JPH034784A - アミド化酵素及び該酵素によるc末端アミド化ペプチドの製造法 - Google Patents
アミド化酵素及び該酵素によるc末端アミド化ペプチドの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[:産業上の利用分野〕
本発明は、ブタ心房の可溶性画分より得られ、分子量約
36000の新規アミド化酵素、並びに、同アミド化酵
素を使用したC末端アミド化ペプチドの製法に関するも
のである。
36000の新規アミド化酵素、並びに、同アミド化酵
素を使用したC末端アミド化ペプチドの製法に関するも
のである。
従来、ペプチド類が多く知られている。そのペプチド類
中には、C末端がアミド化されることにより、活性を示
すものが多く存在している。
中には、C末端がアミド化されることにより、活性を示
すものが多く存在している。
これらのペプチドは生理活性を有するペプチドとして医
薬等に使用されている。
薬等に使用されている。
これらのC末端がアミド化されたペプチドが、生体内で
生成される過程については、いくつかの酵素が関与する
ものと推定されている。ペプチドのC末端がアミド化さ
れる場合は、そのペプチドのC末端にグリシンの付加し
た前駆体が、細胞中に存在するアミド化酵素によって修
飾を受けてC末端グリンンの一つ前のアミノ酸がアミド
′化するものと考えられている。
生成される過程については、いくつかの酵素が関与する
ものと推定されている。ペプチドのC末端がアミド化さ
れる場合は、そのペプチドのC末端にグリシンの付加し
た前駆体が、細胞中に存在するアミド化酵素によって修
飾を受けてC末端グリンンの一つ前のアミノ酸がアミド
′化するものと考えられている。
このようなペプチドのC末端にグリシンの付加した前駆
体をC末端グリンンの一つ前のアミノ酸をアミド化する
酵素の存在を最初に発表したのは、Bradburyら
[:Nature、298,686−688(1982
) 〕であり、その発表は、ヨードでラベルしたD−T
yr−ValGlyがブタ下垂体分泌か粒中のアミド化
酵素によって、D−Tyr−ValNH2に変換するこ
とを見出したことである。その後多くの研究グループに
よって、このような性質を持つ酵素の研究がなされた。
体をC末端グリンンの一つ前のアミノ酸をアミド化する
酵素の存在を最初に発表したのは、Bradburyら
[:Nature、298,686−688(1982
) 〕であり、その発表は、ヨードでラベルしたD−T
yr−ValGlyがブタ下垂体分泌か粒中のアミド化
酵素によって、D−Tyr−ValNH2に変換するこ
とを見出したことである。その後多くの研究グループに
よって、このような性質を持つ酵素の研究がなされた。
例えば、Murthyらは、中下垂体よりP A Ll
−A酵素(分子量54000) 、PAM−8酵素(
分子量42000と37000 )を報告しCJ、B、
C,261,18151822(1986)〕、また、
Kizer らはブタ下垂体より分子m 64000
の酵素を報告している( Endocrinology
、 118.2262−2267(1986) ]。更
に水野らは、アフリカッメガエルの皮膚より分子ffi
39000のAE−I、八E−11a及び分子量34
000の^E−IIbの各酵素を得ている[:BBRC
。
−A酵素(分子量54000) 、PAM−8酵素(
分子量42000と37000 )を報告しCJ、B、
C,261,18151822(1986)〕、また、
Kizer らはブタ下垂体より分子m 64000
の酵素を報告している( Endocrinology
、 118.2262−2267(1986) ]。更
に水野らは、アフリカッメガエルの皮膚より分子ffi
39000のAE−I、八E−11a及び分子量34
000の^E−IIbの各酵素を得ている[:BBRC
。
137、984−991(1986)、特開昭62−2
89184号公報]。
89184号公報]。
また児島らは、ブタ心房の不溶性の膜画分より、分子f
fi 92000の酵素を発表している〔日本化学会抄
録番号210219(1988) :]。
fi 92000の酵素を発表している〔日本化学会抄
録番号210219(1988) :]。
そして、これらの酵素を用いてサケカルシトニン(特開
昭62−205795号公報)、サブスタンスP [B
BRC,l、48.24−30 (1987) 〕の
ような比較的長鎖のC末端がアミド化されたペプチドを
得ることについても知られている。
昭62−205795号公報)、サブスタンスP [B
BRC,l、48.24−30 (1987) 〕の
ような比較的長鎖のC末端がアミド化されたペプチドを
得ることについても知られている。
上記従来の技術において、生理活性を有するC末端がア
ミド化されたペプチドを得る方法として、ペプチドのC
末端にグリシンを付加した前駆体をC末端のグリシンの
一つ前のアミノ酸をアミド化する場合に上記酵素を使用
しても反応後の生成物の回収量が少なく、また、これら
の酵素の製造原料の入手の点等で難点があった。
ミド化されたペプチドを得る方法として、ペプチドのC
末端にグリシンを付加した前駆体をC末端のグリシンの
一つ前のアミノ酸をアミド化する場合に上記酵素を使用
しても反応後の生成物の回収量が少なく、また、これら
の酵素の製造原料の入手の点等で難点があった。
本発明は、これらの難点を解決したペプチドのC末端ア
ミド化に基質特異性を有する新規アミド化酵素並びに同
アミド化酵素を用いてC末端アミド化ペプチドの製造法
を提供することを目的とするものである。
ミド化に基質特異性を有する新規アミド化酵素並びに同
アミド化酵素を用いてC末端アミド化ペプチドの製造法
を提供することを目的とするものである。
本発明者らは、ペプチドのC末端をアミド化する酵素の
探索を、本発明者らが独自に開発した全く新しいアッセ
イ系を使用し、広く天然界に酵素源を求めてスクリーニ
ングした結果、ブタの心房にD−Tyr−X−Glyを
D−Tyr−XNH,に変換する基質特異性を有する分
子l 36000の新規酵素を見出し、この酵素が、サ
ブスタンス−P、デスアセチルα−MSH,マストバラ
ン等の製造に有用であることを見出し、本発明を完成し
た。
探索を、本発明者らが独自に開発した全く新しいアッセ
イ系を使用し、広く天然界に酵素源を求めてスクリーニ
ングした結果、ブタの心房にD−Tyr−X−Glyを
D−Tyr−XNH,に変換する基質特異性を有する分
子l 36000の新規酵素を見出し、この酵素が、サ
ブスタンス−P、デスアセチルα−MSH,マストバラ
ン等の製造に有用であることを見出し、本発明を完成し
た。
本発明は、(a)ブタ心房の可溶性画分より得られ、(
b)分子量約36000、(c)安定p H範囲が4〜
9(50℃で1時間処理し安定)、(d)至適p++が
8〜9、(e)等電点が5〜8の性質を有する新規アミ
ド化酵素、並びに、C末端にグリシン残基を付加したペ
プチド前駆体に上記新規アミド化酵素を作用させてグリ
シン残基が欠失したC末端アミド化ペプチドの製法であ
る。
b)分子量約36000、(c)安定p H範囲が4〜
9(50℃で1時間処理し安定)、(d)至適p++が
8〜9、(e)等電点が5〜8の性質を有する新規アミ
ド化酵素、並びに、C末端にグリシン残基を付加したペ
プチド前駆体に上記新規アミド化酵素を作用させてグリ
シン残基が欠失したC末端アミド化ペプチドの製法であ
る。
本発明のブタ心房の可溶性画分から得られる分子量約3
6000のアミド化酵素は、比較的容易に且つ多量に人
手できるブタの心房のミンチ化物を、トリス−塩酸緩衝
液(20m M、pH7,0)に浮遊させ、ポリトロン
等を用いてホモジナイズして遠心分離し、その上清を分
離した後、沈澱をトリス緩衝液にg2しホモジナイズし
て遠心分離する。この操作を繰り返し行い、上清を合わ
せて、50%飽和硫酸アンモニウムで塩析し、得られた
沈殿をトリス緩衝液に溶解し、透析、a縮し、DEAE
−)ヨバール、ブチル−トヨパール、キレ−ティングセ
ファロース6B、フェニルスーパーロース等にヨリtr
i ’JJして得ることができる。
6000のアミド化酵素は、比較的容易に且つ多量に人
手できるブタの心房のミンチ化物を、トリス−塩酸緩衝
液(20m M、pH7,0)に浮遊させ、ポリトロン
等を用いてホモジナイズして遠心分離し、その上清を分
離した後、沈澱をトリス緩衝液にg2しホモジナイズし
て遠心分離する。この操作を繰り返し行い、上清を合わ
せて、50%飽和硫酸アンモニウムで塩析し、得られた
沈殿をトリス緩衝液に溶解し、透析、a縮し、DEAE
−)ヨバール、ブチル−トヨパール、キレ−ティングセ
ファロース6B、フェニルスーパーロース等にヨリtr
i ’JJして得ることができる。
このアミド化酵素の活性測定は、Bradbury (
Nature、 298.686 (1982) )に
よる125■でチロシンをヨード化した目J−D−Ty
r−Val−Gly をアミド化酵素の基質とし、”J
−D−Tyr−ValNH,が生成されることを追跡す
る方法、水野!:BBRC,137,984(1986
) )による1251−N−^c−D−Tyr−Val
−Glyを基質とし、251−N−^c−D−Tyr−
ValNII、が生成されることを追跡する方法で行う
ことができるが、本発明者らが新たに見出したラベル化
合物を使用しないで、アミド化酵素活性を測定する新し
い方法を採用すると、極めて操作簡易に、正確に測定す
ることができる。この方法は、)IPLC(高速液体ク
ロマトグラフィー)検出器として[ECD (エレクト
ロ ケミカル ディテクター)を付設したH P L
Cアッセイ系を用いる方法である。
Nature、 298.686 (1982) )に
よる125■でチロシンをヨード化した目J−D−Ty
r−Val−Gly をアミド化酵素の基質とし、”J
−D−Tyr−ValNH,が生成されることを追跡す
る方法、水野!:BBRC,137,984(1986
) )による1251−N−^c−D−Tyr−Val
−Glyを基質とし、251−N−^c−D−Tyr−
ValNII、が生成されることを追跡する方法で行う
ことができるが、本発明者らが新たに見出したラベル化
合物を使用しないで、アミド化酵素活性を測定する新し
い方法を採用すると、極めて操作簡易に、正確に測定す
ることができる。この方法は、)IPLC(高速液体ク
ロマトグラフィー)検出器として[ECD (エレクト
ロ ケミカル ディテクター)を付設したH P L
Cアッセイ系を用いる方法である。
たとえば、本酵素活性のスクリーニング用基質としてD
−Tyr−X−Gly (Xは20種類のアミノ酸)を
合成し、この基質を使用してアミド化酵素がD−Tyr
X−NI(、に変換する状慢を、アミド化反応林了後に
この基質と生成物が分離する溶媒系を設定しであるH
P L Cにかけ、検出器としてECD を使用した系
で検出する。ECD上を通過した基質は、電気化学的酸
化を受け、チロシンがキノン型に変換される。
−Tyr−X−Gly (Xは20種類のアミノ酸)を
合成し、この基質を使用してアミド化酵素がD−Tyr
X−NI(、に変換する状慢を、アミド化反応林了後に
この基質と生成物が分離する溶媒系を設定しであるH
P L Cにかけ、検出器としてECD を使用した系
で検出する。ECD上を通過した基質は、電気化学的酸
化を受け、チロシンがキノン型に変換される。
その時に流れる電流を検知して、基質及び生成物に相当
するピークとして表現する。通常、2リボルトの電圧を
かげると、約5−10マイクロアンペアの電流が流れる
。第1図はD−Tyr−Met−Glyのポルクモグラ
ムを示す。この実験をXが20種類のアミノ酸で構成さ
れるD−Tyr−X−Gly について行い、予め合成
したD−Tyr−XNIIzと分離するIIPLCの展
開溶媒系を設定しておき、酵素反応終了後にHPLCに
かけて、基質と生成物とのピーク面積比によりアミド化
反応の進行を追跡した。
するピークとして表現する。通常、2リボルトの電圧を
かげると、約5−10マイクロアンペアの電流が流れる
。第1図はD−Tyr−Met−Glyのポルクモグラ
ムを示す。この実験をXが20種類のアミノ酸で構成さ
れるD−Tyr−X−Gly について行い、予め合成
したD−Tyr−XNIIzと分離するIIPLCの展
開溶媒系を設定しておき、酵素反応終了後にHPLCに
かけて、基質と生成物とのピーク面積比によりアミド化
反応の進行を追跡した。
C末端アミド化酵禦の力価測定は、酵素標品をアスコル
ビン酸0.5m!、I、カタラーゼ100 μg/m
1、硫H’M 50gM1ジイソプロビルフルオロフォ
スフェ)(DFP)5mM 、ペプスタチン10 μg
/mβ、基質のD−Tyr−!、1et−Gly 16
μM (6μg/m A’) ヲ含むトリス−塩酸緩
衝液(0,02!I、p)18.0、反応総↑250μ
β)中で37℃で反応し、5分間沸騰することにより反
応を停止する。反応液を遠心分離し、上清をクロマトデ
スク4^(0,45μm1バイオフイ一ルド社製)で濾
過した後、AsahipaC0DP−50カラムによる
分析を、8%アセトニトリル0,1%トリフルオロ酢酸
(TFA)流速1 ml / mlの移動相によるII
P L Cで行−った。基質のD−Tyr−!、1e
t−Gly及びアミド化されたDT y r −iA
e t −X N H、の検出をεCD で行った。H
PLCによる分析例を第2図に示した。
ビン酸0.5m!、I、カタラーゼ100 μg/m
1、硫H’M 50gM1ジイソプロビルフルオロフォ
スフェ)(DFP)5mM 、ペプスタチン10 μg
/mβ、基質のD−Tyr−!、1et−Gly 16
μM (6μg/m A’) ヲ含むトリス−塩酸緩
衝液(0,02!I、p)18.0、反応総↑250μ
β)中で37℃で反応し、5分間沸騰することにより反
応を停止する。反応液を遠心分離し、上清をクロマトデ
スク4^(0,45μm1バイオフイ一ルド社製)で濾
過した後、AsahipaC0DP−50カラムによる
分析を、8%アセトニトリル0,1%トリフルオロ酢酸
(TFA)流速1 ml / mlの移動相によるII
P L Cで行−った。基質のD−Tyr−!、1e
t−Gly及びアミド化されたDT y r −iA
e t −X N H、の検出をεCD で行った。H
PLCによる分析例を第2図に示した。
酵素単位は上記条件下37℃、1時間にlpmolの基
質をアミド化する酵素Mを1単位とする。
質をアミド化する酵素Mを1単位とする。
本発明のC末端アミド化ペプチドの製造の原イ4(基質
)として用いられるC末端にグリシン残基を付加したペ
プチドとしては、サブスタンス−P前駆体、マストパラ
ン前駆体、デスアセチルαM S H前駆体等のペプチ
ドが具体的に挙げられるが、−船釣にD−Tyr−X−
GlyのペプチドでXが20種の有用なペプチドが用い
られる。
)として用いられるC末端にグリシン残基を付加したペ
プチドとしては、サブスタンス−P前駆体、マストパラ
ン前駆体、デスアセチルαM S H前駆体等のペプチ
ドが具体的に挙げられるが、−船釣にD−Tyr−X−
GlyのペプチドでXが20種の有用なペプチドが用い
られる。
本発明の製法において、上記基質に上記酵素を反応させ
てC末端アミド化ペプチドを得る場合、C末端にグリシ
ンを有するペプチドの前駆体と酵素とを水性溶媒中にお
いて酵素反応を行わせることにより得ることができる。
てC末端アミド化ペプチドを得る場合、C末端にグリシ
ンを有するペプチドの前駆体と酵素とを水性溶媒中にお
いて酵素反応を行わせることにより得ることができる。
なお、この反応溶媒中には銅イオン、たとえば硫酸銅及
びアスコルビン酸、カタラーゼを存在させ、約20℃〜
45℃、好適には37℃前後、pH6〜9、好適にはp
118〜9で行う。反応終了後は煮沸等の手段により反
応を停止させ、この反応液中より高速液体クロマトグラ
フィー等の通常の方法を使用して、目的とするC末端ア
ミド化ペプチドを得ることができる。
びアスコルビン酸、カタラーゼを存在させ、約20℃〜
45℃、好適には37℃前後、pH6〜9、好適にはp
118〜9で行う。反応終了後は煮沸等の手段により反
応を停止させ、この反応液中より高速液体クロマトグラ
フィー等の通常の方法を使用して、目的とするC末端ア
ミド化ペプチドを得ることができる。
次に本発明を更に具体的に説明するため、本発明に使用
する酵素の製造例並びにC末端アミド化ペプチドの製法
の実施例を挙げる。
する酵素の製造例並びにC末端アミド化ペプチドの製法
の実施例を挙げる。
アミド化酵素の製造例
屠殺直後のブタ心房9.05kgをミンチスライザーで
細断した後、301の25mM ) ’)スー塩酸緩衝
液(pH8,6)に懸濁し、ポリトロンでホモゲナイズ
した後、このホモゲ不一トを10000 X gで3
0分間遠心分離してよ清を分離した。その後、沈殿を再
び301のトリス緩衝液に懸濁し、同様にホモゲナイズ
して遠心分離し、この抽出操作を3回繰返した。
細断した後、301の25mM ) ’)スー塩酸緩衝
液(pH8,6)に懸濁し、ポリトロンでホモゲナイズ
した後、このホモゲ不一トを10000 X gで3
0分間遠心分離してよ清を分離した。その後、沈殿を再
び301のトリス緩衝液に懸濁し、同様にホモゲナイズ
して遠心分離し、この抽出操作を3回繰返した。
得られた上清を合し、これに硫酸アンモニウムを50%
飽和になるように加えて塩析し、69.2g(総蛋白量
、8SA換算)の沈殿を得た。これを8βのトリス緩衝
液に溶解後、ホロウ ファイバー(llollowf
1ber) (Ml’l 10000 %シュ /’)
でaW及びaK6L、25 m AIのトリス緩衝
液で平衡化したDEAεトヨバール650M (12c
mX35cm) に吸着させた。吸着物を0〜0.5
!、1食塩水によるリニアーグラジェントで溶出し、前
述したアッセイ系を使用してアミド化酵累活性を測定し
、活性画分を集めてトリス緩衝液で透析。
飽和になるように加えて塩析し、69.2g(総蛋白量
、8SA換算)の沈殿を得た。これを8βのトリス緩衝
液に溶解後、ホロウ ファイバー(llollowf
1ber) (Ml’l 10000 %シュ /’)
でaW及びaK6L、25 m AIのトリス緩衝
液で平衡化したDEAεトヨバール650M (12c
mX35cm) に吸着させた。吸着物を0〜0.5
!、1食塩水によるリニアーグラジェントで溶出し、前
述したアッセイ系を使用してアミド化酵累活性を測定し
、活性画分を集めてトリス緩衝液で透析。
濃縮後、再びDE^巳トヨパール650 !、1にかけ
、0−0.31,1食塩水のリニアーグラジェントで溶
出し、MO−AとMO−8の二つの活性画分に分割した
(第3図参照)。
、0−0.31,1食塩水のリニアーグラジェントで溶
出し、MO−AとMO−8の二つの活性画分に分割した
(第3図参照)。
活性の強かった!、l D −8画分3.568をlQ
m!、I)リス−塩酸、pH8,0で平衡化したブチル
トヨバール650 Mカラム(3am X 24 cm
) に吸着させ、10−0%の硫酸アンモニウム溶液
によるリニアーグラジェントで溶出し、λ10−8−1
、!、I O−8−2の活性画分に分離した(第4図参
照)。量的に多いMO−8−2121mgを0.05M
)リス−塩酸緩衝液pH7,0,0,5M塩化ナト
リウムで平衡化した銅−キレ−ティングセファロース6
Bカラム(1,5cm X 17 am) にかけ、
O−0,07M イミダゾールを含むトリ不一塩酸緩衝
液10.5M塩化ナトリウム溶液のりニア−グラジェン
トで溶出し、活性画分5mgを得た(第5図参照)。M
[]−8822画を更に10%硫酸アンモニウム10.
025M ) IJス塩酸緩衝液で平衡化したフェニ
ルスーパーロースカラムクファルマンア、Phenyl
−superose HR515) に吸着させ、1
0〜0%の硫酸アンモニウム溶液によるリニアーグラジ
ェントで溶出し、活性画分約50μgを得た(第6図参
照)。更に、スーパーロース(ファルマシア、5upe
rose 12)によるゲル濾過を行い、分子ff13
6000の活性画分を得た。
m!、I)リス−塩酸、pH8,0で平衡化したブチル
トヨバール650 Mカラム(3am X 24 cm
) に吸着させ、10−0%の硫酸アンモニウム溶液
によるリニアーグラジェントで溶出し、λ10−8−1
、!、I O−8−2の活性画分に分離した(第4図参
照)。量的に多いMO−8−2121mgを0.05M
)リス−塩酸緩衝液pH7,0,0,5M塩化ナト
リウムで平衡化した銅−キレ−ティングセファロース6
Bカラム(1,5cm X 17 am) にかけ、
O−0,07M イミダゾールを含むトリ不一塩酸緩衝
液10.5M塩化ナトリウム溶液のりニア−グラジェン
トで溶出し、活性画分5mgを得た(第5図参照)。M
[]−8822画を更に10%硫酸アンモニウム10.
025M ) IJス塩酸緩衝液で平衡化したフェニ
ルスーパーロースカラムクファルマンア、Phenyl
−superose HR515) に吸着させ、1
0〜0%の硫酸アンモニウム溶液によるリニアーグラジ
ェントで溶出し、活性画分約50μgを得た(第6図参
照)。更に、スーパーロース(ファルマシア、5upe
rose 12)によるゲル濾過を行い、分子ff13
6000の活性画分を得た。
本酵素は、Cu”イオンが必須であり、酵素反応系から
銅イオンを抜き、50MM □)EDTAを添加すると
、酵素は完全に失活する。また、アスコルビン酸がない
と酵素活性は低下し、N−エチルマレイミドを抜いて1
0 m Mの7ステインを添加すると失活する。また、
pH4〜9.50℃で1時間加熱したり、凍結乾燥して
も安定であるが、ρ1(4〜9.70℃で1時間加熱す
ると完全に失活する。反応の最適なpHは8〜9である
。また等電点は5〜8である。
銅イオンを抜き、50MM □)EDTAを添加すると
、酵素は完全に失活する。また、アスコルビン酸がない
と酵素活性は低下し、N−エチルマレイミドを抜いて1
0 m Mの7ステインを添加すると失活する。また、
pH4〜9.50℃で1時間加熱したり、凍結乾燥して
も安定であるが、ρ1(4〜9.70℃で1時間加熱す
ると完全に失活する。反応の最適なpHは8〜9である
。また等電点は5〜8である。
実施例1
基質としてサブスタンス−P前駆体〔サブスタンス−P
のC末端に相当するメチオニンにグリシンが付加された
ペプチド。ペプチド合成機A31430A(アプライド
バイオシステムズ社製品)で合成〕220m01 を
用い、0.05M のトリス塩酸(pH8,0)、0.
05n+Mのアスコルビン酸、100μg/mβのカタ
ラーゼ、50μ!、1の硫酸銅、5mMのジイソプロピ
ルフルオロフォスフェート、10Mg/m lのペプス
タチン、2800単位の製造例で製造した酵素の反応容
量計250μ!で、37℃で12時間反応させた後、5
分間煮沸して反応を停止させ、その後、イナートシルP
REP−ODSを充填した逆本目高速液体クロマトグラ
フィ(HPLC)にかけ、0〜60%アセトニトリルの
1%トリフルオロ酢酸溶液によるリニアーグラジェント
で溶出し、19nmolの反応生成物を得た。
のC末端に相当するメチオニンにグリシンが付加された
ペプチド。ペプチド合成機A31430A(アプライド
バイオシステムズ社製品)で合成〕220m01 を
用い、0.05M のトリス塩酸(pH8,0)、0.
05n+Mのアスコルビン酸、100μg/mβのカタ
ラーゼ、50μ!、1の硫酸銅、5mMのジイソプロピ
ルフルオロフォスフェート、10Mg/m lのペプス
タチン、2800単位の製造例で製造した酵素の反応容
量計250μ!で、37℃で12時間反応させた後、5
分間煮沸して反応を停止させ、その後、イナートシルP
REP−ODSを充填した逆本目高速液体クロマトグラ
フィ(HPLC)にかけ、0〜60%アセトニトリルの
1%トリフルオロ酢酸溶液によるリニアーグラジェント
で溶出し、19nmolの反応生成物を得た。
この物質をペプチドシーケンサ(AB1470A)
によるC末端アミド化構造の確認及びモルモットの摘出
回腸を使用した筋収縮実験により生物活性出現の確認を
行った。
によるC末端アミド化構造の確認及びモルモットの摘出
回腸を使用した筋収縮実験により生物活性出現の確認を
行った。
ペプチドシーケンサ−によるサブスタンス−Pの確3忍
実施例1によりHPLCで回収したサブスタンス−p
in mo+ を、ペプチドシーケンサ−を使用してア
ミノ酸配列の決定を行った。すなわち、11番目のアミ
ノ酸に相当するPTH−Met 及びPTH−MetN
H2に回収量の差、及びサブスタンス−PのC末端にG
lyの付加した前駆体の12番目のアミノ酸に相当する
PTH−Glyの回収量よりC末端アミド化の進行が容
易に測定できる。
in mo+ を、ペプチドシーケンサ−を使用してア
ミノ酸配列の決定を行った。すなわち、11番目のアミ
ノ酸に相当するPTH−Met 及びPTH−MetN
H2に回収量の差、及びサブスタンス−PのC末端にG
lyの付加した前駆体の12番目のアミノ酸に相当する
PTH−Glyの回収量よりC末端アミド化の進行が容
易に測定できる。
次の第1表に、評品のサブスタンス−P1グリシンの付
加した前駆体、及び前駆体の酵素反応後の生成物のPT
)I アミノ酸回収p mol数を示す。
加した前駆体、及び前駆体の酵素反応後の生成物のPT
)I アミノ酸回収p mol数を示す。
第 1 表
以上の結果より、11番目PTH−Met、 PTH−
MetNHzの回収量及びPTH−Gly の回収量比
より、酵素反応によりサブスタンス−P前駆体がサブス
タンス−Pに変換されたことを確認した。
MetNHzの回収量及びPTH−Gly の回収量比
より、酵素反応によりサブスタンス−P前駆体がサブス
タンス−Pに変換されたことを確認した。
実施例1によって生成したサブスタンス−Pの生物活性
モルモットを放血致死させ、回腸を摘出し、これを15
mf!のタイロート圧液を満たしたマグヌス管中に懸垂
した。張力はアイッソトーニックトランスジューサー(
日本電気三栄製品)及び動歪アンプ〈日本電気三栄製品
記+ 84 ”)を介して、ポリグラフ(日本電気三栄
製品363−8) 上に記録した。この結果を第2表
に示す。
mf!のタイロート圧液を満たしたマグヌス管中に懸垂
した。張力はアイッソトーニックトランスジューサー(
日本電気三栄製品)及び動歪アンプ〈日本電気三栄製品
記+ 84 ”)を介して、ポリグラフ(日本電気三栄
製品363−8) 上に記録した。この結果を第2表
に示す。
第 2 表
実施例Iと同一条件で、2500単位の製造例で製造し
た精製酵素を用いて37℃で12時間反応させ、その後
生成物17n not をHP 1. Cで回収し、ベ
ブチドンーケンサーで生成物の確認を行った。PTHア
ミノ酸の回収p mol数を下記第3表に示す。
た精製酵素を用いて37℃で12時間反応させ、その後
生成物17n not をHP 1. Cで回収し、ベ
ブチドンーケンサーで生成物の確認を行った。PTHア
ミノ酸の回収p mol数を下記第3表に示す。
第3表
以上の結果より、標品のサブスタンス−P及び反応生成
物は、O,001mg/m EからO,Img/m l
の範囲で用量依存的にモルモット回陽を収縮させたが、
前駆合いのサブスタンス−PGlyは081mg/mβ
及び1mg/mffの添加により全く収縮を示さなかっ
た。
物は、O,001mg/m EからO,Img/m l
の範囲で用量依存的にモルモット回陽を収縮させたが、
前駆合いのサブスタンス−PGlyは081mg/mβ
及び1mg/mffの添加により全く収縮を示さなかっ
た。
実施例2
基質としてマストバラン前駆体くマストパランのC末端
に相当するロインンにグリノンが付加されたI5アミノ
酸よりなるペプチド>20n molを用い、以上の結
果より、14番目のPTH−Leu 或いはPTIIf
、 e u N lイ2と15番目のPTH−GIy
と(7) Do 収量 比ヨリ、マストパランが生成
したことを56 a、?2した。
に相当するロインンにグリノンが付加されたI5アミノ
酸よりなるペプチド>20n molを用い、以上の結
果より、14番目のPTH−Leu 或いはPTIIf
、 e u N lイ2と15番目のPTH−GIy
と(7) Do 収量 比ヨリ、マストパランが生成
したことを56 a、?2した。
実施例3
基質としてデスアセチルα−M S N 前駆体くテス
アチルα−MSHのC末端に相当するバリンにグリシン
が付加された14アミノ酸よりなるペプチド)24n
mol を用い、実施例1と同一の条件で2600単
位の製造例で製造した精製酵素を用いて37℃、12時
間反応させた後、21Tl mol の生成物をHPL
Cで回収し、ペプチドシーケンサ−で生成物の確認を行
った。PTf(アミノ酸の回収pmalを次の第4表に
示す。
アチルα−MSHのC末端に相当するバリンにグリシン
が付加された14アミノ酸よりなるペプチド)24n
mol を用い、実施例1と同一の条件で2600単
位の製造例で製造した精製酵素を用いて37℃、12時
間反応させた後、21Tl mol の生成物をHPL
Cで回収し、ペプチドシーケンサ−で生成物の確認を行
った。PTf(アミノ酸の回収pmalを次の第4表に
示す。
以上の結果より、13番目のPTH−Val 又はPT
HValNLと14番目のPTH−Gly との回収量
比Jl)、デスアセチルα−MSN が生成したことを
確認した。
HValNLと14番目のPTH−Gly との回収量
比Jl)、デスアセチルα−MSN が生成したことを
確認した。
参考例
本酵素によるD−Tyr−X−Gly (Xは20種類
の天然に存在するアミノ酸)のアミド化 05mM のアスコルビン酸、100μg/mβのカタ
ラーゼ、50MMの硫酸銅、5 m M のDFP
(ジイソプロピルフルオロフォスフェート)、lOμg
7m flのペプスタチン、100100p のD−T
yr−X−Gly 、 500の酵素を含む0.02M
(p)I 8.0) のトリス−塩酸緩衝液(反応総
量250μりの中で37℃、30分反応させた後、5分
間煮沸して反応を停止し、50μlの反応液をECD
を付設したHPLC系(逆層、イナートンルPREPO
DS)にかけ、基質及び生成物の面債比より基質特異性
を検討した。30分で反応の完結した基質は、反応時間
を縮小することにより特異性を調べた。
の天然に存在するアミノ酸)のアミド化 05mM のアスコルビン酸、100μg/mβのカタ
ラーゼ、50MMの硫酸銅、5 m M のDFP
(ジイソプロピルフルオロフォスフェート)、lOμg
7m flのペプスタチン、100100p のD−T
yr−X−Gly 、 500の酵素を含む0.02M
(p)I 8.0) のトリス−塩酸緩衝液(反応総
量250μりの中で37℃、30分反応させた後、5分
間煮沸して反応を停止し、50μlの反応液をECD
を付設したHPLC系(逆層、イナートンルPREPO
DS)にかけ、基質及び生成物の面債比より基質特異性
を検討した。30分で反応の完結した基質は、反応時間
を縮小することにより特異性を調べた。
その結果、本酵素の基質特異性は、以下の通りであった
。
。
+++ νal、 Asn、 Met、^sp、^la
、 Ile、 Leu、 Thr、 Gin++ P
ro、His、Tyr、Glu、Trp、Lys、Ar
g、Ser+ Phe、Gly、、Cys 〔発明の効果〕 本発明は、ブタ心房の可溶性画分より得られた新規酵素
と、これを用いて生理活性が強く医薬に広く用いられて
いるC末端アミド化ペプチドを収率よく工業的に製造す
る極めて有用な発明である。
、 Ile、 Leu、 Thr、 Gin++ P
ro、His、Tyr、Glu、Trp、Lys、Ar
g、Ser+ Phe、Gly、、Cys 〔発明の効果〕 本発明は、ブタ心房の可溶性画分より得られた新規酵素
と、これを用いて生理活性が強く医薬に広く用いられて
いるC末端アミド化ペプチドを収率よく工業的に製造す
る極めて有用な発明である。
第1図はアミド化酵素活性測定のために基質として1吏
用したD−Tyr−!、1et−Gly のポルタモグ
ラフテある。この結果より、活性を検出するためにHP
LCに付設したECDの検出電位を1ミリボルトに設定
した。 第2図は同検出による酵素反応後の基質と生成物の分離
を示す図である。 第3図はDEAE )ヨバール650 Mによるブタ心
房中の)、IO−^、 MO−8画分の分離を示す図で
ある。 第4図はブチルトヨパール650Mによるブタ心房中の
−40−8画分のMO−8−1,M[]−8−2画分の
分離を示す図である。 第5図は銅キレーティングセファ0−ス6Bによるブタ
心房中の!、I D−B −2画分のアミド化活性画分
の分離を示す図である。 第6図はフェニルスーパーロースHR515によるブタ
心房中の−10−B−2画分のアミド化活性画分の分離
を示す図である。
用したD−Tyr−!、1et−Gly のポルタモグ
ラフテある。この結果より、活性を検出するためにHP
LCに付設したECDの検出電位を1ミリボルトに設定
した。 第2図は同検出による酵素反応後の基質と生成物の分離
を示す図である。 第3図はDEAE )ヨバール650 Mによるブタ心
房中の)、IO−^、 MO−8画分の分離を示す図で
ある。 第4図はブチルトヨパール650Mによるブタ心房中の
−40−8画分のMO−8−1,M[]−8−2画分の
分離を示す図である。 第5図は銅キレーティングセファ0−ス6Bによるブタ
心房中の!、I D−B −2画分のアミド化活性画分
の分離を示す図である。 第6図はフェニルスーパーロースHR515によるブタ
心房中の−10−B−2画分のアミド化活性画分の分離
を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、次の性質、 (a)ブタ心房の可溶性画分より得られる、(b)分子
量約36000である、 (c)安定pH範囲が4〜9(50℃で1時間処理し安
定)である、 (d)至適pHが8〜9である、 (e)等電点5〜8である、 (f)ペプチドのC末端をアミド化する基質特異性を有
する、アミド化酵素。 2、C末端にグリシン残基を付加したペプチド前駆体に
、請求項1記載のアミド化酵素を作用させることを特徴
とするグリシン残基が欠失したC末端アミド化ペプチド
の製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1140760A JPH034784A (ja) | 1989-06-01 | 1989-06-01 | アミド化酵素及び該酵素によるc末端アミド化ペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1140760A JPH034784A (ja) | 1989-06-01 | 1989-06-01 | アミド化酵素及び該酵素によるc末端アミド化ペプチドの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH034784A true JPH034784A (ja) | 1991-01-10 |
JPH0583233B2 JPH0583233B2 (ja) | 1993-11-25 |
Family
ID=15276099
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1140760A Granted JPH034784A (ja) | 1989-06-01 | 1989-06-01 | アミド化酵素及び該酵素によるc末端アミド化ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH034784A (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS424747Y1 (ja) * | 1964-02-05 | 1967-03-13 | ||
JPS58128177A (ja) * | 1982-01-25 | 1983-07-30 | 株式会社 サタケ | 穀物用色彩選別機の流下樋加温装置 |
JPS6192620U (ja) * | 1984-11-19 | 1986-06-16 |
-
1989
- 1989-06-01 JP JP1140760A patent/JPH034784A/ja active Granted
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS424747Y1 (ja) * | 1964-02-05 | 1967-03-13 | ||
JPS58128177A (ja) * | 1982-01-25 | 1983-07-30 | 株式会社 サタケ | 穀物用色彩選別機の流下樋加温装置 |
JPS6192620U (ja) * | 1984-11-19 | 1986-06-16 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0583233B2 (ja) | 1993-11-25 |
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