JPH03236396A - 修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びそれを含むｄｎａ - Google Patents
修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びそれを含むｄｎａInfo
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- JPH03236396A JPH03236396A JP2030432A JP3043290A JPH03236396A JP H03236396 A JPH03236396 A JP H03236396A JP 2030432 A JP2030432 A JP 2030432A JP 3043290 A JP3043290 A JP 3043290A JP H03236396 A JPH03236396 A JP H03236396A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
本発明は、新規な修飾オリゴデオキシヌクレオチド及び
それを含むＤＮＡに関する６本発明の修飾オリゴデオキ
シヌクレオチドは、制限酵素の阻害剤や制限酵素を精製
するためのリガンドとしての用途の他、遺伝子操作の種
々の局面において有用性を有する。
それを含むＤＮＡに関する６本発明の修飾オリゴデオキ
シヌクレオチドは、制限酵素の阻害剤や制限酵素を精製
するためのリガンドとしての用途の他、遺伝子操作の種
々の局面において有用性を有する。
〔従来の技術］
化学的に修飾された核酸塩基は天然にもトランスファー
ＲＮＡあるいはメツセンジャーＲＮＡ等に存在し、核酸
に独特な機能を付与することが知られている。しかしな
がら、はとんどの生物固体の中心的な遺伝物質であるＤ
ＮＡはＴ４ファージにおけるヒドロキシメチルシトシン
のような例外的なものと微生物における制限／修飾系に
よって酵素的に修飾された場合を除き、アデニン、チミ
ン、グアニン及びシトシンからなっている。
ＲＮＡあるいはメツセンジャーＲＮＡ等に存在し、核酸
に独特な機能を付与することが知られている。しかしな
がら、はとんどの生物固体の中心的な遺伝物質であるＤ
ＮＡはＴ４ファージにおけるヒドロキシメチルシトシン
のような例外的なものと微生物における制限／修飾系に
よって酵素的に修飾された場合を除き、アデニン、チミ
ン、グアニン及びシトシンからなっている。
ＤＮＡに作用するタンパク質の解析に化学的に合成した
オリゴデオキシヌクレオチドは極めて有用な材料である
０例えばｌａｃオペレーターの解析には才へレータ−付
近の塩基配列を任意に置換することによってＲＮＡポリ
メラーゼの認識する塩基が同定されてきた。また、この
場合にはブロモウラシル、ヒポキサンチンといった異常
塩基の導入もなされている（ Ｂｅｔｚ、 Ｊ、 Ｌ、
ら、Ｇｅｎｅ廷、 ｐｐ、１２３−１３２ ｆ１９８６
）。
オリゴデオキシヌクレオチドは極めて有用な材料である
０例えばｌａｃオペレーターの解析には才へレータ−付
近の塩基配列を任意に置換することによってＲＮＡポリ
メラーゼの認識する塩基が同定されてきた。また、この
場合にはブロモウラシル、ヒポキサンチンといった異常
塩基の導入もなされている（ Ｂｅｔｚ、 Ｊ、 Ｌ、
ら、Ｇｅｎｅ廷、 ｐｐ、１２３−１３２ ｆ１９８６
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ＥｃｏＲＩはＤＮＡに作用する酵素としては最ちよく研
究されているものであり、例えばＢｅｒｋｎｅｒ、 Ｋ
、Ｌ、 とＦｏｌｋ、 Ｉｌ、Ｒ，ｆＪ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｗ。
究されているものであり、例えばＢｅｒｋｎｅｒ、 Ｋ
、Ｌ、 とＦｏｌｋ、 Ｉｌ、Ｒ，ｆＪ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｗ。
庄、 ３１８５−３１９３ （１９７７＋）は酵素的に
修飾されたファージＤＮＡを用いてＥｃｏＲＩ及びＥｃ
ｏＲＩメチラーゼに対する反応性を調べているが、化学
的に修飾したオリゴデオキシヌクレオチドを用いた研究
は知られていない。
修飾されたファージＤＮＡを用いてＥｃｏＲＩ及びＥｃ
ｏＲＩメチラーゼに対する反応性を調べているが、化学
的に修飾したオリゴデオキシヌクレオチドを用いた研究
は知られていない。
一方、合成オリゴデオキシヌクレオチドは近年になって
独自の生理活性すなわち細胞内で遺伝子の発現を押える
作用が知られるようになり、細胞内に取り込まれやすく
、また細胞内の核酸分解酵素に対して抵抗性の高い誘導
体が合成されてきている（ ５ｔｅｉｎ、 Ｃ，Ａ、と
Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、Ｓ、 ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃ
ｈ ４８．２６５９−２６６８ ｆ１９８８１１゜細胞
内の核酸分解酵素に対して抵抗性の高いオリゴデオキシ
ヌクレオチドは、該核酸分解酵素に対する阻害剤として
用いることができ、また、該核酸分解酵素をアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより精製する際のリガンドとし
ての用途を有する他、遺伝子操作の種々の局面において
有用性を有するものと考えられる。
独自の生理活性すなわち細胞内で遺伝子の発現を押える
作用が知られるようになり、細胞内に取り込まれやすく
、また細胞内の核酸分解酵素に対して抵抗性の高い誘導
体が合成されてきている（ ５ｔｅｉｎ、 Ｃ，Ａ、と
Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、Ｓ、 ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃ
ｈ ４８．２６５９−２６６８ ｆ１９８８１１゜細胞
内の核酸分解酵素に対して抵抗性の高いオリゴデオキシ
ヌクレオチドは、該核酸分解酵素に対する阻害剤として
用いることができ、また、該核酸分解酵素をアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより精製する際のリガンドとし
ての用途を有する他、遺伝子操作の種々の局面において
有用性を有するものと考えられる。
［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、核酸分解酵素に対して高い抵抗性を有
する新規な修飾オリゴデオキシヌクレオチドを提供する
ことである。
する新規な修飾オリゴデオキシヌクレオチドを提供する
ことである。
［課題を解決するための手段］
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の修飾アデニン
を含むオリゴデオキシヌクレオチドが、制限酵素のよう
な核酸分解酵素に対して高い抵抗性を有することを見出
し本発明を完成した。
を含むオリゴデオキシヌクレオチドが、制限酵素のよう
な核酸分解酵素に対して高い抵抗性を有することを見出
し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、デオキシ−７，８−ジヒドロキシ
アデノシン−８−オンを分子中に含むオリゴデオキシヌ
クレオチドを提供する。
アデノシン−８−オンを分子中に含むオリゴデオキシヌ
クレオチドを提供する。
また、本発明は、９−（［２−ヒドロキシル−１−（ヒ
ドロキシメチル）−エトキシ−メチル）−アデニンを分
子中に含む修飾オリゴデオキシヌクレオチドを提供する
。
ドロキシメチル）−エトキシ−メチル）−アデニンを分
子中に含む修飾オリゴデオキシヌクレオチドを提供する
。
さらに、本発明は、上記本発明の修飾オリゴデオキシヌ
クレオチドを分子中に含むＤＮＡを提供する。
クレオチドを分子中に含むＤＮＡを提供する。
［発明の効果］
本発明により、核酸分解酵素に対して高い抵抗性を有す
る新規な修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びそれを含
むＤＮＡが提供された０本発明の修飾オリゴデオキシヌ
クレオチドは、該核酸分解酵素の活性部位と結合するが
該酵素によって分解されないので、該核酸分解酵素の阻
害剤として用いることができ、また、該核酸分解酵素を
アフィニティクロマトグラフィーにより精製する際のリ
ガンドとして用いることらできる。さらに、本発明のオ
リゴデオキシヌクレオチドを含むＤＮＡは、少なくとち
該オリゴデオキシヌクレオチドの部分において該核酸分
解酵素の作用を受けないので、例えば塩基配列を変更す
ることなく制限酵素部位を消失させることができ、後で
詳細に述べるように遺伝子操作の種々の局面において有
用性を有する。
る新規な修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びそれを含
むＤＮＡが提供された０本発明の修飾オリゴデオキシヌ
クレオチドは、該核酸分解酵素の活性部位と結合するが
該酵素によって分解されないので、該核酸分解酵素の阻
害剤として用いることができ、また、該核酸分解酵素を
アフィニティクロマトグラフィーにより精製する際のリ
ガンドとして用いることらできる。さらに、本発明のオ
リゴデオキシヌクレオチドを含むＤＮＡは、少なくとち
該オリゴデオキシヌクレオチドの部分において該核酸分
解酵素の作用を受けないので、例えば塩基配列を変更す
ることなく制限酵素部位を消失させることができ、後で
詳細に述べるように遺伝子操作の種々の局面において有
用性を有する。
［発明の詳細な説明］
上述のように、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチ
ドは、分子中にデオキシ−７，８−ジヒドロキシアデノ
シン−８−オン（以下ｄＡ Ｑ Ｈと示すことがある）
又は９− （［２−ヒドロキシル−１−（ヒドロキシメ
チル）−エトキシーメチルトーアデニン（以下ｄａｃＡ
と示すことがある）を含む。
ドは、分子中にデオキシ−７，８−ジヒドロキシアデノ
シン−８−オン（以下ｄＡ Ｑ Ｈと示すことがある）
又は９− （［２−ヒドロキシル−１−（ヒドロキシメ
チル）−エトキシーメチルトーアデニン（以下ｄａｃＡ
と示すことがある）を含む。
本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、修飾され
たアデニンを含んでおり、制限酵素のような核酸分解酵
素に対して抵抗性を有する。
たアデニンを含んでおり、制限酵素のような核酸分解酵
素に対して抵抗性を有する。
本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、後述のよ
うに、制限酵素の活性部位と結合するが該制限酵素によ
っては分解されない場合に特に有用であるので、本発明
の好ましい態様では、本発明のオリゴデオキシヌクレオ
チドは制限酵素の認識部位を含む、ちっとち、本発明の
修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、制限酵素以外の核
酸分解酵素に対しても抵抗性を示すものと考えられるの
で、制限酵素の認識部位を含むことは必須的ではない。
うに、制限酵素の活性部位と結合するが該制限酵素によ
っては分解されない場合に特に有用であるので、本発明
の好ましい態様では、本発明のオリゴデオキシヌクレオ
チドは制限酵素の認識部位を含む、ちっとち、本発明の
修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、制限酵素以外の核
酸分解酵素に対しても抵抗性を示すものと考えられるの
で、制限酵素の認識部位を含むことは必須的ではない。
特に、下記実施例で具体的に示されるように、下記式［
Ｉ］ないし ［ＩＶ］で示される本発明のオリゴデオキ
シヌクレオチドは、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を含
むが制限酵素ＥｃｏＲ■に対して優れた抵抗性を有する
ことが見出された。
Ｉ］ないし ［ＩＶ］で示される本発明のオリゴデオキ
シヌクレオチドは、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を含
むが制限酵素ＥｃｏＲ■に対して優れた抵抗性を有する
ことが見出された。
ｄ （ＧＧ曳ごＡＴＴＣＣ） ［Ｉ］ｄ
（ＧＧＡＡｏＭＴＴＣＣ） ［ＩＩＩｄ （
ＧＧａｃＡＡＴＴＣＣ） ［ＩＩＩ］ｄ （
ＧＧＡａｃＡＴＴＣＣ） ［ＩＶ］なお、本発
明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ以
外の制限酵素に対しても抵抗性を有するちのと考えられ
る。
（ＧＧＡＡｏＭＴＴＣＣ） ［ＩＩＩｄ （
ＧＧａｃＡＡＴＴＣＣ） ［ＩＩＩ］ｄ （
ＧＧＡａｃＡＴＴＣＣ） ［ＩＶ］なお、本発
明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ以
外の制限酵素に対しても抵抗性を有するちのと考えられ
る。
本発明はさらに、上記本発明の修飾オリゴデオキシヌク
レオチドを含むＤＮＡを提供する０本発明のＤＮＡは、
後述のように、制限酵素の認識部位を含む場合に特に有
用となる。特に、下記式［Ｖ］ないし［Ｖ ＩＩＩ ］
で表わされる配列を有するものは、制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識配列を含むが制限酵素ＥｃｏＲＩに対して抵抗性
を有する。
レオチドを含むＤＮＡを提供する０本発明のＤＮＡは、
後述のように、制限酵素の認識部位を含む場合に特に有
用となる。特に、下記式［Ｖ］ないし［Ｖ ＩＩＩ ］
で表わされる配列を有するものは、制限酵素ＥｃｏＲＩ
の認識配列を含むが制限酵素ＥｃｏＲＩに対して抵抗性
を有する。
ｄ （ＧＡＯＨＡＴＴＣ） ［Ｖ］ｄ （ＧＡＡ
”ＴＴＣ） ［ＶＩ］ｄ （ＧａｃＡＡＴＴＣ）
［ＶＩＩ］ｄ （ＧＡａｃＡＴＴＣ） ［
ＶＩＩＩ］もっとも、上記と同様、本発明のＤＮＡはＥ
ｃｏＲＩ以外の制限酵素に対してち抵抗性を有するちの
と考えられる。
”ＴＴＣ） ［ＶＩ］ｄ （ＧａｃＡＡＴＴＣ）
［ＶＩＩ］ｄ （ＧＡａｃＡＴＴＣ） ［
ＶＩＩＩ］もっとも、上記と同様、本発明のＤＮＡはＥ
ｃｏＲＩ以外の制限酵素に対してち抵抗性を有するちの
と考えられる。
本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びＤＮＡの
製造方法を第１図に基づいて説明する。ちっと６、製造
方法は下記のものに限定されるわけではない。
製造方法を第１図に基づいて説明する。ちっと６、製造
方法は下記のものに限定されるわけではない。
ｄＡＯＨ含ＯＨリゴデオキシヌクレオチドの出発原料と
なるデオキシ−Ｎ−アセチル−７，８−シヒドロアデノ
シンー８−オン（化合物１）は、Ｉｋｅｈａｒａ、 Ｍ
らの方法（Ｃｈｅ＋ｓ、 Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、
１８゜２４４１−２４４６ ＋１９７０１に基づき、８
−ブロモデオキシアデノシンを酢酸ナトリウム存在下で
無水酢酸と反応させ、生成するＮ−アセチル−３゛５゛
−ジアセチル−７，８−ジヒドロアデノシン−８−オン
を水酸化ナトリウムと反応させることにより製造するこ
とができる１次いで化合物ｌを塩化ジメトキシトリチル
（Ｄ ＭＴｒＣｌ）で処理することにより、５゛位が保
護された化合物２を得ることができる０次いで、化合物
２をトリス−ｆｌ、 １．１．３．３．３−ヘキサフル
オロ−２−プロピル）フォスファイト（Ｔ ＨＦ Ｐ
Ｐ ） ［（Ｆ、Ｃ１，ＣＨＯ］、Ｐと、触媒量のピ
リジン存在下、例えばジクロロメタンのような溶媒中で
反応させ、加水分解してＳａｋａｔｓｕｍｅ、０らの方
法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １７゜３
６８９−３６９７ ＋１９８９１ ）に従ってクロマト
グラフィーにより精製することにより３゛位の水酸基が
リン酸化されたヌクレオチド３を得ることができる。
なるデオキシ−Ｎ−アセチル−７，８−シヒドロアデノ
シンー８−オン（化合物１）は、Ｉｋｅｈａｒａ、 Ｍ
らの方法（Ｃｈｅ＋ｓ、 Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、
１８゜２４４１−２４４６ ＋１９７０１に基づき、８
−ブロモデオキシアデノシンを酢酸ナトリウム存在下で
無水酢酸と反応させ、生成するＮ−アセチル−３゛５゛
−ジアセチル−７，８−ジヒドロアデノシン−８−オン
を水酸化ナトリウムと反応させることにより製造するこ
とができる１次いで化合物ｌを塩化ジメトキシトリチル
（Ｄ ＭＴｒＣｌ）で処理することにより、５゛位が保
護された化合物２を得ることができる０次いで、化合物
２をトリス−ｆｌ、 １．１．３．３．３−ヘキサフル
オロ−２−プロピル）フォスファイト（Ｔ ＨＦ Ｐ
Ｐ ） ［（Ｆ、Ｃ１，ＣＨＯ］、Ｐと、触媒量のピ
リジン存在下、例えばジクロロメタンのような溶媒中で
反応させ、加水分解してＳａｋａｔｓｕｍｅ、０らの方
法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １７゜３
６８９−３６９７ ＋１９８９１ ）に従ってクロマト
グラフィーにより精製することにより３゛位の水酸基が
リン酸化されたヌクレオチド３を得ることができる。
次いで、このヌクレオチド３を、例えばマニュアルの固
相合成法のような常法に基づき、他のヌクレオチドと重
合させ、ジクロロ酢酸、次いでアンモニア水で処理して
脱保護することにより本発明の修飾オリゴデオキシヌク
レオチド及びＤＮＡを合成することができる。上記のよ
うにして合成された修飾オリゴデオキシヌクレオチドは
、さらにＤＥＡＥ−セルロースカラム及び逆相クロマト
グラフィー等により精製することができる。
相合成法のような常法に基づき、他のヌクレオチドと重
合させ、ジクロロ酢酸、次いでアンモニア水で処理して
脱保護することにより本発明の修飾オリゴデオキシヌク
レオチド及びＤＮＡを合成することができる。上記のよ
うにして合成された修飾オリゴデオキシヌクレオチドは
、さらにＤＥＡＥ−セルロースカラム及び逆相クロマト
グラフィー等により精製することができる。
ｄａｃＡ含有修飾オリゴデオキシヌクレオチドを製造す
るためには、まず、アシクロアデノシン（化合物４）に
トリメチルクロロシラン（ＴＭＳＣＩ）を加え、これに
直ちに塩化ベンゾイル（ＢｚＣｌ）を加えて反応させた
後、反応生成物に希釈アンモニア水を加えることにより
化合物５を得る６次いでこれをｄＡＯＨの製造の場合と
同様に、ＤＭＴｒＣｌで処理してエーテル部分の２位の
水酸基を保護した化合物６を得、次いでこれを［（Ｆ、
Ｃ１、ＣＨＯ］ 、Ｐと反応させ、加水分解し、生成し
てヌクレオチド７を合成し、他のヌクレオチドと重合さ
せてｄａｃＡ含有オリゴヌクレオチド又はＤＮＡを得る
ことができる。また、上記方法によって特定の塩基配列
を有する本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドを合
成した後、それを常法により伸長して本発明のＤＮＡを
製造することもできる６ 本発明のＤＮＡはまた、例えば構造遺伝子のような天然
のＤＮＡに上記本発明におけるアデニンの化学修飾を導
入することによってち製造することができるものと考え
られる。これは、例えば以下のようにして行なうことが
できると考えられる。すなわち、２゛−デオキシアデノ
シン及びＤＮＡ中のアデニン塩基が活性酸素種（水酸ラ
ジカル）の攻撃を受けるとアデニン８位が水酸化される
。この反応は■■１四においてら起こる。Ｘ線、変異原
性や発癌性を示す化学物質には酸素ラジカルの発生源と
なるものが多いことからＤＮＡ中に生じた８−ヒドロキ
シアデニン残基が発癌に６関与すると考えられる。
るためには、まず、アシクロアデノシン（化合物４）に
トリメチルクロロシラン（ＴＭＳＣＩ）を加え、これに
直ちに塩化ベンゾイル（ＢｚＣｌ）を加えて反応させた
後、反応生成物に希釈アンモニア水を加えることにより
化合物５を得る６次いでこれをｄＡＯＨの製造の場合と
同様に、ＤＭＴｒＣｌで処理してエーテル部分の２位の
水酸基を保護した化合物６を得、次いでこれを［（Ｆ、
Ｃ１、ＣＨＯ］ 、Ｐと反応させ、加水分解し、生成し
てヌクレオチド７を合成し、他のヌクレオチドと重合さ
せてｄａｃＡ含有オリゴヌクレオチド又はＤＮＡを得る
ことができる。また、上記方法によって特定の塩基配列
を有する本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドを合
成した後、それを常法により伸長して本発明のＤＮＡを
製造することもできる６ 本発明のＤＮＡはまた、例えば構造遺伝子のような天然
のＤＮＡに上記本発明におけるアデニンの化学修飾を導
入することによってち製造することができるものと考え
られる。これは、例えば以下のようにして行なうことが
できると考えられる。すなわち、２゛−デオキシアデノ
シン及びＤＮＡ中のアデニン塩基が活性酸素種（水酸ラ
ジカル）の攻撃を受けるとアデニン８位が水酸化される
。この反応は■■１四においてら起こる。Ｘ線、変異原
性や発癌性を示す化学物質には酸素ラジカルの発生源と
なるものが多いことからＤＮＡ中に生じた８−ヒドロキ
シアデニン残基が発癌に６関与すると考えられる。
さらに、ＤＮＡの複製の際に上記ヌクレオチド３又は７
を原料として反応系に供給することにより、ｃＤＮＡに
上記アデニンの化学修飾を導入して本発明のＤＮＡとす
ることら可能であろう。
を原料として反応系に供給することにより、ｃＤＮＡに
上記アデニンの化学修飾を導入して本発明のＤＮＡとす
ることら可能であろう。
本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドは、上述のよ
うに、核酸分解酵素の活性部位と結合するが該核酸分解
酵素によっては分解されないので該核酸分解酵素の阻害
剤又は該酵素をアフイニティクロマトグラフイーで分離
、精製する際のリガンドとして用いることができる０例
えば、上記式［Ｉ］ないし［ＩＶＩで示されるオリゴデ
オキシヌクレオチドは、制限酵素ＥｃｏＲＩの阻害剤又
はＥｃｏＲＩをアフイニテイクロマトグラフィーで精製
する際のリガンドとしての用途を有する。また、本発明
のオリゴデオキシヌクレオチドは、制限酵素の接着末端
の配列を有する場合にはリンカ−としての用途を有する
。すなわち、制限酵素の接着末端の配列を有するリンカ
−に本発明における化学修飾を導入することにより、該
接着末端と結合するが、結合後、該制限酵素によっては
分解されないようにすることができ（すなわち、該制限
酵素部位を消滅させることができ）、後述のような遺伝
子操作の局面において有用性を発揮する。
うに、核酸分解酵素の活性部位と結合するが該核酸分解
酵素によっては分解されないので該核酸分解酵素の阻害
剤又は該酵素をアフイニティクロマトグラフイーで分離
、精製する際のリガンドとして用いることができる０例
えば、上記式［Ｉ］ないし［ＩＶＩで示されるオリゴデ
オキシヌクレオチドは、制限酵素ＥｃｏＲＩの阻害剤又
はＥｃｏＲＩをアフイニテイクロマトグラフィーで精製
する際のリガンドとしての用途を有する。また、本発明
のオリゴデオキシヌクレオチドは、制限酵素の接着末端
の配列を有する場合にはリンカ−としての用途を有する
。すなわち、制限酵素の接着末端の配列を有するリンカ
−に本発明における化学修飾を導入することにより、該
接着末端と結合するが、結合後、該制限酵素によっては
分解されないようにすることができ（すなわち、該制限
酵素部位を消滅させることができ）、後述のような遺伝
子操作の局面において有用性を発揮する。
本発明のＤＮＡは、遺伝子操作において種々の工程で用
いることができる１例えば、構造遺伝子又はその他の有
用な塩基配列に本発明における化学修飾を導入すること
により、該構造遺伝子又は有用配列が制限酵素によって
切断されることを防止することができ、遺伝子操作にお
いて採用できる制限酵素の選択範囲が広がる０例えば、
ベクターに外来遺伝子を導入する場合には、通常、該ベ
クター中に一箇所又は三箇所だけ制限部位が存在する制
限酵素を用いることが普通であるが、該制限部位が三箇
所以上ある場合であってち、所望の制限酵素部位以外の
制限酵素部位に本発明におけるアデニンの修飾を導入す
ることによりその制限酵素部位を消滅させることができ
、従って、採用できる制限酵素の選択範囲が大幅に広が
り、これは、遺伝子操作上、非常に有利なことである。
いることができる１例えば、構造遺伝子又はその他の有
用な塩基配列に本発明における化学修飾を導入すること
により、該構造遺伝子又は有用配列が制限酵素によって
切断されることを防止することができ、遺伝子操作にお
いて採用できる制限酵素の選択範囲が広がる０例えば、
ベクターに外来遺伝子を導入する場合には、通常、該ベ
クター中に一箇所又は三箇所だけ制限部位が存在する制
限酵素を用いることが普通であるが、該制限部位が三箇
所以上ある場合であってち、所望の制限酵素部位以外の
制限酵素部位に本発明におけるアデニンの修飾を導入す
ることによりその制限酵素部位を消滅させることができ
、従って、採用できる制限酵素の選択範囲が大幅に広が
り、これは、遺伝子操作上、非常に有利なことである。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
６っとも、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。
い。
出発物質のデオキシ−７，８−ジヒドロアデノシン−８
−オン（第１図化合物ｌ）は、Ｉｋｅｈａｒａ、 Ｍら
の方法（上掲）に基づき、８−ブロモデオキシアデノシ
ンを酢酸ナトリウム存在下で無水酢酸と反応させ、生成
したＮ−アセチル−３° ５°−ジアセチル−７，８
−ジヒドロアデノシン−８−オンを２Ｎ水酸化ナトリウ
ムと０℃で５分間反応させることにより製造した。なお
、得られた化合物は紫外部最大吸収が２９１ｎ−にあり
、化合物１であることが確認された。
−オン（第１図化合物ｌ）は、Ｉｋｅｈａｒａ、 Ｍら
の方法（上掲）に基づき、８−ブロモデオキシアデノシ
ンを酢酸ナトリウム存在下で無水酢酸と反応させ、生成
したＮ−アセチル−３° ５°−ジアセチル−７，８
−ジヒドロアデノシン−８−オンを２Ｎ水酸化ナトリウ
ムと０℃で５分間反応させることにより製造した。なお
、得られた化合物は紫外部最大吸収が２９１ｎ−にあり
、化合物１であることが確認された。
次いで化合物ｌを塩化ジメトキシトリチルで処理し、化
合物２を得た。処理の条件は化合物（１モル当量）と塩
化ジメトキシトリチル（１，１モル当量）と無水ピリジ
ン中１．５時間反応させた後、水を加え加水分解し、シ
リカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製した。
合物２を得た。処理の条件は化合物（１モル当量）と塩
化ジメトキシトリチル（１，１モル当量）と無水ピリジ
ン中１．５時間反応させた後、水を加え加水分解し、シ
リカゲルクロマトグラフィーを用いて分離精製した。
次いで化合物２をＴＨＰＰＰと反応させた。
この際、化合物２とＴＨＦＰＰとのモル比は１：１．ｌ
であり、また反応は触媒量のピリジン存在下、ジクロロ
メタン中で室温で１０分間行なった０反応生成物をＩＭ
）−リエチルアンモニウムビカーボネート緩衝液（ｐＨ
７，６１を用いて加水分解してＳａｋａｔｓｕｍｅ、
Ｏらの方法（上掲）に従ってクロマトグラフィーにより
精製し、化合物３を得た。
であり、また反応は触媒量のピリジン存在下、ジクロロ
メタン中で室温で１０分間行なった０反応生成物をＩＭ
）−リエチルアンモニウムビカーボネート緩衝液（ｐＨ
７，６１を用いて加水分解してＳａｋａｔｓｕｍｅ、
Ｏらの方法（上掲）に従ってクロマトグラフィーにより
精製し、化合物３を得た。
次いで、ｄＡ、ｄＣ，ｄＧ及びｄＴと共に化合物３を反
応に供し、マニュアルの固相合成法により重合させ、式
［Ｉ］及び［ｎ］のオリゴデオキシヌクレオチド（第１
図中、化合物８及び９）を合成した。また、対照として
、ｄ Ａ ＯＨを含まない通常のオリゴデオキシヌクレ
オチド（化合物１２）も合成した０重合のサイクルは、
Ｈ９Ｔａｋａｋｕらの方法（Ｃｈｅｗ、 Ｌｅｔｔ、
１６７５−１６７８ｆ１９８８１ ）に従って行ない、
サイクル終了後ＴＨＦ−ピリジン−Ｈ，０（４４：３：
３、ｖ／ｖｌ中０．１ＭのＩ２で酸化してフォスフェー
ト体に変換した。
応に供し、マニュアルの固相合成法により重合させ、式
［Ｉ］及び［ｎ］のオリゴデオキシヌクレオチド（第１
図中、化合物８及び９）を合成した。また、対照として
、ｄ Ａ ＯＨを含まない通常のオリゴデオキシヌクレ
オチド（化合物１２）も合成した０重合のサイクルは、
Ｈ９Ｔａｋａｋｕらの方法（Ｃｈｅｗ、 Ｌｅｔｔ、
１６７５−１６７８ｆ１９８８１ ）に従って行ない、
サイクル終了後ＴＨＦ−ピリジン−Ｈ，０（４４：３：
３、ｖ／ｖｌ中０．１ＭのＩ２で酸化してフォスフェー
ト体に変換した。
次いでジクロロメタン中２．５１ジクロロ酢酸で処理し
、次いでアンモニア水で処理して脱保護した。
、次いでアンモニア水で処理して脱保護した。
脱保護後のオリゴマーは、ＤＥＡＥ−セルロースカラム
（東ソー社製、 ＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ−２ＳＷ）
を用いて精製し、さらに逆相の高速液体クロマトグラフ
ィーカラム（東ソー社製、ＴＳＫ ｇｅｌ ｏｌｉｇ。
（東ソー社製、 ＴＳＫ ｇｅｌ ＤＥＡＥ−２ＳＷ）
を用いて精製し、さらに逆相の高速液体クロマトグラフ
ィーカラム（東ソー社製、ＴＳＫ ｇｅｌ ｏｌｉｇ。
ＤＮＡ ＲＰ、０．Ｉ Ｍ ＴＥＡＡ （ｐＨ７，０１
中０．７５〜２５％アセトニトリル直線勾配）によって
再精製した。この時得られたクロマトグラムを第２図に
示す、なお、第２図のａないしｅは、それぞれ化合物８
〜１２（化合物１０．１１については実施例２で記載）
についての結果を示す（以下、図中にａ −ｅの表示が
あるときは同様）、第２図より、各オリゴデオキシヌク
レオチドは実質的に単離されたことがわかる。また、化
合物８．９が第１図に示す配列を有していることは蛇毒
ホスホジェステラーゼとアルカリホスファターゼを用い
て加水分解することにより確認した。
中０．７５〜２５％アセトニトリル直線勾配）によって
再精製した。この時得られたクロマトグラムを第２図に
示す、なお、第２図のａないしｅは、それぞれ化合物８
〜１２（化合物１０．１１については実施例２で記載）
についての結果を示す（以下、図中にａ −ｅの表示が
あるときは同様）、第２図より、各オリゴデオキシヌク
レオチドは実質的に単離されたことがわかる。また、化
合物８．９が第１図に示す配列を有していることは蛇毒
ホスホジェステラーゼとアルカリホスファターゼを用い
て加水分解することにより確認した。
アシクロアデノシン（第１図化合物４）にトリメチルク
ロロシランを加え、これに直ちに塩化ベンゾイルを加え
て反応させた１反応条件は、化合物４（１モル当量）と
塩化ベンゾイル（６モル当量）を無水ピリジン中に溶か
し、室温で２００時間反応せた。反応後、５４ｍ１の希
釈アンモニア水を加えることによって化合物５を得た。
ロロシランを加え、これに直ちに塩化ベンゾイルを加え
て反応させた１反応条件は、化合物４（１モル当量）と
塩化ベンゾイル（６モル当量）を無水ピリジン中に溶か
し、室温で２００時間反応せた。反応後、５４ｍ１の希
釈アンモニア水を加えることによって化合物５を得た。
次いで化合物５を実施例１と同様に処理し、化合物１０
及び１１を得た。化合物ｌＯ及び１１が第１図に示す配
列を有していることは実施例１と同様にして確認した。
及び１１を得た。化合物ｌＯ及び１１が第１図に示す配
列を有していることは実施例１と同様にして確認した。
第１図に示す化合物８〜１２をそれぞれ０．５Ａｘｅ。
ユニット用いてこれらを１００ユニ・ソトのＥｃｏＲＩ
で１８℃、４８時間反応させた（全量１ ｏｏＬＬｌ、
反応液組成５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｆｐＨ７，５
１，１００ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ
） 。
で１８℃、４８時間反応させた（全量１ ｏｏＬＬｌ、
反応液組成５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｆｐＨ７，５
１，１００ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ ＭｇＣ１ｇ
） 。
経時的にサンプリングし、これらを逆相高速液体クロマ
トグラフィーカラム（東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌｏｌｉ
ｇｏ−ＤＮＡ ＲＰカラム（０，Ｉ Ｍ ＴＥＡＡ ｆ
ｐＨ７，ｏｌ中７．５−２５％アセトニトリル直線勾配
）で分析して酵素反応を追跡した。結果を第３図に示す
。
トグラフィーカラム（東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌｏｌｉ
ｇｏ−ＤＮＡ ＲＰカラム（０，Ｉ Ｍ ＴＥＡＡ ｆ
ｐＨ７，ｏｌ中７．５−２５％アセトニトリル直線勾配
）で分析して酵素反応を追跡した。結果を第３図に示す
。
第３図より、対照のオリゴデオキシヌクレオチド１２は
ＥｃｏＲＩにより分解されるが、本発明のオリゴデオキ
シヌクレオチド８〜１１は全く分解されなかったことが
わかる。
ＥｃｏＲＩにより分解されるが、本発明のオリゴデオキ
シヌクレオチド８〜１１は全く分解されなかったことが
わかる。
立夏
第１図に示す化合物８〜１２をそれぞれ０．５Ａ ｉｓ
ｏユニット用いてこれらを５００ｔＬｌの０．ＯＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，８１に溶解し、５μｇの
蛇毒フォスフオシエステラーゼで３７℃、２時間分解し
、引き続いて５μｇのアルカリフォスファターゼで３７
℃、１時間処理した０分解物は逆相高速液体クロマトグ
ラフィーカラム（東ソー社製、ＴＳＫ ｇｅｔ ｏｌｉ
ｇｏ−ＤＮＡ ＲＰカラム（０，Ｉ Ｍ ＴＥＡＡ（ｐ
Ｈ７，Ｏｌｌデアセトニトリル直線勾配３０分間５−８
％、５分間８−２５％、１５分間２５％）で分析した（
第４図）、化合物８及び９についてはモノマーに相当す
る５つのピークが、化合物１０及び１１についてはさら
にちう１つのピークが現われた。最後のピークはそれぞ
れ部分分解物であるｄ （ＧＧａｃＡＡ）、ｄ （ＧＧ
ＡａｃＡ）であることが、化学合成したそれぞれの構造
を持った化合物と同一のクロマトグラフィー的な挙動を
とることから確認された。
ｏユニット用いてこれらを５００ｔＬｌの０．ＯＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，８１に溶解し、５μｇの
蛇毒フォスフオシエステラーゼで３７℃、２時間分解し
、引き続いて５μｇのアルカリフォスファターゼで３７
℃、１時間処理した０分解物は逆相高速液体クロマトグ
ラフィーカラム（東ソー社製、ＴＳＫ ｇｅｔ ｏｌｉ
ｇｏ−ＤＮＡ ＲＰカラム（０，Ｉ Ｍ ＴＥＡＡ（ｐ
Ｈ７，Ｏｌｌデアセトニトリル直線勾配３０分間５−８
％、５分間８−２５％、１５分間２５％）で分析した（
第４図）、化合物８及び９についてはモノマーに相当す
る５つのピークが、化合物１０及び１１についてはさら
にちう１つのピークが現われた。最後のピークはそれぞ
れ部分分解物であるｄ （ＧＧａｃＡＡ）、ｄ （ＧＧ
ＡａｃＡ）であることが、化学合成したそれぞれの構造
を持った化合物と同一のクロマトグラフィー的な挙動を
とることから確認された。
第１図に示す化合物８〜１２の融解温度Ｔｍを、Ｓｈｉ
＋５ａｚｕ１６０分光光度計（島津製作所製）とＳｈｉ
ｍａｚｕＴＣＣ−２４ＯＡ温度コントローラー（島津製
作所製）を用いて、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｆ
ｐＨ７，６１゜８０ ｍＭ ＮａＣ１，２ＯｍＭ
ＭｇＣＬ中で測定した（第５図）、その結果、非修飾オ
クタデオキシヌクレオチド１２は３３℃であったのに対
し、化合物８は２４℃、９は２）”Ｃ１１０は１３℃、
１１は１０℃であった。
＋５ａｚｕ１６０分光光度計（島津製作所製）とＳｈｉ
ｍａｚｕＴＣＣ−２４ＯＡ温度コントローラー（島津製
作所製）を用いて、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｆ
ｐＨ７，６１゜８０ ｍＭ ＮａＣ１，２ＯｍＭ
ＭｇＣＬ中で測定した（第５図）、その結果、非修飾オ
クタデオキシヌクレオチド１２は３３℃であったのに対
し、化合物８は２４℃、９は２）”Ｃ１１０は１３℃、
１１は１０℃であった。
ＣＤスペクトルはＪＡＳＣＯＪ−６分光偏光計（日本分
光社製）を用いてＴｍ測定の際に用いた緩衝液中で測定
した（第６図）、その結果、化合物８〜１１は基本的に
はＢ型フオームの二本鎖構造をとるが、円偏光度は非修
飾のものに比べ低くなっていることが示された。
光社製）を用いてＴｍ測定の際に用いた緩衝液中で測定
した（第６図）、その結果、化合物８〜１１は基本的に
はＢ型フオームの二本鎖構造をとるが、円偏光度は非修
飾のものに比べ低くなっていることが示された。
第１図は、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチドの
合成のための反応経路を示す図、第２図は、陰イオン交
換高速液体クロマトグラフィーカラムによって精製した
本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及び対照のオ
リゴデオキシヌクレオチドの溶離パターンを示す図、第
３図は、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及び
対照のオリゴデオキシヌクレオチドのＥｃｏＲＩによる
消化の経時変化を示す図、第４図は、本発明の修飾オリ
ゴデオキシヌクレオチド及び対照のオリゴデオキシヌク
レ才チドを蛇毒フォスフオシエステラーゼとアルカリフ
ォスファターゼによって消化した後、生じたヌクレオチ
ドを逆相クロマトグラフィーで分離した際の溶離パター
ンを示す図、 第５図は、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及
び対照のオリゴデオキシヌクレオチドの融解プロファイ
ルを示す図、 第６図は、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及
び対唄のオリゴデオキシヌクレオチドのＣＤスペクトル
を示す図である。 第１図
合成のための反応経路を示す図、第２図は、陰イオン交
換高速液体クロマトグラフィーカラムによって精製した
本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及び対照のオ
リゴデオキシヌクレオチドの溶離パターンを示す図、第
３図は、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及び
対照のオリゴデオキシヌクレオチドのＥｃｏＲＩによる
消化の経時変化を示す図、第４図は、本発明の修飾オリ
ゴデオキシヌクレオチド及び対照のオリゴデオキシヌク
レ才チドを蛇毒フォスフオシエステラーゼとアルカリフ
ォスファターゼによって消化した後、生じたヌクレオチ
ドを逆相クロマトグラフィーで分離した際の溶離パター
ンを示す図、 第５図は、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及
び対照のオリゴデオキシヌクレオチドの融解プロファイ
ルを示す図、 第６図は、本発明の修飾オリゴデオキシヌクレオチド及
び対唄のオリゴデオキシヌクレオチドのＣＤスペクトル
を示す図である。 第１図
Claims (13)
- （１）デオキシ−７，８−ジヒドロキシアデノシン−８
−オンを分子中に含む修飾オリゴデオキシヌクレオチド
。 - （２）９−｛［２−ヒドロキシル−１−（ヒドロキシメ
チル）−エトキシ−メチル｝−アデニンを分子中に含む
修飾オリゴデオキシヌクレオチド。 - （３）配列中に制限酵素の認識配列を含む請求項１又は
２記載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。 - （４）前記制限酵素が￥Ｅｃｏ￥ＲＩである請求項３記
載の修飾オリゴデオキシヌクレオチド。 - （５）式ｄ（ＧＧ￥Ａ＾Ｏ＾Ｈ￥ＡＴＴＣＣ）［ I ］
（ただしｄ￥Ａ＾Ｏ＾Ｈ￥はデオキシ−７，８−ジヒド
ロアデニン−８−オンを示す） で表わされる請求項４記載の修飾オリゴデオキシヌクレ
オチド。 - （６）式ｄ（ＧＧＡＡ＾Ｏ＾ＨＴＴＣＣ）［II］（ただ
しｄＡ＾Ｏ＾Ｈはデオキシ−７，８−ジヒドロアデノシ
ン−８−オンを示す） で表わされる請求項４記載の修飾オリゴデオキシヌクレ
オチド。 - （７）式ｄ（ＧＧ￥ａｃＡ￥ＡＴＴＣＣ）［III］（た
だし、ｄ￥ａｃＡ￥は９−｛［２−ヒドロキシル−１−
（ヒドロキシメチル）−エトキシ−メチル｝−アデニン
を示す） で表わされる請求項４記載の修飾オリゴデオキシヌクレ
オチド。 - （８）式ｄ（ＧＧＡ￥ａｃＡ￥ＴＴＣＣ）［IV］（ただ
し、ｄ￥ａｃＡ￥は９−｛［２−ヒドロキシル−１−（
ヒドロキシメチル）−エトキシ−メチル｝−アデニンを
示す） で表わされる請求項４記載の修飾オリゴデオキシヌクレ
オチド。 - （９）請求項１ないし８のいずれかに記載の修飾オリゴ
デオキシヌクレオチドを含むＤＮＡ。 - （１０）式ｄ（Ｇ￥Ａ＾Ｏ＾Ｈ￥ＡＴＴＣ）［Ｖ］（た
だしｄ￥Ａ＾Ｏ＾Ｈ￥はデオキシ−７，８−ジヒドロア
デニン−８−オンを示す） で表わされる配列を含む請求項９記載のＤＮＡ。 - （１１）式ｄ（ＧＡ￥Ａ＾Ｏ＾Ｈ￥ＴＴＣ）［VI］（た
だしｄＡ＾Ｏ＾Ｈはデオキシ−７，８−ジヒドロアデノ
シン−８−オンを示す） で表わされる配列を含む請求項９記載のＤＮＡ。 - （１２）式ｄ（Ｇ￥ａｃＡ￥ＡＴＴＣ）［VII］（ただ
し、ｄ￥ａｃＡ￥は９−｛［２−ヒドロキシル−１−（
ヒドロキシメチル）−エトキシ−メチル｝−アデニンを
示す） で表わされる配列を含む請求項９記載のＤＮＡ。 - （１３）式ｄ（ＧＡ￥ａｃＡ￥ＴＴＣ）［VIII］（ただ
し、ｄ￥ａｃＡ￥は９−｛［２−ヒドロキシル−１−（
ヒドロキシメチル）−エトキシ−メチル｝−アデニンを
示す） で表わされる配列を含む請求項９記載のＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2030432A JPH03236396A (ja) | 1990-02-10 | 1990-02-10 | 修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びそれを含むｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2030432A JPH03236396A (ja) | 1990-02-10 | 1990-02-10 | 修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びそれを含むｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03236396A true JPH03236396A (ja) | 1991-10-22 |
Family
ID=12303785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2030432A Pending JPH03236396A (ja) | 1990-02-10 | 1990-02-10 | 修飾オリゴデオキシヌクレオチド及びそれを含むｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03236396A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996006833A1 (fr) * | 1994-08-31 | 1996-03-07 | Takeshi Imanishi | Nouveaux analogues de nucleotides |
| US6787525B1 (en) * | 1998-12-04 | 2004-09-07 | Herbert Schott | Glyceryl nucleotides, method for the production thereof and their use |
-
1990
- 1990-02-10 JP JP2030432A patent/JPH03236396A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996006833A1 (fr) * | 1994-08-31 | 1996-03-07 | Takeshi Imanishi | Nouveaux analogues de nucleotides |
| US6787525B1 (en) * | 1998-12-04 | 2004-09-07 | Herbert Schott | Glyceryl nucleotides, method for the production thereof and their use |
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