JPH03280900A

JPH03280900A - 核酸配列検査方法及び検査試薬

Info

Publication number: JPH03280900A
Application number: JP8195290A
Authority: JP
Inventors: Teruichi Miyakoshi; 照一宮越; Yuriko Ikuta; 幾田　由里子; Takaharu Suzuki; 鈴木　敬治
Original assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Priority date: 1990-03-29
Filing date: 1990-03-29
Publication date: 1991-12-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明はＤＮＡプローブを用いたデオキシリボ核酸及
び／又はリボ核酸の核酸配列検査方法及び検査試薬に関
する。

［従来の技術］近年の遺伝子工学の進歩によって、遺伝子診断あるいは
研究方法としてＤＮＡプローブを用いた核酸配列検査方
法が提案されている。この核酸配列検査方法は、相補的
なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鎖同士あるいはＤＮＡと
リボ核酸（ＲＮＡ）の特異的な結合に基づくもので、通
常、第２区に示すような方法で行なわれる。

まず、臓器、組織、抹梢血、羊水細胞等がらｐた検体遺
伝子５０を、検体遺伝子がＤＮＡの場イには必要に応じ
制限酵素により適当な大きさにｔ断した後、これをアル
カリ処理して、二本鎖ＤトＡを一本鎖５０ａにする。次
に、−末鎖ＤＮＡξＯａあるいはＲＮＡを適当な膜６ｏ
に移しとり、固定する（サザンプロット）。一方、同様
にしてこの一本鎖ＤＮＡ　５０　ａあるいはＲＮＡと相
補がな一本鎖ＤＮＡ　２０　ａを予め別の検体がら得、
まるいは化学的に合成し、この相補的なりＮＡ２０ａに
１２Ｐなどのラジオアイソトープ３ｏあるいＬ１色素で
標識を付ける。このような標−ＪＤＮＡ　（ＤＮＡプロ
ーブ）と前記ＤＮＡあるいはＲＮＡを固定した膜とを混
ぜることにより両ＤＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡとを結
合させ（ハイブリダイゼーション４０）、しかる後にＤ
ＮＡプローブが結合した膜をＸ線フィルムに密着感光さ
せる等の手法により放射線量を測定して検体中での特定
の核酸配列の有無を検出する。

［発明が解決しようとする課題］ところで、このような従来の核酸配列検出方法において
は、特定のＤＮＡ又はＲＮＡの核酸配列に対して相補的
な一種のＤＮＡのみを用いていたので、例えば複数の遺
伝子疾患を検査する場合には、各遺伝子疾患の異常遺伝
子に対応するＤＮＡプローブを用意しそれぞれのＤＮＡ
プローブについて検査しなければならなかった。従って
検査項目数に対応する数の検体を用意する必要があり、
検出操作も各検査項目毎に行なわなければならず、非常
に手間がかかった。又、サンプルが極めて少ない場合に
はポリメラーゼチエイン反応が応用されるものの多量か
つ多種類のプライマーが必要とされ、検査が困難であっ
た。

この発明は上記従来の核酸配列検出方法の欠点を解消し
、−回の操作で多種類の核酸配列を検出することが可能
な核酸配列検査方法及び検査試薬を提供せんとするもの
である。

［課題を解決するための手段］このような目的を達成する本発明の核酸配列検査方法は
、特定のデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸の核酸配
列に特異的に結合し、各々識別可能な標識でラベルされ
ている２種以上のＤＮＡプローブを、検体と接触させて
検体中に含まれる相補的な検体核酸配列と結合させて、
ＤＮＡプローブと結合した特定の検体核酸配列の各々を
標識で識別するものである。

特に標識は、放射線種の異なる２種以上の放射性同位元
素、極大吸収波長の異なる色素、蛍光極大波長の異なる
蛍光色素、極大発光波長の異なる物置又はこれらの組合
せである。

ここで本発明の検査方法の検出対象物質としては、ＳＶ
４０、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス
（ＨＢＶ）、成人白血病（ＡＴＬＡＶ）、ヒトＴ細胞白
血病（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＨＴＬＶ−ＩＶ）、乳頭腫ウ
ィルス（ＨＰｖ）、リンパ節障害関連ウィルス、アデノ
ウィルス、セムライフ森林ウィルス、バチルスアミロリ
クエファシュンス、パピローマウィルス、エイズウィル
ス、ポリオウィルス、エプスタインＢウィルス、カンピ
ロバクタ−、ロタウィルス、サイトメガロウィルス、ラ
イノウィルス、ニューカッスル病ウィルス、サルモネラ
、大腸菌、赤痢菌、レギオネラ、クラミジア、ＲＯ３，
ｖ−ａ　ｂ　ｌ、　ｖ−ｅ　ｒ　ｂＡ、　ｖ−ｅｒｂＢ
、ｖ−ｆｅｓ、ｖ−ｆｇｒ、ｖ−ｆｍｓ、ｖ−ｆ　ｏｓ
、ｖ−ｍｏｓ、ｖ−ｍｙｂ、ｖ−ｍｙｃ、ｖ−Ｈａ−ｒ
ａｓＳｖ−Ｋｉ−ｒａｓ。

ｖ−ｒｅｌ、ｖ−ｓｉｓ、ｖ−ｓｒｃＳｖ−ｙｅｓ、ｃ
−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ。

ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、インターフＩＣ１ン類
、インターロイキン類、ＡＰＣポリペプチド、ヒト白血
球抗原（ＨＬＡ）、免疫グロブリン類、血液凝固因子類
、プラスミン阻害因子、レニン、ＡＮＦ、カリクレイン
、アポリポタンパク質、ＡｐＯｃｉｔ、ＡｐｏＥ、Ａｐ
ｏＡＩＶ、カルシトニン、アルブミン、プレアルブミン
、トリプシン、カルジオナトリン、エリスロボエチン、
インシュリン、プレプロインシュリン、アクチン、カル
モジュリン、プレプロソーマチン、ウロガステロン、α
−１−アンチトリプシン、アンジオテンシノーゲン、フ
ェニルアラニン水酸化酵素、コリンエステラーゼ、エラ
ステース、レシチンーコレステロールアシルスランスフ
ェラーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、ムタ
ロターゼ、カタラーゼ、トリプシン、ペルオキシダーゼ
、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リパーゼ
、ホスホリパーゼ、グルタミンシンセターゼ、スーパー
オキシドディスムターゼ、グルコースイソメラーゼ、ア
、ミラーゼ、セルラーゼ、グリコアミラーゼ、コラゲナ
ーゼ、チロシナーゼ、セリンプロテアーゼ、ストレプト
キナーゼ、クレアチナーゼ、イソペニシリン合成酵素、
アルカリ性フォスファターゼ、ビオチン合成酵素等の酵
素、耐性関連遺伝子、テトラサイクリン耐性、エリスロ
マイシン耐性、ストレプトマイシン耐性、ゲンタマイシ
ン耐性、インシュリンレセプター、心房性ナトリウム排
出増加ペプチドレセプター、Ｔ細胞レセプター等のレセ
プタ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦＳ　ＩＧＦ。

Ｃ８Ｆ、コルチコトロピン放出因子、癌壊死因子、成長
ホルモン、ソマトスフチン、絨毛性性腺刺激ホルモン、
成長ホルモン放出因子、フルチコトロピン放出因子、プ
ラスミノダン活性化因子、甲状腺刺激ホルモン、マクロ
ファージ活性化因子、Ｂ細胞分化因子等の分化因子、ジ
フテリア毒素、ｐＢＲ３２２、ｐｌＪｃ１１９等のウィ
ルス、バクテリア、腫瘍関連、生体由来のタンパク質、
酵素、ホルモン、耐性関連物質、レセプター、成長因子
、分化因子、活性化因子、毒素、疾病惹起物質、プラス
ミド、コスミッド等の遺伝子、及びこれらの関連物質の
遺伝子、さらに各遺伝子のエンハンサ−、プロモーター
が含まれる。

ここでＤＮＡプローブは、検体核酸配列（ＤＮＡ及び／
又はＲＮＡ）と特異的にハイブリダイゼーションを起こ
す相補的な一本鎖ＤＮＡであり、−末鎖ＤＮＡは所定の
材料から得たＤＮＡを通常、制限酵素で断片に切断し、
アルカリ処理することにより得られる。又、異常遺伝子
（検体核酸配列）の変異を起こした塩基配列と相補的な
オリゴヌクレオチドを合成したものでもよい。

これらＤＮＡプローブはその種類によって識別可能な異
なる標識によってラベルされている。標識としては放射
性同位元素、蛍光色素、発光色素等の色素が用いられる
。例えば放射性同位元素であれば”’Ｉ　Ｓ”ＰＳ”Ｈ
などｓ−ネルギーピークの異なるものが用いられる。

また放射線以外の標識として用いられる色素は以下に挙
げる比色法、蛍光法、発光法等の検知方法で検知される
ものが用いられる。比色法では、基質に１，２−フ二二
しンジアミン或いは３．３゛５５°−テトラメチルベン
チジンを用いるペルオキシダーゼ法、基質に２−ニトロ
フェニル・β−Ｄガラクトシドを用いるβ−Ｄガラクト
シダーゼ法、基質に４−ニトロフェニル・フォスフェー
トを用いるアルカリフォスファターゼ法などの方法、蛍
光法では蛍光色素としてアリルナフタレンスルホンｐ類
（ＡＮＳ）　、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
（ＴＬＴ）、３−カルボエトキシ−７−ヒドロキシクマ
リン（ＣＥＨ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−ＣＤ）な
どを用いる方法や、基質に４−ヒドロキシフェニル酢酸
あるいは３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
を用いるペルオキシダーゼ法、基質に４−メチルウムベ
リフエリル・β−Ｄガラクトシドを用いるβ−Ｄガラク
トシダーゼ法、基質に４−メチルウムベリフェリル・フ
ォスフェートを用いるアルカリフォスファターゼ法など
の方法、生物発光法では、基質にグルコース−６−リン
酸脱水素酵素を用いる脱水素酵素法、基質に２−二トロ
フェニル・β−Ｄガラクトシドを用いるβ−Ｄガラクト
シダーゼ法などの方法、化学発光法では、ルミノールＨ
２０，系によるペルオキシダーゼ法などの公知の方法を
用いることができる。これらは吸収波長、蛍光波長、発
光波長のそれぞれ異なるものを組合せて用いる。また、
放射性同位元素によりラベルしたＤＮＡプローブも放射
性同位元素以外の標識によりラベルしたＤＮＡプローブ
と混合して使用することができる。

これらのＤＮＡプローブの標識化法にはニックトランス
レーション法、キナーゼを用いる５′末端燐酸標識法、
及び化学合成法などの公知の方法を用いることができる
。

又、本発明の検査試薬は、このような標識でラベルされ
ている２種以上のＤＮＡプローブを含有するものであり
、特定のデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸の核酸配
列に特異的に結合するものである。このように識別可能
な標識でラベルされたＤＮＡプローブは、混合して、通
常、水、水−アルコール等の適当な溶媒の溶液として用
いる。

本発明の核酸配列検査試薬は、溶液ハイブリダイゼーシ
ョン、固定された検体遺伝子及び／又はその断片核酸配
列とのハイブリダイゼーションの何れにも適用すること
ができる。

［作用］各々識別可能な標識でラベルされている２種以上のＤＮ
Ａプローブと検体とを接触させると、これら２種以上の
ＤＮＡプローブは各々検体中の特定の相補的な検体核酸
配列と特異的に結合する。

この混合物から公知の方法で未反応の核酸配列を除去し
た後、ＤＮＡプローブと結合している検体核酸配列の混
合物を当該標識を検出する所定の方法、例えば放射線測
定、吸光分光測定、蛍光分光測定等の方法で測定する。

各ＤＮＡプローブに予め結合した標識はそれぞれ、放射
線種、最大吸収波長あるいは蛍光極大波長を異にし識別
可能であるので一回の測定でそれぞれの検体核酸配列を
測定することができる。

［実施例］本発明の核酸配列検査方法を膜に固定した検体核酸配列
とのハイブリダイゼーションに適用した例を第１図に示
した。第１図において、検体核酸配列は制限酵素により
適当な大きさに切断した後、これをアルカリ処理して、
２本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにしたものｌａ、ｌｂで、
これらをニトロセルロース、ナイロン等の膜２に固定す
る（図では分りやすくするため２種の検体ＤＮＡのみが
示されている）。一方、複数種の検体ＤＮＡに対応する
相補的なりＮＡプローブ３ａ、３ｂを生体試料より、ま
たは合成によって用意し、ＤＮＡプローブの種類により
異なる標識４ａ、４ｂでラベルし、これらの混合試薬を
用意する。次いで固定した検体ＤＮＡ１ａ、ｌｂとこの
混合試薬とを適切な温度で、ゾーンハルト溶液、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、食塩、クエン酸ナトリウム等を含む
適切な組成の水溶液中でハイブリダイゼーションを行な
わしめる。これにより検体ＤＮＡ１ａ、ｌｂはそれぞれ
相補的なりＮＡプローブ３ａ、３ｂと結合する。しかる
後に、膜２をよく洗浄して未反応のＤＮＡプローブを除
去した後、放射線測定、吸収分光測定、蛍光分光測定等
の方法で各標識４ａ。

４ｂを測定する。

［発明の効果〕以上の実施例からも明らかなように、本発明の核酸配列
検査方法及び検査試薬によれば、それぞれ異なる標識物
質を用いた複数種のＤＮＡプローブを一つの検体と反応
させればよいので、−度の操作で複数の検査項目を検査
することができる。

従って、極めて微量の検体であっても効率よく検査する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の核酸配列検査方法を示す図、第２図は
従来の核酸配列検査方法を示す図である。ｌａ。３ａ。４ａ。１ｂ・・・・・検体核酸配列３ｂ・・・・・・ＤＮＡプローブ４ｂ・・・・・・標識

Claims

【特許請求の範囲】１、特定の核酸配列に特異的に結合し、各々識別可能な
標識でラベルされている２種以上のＤＮＡプローブを、
検体と接触させて前記検体中に含まれる相補的な検体核
酸配列と結合させて、前記ＤＮＡプローブと結合した前
記特定の検体核酸配列の各々を前記標識で識別すること
を特徴とする核酸配列検査方法。２、前記標識が放射線種の異なる２種以上の放射性同位
元素であることを特徴とする請求項１記載の核酸配列検
査方法。３、前記標識が極大吸収波長の異なる物質、極大発光波
長の異なる物質、極大蛍光波長の異なる物質又はその組
合せであることを特徴とする請求項１記載の核酸配列検
査方法。４、前記標識が極大吸収波長の異なる物質、極大発光波
長の異なる物質、極大蛍光波長の異なる物質又はその組
合せと放射性同位元素との組合せであることを特徴とす
る請求項１記載の核酸配列検査方法。５、特定の核酸配列に特異的に結合し、各々識別可能な
標識でラベルされている２種以上のＤＮＡプローブを含
有し、前記ＤＮＡプローブと結合した検体核酸配列の各
々を前記標識で識別可能とすることを特徴とする検査試
薬。