JPH03501486A - 組織の凍結方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組織の凍結方法 発明の背景 この発明は、一般に組織の凍結方法、かつ特に組織の細胞構造の変質を防止する ために、又は染色及び固定をするかりずに即時検査用に組織サンプルの凍結方法 に関する。

組織又は組織学的検査用に組織を凍結ずろ方法は公知であり利用可能である。例 えば液体窒素を用いる低温技術により組織を凍結することは、比較的に普通で、 手間のかかるものである。

その上、低温凍結した組織の急速かつ正確な検査をさまたげる細胞構造の損傷が 生ずることがある。

水産品の凍結方法が、名越に１９８６年７月２２日に付与された米国特許第４． ６０１．９０９号で知られている。この方法は、ナタネ油、プロピレングリコー ル、塩化カルシウムと水を含有する塩水を製造し、塩水を冷却し、シーフッドを 凍結するまで冷却塩水に浸漬する工程を含む。この方法は、シーフッド中の筋肉 組織の分解を減少さす。従って凍結製品の品質の劣化が防止又は減少する。

肉の急速凍結についての同様な方法か、同じ発明者に！９８７年３月３１日付付 与された米国特許第４，６５４．２１７号に開示し、クレームされている。この 特許に開示の方法は、その方法か牛肉、鶏肉、豚肉等に適用されろことを除いて 、ｉりの特許と同様である。

１９８７年４　Ｊｌ　１４日名越に付与された米国特許第４，６５７゜７６８号 は、生鮮食品の凍結方法を開示しており、その方法は生鮮食品に加熱を行う容器 に入れ、この容器の地表面を冷却塩水又は液化ガスに接触されるものである。従 って生鮮食品は、浸漬せずに急速に２１１枯される。

酒ノドに１９８７年９月！り」に付すされた米国特許第４，６８９．９６３号は 、食品の凍結方法に関する。この方法は、塩水の層が生鮮食品とともに加熱を行 う容器中に入れられることを除いて名越の方法と似ている。凍結は塩水と接して ぃろ１（分のみから進行し、食品が容器に付着する力が減少する。

これらの何れの特許にも、これらの方法が細胞又は組織学的検査用の組織サンプ ルを凍結するのに用いうるという教示又は示唆はない。

従って、細胞又は組織検査の目的で組織サンプルを凍結する方法を提供するのが 賓まれでいる。

この発明は、組織学又は細胞学的検査用の組織サンプルを急速に凍結する方法を ｎｔｌｇすることを目的とする。

この発明の更なる目的は、サンプルの細胞構造を分解させない組織サンプルの凍 結方法を提供することである。

この発明の池の目的は、組織サンプルの経済的な凍結方法を提供することにある 。

この発明の更に他の目的と利点は一部は明白で一部は明細書から明らかであろう 。

発明の要旨 一般的にいえば、この発明により細胞又は組織学的検査を目的とする組成物の凍 結方法が提供される。この方法はアブラナ科油を含有する塩水を作り、塩水を約 −２２〜−４３，６°　Ｆの間の温間に冷却し組成サンプルを得、これを組織サ ンプルが凍結するのに十分な時間冷却塩水に付する工程を含む。塩水は、一般に 適当な油に加えて、グリコール、塩と水を含む。

従って、この発明は、数工程からなり、これらの工程の各々に関しての１以上の 工程の関係は以後に開示される方法で例示されるであろう、かつこの発明の範囲 がクレームで示されるでこの発明による組織サンプルの凍結方法の第１工程は、 アブラナ科油を含む適当な塩水溶液の製造である。好ましい具体例では、アブラ ナ属の植物からの油が用いられる。この油には、ブラシカカンペストリス（Ｂｒ ａｓｓｉｃａ　ｃａｍｐｅｓＬｒｉ＠）の油（ナタネ油として知られている）及 びブラシカヒルタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｈｉｒｔａ）の油（カラシ油として知ら れている）が含まれるが、これらに限定されない。

ナタネ油は、１０℃の固化点、１５℃で０．９Ｘ５の比重、５０℃で１．４７０ ６の屈折率、９Ｂ、（ｉのヨード価、１７４．７の鹸化価を有する。この油は、 油中の唯一の飽和成分として約１％のバルミチン酸、約３２％のオレイン酸、約 １５％のリノール酸、約１％のリルイン酸、約５０％のエルカ酸を含む。バルミ チン酸は、ヘキサデカン酸とて知られ、１６の炭素原子を有する飽和脂肪酸で、 分子１１２５６．４である。

オレイン酸は、（Ｚ）−９−オフタデセノン酸として知られ、１８の炭素原子を 有し、分子ｆｆ１２８２．５である。不飽和の位置は、鎖状中の９位と１０位の 炭素原子の間であり、シス配置を有する。

リノール酸は２つの位置に不飽和を有し、シス、シス−９，１２−オフタデカシ エン酸として知られる。この酸は１８の炭素原子と２８０．５の分子量を有する 。

リルイン酸は、３つの位置に不飽和を有し、（Ｚ、Ｚ、Ｚ）−１９，１２，＋５ −オクタデカトリエン酸として知られる。この酸は１８の炭素原子と２７８．４ の分子量を有する。

エルカ酸は、アブラナ属の油の主成分で、（Ｚ）−１３−トコセノン酸として知 られる。エルカ酸は２２の炭素原子を、１つの不飽和と３３８．６の分子量を有 する。

カラン油も類似である。カラン油は１５℃で０．９１４５の比重、５０℃で１． ４７５の屈折率、１０２のヨード価、１７４の鹸化価を有する。カラン油は、唯 一の飽和酸としての１．３％（重ｆｆ１）のミリスチン酸、２７．２％（劃１の オレイン酸、１６．６％（重量）のリノール酸、１．８％（重量）のリルイン酸 、１．１％（重量）のベヘン酸、１．０％（創１のリグノセリン酸、　５１．０ ％（重量）のエルカ酸を含む。ミリスチン酸はテトラデカノン酸としても知られ 、１４の炭素原子と２２Ｆ１．４の分子ｍを有ずろ。

ベヘン酸は、ドコサノン酸としても知られ、２２の炭素原子を３４０．６の分子 量を何ずろ。リグノセリン酸は、テトラコサノン酸として知られ、２４の炭素原 子と３６８．６の分子量を何する。

カラン油の他の成分は上記されている。

油は、塩水の約ｔｉｉｍ％より少なくない量、より好ましくは約０．８重電より 少なくない量、もっとも好ましくは約０．１〜０．５重量％の間の量用いられる 。

ナタネ油とカラシ油以外の油がこの発明により用い得ることが理解さるべきであ る。例えば、上記した特性を有する合成油も用いうる。加えて、油が機能する仕 方が以下に詳述され、他の油がこの発明に従って受け入れられる機能をし、容易 に決めうろことが明らかであろう。

アブラナ科油に加えて、塩水はまた一般にグリコール、無機塩と水を含有する。

ｉａ切なグリコールには、エチレングリコール、プロピレングリコール、ベンジ レンゲリコール、ブチレングリコール、ジエチレングリコール、ジフェニルゲル コール、エヂリデングルコール等が含まれるが、これらに限定されない。

これらのゲルコールは単独でも他のゲルコールとの組合でも用いうろ。好ましい 具体例ではプロピレングリコールが用いられろ。ゲルコール成分は、塩水中に約 ３０〜５０重量％の間の爪、より好ましくは約３５〜４５重量％の間、最も好ま しくは約４０重量％存在する。

この発明による有用な塩類には、塩化カルシウム、臭化カルシラノ−１沃化カル シウム、塩化カリウム、臭化カリウム、沃化カリウムなどが含まれるが、これに 限定されない。好ましい具体例では、塩化カルシウムが用いられる。塩は、塩水 巾約５〜１５重量％の曵、より好ましくは約７〜１３重量％、最・も好ましくは 約１ｏｉ１ｆ１％存在する。

水は、約４０〜６０ｆｆｌｆｉ％の間の爪、より好ましくは４５〜５５重量％の 間、最も好ましくは約５０重量％存在ずろ。

特に好ましい具体例において、塩水は次の組成を有する。

成分　ｆｆ１（ｒＲ量％） アブラナ科油　０．１〜０．５ プロピレングリコール　４０ 塩水カルシウム　１０ 水　約５０ アブラナ科油は、ナタネ油、カラン油又はこれらの混合物が好ましい。

油を含何する塩水は約−２２′Ｆ〜−４３，６°Ｆの間の温度に冷却されると、 微細氷結晶が塩水中に形成され、均一に分布されると現在考えられている。この 推定が正しいと想定し、次いでこれらの結晶が、効果的な冷伝達をし、塩水中に 浸した組織サンプルの所定冷凍速度の増加をさせる。結果的に、組織サンプルを 凍結ずろのに要する時間が減少する。特に好ましい因様では、組織サンプルが導 入されたとき、塩水の温度を実質的に一定値に止まるよう塩水からの熱を除去ず ろために冷却手段が備えられる。それにより、組織サンプルは最大水晶形成帯す なわち−０，５〜−５℃を急速に通過を可能にする。従って、氷晶の凍結のｎｔ Ｉに、組織サンプルは公知技術で作られる。組織、サンプルは、例えば肺臓、肝 臓、目、心臓などについて薄いシートであるのが好ましい。しかし、厚く切っに ような標品は、特にマイクロドームで薄いスライスにカプトした後冷凍し、検査 してもよい。組織サンプルは、約０．５〜２分間塩水に浸し凍結されろ。この発 明に有用な別の方法として、組織は加熱を行うパン又はトレー中に入れ、凍結で きる。次いで、パン又はトレーの反対側を冷却した塩水に接触させる。さらに別 の態様では、塩水が、加熱を行うパン又はトレーに入れ、次いでトレーの反対側 を、組織サンプルの凍結のため冷却塩水に接触させる。

凍結後に組織は検査できる。サンプルは細胞構造の損傷が上記の方法を用いるこ とにより最少にされているので特に有用である。

次いで、凍結したサンプルはマイクロドームで顕微鏡検査用に薄いシートにスラ イスしなければならない。組織サンプルを凍結ずろ方法は水の除去と分子の架橋 が最少されているので特に有用であると考える。

上記で明らかにされたものから、上記した目的が効果的に達せられるのが理解さ せよう、かつこの発明の木質と範囲を離れることなく、上記の方法のある種の変 更を行うことができるので、上記に含まれた全ての事項は例示と解すべきで、限 定されるものではない。

また、次のクレームは、ここに記載した発明の一般的及び特定の特長の全てとか つ用語としてその中に含まれる発明の範囲の全ての記述をカバーすることを意図 している。

特に、これらのクレーム中で、単数で引用した化合物の成分は、意味が許す限り 、その成分の相溶性混合物を含むことを意味するものである。

ＦＩ６．２ 国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも約０．１重量％のアブラナ科汕を含有する塩水を作り、塩水を約 −２２°〜−４３．６°Ｆの間の温度に冷却し、組織標品を供給し、かつ、組織 標品を、凍結するのに十分な時間冷却した塩水と熱伝達に付すことからなる組織 標品の凍結方法。
2. ２．油がアブラナ属の植物から抽出されている請求の範囲１項の組織の凍結方法 。
3. ３．油が、ナタネ油、カラシ油及びこれらの混合物からなる群より選択される請 求の範囲１項の組織の凍結方法。
4. ４．油が単一の主成分としてエルカ酸を含有する請求の範囲１項の組織の凍結方 法。
5. ５．油が約２％以上の飽和成分を含有する請求の範囲１項の組織の凍結方法。
6. ６．油が塩水の約０．１〜０．５重量％の間の量用いられる請求の範囲１項の組 織の凍結方法。
7. ７．塩水がグルコール、無機塩と水を含有する請求の範囲１項の組織の凍結方法 。
8. ８．グルコールがプロピレングリコールである請求の範囲７項の組織の凍結方法 。
9. ９．グルコールが塩水中約３０〜５０重量％の間の量存在する請求の範囲７項の 組織の凍結方法。
10. １０．塩が塩化カルシウムである請求の範囲７項の組織の凍結方法。
11. １１．塩が塩水の約５〜１５重量％の間の量存在する請求の範囲７項の組織の凍 結方法。
12. １２．水が塩水の約４０〜６０重量％の間の量存在する請求の範囲７項の組織の 凍結方法。
13. １３．組織標品が、植物又は動物材料の薄いシートである請求の範囲１項の組織 の凍結方法。
14. １４．組織標品が、約０．５〜２分間塩水と熱伝達関係に付される請求の範囲１ 項の組織の凍結方法。
15. １５．組織標品が、冷却塩水に浸漬されて熱伝達関係に付される請求の範囲１項 の組織の凍結方法。
16. １６．組織標品が、熱伝達パンに入れられ、その熱伝達パンを冷却塩水に付すこ とにより熱伝達関係に付される請求の範囲１項の組織の凍結方法。
17. １７．組織標品が、熱伝達トレー中に、トレーの底を少なくとも覆うに十分な塩 水と共に入れられ、その熱伝達トレーを冷却塩水に付すことによって熱伝達関係 に付される請求の範囲１項の組織の凍結方法。
18. １８．組織標品の細胞構造の変質を最少にするよう熱伝達関係に付される組織標 品の凍結速度を増加する適当な油の有効量を含有する塩水を作り、その塩水を− ２２〜−４３．６°Ｆの間の温度に冷却し、組織標品を供給し、組織標品を凍結 するのに十分な時間冷却塩水との熱伝達関係に組織標品を付すことからなる組織 標品の凍結方法。
19. １９．塩水が、ナタネ油、カラシ油及びそれらの混合物からなる群より選択され たアブラナ科油を約０．１〜１．０重量％含有する請求の範囲１８項の組織標品 の凍結方法。
20. ２０．塩水がさらに、約３０〜５０重量％のプロピレングルコールと約５〜１５ 重量％の塩化カルシウムと残部の水を含有する請求の範囲１８項の組織標品の凍 結方法。