JPH03266983A - 形質転換した精子細胞の人工受精を介した使用によるトランスジェニック脊椎動物の発生、およびそれによって発生したトランスジェニック脊椎動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、外来ＤＮＡ配列を含む、形質転換した脊椎動
物の精子細胞とそれを調製する方法、およびそのを椎動
物の卵子を本発明の形質転換した精子細胞で受精させる
ことによって発生したトランスジェニック動物およびそ
れを処理する方法に関する。また、本発明は、遺伝子工
学手法により、本発明のトランスジェニック動物により
蛋白質を生産する方法にも関する。また、本発明は、精
子細胞を保存し、本発明に係わるそれらの形質転換を行
うのに特に適した新規な緩衝溶液にも関する。

この緩衝溶液により、精子細胞を長期間保存することが
できる。

ここで使用する形質転換の用語は、精子細胞に外来ＤＮ
Ａを導入することを意味する。

本明細書では、各種の文献を括弧付きのアラビア数字で
示しである。これらの文献の詳細については、本明細書
の末尾に記載しである。ここに記載し、特許請求する本
発明の時点で、当業者に公知の現状技術水準をより詳細
に記載するために、これらの文献の記載内容全体を本明
細書に参考として含める。

発明の背景 動物、特に飼育動物、例えば飼育される鶏の遺伝的性質
を変化させるために、トランスジェニック動物を発生さ
せることは非常に重要である。鶏に導入できる経済的に
重要な遺伝子の数は日毎に増えており、例えば、成長ホ
ルモン、成長ホルモン放出因子、あるいはウィルスエン
ベロープ遺伝子をコードする遺伝子は特に有益である。

このことに関しては、これまでのところ、トランスジェ
ニック動物の系統を発生させるのが困難なことが主な制
約になっている。外来遺伝子を鶏に導入することにより
、成長を促進し、特定のウィルスによる感染に対する免
疫を示すよりよい系を得ること、なとができる。

トランスジェニックを椎動物を生産するための、幾つか
の独立した技術が使用されている（１．２参照）。これ
らの技術には、（＋）受精卵の前核中−２の外来ＤＮＡ
のマイクロインジェクション法（３）　、（＋＋）胚盤
胞に由来する胚幹細胞系の形質転換とそれに続く、キメ
ラ形成のための、発育する胚盤胞中への形質転換細胞の
注入（４）　、（Ｈｉ）初期胚のし）・ロウィルス感染
（５）　、（ｉｖ）外来ＤＮＡによる精子細胞の形質転
換に続く受精および胚細胞中への外来ＤＮＡ挿入（６）
および動物における遺伝子の発現（７）がある。しかし
、ラビトラノら（７）により報告された結果を再現する
ために多くの研究所で行った実験は失敗したと報告され
ている（２６）。

を椎動物ゲノムに外来ＤＮＡ配列を挿入する技術により
、生体内遺伝子制御および動物に対するそれらの遺伝子
発現の影響に関する研究が容易になっている。誘導性プ
ロモーターの制御下で、ラットの成長ホルモンをコード
する遺伝子でマウスの形質転換を行うことにより、巨大
マウスが得られている（８）。他の場合では、発現した
遺伝子こより異常成長か起こり、多くの場合動物は早期
に死自している（９，１．０）。

最初の核分裂の際に雛胎児に到達するのは困難なので、
レトロウィルスに由来するベクターを使用してトランス
ジェニック鶏を生産している（５゜１１　１２　１Ｂ）
。外来ＤＮＡ配列を含むレトロウィルスの組み入れが子
の２−８％で観察され（１４）、これらの配列の発現か
観察された（１５）が、レトロウィルス系のベクターに
は幾つかの大きな欠点がある（５．１３）。これらの欠
点とは、（１）レトロウィルス系のベクターは幾つかの
鶏株には使用できるが、他のものには使用できない、（
Ｎ）レトロウィルスベクター中にクローン化できるＤＮ
Ａ部分の大きさが限られている（５）、および（ｉｉｉ
　）これらのレトロウィルスベクタに感染した鶏を農産
目的に使用することは、般に認められる必要がある、こ
とである。

発明の概要 本発明は、外来ＤＮＡを含む、形質転換したを椎動物の
精子細胞、例えば鳥類および哺乳動物の精子細胞に関す
る。鳥類に関しては、本発明は好ましくは、飼育される
鳥の形質転換した精子細胞に関する。

また、本発明は、哺乳動物の精子細胞および鳥類、好ま
しくは飼育する鳥の精子細胞を含む、を］　３ 椎動物の精子細胞を形質転換するための方法に関する。

この精子細胞の形質転換方法には、やはり本発明の目的
である新規な緩衝溶液（以下、ＥＲ８緩衝剤と呼ぶ）を
使用する。

また、本発明は、動物の卵子を本発明の形質転換した精
子細胞で受精させることによって発生したトランスジェ
ニック動物、特に哺乳動物および鳥類、後者の場合には
好ましくは飼育する鳥、の発生にも関する。受精は一般
に人工授精により行う。

下記の例および図面により本発明の詳細な説明する。

精子細胞の効率の高い形質転換を達成するために、人工
授精における高い受精率を維持し、且つＤＮＡ仲介によ
り遺伝子移入した後の精子の生存力を延ばす緩衝溶液を
まず開発する必要があった。

本発明者は、８７ｍＭ　〜１７４ｍＭのＮａＣｌ、１７
、４ｍＭ〜３４．　８ｍＭのＫＣＩ　　、　３．３ｍＭ
〜３４，８ｍＭのＣａ　Ｃ１２、］、、５５ｍＭ〜３，
１ｍのＭｇＳＯ４および２１ｍＭ〜４４ｍＭのＮ　ａ　
ＨＣＯｓを含み、ｐＨか約７．２である緩衝溶液が上記
の２９の必要条件を非常に効果的に満たすことを発見し
た。好ましくは、緩衝溶液は約１１６ｍＭのＮａＣｌ、
約２３ｍＭのＫＣｌ、約６ｍＭのＣａＣ１、約２ｍＭの
ＭｇＳＯ４および約２９ｍＭのＮ　ａ　ＨＣ０３を含み
、ｐＨが約７．２のものを用いる。ＥＲ３緩衝剤の調製
方法は例１に記載する。例えば、ＥＲ８緩衝剤溶液で希
釈した雄鶏の精子細胞の生存性を例２および第１図に示
す。

したがって、本発明は、その特徴の一つにおいて、この
新規なＥＲ８緩衝剤溶液にも関する。さらに、長期間冷
凍保存するために、グリセロールの様な極低温保存剤を
ＥＲ８緩衝剤に加えることができる。その上、この緩衝
溶液は、所望により、アンピシリン、ストレプトマイシ
ンおよびカナマイシンの様な抗生物質を含むこともでき
る。下記の例で示すように、抗生物質の添加により、精
子細胞の生存性に対して悪影響を及ぼすことは無く、抗
生物質の添加は保存中の細菌汚染を防ぐために特に推奨
される。また、本発明は、外来ＤＮＡ物質を含む、形質
転換したを椎動物の精子細胞にも関する。

本発明は、その特徴の一つにおいて、外来ＤＮＡを含む
、特に形質転換した鳥類の精子細胞、好ましくは飼育す
る鳥の精子細胞に関する。外来ＤＮＡは細菌、真核生物
またはウィルスに由来するものでよく、植物、植物ウィ
ルス、真核生物またはウィルス遺伝子調節因子に連結さ
れていてよい。各種の有用な外来遺伝子を精子細胞に導
入することかできる。これらの遺伝子としては、成長ホ
ルモンをコードする遺伝子、ウィルスエンベロープ遺伝
子、その他の多くの有益な遺伝子がある。

また、本発明は、外来ＤＮＡ物質を含む、形質転換した
哺乳動物の精子細胞、例えばマウスまたはラットの精子
細胞にも関する。これに関連する他の特徴は鳥類の精子
細胞に関する特徴と同じである。

鳥類および哺乳動物の精子細胞はとちらもＥＲ３ｍ衝剤
中で効率的に外来ＤＮＡ配列を取り込むことかできる。

ＥＲ８緩衝剤中に存釈した精子細胞を、望まれるＤＮＡ
を含むプラスミドで処理し、環境温度で適当な時間培養
する。例３（Ａ）に示すように、雄鶏の精子細胞を使用
する場合、外来ＤＮＡの取り込みは十分てあり、直線状
プラスミドを使用した場合の方が、閉じた環状プラスミ
ドを使用する場合よりも取り込み率が高い。マウス精子
細胞によるＤＮＡ取り込みでは、精子細胞にＦＭ中でキ
ャパシテーションを行い、次いでＥＲ８緩衝剤中に再分
散した。このＥＲ８ｇ衝剤中のマウスの細胞にＤＮＡを
加え、室温で異なった時間培養した。例３（Ｂ）および
第４図に示すように、この様にして処理したマウスの精
子細胞は外来ＤＮＡを十分に取り込む。

この様に、本発明は、望まれる外来ＤＮＡ物質を含む、
形質転換した精子細胞、特に哺乳動物の精子細胞および
鳥類、好ましくは飼育する鳥の精子細胞に関する。例え
ば、本発明は、成長ホルモンおよび／または成長ホルモ
ン放出因子をコードする遺伝子、ウィルスエンベロープ
遺伝子、あるいは他の望まれる遺伝子を含む鳥類の精子
細胞に関する。ＣＡＴ　（クロラムフェニコール　アセ
チル　トランスフェラーゼ）遺伝子またはｌａｃＺ遺伝
子で形質転換した精子細胞、並びにこれらの遺伝子のＦ
１世代への胚（ｇｅｒｍ）系伝達を、以下の例でより詳
細に説明する。

また、本発明は、脊椎動物の精子細胞、特に哺乳動物の
精子細胞および鳥類、好ましくは飼育する鳥の精子細胞
を形質転換する方法にも関する。

本方法では、精子細胞を動物から通常の方法により採取
し、該ＥＲ８緩衝剤溶液で望まれる濃度に希釈する。こ
の段階で、精子細胞は直ぢに使用することもできるし、
あるいは室温または低温、例えば４℃で保存することも
できる。これらの条件下で、すでに上に述べた様に、お
よび例１および第１図に記載するように、生存性は十分
に保存される。液体Ｎ２中でも、好ましくはグリセロー
ルの様な極低温保存剤を加えることにより、保存するこ
とができる。雄鶏の精子細胞を、約１５％グリセロール
を含むＥＲ８緩衝剤中に希釈して保存した場合、４℃で
解凍した後、細胞の９５％以上か生存していた。上記の
希釈に続いて、精子細胞を望まれるＤＮＡで処理し、環
境温度で必要な時間培養する。ＤＮＡの取り込みは十分
である。

改良した、形質転換した飼育動物系が経済的に非常に重
要であることは、すでに序論で述べた。

本発明は、その大まかな特徴において、本発明に係わる
形質転換した精子細胞により発生したトランスジェニッ
ク脊椎動物に関する。特に、該動物は哺乳動物および鳥
であり、後者の場合には、好ましく飼育鳥、例えば飼育
雌鳥である。受精は、該形質転換した、ＥＲ８緩衝剤溶
液で希釈した精子細胞を使用した人工授精により行う。

本発明のＥＲ３緩衝剤を使用することにより、鳥の人工
授精効率は、希釈していない精子またはＦＭ溶液で１・
１０に希釈した精子（７）を使用する場合よりも高くな
る。例えば、ホワイトレグホーンの雌鳥を使用する場合
、ＥＲ８緩衝剤を使用する人工授精の成功率は、ＦＭ培
地に比較して４倍高く、新しい、希釈していない精子を
使用する場合に比較して２０％高い。

下記の例は説明目的で記載しているたけてあって、請求
項の範囲によってのみ定義される本発明を制限するもの
ではない。

例Ｉ ＥＲ３緩衝剤の調製 約１１６ｍＭのＮａＣｌ、約２３ｍＭのＫＣＩおよび約
６１１ＩＭのＣａ　Ｃｌ　２を含む水溶液を、これらの
成分を水に溶解することによって調製する。次いで、こ
の溶液に、最終濃度約２ｍＭのＭｇＳＯ４および最終濃
度約２９ｍＭのＮ　ａ　ＨＣＯａを加える。

ｐＨは約７．２である。この溶液を０．２２μｍフィル
ターを通して濾過する。この濾過した溶液が、本発明に
係わるＥＲ８緩衝剤である。

希釈した精子を長期間低温保存するために、グリセロー
ルの様な通常の極低温保存剤をこのＥＲ８緩衝剤に加え
ることができる。例えば、グリセロールは約１５％の濃
度で加え、精子を液体窒素中で保存するのに適した緩衝
剤にすることができる。

例２ （１）ＥＲ８緩衝剤中における精子の生存性（Ａ）（ｉ
）ホワイトレグホーン雄鶏の精子従来の方法により雄鶏
から精子を得た後、直ちにその精子をＥＲ８緩衝剤で１
：１０に希釈する。

精子を直ちに使用しない場合は、４℃または室温で保存
することができる。精子をこの緩衝液中に４℃または室
温で２週間保存した後、その試料中の動いている精子細
胞の数の顕微鏡分析した結果、８０％を超える精子の生
存が確認された（第１図）。ＥＲ３緩衝剤に約１５％の
グリセロールを加えると、精子細胞を液体Ｎ２中に保存
し、４°Ｃで解凍した時に、９５％を超える精子が生存
できる。外来ＤＮＡで精子を形質転換しても精子の生存
性はほとんど低下しなかった（第１図）。

このＥＲ８緩衝剤中に希釈した雄鶏精子による受精の効
率を確認するために、さらに実験を行った。

精子を下記のように希釈した。

第１グループ：希釈していない精子。４０羽の雌鳥に人
工授精（Ａ）。

第２グループ：精子をＥＲ３緩衝剤中に１＝１０で希釈
。８０羽の雌鳥に人工授精（Ｄ）。

それぞれ、雄鶏のグループ（約１０固体）全体から精子
を採取し、直ちに望まれる濃度に希釈し、直ちに、各雌
鳥にＯ，１ｍｌの精子溶液で人工授精した。卵を採取し
、ビクトリアふ卵器中で、１ｒｐｈで振りながら、最適
温度および湿度条件下でふ卵（培養）した。

２４〜７２時間のふ卵に続いて、これらの卵を開き、各
バッチにおける受精卵の百分率を確認した。

結果は次ぎの通りであった。

人工授精後２および３日 グループ　　　　　　　　　Ａ　　　　　　Ｄ卵の総数
　　　　　　　　５６　　　１２７未受精卵　　　　　
　　　　３８ 受精卵％　　　　　　　　９４．６　　９３．７人工授
精後５および６日 卵の総数　　　　　　　　５８　　　１２３未受精卵　
　　　　　　　　３　　　１４受精卵％　　　　　　　
　９４．８　　８８．６人工授精後２．３．５．６日−
全体の結果弁の総数　　　　　　　１１４　　　２５０
未受精卵　　　　　　　　　６　　　２２受精卵％　　
　　　　　　９４．７　　９１．２希釈した精子を使用
した場合の、５および６日の受精率か僅かに低下してい
るのは、受精後６日目に産んだ卵のためである。非希釈
精子で受精したグループＤからの雌鳥の受精卵％に関し
ては比較がない。

（Ａ）（ｉｉ）ダチョウ ダチョウの精子は、イスラエル、キブッ　ハオンのダチ
ョウ農場で、雄のＮｏ、８０から採取した。

精子細胞密度は、測定の結果、５Ｘ１０９精子細胞／ｍ
ｌであることが分った。この精子細胞を直ちにＥＲ８緩
衝剤で、最終体積が０．　３ｎ＋Ｉ〜１ｍｌで、１：１
０．１：４および１：１に希釈した。未希釈精子細胞は
比較として使用した。室温で１時間培養した後、各希釈
からの４試料を氷上で保存し、他の２９の試料は室温で
放置した。さらに４時間培養した後、氷上で保存した試
料の内の２９にグリセロールを、最終濃度がそれぞれ１
０％および１５％になる様に加え、これらの試料を液体
窒素中で保存した。

第３図に示すように、２４時間の培養の後、室温で保存
したダチョウの精子細胞の生存率は、その能動性により
判定して、すべての希釈において６５％を超えていた。

４８時間の培養後では、］：１および１：４の希釈で精
子細胞の２０％以上かなお生存していた。液体窒素中で
低温保存した精子細胞は、７５％まで生存していた。最
良の結果は、グリセロールの濃度が１０％で、ＥＲ８緩
衝剤中の希釈率が１＝４の場合に得られた。

（Ａ）（ｉｉｉ）ガチョウ 雄ガチョウの精子を、イスラエル、キブツ　キルヤット
　アナヴイムの農場で、雄のガチョウから採取し、ＥＲ
３緩衝剤で下記のように希釈した。

雄ガチョウ　試料体積　精子細胞密度　最終体積Ｎｏ、
　　　　ｍｌ　　　　　細胞／　ｍ　Ｉ　　　　ｍ　１
２００２　　　　０、　３　　　　　　　＜１０４　　
　　　３．　０２０３２　　０．５　１．３ｘ１０　　
　５．０１９７４　　０．３　　　　１０”　　　　３
．０１３２２　　１．０　　　５ｘ１０７１０．０１６
２０　　記録せず　　　１０　　　記録せず緩衝液で希
釈した後、各試料の等部分を室温に、もう一つの等部分
を４℃（氷バケツ）に保持した。

これらの等部分を顕微鏡で観察したが、ゼロ時間のデー
タは無い。

５時間の培養後、室温および４℃に保持したすべての試
料で、９５％を超える良好な運動性か観察された。精子
は形態学的に無傷の様であった。

４℃に保存した等部分にグリセロールを最終濃度１０％
になる様に加え、これらの等部分を液体窒素中で冷凍し
、−８０℃で保存した。

２４時間の培養後、室温に保持した等部分は細菌で汚染
したので、緩衝液の精子保存能力を評価するのが困難で
あった。この条件下においても、Ｎｏ、　２０３２の精
子で５０％の運動性が、Ｎｏ、　１９７４．１３２２お
よび１６２０の精子で２５％の能動性が観察された。運
動性は、希釈後５時間で観察した運動性よりも弱かった
。低温冷凍したＮｏ、　２０３２および１９７４の試料
は一８０℃で４日間保存した後、解凍した。精子の運動
性は６０％を超えていた。

したがって、ＥＲ８緩衝剤は、ガチョウの精子を希釈し
、少なくとも４時間保存するのに効果的に使用すること
ができ、保存は室温でも４℃でも可能であり、また、精
子は、ＥＲ８緩衝剤で希釈した場合、極低温条件下でも
効果的に保存されることが分かる。

（Ｂ）アウトブレッド　サブラ　マウスの精子アウトブ
レッド　サブラ　マウスの精子細胞は、マウスの副翠丸
を解剖して採取した。その精子細胞をＦＭ　（７）また
はＥＲ８緩衝剤中に移した。

４℃または室温で６時間培養した後、両緩衝液中で９０
％を超える精子細胞の生存性が観察された。

さらに、６時間の培養後、精子細胞をＥＲ３緩衝剤中で
培養した場合は、事実上細胞の凝集が見られなかったの
に対し、ＦＭ緩衝液中では、精子細胞の大部分が凝集し
た。

（２）グリセロールの異なった濃度の、冷凍後の精子の
生存性に対する影響 グリセロールの異なった濃度の、液体窒素中で冷凍した
後の精子細胞の生存性に対する影響を第２図に示す。精
子をＥＲ８緩衝剤で１：１０に希釈し、グリセロールを
、最終体積１．５…１で望まれる濃度になる様に加えた
。０．　５％〜６０％の濃度で、生存している精子細胞
を観察した。６％〜１２％濃度のグリセロールで、９０
％を超える生存率か確認された。

冷凍した精子細胞は人工授精に使用できる。冷凍した精
子細胞を、それらの液体窒素中における冷凍から数日間
または数週間後に解凍し、鶏の人工授精に使用した。卵
は生み付けられたその日に集め、培養した。生存できる
鶏がこれらの卵からふ化した。さらに、類似の冷凍精子
細胞を解凍し、ＤＮＡで培養し、鶏のトランスフェクシ
ョンに使用した。トランスフェクションの効率は、冷凍
しなかった精子細胞のそれと同等であった。

（３）抗生物質の影響 ＥＲ３緩衝剤中に５００μｇ／ｍ　ｌまでの濃度に希釈
した、３種類の抗生物質、アンピシリン、ストレプトマ
イシンおよびカナマイシン、およびアンピシリンとスト
レプトマイシンの組合わせの、精子細胞の生存性に対す
る影響を分析した。これらの抗生物質の、雄鶏精子細胞
の生存性に対する悪影響は観察されなかった。結果を第
２（Ｂ）図に示す。したがって、精子細胞保存中に起こ
り得る細菌汚染を防ぐには、例えば５０μｇ／ｍｌまで
のアンピシリンおよびストレプトマイシンの添加を推奨
できる。

例３ 精子細胞によるＤＮＡの取り込み （Ａ）ホワイトレグホーン雄鶏の精子 ＥＲ８緩衝剤中の精子細胞は、異ＤＮＡ配列を効率的に
取り込むことができる。ＥＲ３緩衝剤中に約５ｘ１０６
精子細胞／　ｔｎ　ｌを含む溶液１００μｍを、５０％
ｇの［３２Ｐコー標識を付けたＤＮＡ（２，７ｘｌＯ８
ＣＰＭ／μｇ　ＤＮＡ）で処理した。室温で１時間培養
した後、半分量の精子細胞をＥＲ８緩衝剤中で５分ずつ
３回洗浄し、他の半分は１％硫酸デキストランを含むＥ
Ｒ８緩衝剤中で３回洗浄した。両試料をシンチレーショ
ン計数器で測定した。閉じた環状プラスミドを使用した
場合、両方の洗浄で、１２％の計数が洗浄した精子に結
合したままであった。直線状のプラスミドを使用した場
合は、２８％のプラスミドが精子に結合していた。

（Ｂ）アウトブレッド　サブラ　マウスの精子５％ＣＯ
２により３７℃で平衡化したＦＭ緩衝液中で精子細胞を
１．５時間培養することによる、精子細胞のキャパシテ
ーションに続いて、その細胞をＥＲ８緩衝剤中に移し、
ｌｎｇの［３２Ｐコー標識を付けたＤＮＡにより、室温
で１時間培養した。

精子細胞を数回洗浄した後、細胞のそれぞれに約３．５
００個のＤＮＡ分子が結合しているのが分かった。ＥＲ
８緩衝剤中のＤＮＡの取り込みは、ＦＭ緩衝液中の取り
込みと同等であった。結果を第４図に示す。

例４ 遺伝子移入した鶏の発生 ９つの異なったプラスミド構造物を使用し、形質転換し
た精子細胞を造り、さらに遺伝子移入した雛の胎児を発
生させるのに使用した。これらの構造物は多種多様の生
物、例えば植物ウィルス（カリフラワー　モサイクウィ
ルスーＣａ、　Ｍ　Ｖ　）、動物ウィルス（ヘルペス単
（ＩＨ８Ｖ、ＳＶ４０゜巨大細胞ウィルス−ＣＭＶ）、
細菌（Ｅ、　　コリ）およびを椎動物（マウス、ラット
）から得た。

（１）細菌ｌａｃＺ遺伝子に結び付けたＨＳＶｔｋ最小
プロモーターを含むｐＨＦＢＧ２（１６）、 （２）植物Ｃａ　Ｍ　Ｖプロモーターにより動かされる
細菌ＣＡＴ遺伝子を含む ｐＣａＭＶＣＡＴ　（１７）、 （３）ＳＶ４０早期プロモーターにより動かされ（１９
）、 （４）ＳＶ４０早期プロモーターにより動かされる細菌
ｌａｃＺ遺伝子を含むｐＳＶ４０β（１９）、 （５）巨大細胞ウィルス　プロモーターにより動かされ
る細菌ｌａｃＺ遺伝子を含む ｐＣＭＶβ（１９）、 （６）マウスＬ７リポソーム性プロモーターにより動か
される細菌ＣＡＴ遺伝子を含む １）Ｌ７ＣＡＴ３　（２０）、 （７）マウスＬ７プロモーターにより動かされる細菌ｌ
ａｃＺ遺伝子を含むｐＬ７ＬＡＣＺ（この研究のために
、マウスＬ７プロモーター（２０）をｐＮＡｓｓプラス
ミド （１つ）中にサブ−クローニングすることにより本発明
者が調製した）。

（８）ラットＰＥＰＣＫ組織特異性プロモーターにより
動かされる細菌ＣＡＴ遺伝子を含むｐＣＫＣＡＴ　（２
１）および （９）ラット肝臓アルブミンプロモーターにより動かさ
れる細菌ＣＡＴ遺伝子を含む ｐＡｌ　ｂＣＡＴ　（２２）。

精子の形質転換は、精子を無菌の管内に入れ、ＥＲ３緩
衝剤で約１：１０に希釈し、約５Ｘ１０６精子細胞／ｍ
ｌにして行う。次いで、ＤＮＡをこの精子溶液に、２〜
３μｇ／＋ｎ　ｌの濃度になる様に加え、２２℃で６０
分間培養する。

各雌鳥に、約１００μｌの形質転換した精子細胞（約５
ｘ１．０６精子細胞／ｍ１）を腟開口部を通して注入し
、その雌鳥をおりに戻した。毎朝、卵を集め、印しを付
け、３７°Ｃの湿気のあるふ部器中でふ卵した。卵は、
１日歩なくとも１回回転させ、胎児が卵の殻に密着する
のを防いだ。２日間のふ卵後、胎児発生の有無を調べた
。

望ましい発生期間の後、胎児を含む卵を開き、胎児の形
態学的な奇形を調べ、直ちに液体窒素中で一８０℃で保
存したが、または直ちにＤＮＡおよび酵素分析に使用し
た。

例５ 精子細胞による人工受精の効率 ＥＲ８緩衝剤を使用することにより、希釈していない精
子およびＦＭ溶液（７）で１＝１０に希釈した精子細胞
と比較して、人工授精の効率か高くなる。ホワイトレグ
ホーンの雌、弓を使用した場合、ＥＲ８緩衝剤を使用し
た人工授精の成功率は、ＦＭ媒体の場合よりも４倍高く
、新しい、希釈していない精子の場合より２０％高かっ
た。

例６ 鶏胎児における異ＤＮＡ発現の分析 クロラムフェニコール　アセチル　トランスフェラーセ
評価分析 ＣＡＴ　（クロラムフェニコール　アセチル　トランス
フェラーゼ）評価分析は、本質的に（１７）に記載する
ようにして行った。胎児の組織を、０．２５ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ　　ｐＨ＝７．８、］、ｍＭのＥＤＴＡ、お
よびＤＭＳＯ中０．４ＭのＰＭＳＦの新しい原液から採
った０、５ｍＨのＰＭＳＦを含む０．　５ｍｌの緩衝液
中で均質化した。

この均質化した組織を３０秒間超音波処理した。

分解質を氷上で５分間冷却し、微量遠心分離器中で４℃
で５分間遠心分離し、上澄み液を採取した。

この上澄み液を６０℃で１０分間培養し、室温に冷却し
てから５分間遠心分離した。　２０μｍの８ｍＭアセチ
ル補酵素Ａおよび２０μｍの３Ｍ）リス−ＨＣｌ　　ｐ
Ｈ＝７．８を含む管に、２００μｍの分解質および３μ
ｍの［’Ｃ］Ｃクーラムフェニコール（４０−６０ｍＣ
ｊ／ｍｍｏｌ、アメルシアム）を加え、この混合物を３
７℃で一晩培養した。この反応混合物を１体積の酢酸エ
チルで１回抽出し、有機相を別の管に移し、蒸発させ、
２０μｍの酢酸エチルでｖｏｒｔｅｘ処理した。これら
の試料をＴＬＣ板上に載せ、クロロホルム／メタノール
（１，９：１）を含むクロマトグラフィー容器に入れた
。溶液が板の最上部に達するまでＴＬＣを行った。次い
で、これらの板をＸ線フィルムに晒した。

ｐ　Ｌ　７　ＣＡＴ　３による形質転換の発現結果を第
５図に示す。比較用の胎児はＣＡＴ活性を全く示さなか
ったのに対し、４個の処理した胎児の一つは著しいＣＡ
Ｔ活性を示した。５個の別の胎児を使用した第二の実験
でも同様の結果が得られた。

ｐＳＶ２ＣＡＴは、試験した５個の胎児の中の２個で、
ＣＡＴ活性水準がより低かった。

ｐＡｌｂｃＡＴによる形質転換の発現結果を第６図に示
す。トランスフェクションした鶏のふ化から約７日後、
腎臓、肝臓および心臓を解剖し、ＣＡＴ評価分析を行う
のに使用した。分析した鶏の内の６羽で、ＣＡＴ活性は
肝臓にのみ観察された。１羽の鶏では、ＣＡＴ活性は肝
臓および心臓で観察された。処理していない鶏またはｐ
ＣＭＶβでトランスフェクションした鶏はＣＡＴ活性を
示さなかった。行ったすべての実験で好結果が得られた
。

予想した通り、ラットのアルブミンプロモーターは、Ｃ
ＡＴ遺伝子の発現を生後７日のひな鳥の肝臓に優先的に
向けている。ラットにおけるこのプロモーターの発現場
所は肝臓であるので、この結果は、導入した遺伝子の発
現の組織特異性を示している。

β−ガラクトシダーゼ活性 卵から胎児を分離した後、この胎児を、０．２％グルタ
ルアルデヒド、１％パラホルムアルデヒドおよび０，０
２％ＮＰ４０をリン酸塩緩衝塩（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中に含む
溶液中で４°Ｃで５〜３０分間（胎児の大きさに応じて
）固定した。ＰＢＳ中で５分ずつ３回洗浄した後、ＰＢ
Ｓ中に５ｍＭのへキサシアノ鉄（ＩＩ）酸カリウム、５
１℃Ｍのへキサシアノ鉄（ＩＩ＋）酸力ＩＪ　’７ム、
２ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌのＸ−ＧＡＬを
含む溶液中で、３０℃で一晩染色した。次いで、この胎
児をＰＢＳ中で、室温で各５分ずつ３回洗浄し、水中に
７０％エチルアルコールを含む溶液に移し、双眼顕微鏡
で観察した。別の組の実験では、パラホルムアルデヒド
とＮＰ４０を固定緩衝液に入れなかった。

これらの実験の結果を第７および８図に示す。

処理していない胎児では、本質的に染色か見られないの
に対し、ｐＳＶ４０βまたはｐＣＭＶβで形質転換した
胎児の約７０％が強いβガラクトース染色を示している
。最初の組の実験では、合計６３個の胎児を使用した。

比較用の、処理をしていない７個の胎児は、β−ガラク
トース活性を示さなかった。ＣＭＶ−ｌａｃＺ構造で形
質転換した２６個の胎児の内６個がすべての胎児性組織
の中でβ−ガラクトース活性を示している。１４個の胎
児は、組織の一部でのみβ−ガラクトース活性を示した
。残りの６個の胎児は、β−ガラクトース活性を示さな
かった。ｐＳＶ４０βで形質転換した３０個の胎児の内
の８個が、すべての胎児性組織でβ−ガラクトース活性
を示した。１０個の胎児はβ−ガラクトース活性を組織
の一部にたけ示し、残りの胎児はβ−ガラクトース活性
を示さなかった。

パラホルムアルデヒドおよびＮＰ４０を固定工程で使用
した場合、比較用胎児は黄色がかり、処理した胎児は緑
色になったが、これは恐らく、青色のＸ−ＧＡＬ染色と
組織の色が組み合わされた結果であろう。パラホルムア
ルデヒドおよびＮＰ４０を固定工程で使用しなかった場
合、この実験で使用した２個の胎児は、すべての胎児組
織で強い青色染色を示した（第８図）。

例７ ＤＮＡ分析 （１）胚性ＤＮＡ分析 １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ＝７．８．０．４Ｍ
のＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳお
よび１００μｇ／ｍ　ＩのプロテイナーゼＫを含む緩衝
液中で３７°Ｃで組織を培養することによって、胎児か
らＤＮＡを抽出した。ＤＮＡは、フェノール抽出１回、
フェノール／クロロホルム（１：　１　（Ｖ／Ｖ）　）
抽出１回、その後２体積のエタノールで沈殿させること
によって精製した。

ＤＮＡの制限消化は、製造者の指示に従って行った。通
常、１０μｇのＤＮＡを消化し、０．８％アガロースゲ
ルを使用して、アガロースゲル電気泳動にかけた。次い
で、ＤＮＡをナイロン薄膜（ハイボンドＮ１アメルシヤ
ム）に、ナイロンメカ−の指示によりプロットした。ハ
イブリダイゼーションに使用したプローブは、ｐＨＦＢ
Ｇ２プラスミド、ＨｉｎｄｌｌＩで開裂した３、２ｋｂ
のｌａｃＺ遺伝子またはＥｃｏＲＩで開裂した２、２ｋ
ｂＣＡＴ遺伝子およびｐＳＶ２ＣＡＴからのＨｉｎｄＩ
ＩＩであった。プローブの標識付けは、アメルシャム（
英国）のマルチプライム標識キットを使用して、約１１
０９ＣＰ／μｇの比活性を与えた。薄膜は、５０％ホル
ムアミド、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｘＳＳＣ，１
０ｘデンハルトの溶液、および２５０μｇ／＋ｎｌのシ
アリングしたサケの精子ＤＮＡにより、４２℃で４時間
予備ハイブリッド化した。ハイブリダイゼーションは、
２　ｘ　１０６ＣＰＭ／ｍｌの標識をイｑけたプローブ
を含む同じ緩衝液中で、４２℃で１４〜１６時間行った
。洗浄は、室温で、２　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ。

０．１％ＳＤＳ中で各１０分ずつ２回、５５℃で、０．
１％ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で、各３０分ずつ２回行
った。

精子細胞の形質転換および人工受精により、生後４〜５
日の胎児の約８０％が、ｌａｃＺまたはＣＡＴ遺伝子を
プローブとして使用するサザーンブロット　ハイブリダ
イゼーションから判定して、それらのゲノム中にｌａｃ
ＺまたはＣＡＴ遺伝子を含んでいた（第９図）。

（２）成体ＤＮＡ分析 （ａ）ＰＣＲ分析 （２７）に記載されている様にして、血液細胞からＤＮ
Ａを抽出した。このＤＮＡを ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで消化し、ポリメラーゼ連鎖反応分
析（ＰＣＲ）に使用した。約１１００ｎの消化ＤＮＡを
、標準ＰＣＲ反応混合物中で、文献に記載されているＣ
ＡＴ遺伝子配列またはＬａｃＺ配列に従って調製した合
成オリゴヌクレオチドで培養した。これらの合成オリゴ
ヌクレオチドの配列は、 ＣＡＴ遺伝子については、 ＧＣＣＡＣＴ　ＣＡＴ　ＣＧＣＡＧＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ
ＣＡ　ＧＴＣＡＧＴ　ＴＧＣＴＣＡ　ＡＴＣＴＡＧＬａ
ｃＺ遺伝子については、 ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＧＣＧＡ
ＴＴＴＧ　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＧＣＧ　ＧＯＴ　ＧＡＴ　
ＧＴである。

この緩衝液およびヌクレオチドは、メーカーから供給さ
れたものである。９５℃で５分間変性した後、２．５単
位の酵素Ｔａｑポリメラーゼを加え、培養を、先ず５６
°Ｃで１０分間、次いで７２℃で２分間行った。次にこ
れらの試料を、９２°Ｃで１．５分間、５５℃で１，５
分間、７２°Ｃで２分間の２５〜５０サイクルにかけた
。

第１０図に示すように、ＰＣＲ生成物の約４分の１を１
．５％アガロースゲル上に載せた。

ＣＡＴ遺伝子に対して陽性であった鶏中のＰＣＲ生成物
は、予想した５７１ｂｐＤＮＡバンドを与えた。この生
成物は、ＥｃｏＲ１部位を含んでいるはずである。ＰＣ
Ｒ生成物の別の４分の１は、ＥｃｏｒＩで消化され、予
想した４２７ｂｐおよび１４４ｂｐバンドを与えた。

（ｂ）サザーンプロット分析 数羽の性的に成熟した雄鶏の血液および精子細胞からＤ
ＮＡを抽出した。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、３
２［Ｐコー標識を付けたＳＶ４０βをプローブとして使
用し、サザーンブロット分析にかけた。第１２図は、２
羽の成体雄鶏（翼Ｎｏ、　２０４５および２０８９）か
ら得た結果を示す。外来遺伝子は、Ｎｏ、　２０８９の
血液および精子中、およびＮｏ、　２０４５の精子中に
のみ検出された。別の雄鶏（翼Ｎｏ、２００６）中には
、切断された外来遺伝子が検出され、遺伝子の一部分の
みとの組換えが起きたこと、あるいは統合されたＤＮＡ
が統合前に部分的に消化されたことを示している（デー
タは示していない）。

例８ 外来ＤＮＡ配列のＦ１世代へのジャームライン伝達 （ａ）β−ガラクトシダーゼ活性 精子細胞をＳＶ４０βでトランスフェクションし、人工
受精に使用した。卵をふ化させ、雛を性的に成熟するま
で飼育した。ＬａｃＺ配列を求めるためのＰＣＲ反応で
陽性であった、トランスフェクションした雄鶏（翼Ｎｏ
、　２０８９　）の１羽から採取した精子を、未処理の
雌に人工授精するのに使用した。これらの雌の卵を集め
、３７°Ｃで５〜１０日間培養した。次いで、胎児を解
剖し、染色してβ−ガラクトシダーゼ活性を調べた。未
処理の胎児も同し溶液で染色した。２個の比較用胎児お
よび５個のＦ１胎児の内の３個は、β−ガラクトンダー
セ活性に対して陰性であった。第１．１図に示すように
、２個の胎児（番号６ｆ、１０ｆ）が、強いＸ−ｇａ＋
染色を示した。これらの胎児のすべての組織でこの染色
が観察された。異ＤＮＡ配列の次世代への伝達の、最大
予測頻度は５０％であるので、１つの統合部位を仮定し
て、得られた頻度は、この世代におけるｐｒｅｍｏｒｄ
ｉａｌ生殖細胞の大部分が形質転換したことを示してい
る。

（ｂ）ザザーンプロット分析 ２個がＸ−ｇａｌ染色評価分析で陽性であった、これら
の子である胎児の内の、４個の外部胎児組織からＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で消化し、ザザーンブロット分析に
かけた。第１３図に示すように、β−ガラクトシダーゼ
活性を含む２個の胎児（６ｆおよび１０ｆ）は、Ｌａｃ
Ｚ遺伝子も含んでいるのに対し、β−ガラクトシダーゼ
活性に対して陰性であった２個の胎児（８ｆおよび９ｆ
）は、外来遺伝子を含んでいなかった。

献 １、ワーグナー、Ｆ、Ｅ、　およびスチュワート、Ｃ，
Ｌ、　、マウス胎児に導入した遺伝子の統合および発現
。哺乳動物胎児発生を解明するための実験的方法、５０
１−５４９ページ、編集Ｊ３ロサントおよびＲ，Ａ、ペ
ダーソン、ケンブリッジ大学出版（１９８６）。

２、ジェニッシュ、Ｒ１、サイエンス２４０．１４６８
−１４７４　（１９８８）。

３、ゴートン、Ｊ、Ｗ、　　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１
．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７７．７３８０−７３８４（１，９
８０）。

４、ゴスラー、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　　８３．９０６５−９０６９ （１９８６）。

５、サルター、Ｄ、Ｗ、　　ら、ボウルトリーサイエン
ス　６５．１４４５−１４５８ （１９８６）。

６、ブラケット、Ｂ、Ｇ、　　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　　６８．３５３−
３５７文 （１９７１）。

７．ラビトラノ、Ｍ、ら、セル　５７．７１７−７２３
　（１９８９）。

８、パルミター、Ｒ，Ｄ、およびプリンスターＲ１Ｌ、
　　、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、　　２０．４６
５４９９　（１９８６）。

９、ハマー、Ｒ，Ｅ、　　ら、ネイチャー　３１５．６
８］、−６８３（１９８５）。

１０、パーセル、Ｖ、　　Ｇ、ら、サイエンス２４４．
１２８１−１２８８　（１９８９）。

］１．スーザ、Ｌ、　Ｍ、　　ら、Ｊ、Ｅｘｐ、スオロ
ジ−２３２，４６５−４７３（１９８４）。

１２、フッゲス、Ｓ、Ｈ，ら、ボウルトリーサイエンス
　６５．１４５９−１４６７ （１９８６）。

１３、シューマン、Ｒｏおよびショフナー、Ｒ１、ボウ
ルトリーサイエンス　６５．１４３７１４４４　（１９
８６）。

］４．ボッセルマン、Ｒ，Ａ、　　ら、サイエンス２４
３．５３Ｂ−５３５（１９８９）。

１５、サルター、Ｄ、　Ｗ、およびクリテンデン、Ｌ、
　　Ｂ、　、Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、
　７７．４５７−４６１　（１９８９）。

１６、アレン、Ｎ、Ａ、　　ら、ネイチャー３３３．８
５２−８５５　（１９８８）。

１７．ヘルシュコヴイッッ、Ｍ、ら、ＦＥＢＳレターズ
　２５３．１６７−１７２ （１９８９）。

］８．ボルマン、Ｃ，Ｍ、　　ら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ
Ｂｉｏｌ、　２、］−Ｏ０４４−１，０５］、　（１９
８０）。

］９．マクグレガー、Ｇ、　Ｒ，およびカスキＴ、　　
Ｃ，、Ｎｕｃｌ、　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、］　７．２３
６５（１，９８９） ２０、メユハス、０．およびクライン、Ａ３、Ｍｏ１ｅ
ｃ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｊｏｌ、　　（印刷中）２
１、ペンヴエニスティ、Ｎ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、Ｕ　Ｓ　Ａ　　８６、］１１８１
．１２２（１９８９）。

２２、オツド、Ｍ、　　−０，ラ、ＥＭＢＯＪ、　　１
１．２５０５−２５１０　（１９８４）。

２３、クラーク、Ａ、Ｊ、アニマルＧｅｎｅｔ、　２０
．３２７−３２８　　（１９８９）　。

２４、ピッティウス、Ｃ，Ｗ、　　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　　　８５．５８
７４５８７８（１，９８８）　。

２５、レイク、Ｐ、Ｅ、　　およびラビー、Ｏ３、ブリ
ティッシュ　ボウルトリー　サイエンス２８．７５−８
０　（１９８７）。

２６、プリンスター、Ｒ，Ｌ、　　ら、セル　５９．２
３９−２４１　（１９８９）。

２７、ハラ−マン、Ｅ、Ｍ、　　ら、アニマル　ゲネテ
ィックス　１８．２１３−２２２ （１９８７）。

１、　　Ｗａｇｎｅｒ、　　Ｆ、Ｅ、　　ａｎｄ　　５
ｔｅｔａａｒｔ、　　Ｃ，Ｌ、、　　工ｎｔｅｇｒａｔ
ｉｏｎ　　ａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｌｏｎ　　　ｏｆ　　
　Ｇｅｎｅｓ　　　工ｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　　　ｉｎ七
ｏ　　　Ｍｏｕｓｅ　　　ＦＡｂｒｙｏｓ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ七ａｌ　　　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ
　　　ｔｏ　　Ｍａｍ＋ｎａｌｉａｎ　　　Ｅｍｂｒｙ
ｏｎｉｃＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、　　ｐｐ　　５０９
−５４９．　　Ｅｄｓ、　　Ｊ、　　Ｒｏｓｓａｎヒ　
ａｎｄ　　Ｒ，Ａ。

Ｐｅｄｅｒｓｏｎ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８６１゜２、　　Ｊａ
ｅｎｉｓｃｈ、　Ｒ，、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．１４
６８−１４７４　［９Ｂ８１゜３、　　　Ｇｏｒｄｏｎ
、　　Ｊ、Ｗ、、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ｔｌｓ
八　７７゜７３８０−７３８４　　＋１９８０＋。

４、　　　Ｇｏｓｓｌｅｒ、　　Ａ、、　　　ｅｔ　　
ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、
　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　８３゜９０６５−９０６９　
　＋１９８６）。

５、　５ａｌｔｅｒ、　　Ｄ、Ｗ、、　　ｅｔ　　ａｌ
、、　　Ｐｏｕｌｔｒｙ　　５ｃｉｅｎｃｅ　　６５．
　１４４５−１４５８（１９８６１゜ ６、　　Ｂｒａｃｋｅｔｔ、　Ｂ、Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ　６８゜３５３−３５７　　［１９７１）。

７、　　Ｌａｖｉｔｒａｎｏ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｃｅ１ｌ　５７．７１７−７２３　（１９８９１゜
８、　　　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　　Ｒ，Ｄ、　　ａｎｄ
　　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ　　Ｒ，Ｌ、、　　入ｎｎ、　　
Ｒｅｖ、　　Ｇｅｎｅｔ、　　２０゜４６５−４９９　
　（１９８６）。

９、　　Ｈａｒｎｍｅｒ、　Ｒ，Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５．６８１−６８３　＋１９８
５１゜１０、　Ｐｕｒｓｅｌ、　Ｖ、Ｇ、、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．１２８１−１２８８
　（１９８９１゜１１、５ｏｕｚａ、　　Ｌ、Ｍ、、　
　ｅＩ：ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｅｘｐ、　　Ｚｏｏｌｏ
ｇｙ　　２３２．　４６５−４７３（１９８４１゜ １２、、Ｈｕｇｈｅｓ、　　Ｓ、Ｈｌ、　　ｅｔ　　ａ
ｌ、、　　Ｐｏｕｌｔｒｙ　　５ｃｉｅｎｃｅ　　６５
．　１４５９−４４６７（１９８６１゜ １３、５ｈｕｎｖｎａｎ、　　Ｒ，ａｎｄ　　５ｈｏｆ
ｆｎｅｒ、　　Ｒ，、Ｐｏｕｌｔｒｙ　　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　　６５゜１４３７−１４４４　　＋１９８６１．　
　　−１４、　　Ｂｏｓｓａｌｍａｎ、　　Ｒ，入、、
　　ｅｔ、ａｌ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ　　２４３．　
５３３−５３５　　＋１９８９１゜１５、　５ａｌｔｅ
ｒ、　　Ｄ、Ｗ、　　ａｎｄ　　Ｃｒ１ｔｔｅｎｄｅｎ
、　　Ｌ、Ｂ、、　　Ｔｈｅｏｒ、　　入ｐｐ１．　　
Ｇｅｎｅｔ７７．４５７−４６１　　（１９８９１゜１
６、　八１ｌｅｎ、　　Ｎ、入、、　　ｅｔ　　ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ　　３３３．　８５２−８５５　　＋１
９８８１゜１７、　　Ｈｅｒｓｃｈｋｏｖｉセｚ、　　
　Ｍ、　　　ｅｔ　　　ａｌ、、　　　ＦＥＢＳ　　　
Ｌｅｅｔｅｒｓ　　　２５３．　　１６７−１７２（１
９８９１゜ １Ｂ、　Ｇｏｒｍａｎ、　　Ｃ，Ｍ、、　　ｅｔ　　ａ
ｌ、、　　Ｍｏ１ｅｃ、　　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　　
２．　１０４４−１０５１（１９８０１゜ １９、　ＭｃＧｒ＝ｇｏｒ、　　Ｇ、Ｒ，ａｎｄ　Ｃａ
５ｋｅｙ、　　Ｔ、Ｃ，、Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　１．１゜２３６５　　＋１９８９＋。

２０、　Ｍｅｙｕｈａｓ、　　Ｏ，ａｎｄ　Ｋｌｅｉｎ
　Ａ、、　　Ｍｏ１ｅｃ、　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌ、　　（ｉｎｐｒｅｓｓ）。

２３、　　Ｃ１ａｒｋ、　　入、Ｊ、、　八ｎｉｍａｌ
　　Ｇｅｎｅｔ、　　２０．　３２７−３２８　　（１
９８９）。

２６、　Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、、　ｅｔ　ａ：
Ｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５９．２３９−２４１　（１９８９
１゜２７、　　Ｈａｌｌｅｒｍａｎ、　　　Ｅ、Ｍ、　
　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　入ｎｉｍａｌ　　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ　　１８：　　　２１３−２２２（１９８７１
゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、精子の能動性により判定した、ＥＲ８緩衝剤
中の、４℃、室温（ＲＴ、約２２°Ｃ）および３７°Ｃ
における雄鶏精子細胞の生存性を精液中のそれと比較し
て示す。 第２Ａ図は、異なったグリセロール濃度の、ＥＲ８緩衝
剤溶液の雄鶏精子細胞冷凍保存能力に対する影響を示す
。精子細胞の生存性は、能動性精子の百分率により判定
した。 第２Ｂ図は、アンピシリン、ストレプトマイシンおよび
カナマイシンの、ＥＲ８緩衝剤溶液の雄鶏精子細胞保存
能力に対する影響を示す。精子細胞の生存性は、能動性
精子の百分率により判定した。 第３図は、ＥＲ５緩衝剤溶液で１：１．１：４および１
：１０に希釈したダチョウ精子細胞の、４℃、室温、１
０％グリセロールおよび１５％グリセロールを加えて冷
凍して保存した後の生存性を示す。精液中で保存した精
子細胞は、４℃でも室温でも、５時間の培養後には事実
上死滅してい５ま た。 第４図は、精子細胞に結合しているカウント数により表
した、マウス精子細胞によるＤＮＡの取り込みを示す。 第５図は、ｐＬ７ＣＡＴでトランスフェクションした鶏
胎児におけるＣＡＴ　（クロラムフェニコール　アセチ
ル　トランスフェラーゼ）活性を示すＴＬＣ後のＸ線写
真である。 異なったレーンは、 （１）　　　Ｅ、ｃｏｌｉ細胞中で発現したＬ７ＣＡＴ （２）　　　トランスフェクションしていない胎児の比
較 （３−６）ｐＬ７ＣＡＴでトランスフェクションした４
個の異なった胎児を示す。 第６図は、ｐＡｌｂｃＡＴでトランスフェクションした
２羽の鶏におけるＣＡＴ活性を示すＴＬＣ後のＸ線写真
である。 （１）　Ｅ、　　ｃｏ　ｌ　ｉ細胞中でトランスフェク
ションしたｐＳＶ４０β （２−７）ｐＡｌｂｃＡＴでトランスフェクションした
２羽の鶏の腎臓（Ｋ）、肝臓（Ｌ）および心臓（Ｈ）に
おけるＣＡＴ活性。 第７図は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよ
びＮＰ４０中に固定、染色した後の、鶏におけるβ−ガ
ラクトシダーゼ発現を示す生物（胎児）の形態の写真で
ある。 各パネルは、 （１）右：比較用のトランスフェクションしていない胎
児、左：ｐＳＶ４０βでトランスフェクションした胎児
を、同じ発生段階で並べて示す。 （２，３，６，７）ｐＳＶ４０βでトランスフェクショ
ンした胎児。 （４，５）Ｉ）ＣＭＶβでトランスフェクションした胎
児。 （８）ｐＳＶ４０ｃＡＴでトランスフェクションした比
較用胎児。 第８図は、グルタルアルデヒド中に短時間固定して染色
した後の、鶏胎児におけるβ−ガラクトシダーゼ発現を
示す生物（胎児）の形態の写真である。 各パネルは、 （９）Ｔ）ＳＶ４０βでトランスフェクションした胎児
。 （１０）ｐＣＭＶβでトランスフェクションした胎児。 （１１）ｌ−ランスフェクションしていない比較用胎児
。 第９図は、ｐＨＦＢＧ２で形質転換した１２個の独立し
た遺伝子移入鶏胎児から得た、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し
たＤＮＡのサザーンプロット分析を示す電気泳動の写真
である。 第１０図は、ｐＡｌｂＣＡＴまたは ｐＣＫＣＡＴで形質転換した、生後５箇月の鶏の血液細
胞から抽出したＤＮＡに対して行ったポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を示す電気泳動の写真である。 （１，２６）Ｈａｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化したΦＸ　　Ｄ
ＮＡ　　のサイズマーク、 （２，４，１２、］４．１６．１８．２０）翼番号がそ
れぞれ２１１６．２１２４．２１８７．２１９５．２２
１２．２２１３および ２２２５の、ｐＡｌｂｃＡＴでトランスフェクションし
た鶏から得たＤＮＡのＰＣＲ生成物。 （３，５，１３，１５，１７，１９，２１）ＥｃｏＲＩ
で消化した同じＰＣＲ生成物。 （６，８，１０）翼番号がそれぞれ２１２９．２１７１
および２１７３の、ｐＣＫＣＡＴでトランスフェクショ
ンした鶏から得たＤＮＡのＰＣＲ生成物。 （７，９，１１）ＥｃｏＲＩで消化した同じＰＣＲ生成
物。 （２２，２３）ＣＡＴ遺伝子を含む細胞系統から得たＤ
ＮＡのＰＣＲ生成物。 （２４，２５）ＣＡＴ遺伝子を含まない細胞系統から得
たＤＮＡのＰＣＲ生成物。 （２７，２８）トランスフェクションしていない鶏のＤ
ＮＡから得たＰＣＲ生成物。 第１１図は、ＳＶ４０βでトランスフェクションした雄
鶏の精子細胞で、未処理の雌に人工授精して得た染色後
の３個のＦ１胎児（ＡＳＢ、Ｃ）を示す生物（胎児）の
形態の写真である。 強いβ−ガラクトシダーゼ発現が２個の胎児（Ａ、Ｂ）
で観察される（胎児（Ｂ）の頭は染色時に切断した）。 胎児（Ｃ）には発現は見られない。 第１２図は、ＳＶ４０βで形質転換した精子細胞から得
た２羽の性的に成熟した雄鶏（翼番号がそれぞ゛れ２０
４５および２０８９）に由来する、未消化およびＥｃｏ
ＲＩで消化した、血液（ｂ）および精子（ｓ）ＤＮＡ試
料のサザーンプロット分析を示す電気泳動の写真である
。 比較用レーンは、形質転換していない雄鶏に由来する、
ＥｃｏＲＩで消化した精子ＤＮＡを示す。 Ｎｏ、　２０４５では、精子ＤＮＡだけが異遺伝子を含
んでいたことが分かる。サイズマーカーはパネルの間に
示してあり、両方のパネルに適用される。 第１３図は、雄鶏Ｎｏ、　２０８９の血液（ｂ）および
精子（Ｓ）、およびその子である４個の外部胎児組織（
６ｆ、８ｆ、９ｆ、１０ｆ）に由来する、ＥｃｏＲＩお
よびＢｇｌＩＩで消化したＤＮＡのサザーンプロット分
析を示す電気泳動の写真である。 胎児Ｎｏ、６ｆ（第１１ａ図に示す）および１０ｆ（第
１．１　ｂ図に示す）は、第１１図にみられる様に、強
いβガラクトシダーゼ活性を示したのに対し、胎児Ｎｏ
、８ｆ（第１１ｃ図）および９ｆは、β−ガラクトシダ
ーゼ活性を示さなかった。サイズマーカーは左側にある
。 ％ミＡ鑞ｔ ％ηＩ罎ｒ Ｌ月日 ％優薙１ ％湿俺ｊ Ｅｌ 塘壜θチｒ８？（刺 ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、ＩＩａ ｃｏＲ 参・１王′１′生

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、外来ＤＮＡ配列を含む、形質転換した脊椎動物の精
   子細胞。 ２、前記外来ＤＮＡが望まれる遺伝子を含むことを特徴
   とする、請求項１に記載する形質転換した精子細胞。 ３、前記ＤＮＡ配列が真核生物またはウィルス遺伝子調
   節因子に連結されていることを特徴とする、請求項１に
   記載する形質転換した精子細胞。 ４、前記ＤＮＡ配列が、動物の特性を変える能力を有す
   る遺伝子を含むことを特徴とする、請求項３に記載する
   形質転換した精子細胞。 ５、鳥類の精子細胞であることを特徴とする、請求項１
   〜４のいずれか１項に記載する形質転換した精子細胞。 ６、請求項５に記載する、形質転換した、飼育される鳥
   の精子細胞。 ７、請求項６に記載する、形質転換した、飼育雄鶏の精
   子細胞。 ８、哺乳動物の精子細胞であることを特徴とする、請求
   項１〜４のいずれか１項に記載する形質転換した精子細
   胞。 ９、請求項８に記載する、形質転換した、ネズミの精子
   細胞。 １０、精子細胞中に外来ＤＮＡを組み入れることにより
   、脊椎動物の精子細胞を形質転換する方法であって、 （ａ）その動物から精子細胞を採取し、その精子細胞を
   好適な生存力を保存する緩衝溶液中に、望まれる濃度に
   希釈し、所望により、続いてその精子溶液を好適な温度
   で、所望により保存剤を加えて、保存する工程、および （ｂ）その精子細胞溶液を望まれるＤＮＡで処理し、そ
   の混合物を好適な温度で、好適な期間培養する工程 を含むことを特徴とする、方法。 １１、前記緩衝溶液が、８７ｍＭ〜１７４ｍＭのＮａＣ
   ｌ、１７．４ｍＭ〜３４．８ｍＭのＫＣｌ、３．３ｍＭ
   〜３４．８ｍＭのＣａＣｌ＿２、１．５ｍＭ〜３．１ｍ
   ＭのＭｇＳＯ＿４および２１ｍＭ〜４４ｍＮのＮａＨＣ
   Ｏ＿３を含み、ｐＨが約７．２であり、所望によりさら
   に通常の添加剤を含むことを特徴とする、請求項１０に
   記載する精子細胞を形質転換する方法。 １２、前記緩衝溶液が、約１１６ｍＭの ＮａＣｌ、約２３ｍＭのＫＣｌ、約６ｍＭのＣａＣｌ＿
   ２、約２ｍＭのＭｇＳＯ＿４および約２９ｍＭのＮａＨ
   ＣＯ＿３を含み、ｐＨが約７．２であり、所望によりさ
   らに通常の添加剤を含むことを特徴とする、請求項１１
   に記載する精子細胞を形質転換する方法。 １３、緩衝剤により希釈した精子細胞を室温〜４℃の温
   度で保存することを特徴とする、請求項１０〜１２のい
   ずれか１項に記載する精子細胞を形質転換する方法。 １４、ＤＮＡによる培養を環境温度で行うことを特徴と
   する、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載する精子
   細胞を形質転換する方法。 １５、前記外来ＤＮＡが、細菌、真核生物またはウィル
   スに由来する望まれる遺伝子を含むことを特徴とする、
   請求項１０〜１４のいずれか１項に記載する精子細胞を
   形質転換する方法。 １６、前記外来ＤＮＡ配列が、植物または植物ウィルス
   または真核生物またはウィルス遺伝子調節因子に連結さ
   れていることを特徴とする、請求項１５に記載する精子
   細胞を形質転換する方法。 １７、前記精子細胞が鳥類の精子細胞であることを特徴
   とする、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載する精
   子細胞を形質転換する方法。 １８、請求項１７に記載する、飼育される鳥の精子細胞
   を形質転換する方法。 １９、請求項１８に記載する、飼育される雄鶏の精子細
   胞を形質転換する方法。 ２０、前記ＤＮＡが、植物ＣａＭＶプロモーターにより
   御されるＣＡＴ遺伝子を含む ｐＣａＭＶＣＡＴであることを特徴とする、請求項１７
   に記載する鳥類の精子細胞を形質転換する方法。 ２１、前記ＤＮＡが、ＳＶ４０初期プロモーターにより
   御されるＣＡＴ遺伝子を含む ｐＳＶ＿２ＣＡＴであることを特徴とする、請求項１７
   に記載する鳥類の精子細胞を形質転換する方法。 ２２、前記ＤＮＡが、マウスＬ７リボソームプロモータ
   ーにより御されるＣＡＴ遺伝子を含むｐＬ７ＣＡＴ３で
   あることを特徴とする、請求項１７に記載する鳥類の精
   子細胞を形質転換する方法。 ２３、前記ＤＮＡが、ラットＰＥＰＣＫ組織特異性プロ
   モーターにより御されるＣＡＴ遺伝子を含むｐＣＫＣＡ
   Ｔであることを特徴とする、請求項１７に記載する鳥類
   の精子細胞を形質転換する方法。 ２４、前記ＤＮＡが、ラット肝臓アルブミンプロモータ
   ーにより御されるＣＡＴ遺伝子を含むｐＡｌｂＣＡＴで
   あることを特徴とする、請求項１７に記載する鳥類の精
   子細胞を形質転換する方法。 ２５、前記ＤＮＡが、ｌａｃＺ遺伝子に連結されている
   ＨＳＶ−ｔｋミニマルプロモーターを含むｐＨＦＢＧ２
   であることを特徴とする、請求項１７に記載する鳥類の
   精子細胞を形質転換する方法。 ２６、前記ＤＮＡが、サイトメガロウィルスプロモータ
   ーにより御されるｌａｃＺ遺伝子を含むｐＣＭＶβであ
   ることを特徴とする、請求項１７に記載する鳥類の精子
   細胞を形質転換する方法。 ２７、前記ＤＮＡが、ＳＶ４０初期プロモーターにより
   御されるｌａｃＺ遺伝子を含む ｐＳＶ４０βであることを特徴とする、請求項１７に記
   載する鳥類の精子細胞を形質転換する方法。 ２８、前記ＤＮＡが、マウスＬ７リボソームプロモータ
   ーにより御されるｌａｃＺ遺伝子を含むｐＬ７ｌａｃＺ
   であることを特徴とする、請求項１７に記載する鳥類の
   精子細胞を形質転換する方法。 ２９、前記精子細胞が哺乳動物の精子細胞であることを
   特徴とする、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載す
   る精子細胞を形質転換する方法。 ３０、請求項２９に記載するマウスの精子細胞を形質転
   換する方法。 ３１、脊椎動物の卵子を、請求項１〜４のいずれか１項
   に記載する形質転換遺伝子で受精させることにより発生
   した、トランスジェニック脊椎動物。 ３２、脊椎動物の卵子を、請求項１０〜１６のいずれか
   １項に記載する方法により得た、形質転換遺伝子で受精
   させることにより発生した、トランスジェニック脊椎動
   物。 ３３、鳥の卵子を、請求項５〜７のいずれか１項に記載
   する形質転換した精子細胞で受精させることにより発生
   した、トランスジェニック鳥。 ３４、鳥の卵子を、請求項１７〜２８のいずれか１項に
   記載する方法により得た、形質転換精子細胞で受精させ
   ることにより発生した、トランスジェニック鳥。 ３５、請求項３３または請求項３４に記載する、トラン
   スジェニックな飼育される鳥。 ３６、哺乳動物の卵子を、請求項８または請求項９に記
   載する形質転換した精子細胞で受精させることにより発
   生した、トランスジェニック哺乳動物。 ３７、哺乳動物の卵子を、請求項２９の方法により得た
   、形質転換した精子細胞で受精させることにより発生し
   た、トランスジェニック哺乳動物。 ３８、マウスの卵子を、請求項３０の方法により得た、
   精子細胞で受精させることにより発生した、トランスジ
   ェニックマウス。 ３９、前記卵子が、前記形質転換した精子細胞で人工授
   精により受精することを特徴とする、請求項３１〜３８
   のいずれか１項に記載するトランスジェニック動物を発
   生させる方法。 ４０、８７ｍＭ〜１７４ｍＭのＮａＣｌ、 １７．４ｍＭ〜３４．８ｍＭのＫＣｌ、３．３ｍＭ〜３
   ４．８ｍＭのＣａＣｌ＿２、１．５ｍＭ〜３．１ｍＭの
   ＭｇＳＯ＿４および２１ｍＭ〜４４ｍＭのＮａＨＣＯ＿
   ３を含み、ｐＨが約７．２であり、所望によりさらに通
   常の添加剤を含むことを特徴とする水性緩衝溶液。 ４１、約１１６ｍＭのＮａＣｌ、約２３ｍＭのＫＣｌ、
   約６ｍＭのＣａＣｌ＿２、約２ｍＭのＭｇＳＯ＿４およ
   び約２９ｍＭのＮａＨＣＯ＿３を含み、ｐＨが約７．２
   であることを特徴とする、請求項４０に記載する水性緩
   衝溶液。 ４２、ＭｇＳＯ＿４およびＮａＨＣＯ＿３を、溶解した
   前記の他の成分に、最終希釈において加え、得られた溶
   液を０．２２μｍフィルターを通して濾過することによ
   って調製する、請求項４０または４１に記載する緩衝溶
   液。 ４３、さらに所望により保存剤を含むことを特徴とする
   、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載する緩衝溶液
   。 ４４、前記保存剤が、０．５〜６０％濃度のグリセロー
   ルであることを特徴とする、請求項４３に記載する緩衝
   溶液。 ４５、グリセロールの濃度が６〜３０％であることを特
   徴とする、請求項４４に記載する緩衝溶液。 ４６、さらに抗生物質を含むことを特徴とする、請求項
   ４０〜４５のいずれか１項に記載する緩衝溶液。 ４７、前記抗生物質がアンピシリン、ストレプトマイシ
   ンまたはカナマイシンまたはそれらの混合物であること
   を特徴とする、請求項４７に記載する緩衝溶液。