésére, vagy egy teszt-vegyület azonosítására .
Thilly ismertetett egy eljárást baktériumsejtekben bekövetkező mutagenezis vizsgálatára (4 299 915 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás, 1981. 11. 10.), amelyben baktériumsejteket - például S. typhimuriumot - a vizsgált vegyülettel kezelnek, és egy purin-analóg jelenlétében lemezre viszik. Ez az eljárás a hagyományos lemez-módszerektől függ, és • · • · • · · · * · • · · · · · · • · - · · · · · ugyanúgy érzéketlen bizonyos vegyületekkel szemben, valamint csak laboratóriumban lehet kivitelezni.
A találmány célja elsősorban biológiai vizsgálati módszer és berendezés a környezetben lévő vegyszerekkel kiváltott toxikus válasz kimutatására és mérésére, amely vegyszerek koncentrációja túl alacsony akut toxikus tünetek kiváltására, de amelyek krónikus hatására évek alatt toxikus válasz vagy károsodás fejlődhet ki.
A találmány további célja egységes differenciális fényszórási (DLS) sémák kifejlesztése kémiai szerekre, Bacillus subtilis vad tipusu és izogén repair mutáns törzsek alkalmazásával .
További célunk volt a Bacillus subtilis törzsek közül egy minimális csoport vagy izoszett” kiválasztása, amely specifikus kémiai vegyületcsoportokra adott válasz-sé^ák meghatározásához szükséges.
A találmány további célja a kiválasztott baktériumok toxicitási válaszának kiértékelésére, és a fenti válaszok ismert kémiai szerekre adott válaszokkal való összehasonlítására szolgáló eszköz kifejlesztése.
A találmány további célja toxikus válaszok kiértékelésére alkalmas eszköz olyan vegyületekre, amelyekre a genotoxikus válasz kimutatása bonyolult, vagy éppen lehetetlen az ismert mutagén vizsgálati módszerekkel.
A találmány további célja összehasonlításként ismert vegyületek DLS-sémáinak meghatározása a fenti baktériumokkal, az ismeretlen minták toxicitásának szűrővizsgálatára, azonosítására és mennyiségi meghatározására· • ·
- 8 A találmány további célja vizoldhatatlan minták szolubilizálására alkalmas közeg kiválasztása, amely közeg a vizsgálatban haszrált baktériumokra nézve ártalmatlan, és a baktériumokkal összekeverve optikailag tiszta, azaz a sugárzás könnyen áthatol rajta és a szórás detektálható.
A találmány további célja bizonyos vizsgálandó vegyszerek metabolikus aktiválása, hogy a fenti vegyszereket a baktériumsejtek fel tudják venni. A fenti célokat úgy értük el, hogy sikerült olyan Bacillus subtilis izogén törzseket találnunk, amelyekből hiányoznak bizonyos genetikus javító funkciók, és olyanokat, amelyekben a javító mechanizmus kielégítő, igy a toxikus vegyszerekre adott jellemző válaszuk kimutatható differenciális fényszóró lézer rendszer alkalmazásával. A fenti válaszokat kiértékelve azután meghatározhatjuk például az akut toxikus vagy genotoxikus hatásokat. A válasz-indexként számított értékeket azután a fenti baktériumtörzsek azonosított kémiai szerekre adott ismert válaszaival hasonlítjuk össze. A fenti módszer a vizsgálandó vegyszer mennyiségének meghatározására is alkalmas .
A találmányt közelebbről az alábbi részletes leírás és ábrák segítségével ismertetjük.
Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábra a találmány szerinti eljárás és készülék sematikus ábrázolása.
A 2a - 2d ábrákon láthatók a vizsgálatban használt baktériumok differenciális fényszórási sémái, ha a baktériumokat
4-nitro-kinolin-N-oxid (4NQ0) különböző koncentrációival kezeljük.
A 3a és 3b ábra mutatja a vizsgált baktériumok diffe• · • « « • ·
renciális fényszórási sémáit N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin (MNNG) különböző koncentrációival végzett kezelés után.
A 4a - 4d ábra mutatja a vizsgálatban használt baktériumok differenciális fényszórási sémáit benzo/a/pirén (B/a/P) különböző koncentrációival végzett kezelés után.
Az 5a - 5d ábrán látható a vizsgálatban használt baktériumok differenciális fényszórási sémája lindán különböző koncentrációival végzett kezelés után.
Az előnyös megvalósítási módot az alábbiakban ismertetjük .
Az 1. ábrán látható a találmány szerinti berendezés sematikus képe, amelyben a találmány szerinti biológiai vizsgálatot végezhetjük. A vizsgálati rendszer egy 4 sugárforrást tartalmaz, például egy lézer-rendszert, amely az előnyös megvalósítási mód szerint például a 4 541 719 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett rendszer lehet, amely monokromatikus látható vagy infravörös sugarat kibocsátó lézert tartalmaz, a sugár síkban polarizált a két detektor-tömbhöz viszonyítva. A lézer-rendszer 1200 mérést képes másodpercenként végezni 15 különböző szögben. A vizsgálati rendszer tartalmaz ezenkívül egy 2 Bacillus subtilis izogén mutáns szettet. A lézer megvilágítja a 2 baktérium szuszpenzióját tartalmazó 1 küvettát, a baktériumok a fényt differenciálisán szórják. A lézer-sugár 6 differenciális fényszórását (DLS) mint a szórt fény intenzitását detektáljuk a szög függvényében. Másik megvalósítási mód szerint az 5 detektor detektálja a DLS-t és a jeleket a 7 kiirószerkezetbe táplálja, amely grafikus formában kiírja a szórt intenzitás görbéjét. Másik megvalósítási mód szerint egy analizáló készülék *·«·
- 10 - például egy 8 számítógép - közvetlenül kapja az 5 detektortól az adatokat.
A szórt fény intenzitásának változását DLS sémának nevezzük, és ez a baktériumok átlagos méretétől és szerkezetétől, valamint a tenyészet méret-eloszlásától függ. Egy szuszpenzió DLS sémája megmutatja, hány részecske van jelen, azok méretét, alakját és a részecske-eloszlást. Ezért, ha a baktériumsejtek zsugorodnak vagy megnagyobbodnak, osztódnak vagy lizálódnak, a DLS séma eltér a kezeletlen baktériumokkal kapott kontroll-sémától. A baktériumszámot a DLS séma magasságával, vagy legmagasabb pontjával mérjük. A vizsgált DLS séma csúcs-eltolódása a kontroll mintához képest a morfológiai változás mértékét jelenti. Magától értetődően a DLS séma mágnesesen rögzített digitális formában is lehet gépi leolvasáshoz, vagy grafikus formában rögzítjük, igy a szórt fény intenzitási séma szemmel leolvasható görbeként jelenik meg.
Az adatbevitel és számítás megkönnyítésére abban az esetben, amikor az 5 detektorból nem egy 7 kiíróba visszük az adatokat, egy (az ábrán nem látható) digitális átalakító táblát használunk az egyes sémák görbéjének leírására és ezzel egyidejűleg egy analizáló készülékbe - például egy 8 számítógépbe - folyamatosan betápláljuk az x és y koordinátákat. Mint említettük, a digitális átalakító elhagyható, ha intergált lézer-számítógép rendszert használunk, igy a rendszerbe való adatbevitel sokkal gyorsabb, és elkerülhetők a bevitel hibái. Az 1. ábra mutatja mindegyik megvalósítási módot pontozott vonalas összekötésekkel.
Az analizáló készülék - amely az előnyös megvalósítási mód szerint egy 8 számítógép - elvégzi a kontroll DLS-ének a min··«· * « * * * ’ a · · ··· · • ····«· • · · · · * ·
- 11 tóhoz viszonyított eltolódósát és a baktériumszám-változást képviselő válasz-indexek kiszámítását. A kapott indexből azonnal következtethetünk a toxikus válaszra, a DNS-t károsító (genotoxikus) aktivitásra és segít a Bacillus subtilis baktériumok izogén-szett j ének azonosításában a vegyület azonosítására.
A mintában lévő vegyszer koncentrációját az adott mintára adott baktérium-válasz mértéke határozza meg. A biológiai vizsgálatra használt baktérium-szett tagjai egymástól csak egyetlen tulajdonságban térnek el, amelynek következtében érzékenyebbek lesznek egy másik szett tagjainál a toxicitás mechanizmusa miatt. Ezért a szettbe tartozó baktériumok differenciális válaszából minden egyes vegyületre egy ujjlenyomat vagy egyedi profil alakul ki. Az igy kapott ujjlenyomatok kiértékelésével a vizsgált vegyület azonosítására, koncentrációjának meghatározására és a vegyület akut vagy krónikus toxicitásának becslésére is kapunk adatokat.
Másik megvalósítási mód szerint egy 9 könyvtárat képezünk a DLS sémákból és a számított válasz-indexekből^ azonosított minták biológiai vizsgálatával. Az ismeretlen minta DLS-ét az igy elraktározott DLS sémával összehasonlítva meghatározhatjuk az ismeretlen minta toxicitását, azonosíthatjuk a toxikus vegyületet és koncentrációját is meghatározhatjuk.
A teljes vizsgálathoz szükséges idő közelítőleg 60 - 66 perc, az az idő, ami a kezeletlen baktérium kétszeri osztódásához szükséges, bármilyen vegyszer távollétében. Azonban az egyes mintákat 1 minta/perc sebességgel is analizálhatjuk, egy vegyület koncentrációjának meghatározására vizes mintában.
A vizsgálatban alkalmazott baktériumok ·«·« ··
- 12 A vizsgálatban használt baktériumok egyetlen fajhoz, a Bacillus subtilishez tartoznak, amely számos előnnyel rendelkezik a biológiai vizsgálatokban hagyományosan használt egyéb baktériumokkal szemben. Először, a Bacillus subtilis a leginkább tanulmányozott és genetikailag feltérképezett Gram-pozitiv mikro organizmus /Henner D.J. és Hich J.A., The Bacillus subtilis Chromosome, Microbiol. Rév. 44, 57-82 (198017·
A fenti organizmusok morfológiáját, biokémiáját, genetikáját és fiziológiáját igy alaposan ismerjük. A fenti baktériumok morfológiai tulajdonságai is könnyen adaptálódnak a biológiai vizsgálat érzékenységével és reprodukálhatóságával kapcsola tos követelményekhez. A Bacillus subtilis nyugvó állapotában spóra formájában létezik, amely genetikailag változatlan formában képes a túlélésre, és korlátlan ideig ellenálló hővel, szárítással vagy egyéb káros hatásokkal szemben. Vegetatív sejtként a baktérium gyorsan osztódik, mintegy 26 perc alatt képes megkétszereződni a logaritmikus szaporodási fázisban, és ebben a szakaszban sokkal érzékenyebb a toxikus vegyületekre, mint a Gram-negativ Salmonella typhimurium és Escherichia coli mikroorganizmusok. Megfelelő állapotban a Bacillus subtilis könnyen felvesz nagy molekulákat - például DNS-t -, és saját fajtájának tagjaiból vagy más fajokból származó géneket képes integrálni a hagyományos rekombináns DNS-eljárásokkal.
A találmány szerinti biológiai vizsgálatban használt Bacillus subtilis mutánsok genetikailag azonosak vagy izogének, kivéve egy vagy több genetikus blokkot az egyes enzimatikus javító folyamatokban vagy lépésekben, amelyek a kémiailag sérült DNS funkcionális állapotát állítják helyre. A Bacillus subtilis • · · V · * • · · ··· · • «···«» izogén szettben a specifikusan kiválasztott törzsekből hiányoznak a különböző rekombinációs (Rec-), kivágási (Exc-), polimeráz (Pol-) vagy spóra-javítási(Spp-) javitó-lépések. Ezekből a törzsekből egy vagy több javító lépés hiányozhat, és ide tartoznak a Rec- törzsek: recAl, recA8, recB2, recC5, recD3, recE4, recG13, mc-1 és m45; a Pol- törzsek: T-l, TKJ8201; az Exc- törzsek: hcr-9 és TKJ8206; az Exc- és Rec- törzs: FH2006-7; az Exc-, Rec- és Pol- törzs: HJ15; az Exc- és Spp- törzs: TKJ5211; az Exc-, Pol- és Spp- törzs: TKJ6321; és a megfelelő javító mechanizmussal rendelkező törzsek: HA1O1, 168 és vad tipusu 168. A fenti csoportba tartozó mutánsok ezért érzékenyebbek a kémiai szerek széles körének metabolikustoxicitásával vagy genotoxikus aktivitásával szemben, nanomól vagy nanogramm koncentrációkban .
Mivel a fenti folyamatokban számos enzimatikus lépés és javító folyamat van, egy adott vegyület csak bizonyos izogén mutánsokra hat, ezáltal egyedi DLS sémát fog mutatni.
A fenti Bacillus subtilis mutánsok besugárzással vagy különféle kémiai mutagénekkel végzett kezeléssel állíthatók elő. így például nitrozo-guanidint - egy erős kémiai mutagént használtak a baktériumok genetikai szerkezetének megváltoztatására, vagy trimetoprimmel szelektálták azokat a mutánsokat, amelyek timin hozzáadása nélkül nem tudnak DNS-t szintetizálni. A Felkner által izolált egyik mutáns-csoport - amelyet FH2001 - FH2006 jelöléssel láttak el - a JB01-200 törzsből származik, amelynek leszármazását Felkner definiálta /J. Bacteriol. 104, 1030-3032 (1970)/. Az idézett cikkben leirt módon, a szokásos genetikai analízissel megállapították, hol helyezkedik
4«·· ·♦
- 14 el a baktérium kromoszómájában az egyetlen timin-génhiány. Ezt követően trimetoprim-kezeléssel izoláltak egy mutánst, amely rendkívül szenzitiv volt ultraibolya fényre és a karcinogén hatású 4-nitro-kinolin-l-oxidra /Felkner I.C., Isolation and
Characterization of Thymineless Mutants from Ultraviolet-Sensitive Bacillus subtilis Strains, J. Bacteriol. 104, 1030-1032 (1970).7. Az FH2006-7-nek jelölt fenti törzsről kimutatták, hogy egy gén-mutációt tartalmaz genetikailag a timin-lokuszhoz kötve, aminek következtében a mutáns képtelen a genetikus rekombinációra. A fenti mutánsból származó géneket DNS-izolálással, felvétellel és integrálással egy szülői vad tipusu törzsbe vitték át, igy az alábbi genotipusu FH2006-7 utódokat nyerték:
| (1) | trp-, | thy-, | hcr-. | rec- |
| (2) | trp+, | thy-, | hcr-, | rec- |
| (3) | trp+, | thy+, | hcr-, | rec- |
A (2) és (3) tipusu mutáns alkalmas a hcr- és rec- mutációk vizsgálatára, a DNS-károsodás kimutatására. A hagyományos genetikai manipulációkkal előállított fenti baktériumok a természetben nem fordulnak elő, vagy nem keletkeznek egy szaporodó izolált baktérium-tenyészetben.
A találmány szerinti biológiai vizsgálatban használt törzs közül a recA8, recAl, recB2, recC5, recD3, recE4, recG13, hcr-9, mc-1 és FH2006-7 a 168 törzsből származik. Ez a törzs a trp C törzsből ered /Spizizen J., Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 44, 1072-1078/. A többi mutáns törzs ebből a törzsből származik, de közvetlenül a HA 101 törzsből származtatható /kada T., Sadaie Y. és Tutikawa K. , Mutat. Rés. 165 • · · » a · • · · ··· · • *····« (1972); és Tanooka Η. , Mutat. Rés. 42, 1 (1977^/. A találmány szerinti előnyös biológiai vizsgálatban alkalmazott mutáns törzseket ismert gén-technológiai eljárásokkal és transzformálásokkal állíthatjuk elő az alábbiakban ismertetett módon, és az idézett irodalmak alapján: Henner D.J. és Hoch J.A., The Bacillus subtilis Chromosome, Microbiol. Rév. 44, 57-82 (1980); Laumbach
A.D. és Felkner I.C., Formations of a 4-nitroquinoline-l-oxide complex in normál and repair deficient strains of Bacillus subtilis, Mutat. Rés. 15, 233-245 és 16, 444 (1972); Felkner I.C., Isolation and Charasterization of Thymineless Mutants from Ultraviolet-Sensitive Bacillus subtilis Strains, J. Bacteriol. 104, 1030 (1970); Felkner I.C., Kadlubar F., Parallel Between Ultraviolet Light and 4-Nitroquinoline-l-0xide Sensitivity in Bacillus subtilis, J. Bacteriol. 96, 1448 (1968); és Felkner I.C., Microbial Testers: Probing Carcinogenesis (1981).
A fenti mutánsok alcsoportjaként definiált izo-szett a meghatározandó minta definiálásához szükséges minimális számú törzsből áll. A részleges túlélési vizsgálatokból származó adatok és ellenőrző próbából származó adatok alapján határozhatjuk meg, hogy mely Bacillus subtilis törzseket kell tartalmaznia az izo-szettnek egy adott vegyület azonosítására a sugárzásos biológiai vizsgálattal.
A találmány szerinti biológiai vizsgálatban használt izo-szett tagjainak kiválasztására az izogén mutánsokat először ismert vegyületeket tartalmazó ellenőrző vizsgálattal szűrjük ki. A DNS-kárositási vizsgálatot Felkner I.C. módszere szerint végezzük /Felkner I.C., Microbial Testers: Probing Carcinogenesis (1981); és Felkner I.C., Proceeding of the National Conference cn Environmental Engineering, Medine A. és Anderson W. szerk., Am. Soc. Civil Eng., N.Y., 204-209. oldal (19831/. Minden egyes mutáns törzset agy-sziv-infuziós (BHI) folyékony tápközeg 5 ml-ébe oltunk, vagy mintegy 1 x 10 mosott spórát tartalmazó koronggal,, vagy spórás ferde tenyészetről 1 mm-es kacsnyi baktériummal , és a tenyészetet 37-39 °C-on 16 órán keresztül rázatjuk. Ezt a tenyészetet o/n tenyészetnek nevezzük. Az o/n tenyészetből 1 mm-es oltókaccsal sugárirányban csikókat huzunk egy tápagaros lemezre egy l(^ul vizsgálandó vegyületet tartalmazó koronghoz, amelyet adott esetben patkánymáj-mikroszóma-frakcióval (S-9) előinkubálunk, a metabolikus aktiválás biztosítására. A lemezeket 37-39 °C-on inkubáljuk, majd finombeállitó sublerrel mérjük a szaporodás-gátlás távolságát (mm) a kerülettől számítva. Ha a vizsgálandó anyagot különböző koncentrációkban alkalmazzuk, egy koncentráció-függő szaporodás-gátlási görbét szerkeszthetünk, az érzékeny mutánsokkal ka^pott adatokból. Bizonyos vegyületeket nem vesz fel könnyen a baktérium, metabolikus. aktiválás nélkül. Az S-9 frakciónak nevezett máj-mikroszómákat Aroclor 1254-gyel (Litton Bionetics, Charleston, SC 19405) indukált Spargue-Dawley patkányokból preparáljuk. Az S-9 frakciót KCl-os homoger.i zátumként állítjuk elő, amelynek protein-koncentrációja 25-28 mg/ml. A fenti frakció lehet mikroszomális vagy poszt-mikroszomális, és a szövet eredetétől független.
A koktél
Sok promutagén/karcinogén vízben oldhatatlan. Ezért egy koktélt használunk, hogy a vizsgálandó vegyület tiszta vizes oldatát elegyíthessük a teszt-baktériumokkal és a hidrofil
S—9 frakcióval, ezáltal minimálisra csökkentsük az interferenciát a sugárforrással, és annak azon képességét, hogy a fenti baktériumok által szőrt sugárzásból DLS sémát fejlesszen ki.A koktél előnye, hogy vizes oldatban szolubilizálja azokat a vegyületeket, amelyek ismert eljárásokkal, dimetil-szulfoxid (DMSO), etanol vagy aceton alkalmazásával nem könnyen szolubilizálódnak a. vizes vizsgálati rendszerbe való bevitel előtt. Ezenkívül a koktél nem toxikus a vizsgálatban használt baktériumokra nézve, és nem gátolja az S-9 frakció enzimjeit abban, hogy a vizsgálandó vegyületeket metabolizálják. A találmány szerinti biológiai vizsgálati eljárás egyik előnyös megvalósítási módja értelmében COREXIT 7664 Oil Dispersant néven forgalomba hozott diszpergálószert (Exxon Chemicals, Clark, New Jersey, USA) és EMULPHOR EL-620 néven forgalomba hozott neir.ionos felületaktív szert (GAF Corp., 140 West 51 Street, New York, N.Y. 10020, USA) használunk. Mind a COREXIT diszpergálószer, mind az EMULFHOR felületaktív szer könnyen beszerezhető, és mind a vegyészek, mind a kereskedelmi felhasználók által jól ismert. A fenti termékek kémiai öszszetételét a gyártó cégek titokban tartják.
Az EMULPHOR felületaktív szer egy polietoxilezett növényi olaj .
°C-on tiszta, világosbarna folyadék, amelynek fajlagos tömege a fenti hőmérsékleten 1,04 - 1,05 és viszkozitása 600 - 1000 cps. 25 °C-on vízben könnyen oldódik, és semlegesítési száma maximum 0,5. Amint említettük, ezt a készítményt azért választittuk, mert Bacillus subtilis baktériumokkal szemben nem toxikus, ha a vizsgálandó kémiai mintával, a baktériumokkal és a hidrofil S-9 frakcióval elegyítjük (amennyiben metabolikus aktiválás szükséges), tiszta szuszpenziót kapunk, amely nem zavar18 ja a lézer-sugár behatoló képességét, vagy a sugárzás szóródásának intenzitását.
A COREXIT 7664 egy felületaktív észter, színe halvány borostyánsárga, és alkoholos szaga van. 15,6 °C-on fajlagos tömege 1,03, sűrűsége 8,59, és viszkozitása 29. Friss vízben és tengervízben oldódik, és szénhidrogénekben diszpergálható. Mint említettük, ezt a terméket azért használjuk a koktélban, mert a baktériumokkal szemben nem toxikus, és a baktériumok vizes oldatával opálosodás nélkül elegyíthető, igy nem zavarja a lézersugárzást a szuszpenzión való áthatolásban.
Sugárforrás
A biológiai vizsgálat 1 sugárforrása egy lézer, mint például a 4 541 719 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Wyatt). Ez a berendezés 15 szög-helyzetben méri a szóródás intenzitását, aminek következtében meghatározható a törésmutató, méret és alak közötti összefüggés. Ezenkívül a leolvasófej anódozott, leforrasztott, és közvetlenül csatlakozik a lézerfejhez, valamint egy integrált áramkör-táblához, ami optikai szerelőlapot, és egyben a detektor-elemeknek zárt helyet jelent. A találmány szerinti előnyös megoldásban használt lézer jellemzői az alábbiak:
fényforrás: 5 mW He-Ne lézer, 7) = 632,8 nm, síkban polarizált egyidejűleg mért szögek: 15 0 0,2 < sin 0/2 < 0,9^ 0,05-kénti lépésekben computer interface: parallel analóg outputok 16-csatornás, 12 bites A/D programmozható multiplexerhez csatlakoztatva adatgyűjtés; 12500 átalakítás/másodperc - 25000 átalakítás/másodperc • · · · ·· ·· • * · · egyes részecskék mérése: koncentráció <( 5 x lCr/ml, méret (törésmutatótól függően) 0,6 - 50 ^um detektorok: transzimpedancia fotodiódák, beépített erősítőkkel detektor output dinamikus tartomány: 0 - 10 V dinamikus tartomány: 10 linearitás: + 0,1 % sötétáram zaj: +0,2 mV.
A fenti lézer-berendezés a találmány szerinti előnyös megoldás részét képezi, de természetesn alkalmazható bármely más olyan lézer-berendezés is, amellyel a találmány szerinti biológiai vizsgálat elvégezhető.
Példák a sugárzásos biológiai vizsgálatra
A találmány szerinti biológiai vizsgálatban példaként a 4-nitro-kinolin-N-oxidot (4NQ0), N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidint (MNNG), benzo/a/pirént (B/a/P) és az 1,2,3,4,5,6-hexaklór-ciklohexánt (lindán) vizsgáljuk. A 4NQ0 és az MNNG bizonyítottan mutagén és DNS-kárositó hatással rendelkeznek baktériumokban, vízben oldhatók és karcinogén aktivitással rendelkező, közvetlenül ható genotoxikus vegyületek. A B/a/P ismerten prokarcinogén/mutagén hatású, vizes rendszerben oldhatatlan, és patkánymáj mikroszoma frakcióval (S-9) aktiválni kell ahhoz, hogy elektrofillé váljon, és DNS-károsodást vagy mutagén választ okozzon. A lindán olyan vegyület, amelyet nehéz genotoxikus aktivitás szempontjából vizsgálni a technika állásából ismert mutagén vizsgálatokkal.
A találmány szerinti biológiai vizsgálatot előnyösen az alábbiak szerint végezzük.
1) A megfelelő Bacillus subtilis törzset és a dehidra···· · · ·· ·* • · · · · · • · · · · · · • · · ♦ · ♦ · tált tápközeget tartalmazó liofilizált tablettákat vizet tartalmazó küvettákba helyezzük. Az alább ismertetett példákban megadott, megfelelő koncentrációjú baktériumsejt-szuszpenziókat is használhatunk.
2) Az inokulumot tartalmazó küvettákat inkubátor-kamrába helyezzük, amelyet 37 - 39 °C-ra előmelegítettünk, és az inkubálást 1-1,5 órán kérészül folytatva a tenyészetet vizsgálatra kész állapotba hozzuk.
3) A küvettákba bemérjük a vizsgálandó, illetve kontroll anyagot, minden egyes teszt-organizmus esetén 2 küvettában végezzük a vizsgálatot. A vizsgálatokban vizsgálandó anyagot nem tartalmazó negatív kontrollt, és pozitív kontrollt is használunk, az utóbbi olyan koncentrációban tartalmaz egy ismerten toxikus vegyületet, amelyben a toxikus választ már meghatároztuk.
4) A küvettákat 37 - 39 °C-on 1 percen keresztül inkubáljuk, minden egyes küvettát legalább 50-szer olvasunk le (a teljes leolvasási idő mintánként 30 másodperc).
5) Az inkubálást 37 - 39 °C-on 60 - 70 percen keresztül folytatjuk, és minden egyes küvettát ismét legalább 50-szer leolvasunk.
6) A mintákat értékeljük, és kiértékeljük a bakteriális választ.
x A baktériumokat vegetatív sejtek vagy spórák formájában liof ilizálhat juk, kapszula forrná jábani.. Abban az esetben, ha spórákat használunk - amely forma stabilitása miatt előnyös -, azokat az inkubálás előtt 8-10 percen keresztül 60 °C-on hőkezelni kell.
A találmány szerinti eljárást az alábbiak szerint is végezhetjük.
» · · · • · · ·
1) A mintát vizes oldatban szolubilizáljuk. Vízben oldhatatlan minták esetén a minta kicsapódásának megakadályozására megfelelő mennyiségű koktélt használunk.
2) A szolubilizált mintából sorozathigitást készítünk.
3) A baktérium-spórákat és dehidratált tápközeget tartalmazó kapszulát vizet tartalmazó küvettába helyezzük.
4) A baktériumot tartalmazó küvettába a szolubilizált minta minden egyes hígításából meghatározott mennyiséget mérünk, és a küvettát 37 - 39 °C-on inkubáljuk. Vizsgálandó anyagot nem tartalmazó negatív kontrollt és egy pozitív kontrollt is készítünk, amely toxikus anyagot tartalmaz olyan koncentrációban, amelyben a választ már meghatároztuk.
5) A mintákat a relatív szaporodás meghatározására amelyet a részecskeszám növekedése jelez - minden egyes hígításban a 0., 6. és 66. percben leolvassuk.
7) A mért adatokat az ismert vegyületek mért adataival összehasonlítva meghatározzuk a megfelelő válasz-profilt.
8) Ismert dózis-hatás görbéből meghatározzuk a koncentrációt. Ha a minta ismeretlen, odaillő kémiai válasz keresünk, aminek alapján a mintát azonosítjuk, és koncentrációját meghatározzuk .
Természetesen a negatív kontroll 4-nitro-kinolin-N-oxiddalvagy 4-nitro-kinolin-l-oxiddal kezelt baktériumok kontroll mintája és benzo/a/pirénnel kezelt baktériumok pozitív kontrollja is lehet.
A találmány szerinti biológiai vizsgálatra a baktériumsejteket megfelelő koncentrációban úgy tenyésztjük, hogy a Bacillus subtilis törzseket 1 ml agy-sziv-infuziós folyékony tápközeg• · * · · ··· · • · · · · · ·
- 22 ben (BHI) 20 percen keresztül hő-sokkoljuk. A tenyészethez még annyi folyékony tápközeget adunk, hogy az abszorpció 540 nm-en (A540) θ,2 legyen. A tenyészeteket 37 - 39 °C-on A^q = 0,5 eléréséig inkubáljuk, ez mintegy 2 óra alatt következik be. Azokat a tenyészeteket, amelyek a fenti optikai denzitás elérésére hosszabb időt igényelnek, nem tekintjük alkalmasnak a biológiai vizsgálatra. A megfelelőnek talált tenyészeteket BHI tápközeggel A540 = 0,3 értékre hígítjuk, igy mintegy 2 x 10 baktérium/ml koncentrációjú tenyészetet kapunk. Ha a sejteket a küvetta-vizsgáβ lathoz .szükséges mennyiségre hígítjuk, a sejtkoncentráció 10° baktérium/ml lesz.
| 1. | Metabolikus aktiválás nélküli biológiai vizsgálat (küvetta-vizsgálát) Vegyületek és baktérium-izcszett: 4NQ0-t vizsgálunk 8,5, 4,2 és 2,1 /Ug/ml végkoncent- |
| rációban, | Bacillus subtilis recE4 (6), 168 vagy vad tipusu 168 (11) |
törzset használva. Az egyes vizsgálatok DLS sémáját a 2a - 2d ábrák mutatják.
Az MNNG-t 3,6 /Ug/ml végkoncentrációban vizsgáljuk, a és 11 törzzsel. A vizsgálatok DLS sémáját a 3a és 3b ábra mutatja.
A lindánt 53,7 és 107 /Ug/ml végkoncentrációkban vizsgáljuk Bacillus subtilis FH2006-7 (10) és 11 törzzsel. A vizsgálatok DLS sémáját az 5a - 5d ábrák mutatják.
Módszer
13,6 ml 37 - 39 °C-os ionmentes vizet tartalmazó csavaros kupaku csőbe 0,3 ml baktrériumot és 0,1 ml vizsgálandó vegyületet pipettázunk. A csövet óvatosan megfordítjuk és tartalmát ···* · · ♦ ♦ · ♦ • · « » · » • · · · · · · • · · · · · ·
- 23 küvettába öntjük. A küvettát a lézerrel megvilágítjuk, és a szórt fény intenzitását mérjük és értékeljük.
A küvettát ezután 37 - 39 °C-on mintegy 1 órán keresztül inkubáljuk, és azonos módon megvilágítjuk. A baktériumok negatív kontrollját ionmentes vízben párhuzamosan vizsgálva minden egyes törzsnél meghatározzuk az alapvonal-értéket.
A meghatározást úgy is elvégezhetjük, hogy liofilizált baktériumot és megfelelő mennyiségű dehidratált BHI-t használunk, amely a vizsgálat alatt biztosítja a baktériumok szaporodását. A leolvasáshoz szükséges' folyadék-mennyiség a küvettában összesen 10 ml. Ezért a sejtek tápközegének rehidratálására mintegy 0,4 ml folyadékot használunk. Az inkubációs idő változatlan, és a megvilágításokat 15 perces időközökben végezzük.
2. Biológiai vizsgálat metabolikus aktiválással (előinku- bálás)
Vegyület és baktérium-izoszett:
B/a/P-t vizsgálunk, 15,1 és 7,6 /Ug/ml végkoncentrációkban, Bacillus subtilis 11 és TKJ6321 (19) törzset használva.
Módszer
Nagyméretű, kupakos kémcsőbe 0,5 ml COREXIT-et, 0,5 ml EMULPHOR-t, 0,5 ml megfelelő koncentrációjú B/a/P-t, 0,5 ml S-9 frakciót és 0,3 ml baktériumot pipettázunk. A térfogatot 37 °C-ra előmelegített ionmentes vízzel 14 ml-re kiegészítjük. Minden egyes törzs esetén COREXIT-et, EMULPHOR-t, S-9 frakciót és ionmentes vizet tartalmazó kontrollt is készítünk, a vizsgálandó mintában alkalmazott arányoknak megfelelően. A csöveket vízfürdős rázógépen mintegy 1 órán keresztül inkubáljuk. Az inkubálás befejeztével a csövek tartalmát küvettákba töltjük, és a szórt fény • ·
-24intenzit ását mér jük és kiértékeljük, a méréseket a 0. és 60. percvégezzük, az előzőekben leirtak szerint.
Ha liofilizált baktériumot és tápközeget használunk, kisebb mennyiségű baktériumot használunk a kívánt kezdeti optikai sűrűség elérésére 1 óra alatt, a baktérium vizsgálandó vegyülettel való kezelése előtt. A COREXIT, EMULPHOR és S-9 frakció térfogata egyenként mintegy 180 yul/5 ml minta.
3. Biológiai vizsgálat metabolikus aktiválással (küvetta inkubálás)
Vegyület és baktérium-izoszett:
B/a/P-t vizsgálunk, 15,1 és 7,6 /Ug/ml végkoncentrációban, Bacillus subtilis 11 és TKJ6321 (19) törzset használva. A kapott DLS sémákat a 4a - 4d ábrákon mutatjuk be.
Módszer
Letapogató küvettába annyi COREXIT-et pipettázunk, amennyi megakadályozza a B/a/P kicsapódását, amikor hozzáadjuk a baktériumot és S-9 frakciót tartalmazó vizes inkubációs elegyhez. A COREXIT-B/a/P elegyet 0,5 ml S-9 frakcióval és 0,3 ml baktériummal együtt küvettába mérjük, és az össztérfogatot 37 °C-ra előmelegített ionmentes vízzel 14 ml-re állítjuk. Minden egyes vizsgált törzs esetén elkészítünk egy kontroll csövet is. A küvettákat leolvassuk és a szórt intenzitásokat a 0. és 60. percben értékeljük, az előzőekben leirtak szerint.
Úgy is eljárhatunk, hogy az S-9 frakció és a baktérium bemérése előtt a COREXIT-ből, EMULPHOR-ból és vízből vizes koktélt készítünk. Ekkor 180 ^ul EMULPHOR-t és 180 /U1 COREXIT-et adunk 5-5 ml ionmentes vízhez, és összekeverjük. A vizsgálat megkezdésekor 180 /U1 S-9 frakciót adunk hozzá annyi liofilizált bak• w • e • · tóriummal és tápközeggel, hogy a sejt-koncentráció 10θ baktérium/ml legyen.
Válasz kiértékelése
A biológiai vizsgálat kiértékelése úgy történik, hogy mérjük a DLS görbe magasságát, ami a baktériumszám függvénye, és a vizsgált vegyülettel kapott görbe és a kontroll görbe csúcsa közötti eltolódás nagyságát, amely jellemző a baktériumok alakjában és méretében bekövetkezett morfológiai változások mértékére. Az igy kapott indexek a toxikus választ és a DNS-kárositó (genotoxikus) potenciált azonnal jelzik, és a vegyület azonosítására alkalmas izoszettek is azonosíthatók.
Az egyes sémák magasságának méréséből a baktériumszámra lehet következtetni, ezért a toxicitásnak ez a fő indikátora.
A morfológiai változások felismerésére szolgáló értékelési technika kifejlesztésekor felismertük, hogy van egy függvény, amely a görbe kezdetétől végéig zárt intervallumban folytonos. Bármely két szomszédos pont közötti szakasz ivet alkot, és az X-tengely minden egyes pontjával csak egyetlen pont kapcsolódik a sémában. Digitalizáló táblázatot használva megfelelő nagy számban kaphatunk olyan pontokat, hogy az összes szomszédos pontok közötti távolságok összege a görbe hosszát megközelítse. Ezt a görbe ívhosszaként definiáltuk. Az ívhossz változása a baktérium morfológiai változásának felel meg, közelebbről az egyes sejtek méretével van kapcsolatban. Egy vegyület bizonyos koncentrációjával végzett kezelésre adott válasz értelmezésének leegyszerűsítésére egy 3 számjegyű rendszert fejlesztettünk ki, amelyek mindegyike egy választ indikál. A válasz jellegét 1-től 4-ig terjedő számmal értékeljük, a görbe magasságával és az ··»· ·· ·* ·· • · » · · · • « · ··· · • · · · · · 4
- 26 eltolódás irányával összhangban, ami a baktérium-populációra kifejtett hatás típusával van összefüggésben. A kezelés-sorozat indexeinek meghatározására mérjük egy alapvonal-kontroli minta baktériumszám-változását és DLS sémáját. A további kezeléseket és kontroll mintákat az alapvonal-válasszal hasonlítjuk össze.
Indexek kiszámítása
Négy sémát digitalizálunk a következő sorrendben: kontroll a 0. és 60. percben; kezelt minta a 0. és 60. percben. Az egyes sémákra a fenti sorrendben meghatározzuk a válasz-indexeket, úgy, hogy kiszámítjuk a szomszédos pontok közötti távolságot a görbén, ívhosszként. A baktériumszám-index meghatározására kiszámítjuk a koordináta-párok átlagos Y értékét. A 0. időpontban mért kontrollt tekintjük alapvonal-kontrolinak. Az összes többi görbére kiszámítjuk a százalékos eltérést a séma átlagos Y értéke és az alapvonal-séma átlagos Y értéke között. A negyedrendű Y-index meghatározására az^Y %-os eltérését osztjuk 5-tel, és ha az eltérés pozitív, 1-et hozzáadunk, ha az eltérés negatív, 1-et kivonunk. A végső egész szám értéket megtartjuk. Kiszámítjuk a %-os eltérést a vizsgálati séma ívhossza és az alapvonal-séma ívhossza között. A negyedrendű ív-index meghatározására az ívhossz %_os változását osztjuk 5-tel, és ha a változás pozitív, 1-et hozzáadunk, ha a változás negatív, 2-t kivonunk. Az egész szám értéket megtartjuk.
A három számjegy mindegyike a PRI indexben balról jobbra az alábbi táblázatból származik, a sémák negyedrendű indexeivel összhangban, a 0 időpontban felvett kontrollal kezdve összehasonlításként, és a 60 perces kontrollal első számjegy ként .
| Negyedrendű | Negyedrendű | PRI számjegy |
| Y-index | iv-index | értéke |
| + | + | 1 |
| + | - | 2 |
| - | - | 3 |
| — | + | 4 |
A biológiai értelmezés a számjegyek alapján az alábbi módon történhet:
a baktériumszám növekedését jelenti, a baktériumok méretének egyidejű csökkenésével (pozitív eltolódás), és nem-toxikus választ; gyorsan osztódó sejtek esetén normális, hogy méretükben csökkenés tapasztalható a baktériumszám növekedését jelenti, a méret egyidejű növekedésével (negatív eltolódás), és minimális toxikus választ a baktériumszám csökkenését, és egyidejűleg a méret növedését (negatív eltolódás), és toxikus vagy letális választ jelent a baktériumszám csökkenését és egyidejűleg a méret csökkenését (pozitív eltolódás), és toxikus vagy letális választ jelent.
Az egyes indexelt sémák tercier válaszát úgy kapjuk, hogy a negyedrendű Y-indexet osztjuk a negyedrendű iv-indexszel. A másodlagos válasz—indexet (SRI) úgy határozzuk meg, hogy kiszámítjuk a tercier indexek összegét, együtt az összes indexelt * « «··« 4« • ο · « a · · ··· • · · · • ·· ··
- 28 sémára. A fenti számítási módszert az alábbi, vizsgálatból származó adatokkal szemléltetjük:
| Y átlag | ívhossz | %-os Y | változás ívhossz | Negyedrendű Y-index | Negyedrendű iv-index | Harmadlagos válasz-index | Másodlagos válasz-index | Elsődleges válás z-index |
| 712,0 | 2064,0 | N/A | N/A | N/A | N/A | |||
| 974,7 | 2217,6 | 36,89 | 7,44 | 8 | 2 | 16 | ||
| 697,4 | 2013,9 | -2,05 | 2,43 | -1 | -1 | 1 | ||
| 824,6 | 2030,5 | 15,81 | -1,63 | 4 | -1 | -4 | 13 | 132 |
A PRI 132 érték értelmezése az, hogy a 66 perces kontroll normálisan szaporodik, mivel az első számjegy az 1. A kezelt mintában a 0 időpontban a baktériumszám csökken és egyidejűleg a méret nő, mivel a második számjegy a 3. A 66. percben a kezelt mintában a baktériumszám növekedik és egyidejűleg a méret nő, mivel a harmadik számjegy 2.
A PRI két extrém esetben 133 és 144. Ezek az azonnali toxikus válaszra példák, amiből a sejt nem tud regenerálódni. A 133 PRI érték mutatja, hogy a sejt megnagyobbodik, mig a 144 PRI érték azt jelzi, hogy a sejt zsugorodik, mindkettő esetén a sejt képtelen a regenerálódásra, de a hatásmechanizmusok eltérőek. A PRI első számjegyeként a 3 vagy 4 azt jelzi, hogy a vizsgálat nem értékelhető, mivel a kontroll baktériumtenyészet nem szaporodik normálisan.
A baktériumok szaporodásának vagy a szaporodás gátlásának pontos meghatározására a vizsgált mintában a kontroll baktériumokhoz viszonyítva alkalmas az úgynevezett screening score
V··· ·· «4 «· • · · · · · • · · ··· · • · · · * · · (S), amelyet a DLS-eltolódási értékekkel definiáltak /Wyatt P.J., Phillips E.T., Scher M.G., Kahn M.R. és Allém E.H.: J. Agric.
Food Chem. 25, 1080 (1977); Wyatt P.J., Scher M.G. és Phillips D. T.: J. Agric. Food Chem. 2_5, 1086 (1977)/. Eszerint
10(Dbc/300) - 10(Dc/300)
S = 300 lóg
10(Dbt/300) - 10(Dt/300) ahol
Dbc a vizsgálati tápközeg + baktérium DLS-eltolódása a vizsgálati tápközeghez (kontroll) képest,
De a kontroll vakpróba eltolódása magához képest (értéke 0, ha nincs háttér-interferencia)
Dbt a vizsgált anyag + tápközeg + baktérium eltolódása a kontrolihoz képest
Dt a vizsgált anyag + tápközeg eltolódása a kontroll vakpróbához képest.
Az egyenlet a logaritmikus DLS séma adatokat lineáris formába alakítja vissza, úgy, hogy a hátteret levonja, ennélfogva szokásos logaritmikus formába alakítja. Az egyenlet egy 300-as faktort ad meg a kontroll baktériumok vizsgált baktériumokhoz viszonyított 10-szeres szaporodására.
Index-számítások alkalmazása a vizsgált mintákra
Az összes ábrán a kezeletlen 0 időponthoz tartozó kontrollt összefüggő vonal (------), az 1 órás kezeletlen kontrollt pontozott vonal (......), a 0 időponthoz tartozó kezelt mintát nagy közökkel megszakított szaggatott vonal (————)} az 1 órás kezelt mintát kis közökkel megszakított szaggatott vonal (-----) jelöli.
- 30 4NQ0 DLS toxicitási válaszai
A 2a - 2d ábrákon láthatók a 6. törzs (rec 34) és a
11. törzs (168 vad típus) DLS-válaszának görbéi. A 0 és 1 órás minták átlagos Y-értékeiből kitűnik, hogy az összes kezeletlen kontroliban növekedik a sejtszám. A 2a és 2b ábrákból látható, hogy a 4NQ0 4,2 /Ug/ml és 2,1 /Ug/ml koncentrációban növekedést okoz az ívhosszakban és a görbék balra tolódnak a negatív 0 időpontos kontroll fényszórási szögeihez viszonyítva. A relatív intenzitás kevésbé növekedik a 0 időponttól 1 óráig tartó intervallumban. A 2c ábrából látható, hogy 8,5 /Ug/ml 4NQ0 az ívhossz csökkenését okozza, és a görbe balra tolódik a negatív 0 időpontos kontroll fényszórási szögeihez képest. Azonban 4,2 /Ug/ml koncentrációban az Ívhossz változása nem lényeges, és a görbe eltolódása a fényszórási szögek vonatkozásában kismértékű a nagyobb szögek felé.
A válasz-index számításokat felhasználva az alábbiak szerint értelmezhetjük az eredményeket. A 6. törzs PRI értéke 132 és 131, a 4,2 illetve 2,1/Ug/ml koncentrációnál. 4,2 /Ug/ml koncentrációnál azonnali toxikus és letális hatás tapasztalható a 0 időpontban. A baktériumok kismértékben regenerálódnak, mivel a sejtszám a 60. percre növekedik. Azonban a baktériumok mérete a normálisnál nagyobb marad. 2,1 /Ug/ml koncentárciónál azonnali, toxikus és letális hatás észlelhető a 0 időpontban, de a 60. percre a sejtszám növekedik és a sejtek mérete normális. A 11. törzset azonban 4,2 yug/ml koncentrációban nem károsítja a 4NQ0. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a 11. törzs ellenállóbb a 4NQ0 hatásával szemben, mint a 6. törzs, még akkor is, ha a 11. törzset magasabb dózissal kezeljük. A genotoxikus megnyilvánulás elsődleges válasz-szinten fejeződik ki.
MNNG DLS toxicitási válaszai
A 3a ás 3b ábrákon láthatók a 6. törzs (rec E4) és a
11. törzs (168 vad típus) DLS-válaszának görbéi. A 0 és 1 órás minták átlagos Y-értékeiből látható, hogy az összes kezeletlen kontroliban növekedik a sejtszám. A 3a ábrán látható, hogy 3,6 /Ug/ml MNNG hatására, csökken az ívhossz, és a görbe balra tolódik a negatív 0 időpontos kontroll fényszórási szögeihez viszonyítva. A relatív intenzitás kevésbé növekedik, mint a negatív kontroliban a 0. időponttól 1 órás időpontig terjedő intervallumban.
A 3b ábrán látható, hogy 3,6 /Ug/ml MNNG nem okoz ívhossz-csökkenést, bár az ívhossz-növekedés alig kisebb, mint a negatív kontrolié. A görbe eltolódása a fényszórási szögek vonatkozásában a nagyobb szögek irányába majdnem megközelíti a negatív 0 időpontos kontrollt.
A válasz-index számításokat alkalmazva ezeket az eredményeket az alábbiak szerint értelmezhetjük. A 6. törzs PRI értéke 3,6 /Ug/ml koncentrációnál 132, ami azonnali toxikus és letális hatást jelent a 0 időpontban. A baktériumok bizonyos mértékben regenerálódnak, mivel a sejtszám a 60. percre növekszik. Azonban a baktériumok mérete a normálisnál nagyobb marad. A 11. törzs PRI értéke 3,6 /Ug/ml koncentrációnál 111, azaz nem mutat toxikus választ a vegyületre sem azonnal, sem a kezelést követő 60. percben. Ez egy elsődleges válasz-szinten kifejeződött genotoxikus válasz. Ezenkívül a 6. és 11. törzs SRI értéke -3, illetve 19. A 6. törzs negatív másodlagos válasza a 11. törzs pozitív SRI értékével összehasonlítva azt jelzi, hogy az MNNG-nek genotoxikus hatása van, amelyet a vad tipusu törzs (11.
• ·
- 32 törzs) képes kijavítani, de a Rec- mutáns törzs (6. törzs) nem.
Lindán DLS toxicitási válaszai
Az 5a - 5d ábrák mutatják a 10. törzs (FH2006-7) és a
11. törzs (vad tipusu 168) DLS-válaszának görbéit. A 0 és 1 órás minták átlagos Y-értékeiből látható, hogy az összes kezeletlen kontroliban növekedik a sejtszám. Az 5a és 5b ábrából látható, hogy a lindán 107 /Ug/ml illetve 53,6 /Ug/ml koncentrációban kezdetben az ívhosszak csökkenését eredményezi és a görbék balra tolódnak el a negatív 0 időpontos kontroll fényszórási szögeihez viszonyítva. Azonban az alacsonyabb koncentrációban a 60. percben pozitív eltolódás tapasztalható. A relatív intenzitás nem változik lényegesen a 0 időponttól 1 órás időpontig terjedő intervallumban a magasabb koncentráció esetén. Az,ónban az alacsonyabb koncentrációnál növekedést észlelünk.
Az 5c és 5d ábrákból látható, hogy a lindán mindkét koncentrációban kezdeti csökkenést okoz az ívhosszban és a görbe balra tolódik el a negatív 0 időpontos kontroll fényszórási szögeihez viszonyítva. Azonban az ívhosszak növekednek és a fényszórási szög jobbra tolódik el a negatív 0 időpontos kontrolihoz viszonyítva, 1 óra elteltével.
A válasz-index számításokat alkalmazva az eredményeket az alábbiak szerint értékelhetjük. A 10. törzs 107 és 53,6 /Ug/ml koncentrációban 222 illetve 131 PRI értékkel rendelkezik. 107 /Ug/ml koncentrációnál toxikus és nyújtott hatás (sejt-nagyobbodás) látható. Azonban 53,6 /ug/ml koncentrációnál a baktériumok 60 perc elteltével regenerálódnak. A 11. törzs PRI értéke mindkét koncentrációnál 131. Ez azt jelenti, hogy mindkét koncentrációnál letális hatás és sejt-nagyobbodás észlelhető, de egy óra múlva a baktérium teljesen regenerálódik, ami a sejtszaporodásban és a normális méretre való visszaállásban egyaránt megnyilvánul. Noha a lindán magasabb koncentrációja esetén a 10. törzs kissé erősebben reagál, mint a 11. törzs, a PRI értékek különbsége úgy tűnik, hogy nem alkalmas a toxicitás becslésére. Az SRI értékek azonban jelentősen különböznek a 10. és 11. törzs esetén. Az SRI érték a 10. törzsre 107 /Ug/ml és 53,6 /Ug/ml koncentráció esetén -19, illetve 7. Az SRI érték dózis-függése a 10. törzsnél megfigyelhető, mig a 11. törzsnél nem, és ez jelzi a lindán genotoxikus hatását, amit a magasabb dózis esetén a negatív SRI érték mutat. A 11. törzs - amint a pozitív SRI értékek mutatják mindkét koncentráció esetén képes a genetikus károsodás kijavítására és a normális osztódásra. A 10. törzs csak az alacsonyabb koncentráció (53,6 /Ug/ml) esetén képes a genetikus károsodás kijavítására és normális osztódásra.
Ezekből az eredményekből látható, hogy az elsődleges citotoxicitást egy három számjegyű számmal lehet kifejezni. Mutáns és vad tipusu baktériumok elsődleges válaszának felhasználásával bizonyos erősen toxikus vegyületek - például az MNNG és 4NQ0 - genotoxikus aktivitása is kimutatható. Bizonyos vegyületek - például B/a/P - S-9 frakcióval való aktiválás után nem bizonyultak genotoxikusnak az elsődleges válasz-szintet vizsgálva egyedül. A genotoxikus hatás azonban meghatározható, ha kiszámítjuk a másodlagos választ. Más vegyületek - például a lindán - genotoxikus hatását, amelyet a technika állásából ismert mutagén vizsgálatokkal nehéz vagy lehetetlen kimutatni, a találmány szerinti biológiai vizsgálattal egyszerűen kimutathatjuk, a másodlagos válasz-indexek kiszámításával.
Claims (32)
- Szabadalmi igénypontok1. Berendezés minták biológiai vizsgálatára, baktériumok morfológiai változásai meghatározásával, azzal jellemezve , hogy (a) a mintával kezelt, morfológiailag megváltozott baktériumokból szórt sugárzást generáló eszközökből és (b) a szórt sugárzást detektáló eszközökből és a detektált szórt sugárzást képviselő sémát generáló eszközökből áll.
- 2. Az 1. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy (c) a baktérium ismert mintával való kezelésével generált, legalább egy referencia-sémával rendelkező referencia-eszközöket és (d) a minta azonosítására és mennyiségi meghatározására a referencia-sémát a minta sémájával összehasonlító eszközöket is tartalmaz.
- 3. A 2. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a baktérium Bacillus subtilis, Bacillus subtilis izogén mutáns törzs, vagy egy alábbi Bacillus subtilis törzs: recAl, recA8, recB2, recC5, recD3, RecE4, recG13, mc-1, m45, T-l, TKJ8201, hrc-9, TKJ8206, FH2006-7, HJ15, TKJ5211, TKJ6321, HS 101, 168 és 168 (vad típus).
- 4. A 2. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a baktériumok a meghatározandó vegyületre adott válasz definiálásához szükséges minimális számú mutáns törzsből álló szettet foglalnak magukban.
- 5. Az 1. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a detektálásra szolgáló eszközök olyan eszközöket foglalnak magukban, amelyek egy kontroll mintában és egy meghatározandó mintában a 0 időpontban és legalább egy választott időpontban detektálják a szórt sugárzás intenzitását .
- 6. Az 5. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy magában foglalja a séma x-y koordinátarendszerbeni grafikus ábrázolására alkalmas eszközöket, ahol az x tengely a szórási szöget és az y tengely a relatív szórt intenzitást jelenti;a fenti séma kiértékelésére alkalmas eszközöket, a séma magasságának mérésével, és legalább egy csúcs eltolódásának kiszámításával ;a kiértékelésre alkalmas eszközök magukban foglalják a séma olyan x és y koordinátáinak meghatározására szolgáló eszközöket, ahol az x tengely a baktériumszámnak és az y tengely a baktériumok méretében és alakjában bekövetkezett morfológiai változásoknak felel meg;a görbe ívhosszának meghatározására alkalmas eszközöket, a szomszédos x koordináták közötti távolságok összegzésével;a séma minden egyes koordinátapárjára az átlagos Y érték kiszámítására alkalmas eszközöket;eszközöket a kontroll séma átlagos Y értékei és a minta séma átlagos Y értékei közötti %-os változás kiszámítására, a negyedrendű Y-index meghatározására alkalmas eszközöket, az Y- 36 %-os változása 5-tel való osztásával, és ha a változás pozitív,1 hozzáadásával, ha a változás negatív, 1 kivonásával;a kontroll séma ívhossza és a minta séma ívhossza közötti %-os változás meghatározására alkalmas eszközöket;eszközöket a negyedrendű iv-index meghatározására, az ívhossz %-os változása 5-tel való osztásával, és ha a változás pozitív, 1 hozzáadásával, ha a változás negatív, 1 kivonásával;eszközöket az elsődleges válasz-index számértének meghatározására, az alábbi táblázat alapján:Negyedrendű NegyedrendűY-index iv-indexElsődleges válasz-index számértéke + +1 + -2 +4 ahol1 a baktériumszám növekedését jelzi a baktériumméret egyidejű csökkenésével, és nem-toxikus választ,2 a baktériumszám növekedését jelzi a méret egyidejű növekedésével, és kismértékű toxikus választ,3 a baktériumszám csökkenését jelzi a méret egyidejű növekedésével, és letális toxikus választ,4 a baktériumszám csökkenését jelzi a méret egyidejű csökkenésével, és letális toxikus választ.
- 7. Az 5. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a tercier válasz-index kiszámítására alkalmas eszközöket is magában foglal, a negyedrendű Y-index és a negyedrendű iv-index szorzásával.
- 8. Az 5. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a másodlagos válasz-index kiszámítására alkalmas eszközöket is magában foglal, az indexelt sémák tercier indexeinek összegzésével.
- 9. Az 1. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a séma generálására szolgáló eszközök magukban foglalnak negatív kontroll generálására szolgáló eszközöket, 4-nitro-kinolin-N-oxiddal kezelt kontroll baktérium-minta sémájának ábrázolásával, és pozitív kontroll generálására szolgáló eszközöket, benzo/a/pirénnel kezelt kontroll baktérium-minta sémájának ábrázolásával.
- 10. Az 1. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy magában foglal a baktériumok metabolikus aktiválásába szolgáló eszközöket is, a baktériumok mikroszomális vagy posztmikroszomális frakcióval való kezelésével.
- 11. Az 1. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a minta vízben oldhatatlan, és a készülék tartalmaz felületaktív eszközöket és diszpergáló eszközöket is, amellyel a vízben oldhatatlan minta szuszpenzióban szolubilizálódik, és a szuszpenzió optikai tisztasága biztosítva van.
- 12. Az 1. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a minta polio'kietilezett növényi olajjal, előnyösen EMULPHOR EL-620-szal és diszpergálószerrel, előnyösen COREXIT 7664 Oil Dispersant-tal van szolubilizálva.
- 13. Az 1. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve , hogy a sugárzást generáló eszköz egy monokromatikus lézer.
- 14. Eljárás minták biológiai vizsgálatára, baktériumok morfológiai változásai meghatározásával, azzal jellemezve , hogy (a) a mintával kezelt, morfológiailag megváltozott baktériumból szórt sugárzást generálunk, és (b) a szórt sugárzást detektáljuk és a detektált szőrt sugárzást képviselő sémát készítünk.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy további lépésként a baktériumot ismert mintával kezelve legalább egy referencia-sémát készítünk és a kapott referencia-sémát az ismeretlen minta sémájával összehasonlítva azonosítjuk és mennyiségileg meghatározzuk a mintát.
- 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a baktériumokat és a mintát az alábbiak szerint kezeljük:(a) a mintát szolubilizáljuk, (b) a szolubilizált mintából sorozathigitást készítünk, (c) a baktériumot legalább egy tiszta optikai küvettába visszük, (d) a szolubilizált minta higitásaiból a baktériumot tartalmazó küvettába meghatározott mennyiséget mérünk.
- 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a mintát és a baktériumot mintegy 37 és 39 C közötti hőmérsékleten inkubáljuk.♦ ···
- 18. A 14, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy baktériumként Bacillus subtilist, egy izogén mutáns Bacillus subtilis törzset, vagy egy alábbi csoportba tartozó Bacillus subtilis törzset használunk: recAl, recA8, recB2, recC5, recD3, recR4, recG13, mc-1, m45, T-l, TKJ8201, hcr-9, TKJ8206, FH2006-7, HJ15, TKJ5211, TKJ6321,HA 101, 168 és 168 (vad típus).
- 19. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy baktériumként a mutáns törzsek olyan szettjét használjuk, amely a meghatározandó vegyületre adott válasz definiálásához szükséges minimális számú törzsből áll.
- 20. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a detektálás lépésében egy kontroll mintában és egy meghatározandó mintában a 0 időpontban és legalább egy választott időpontban detektáljuk a szórt sugárzás intenzitását.
- 21. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a séma elkészítésének lépésében a sémát egy x-y koordinátarendszerben grafikusan ábrázoljuk, ahol az x tengely a szórási szöget és az y tengely a relatív szórt intenzitást jelenti.
- 22. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a további lépésként a sémát olyan x és y koordinátákkal készítjük el, ahol az x tengely a baktériumszámot és az y tengely a baktérium méretében és alakjában bekövetkezett változást jelenti, • · • · meghatározzuk a séma ívhosszát a szomszédos x koordináták közötti távolságok összegzésével, kiszámítjuk az átlagos Y értéket a séma összes koordináta-párjára, kiszámítjuk a kontroll séma átlagos Y értéke és a minta séma átlagos Y értéke közötti %-os változást, meghatározzuk a negyedrendű Y-indexet az Y %-os változását 5-tel osztva, és ha a változás pozitív, 1-et hozzáadva, ha negatív, 1-et kivonva, kiszámítjuk a kontroll séma Ívhossza és a minta séma ívhossza közötti %-os változást, meghatározzuk a negyedrendű iv-indexet az ívhossz %-os változását5-tel osztva, és ha a változás pozitív, 1-et hozzáadva, ha negatív, egyet kivonva, és meghatározzuk az elsődleges válasz-index számértékét az alábbi táblázat alapján:Negyedrendű Negyedrendű ElsődlegesY-index ív-index válasz-index számértéke + +1 + -2- -3- +4 ahol1 a baktériumszám növekedését jelzi a baktériumméret egyidejű csökkenésével, és nem-toxikus választ,2 a baktériumszám növekedését jelzi a méret egyidejű növekedésével, és kismértékű toxikus választ,3 a baktériumszám csökkenését jelzi a méret egyidejű növekedésével, és letális toxikus választ,4 a baktériumszám csökkenését jelzi a méret egyidejű csökkenésével, és letális toxikus választ.
- 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy további lépésként a negyedrendű Y-indexet a negyedrendű iv-indexszel osztva kiszámítjuk a séma tercier válasz-indexét.
- 24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy további lépésként az összes indexelt séma tercier indexeinek összegzésével kiszámítjuk a másodlagos válasz-indexet.
- 25. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy ha a minta vízben oldhatatlan, további lépésként a vizoldhatatlan mintát szuszpenzióban szolubilizáljuk, és a szuszpenzió optikai tisztaságát felületaktív szer és diszpergálószer alkalmazásával tartjuk fenn.
- 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a szolubilizálásra polioxietilezett növényi olajat, előnyösen EMULPHOR EL-620-at, diszpergálószerként COREXIT 7664 Oil Dispersant-ot használunk.
- 27. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a sugárzást monokromatikus lézerrel generáljuk.
- 28. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy további lépésként negatív kontrollt készítünk 4-nitro-kinolin-N-oxiddal kezelt kontroll baktérium-minta görbéjének felvételével, és pozitív kontroll készítünk benzo/a/pirénnel kezelt kontroll baktérium-minta görbéjének felvételével.
- 29. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a baktériumot mikroszomális vagy posztmikroszomális frakcióval kezelve metabolikusan aktiváljuk.
- 30. Bacillus subtilis baktériumtörzsekből álló készlet, amelyek mindegyike egyedi morfológiai változás-választ ad kémiai kezelésre, és eszközök a változások meghatározásra és értékelésére .
- 31. Készítmény kémiai minták szolubilizálására, a z zal jellemezve, hogy felületaktív szert és diszpergálószert tartalmaz, és a készítmény optikailag tiszta, ha a vizsgálati baktériumokkal elegyítjük, és a fenti baktériumokra nézve ártalmatlan.
- 32. Eljárás optikailag tiszta közeg előállítására sugárzás mérésén alapuló biológiai vizsgálatokhoz, azzal jellemezve , hogy egy vízben oldhatatlan mintát COREXIT 7664 diszpergálószerrel és EMULPHOR EL-620 nemionos felületaktív szerrel elegyítünk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US18289888A | 1988-04-18 | 1988-04-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU892635D0 HU892635D0 (en) | 1991-06-28 |
| HUT56189A true HUT56189A (en) | 1991-07-29 |
Family
ID=22670530
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU263589A HUT56189A (en) | 1988-04-18 | 1989-04-18 | Biological testing apparatus and method for detecting toxic materials by means of measuring of the morphologic variations of the bacteriums |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0449820A1 (hu) |
| JP (1) | JPH03505522A (hu) |
| AU (1) | AU3448889A (hu) |
| FI (1) | FI905113A0 (hu) |
| HU (1) | HUT56189A (hu) |
| WO (1) | WO1989010549A2 (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9118981D0 (en) * | 1991-09-05 | 1991-10-23 | Pa Consulting Services | Toxicity sensing |
| CA2092373A1 (en) * | 1992-04-24 | 1993-10-25 | Klaus W. Berndt | Methods and apparatus for detecting biological activities in a specimen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3730842A (en) * | 1970-05-04 | 1973-05-01 | Science Spectrum | Process for determining bacterial drug sensitivity |
| US4541719A (en) * | 1982-07-20 | 1985-09-17 | Wyatt Philip J | Method and apparatus for characterizing microparticles and measuring their response to their environment |
-
1989
- 1989-04-18 EP EP19890904987 patent/EP0449820A1/en not_active Withdrawn
- 1989-04-18 WO PCT/US1989/001564 patent/WO1989010549A2/en not_active Application Discontinuation
- 1989-04-18 AU AU34488/89A patent/AU3448889A/en not_active Abandoned
- 1989-04-18 HU HU263589A patent/HUT56189A/hu unknown
- 1989-04-18 JP JP50479989A patent/JPH03505522A/ja active Pending
-
1990
- 1990-10-17 FI FI905113A patent/FI905113A0/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3448889A (en) | 1989-11-24 |
| FI905113A0 (fi) | 1990-10-17 |
| EP0449820A1 (en) | 1991-10-09 |
| WO1989010549A2 (en) | 1989-11-02 |
| HU892635D0 (en) | 1991-06-28 |
| JPH03505522A (ja) | 1991-12-05 |
| WO1989010549A3 (en) | 1990-02-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Degens et al. | Development of a physiological approach to measuring the catabolic diversity of soil microbial communities | |
| Maquelin et al. | Identification of medically relevant microorganisms by vibrational spectroscopy | |
| Richardson et al. | A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test | |
| RU2126962C1 (ru) | Способ обнаружения микроорганизмов в образце, способ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотику и система для реализации таких способов | |
| Brams et al. | A comparative study, with 40 chemicals, of the efficiency of the Salmonella assay and the SOS chromotest (kit procedure) | |
| US6989246B2 (en) | Sensor formulation for simultaneously monitoring at least two components of a gas composition | |
| Madison | Application of stains in clinical microbiology | |
| Rebuffo-Scheer et al. | Rapid species and strain differentiation of non-tubercoulous mycobacteria by Fourier-Transform Infrared microspectroscopy | |
| US4256832A (en) | Carcinogen and mutagen screening method and apparatus | |
| McCann et al. | An evaluation of Salmonella (Ames) test data in the published literature: application of statistical procedures and analysis of mutagenic potency | |
| Allman et al. | Flow cytometric analysis of heterogeneous bacterial populations | |
| Ogodo et al. | Microbial techniques and methods: basic techniques and microscopy | |
| Amory et al. | Application of XPS to the surface analysis of yeast cells | |
| HUT56189A (en) | Biological testing apparatus and method for detecting toxic materials by means of measuring of the morphologic variations of the bacteriums | |
| Wright et al. | Determination of mean growth parameters of bacterial colonies immobilized in gelatin gel using a laser gel-cassette scanner | |
| MacGregor et al. | The sporulation system of Bacillus subtilis as the basis of a multi-gene mutagen screening test | |
| US4675288A (en) | Method for the performance of a mutagenicity test | |
| Busch et al. | Presence and measurement of sample histidine in the ames test: Quantification and possible elimination of a source of false‐positive mutagenicity test results | |
| JPH08173190A (ja) | 微生物の存在の検査法および該検査法に使用する検査キット | |
| Giltinan et al. | Design and analysis considerations in evaluating the chemiluminescence response of mouse spleen cells | |
| Stull | Clinical laboratory use of differential light scattering. I. Antibiotic susceptibility testing | |
| Greger et al. | Adenosine 5′-triphosphate content of Streptococcus mutans GS-5 during starvation in a buffered salt medium | |
| Felkner et al. | Newest approaches to quantitative assessment of bioactive organotins | |
| Barr | Variation in metabolism of biochemical test substrates by Klebsiella species: an epidemiological tool | |
| Felkner et al. | Laser/microbe bioassay system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee |