JPH03232485A - ハイブリドーマ細胞株の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は三種の新しいハイブリドーマ細胞株の製造及び
それにより産生されたモノクローナル抗体てあってヒト
インターロイキン−６を認識又はインターロイキン−６
の作用を阻害するものに関する。

本発明はまた、これらモノクローナル抗体の、治療目的
及び診断目的のための使用に関する。

インターロイキン−６（ＩＬ−６）はもともとヒトＢ細
胞刺激因子２　（ＢＳＦ−２）　　（Ｍ　　Ｋａｗａｎ
ｏ、Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ。

３３２巻、３号、８３〜８５頁、１９８８年）又はハイ
ブリトーマ成長因子（ＨＧＦ）（Ｒ，ＢａｚｉｎとＲ，
Ｌｅｍｉｅｕｘ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。

１、　　１３９巻、７８号、８７頁、１９８７年）とも
いわれ、細胞性免疫系の媒介物に属する。

ｒＬ−６をコードするｃＤＮＡの配列とそれに由来する
アミノ酸配列（１８４個のアミノ酸）は文献に記載され
ている（Ｔ、Ｈｉｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻
、６号、７３〜７６頁、ＩＯ２・・・）。

インターロイキン−６（ＩＬ−６）か広い生物学的機能
スペクトルを有することは知られている。

Ｔ細胞（Ｒ，Ｄ、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｎ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４巻、７６２９〜７６
３３頁、１９８７年）、形質細胞腫（Ｊ、ｖａｎ　　Ｄ
ａｍｍｅら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ。

ｄ、　　　１６５巻、９１４〜９１９頁、１９８７年）
、肝細胞（Ｔ、Ａｎｄｕｓら、ＦＥＢｓ　　Ｌｅｔｔ、
　　２２１巻、１８〜２２頁、１９８７年）及び繊維芽
細胞（Ｍ、Ｋｏｈａｓｅら、Ｃｅ１１．４５巻、６５９
〜６６６頁、１９８６年）に対するインターロイキン−
６の効果はそれぞれの文献に明瞭に記載されている。

ＩＬ−６とＩＬ−６拮抗因の役割は以下の総説に記載さ
れている。

「急性期免疫応答の調整（Ｒｅｇｕｌａ↑１０ｎ　　ｏ
ｆ　　ｔｈｅ　　ａｃｕｔｅ　　ｐｈａｓｅ　　ａｎｄ
　　ｉｍｍｕｎｅ　　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：ＭＦインタ
ーロイキン−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｌｎ−６コ 編者Ｐ、Ｂ、Ｓｅｈｇａｌら、Ｔ　ｈ　ｅ　　Ｎ　ｅ　
ｗＹｏｒｋ　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ、２、Ｅａｓｔ　　　６３ｒｄ　　５ｔｒｅｅｔ
。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ及びＴ、Ａｎｄｕｓら、Ｄ
ＭＷ、４４巻、１９８９年。

上記の文献は、様々な症候群の形成とそれらの進行にδ
けるＴＬ−６の重要性ならびに血液学的腫瘍、固形腫瘍
、自己免疫疾患、炎症過程、ウィルス感染、細菌感染、
糸状菌感染、急性期応答障害棒び１１　＞−才力インカ
スケードへの影響（こお：するＩＬ−６拮抗因ＣＩＬ−
６抗体）による影響をまとぬている。

さらへこ、ＩＬ−６の病態生理学的役割については文献
に非常に多くの例か見られるか、ここではそのうちのほ
んの数例のみを引用している。

たとえば、Ｃ，Ｐ、ＣｈｉｎとＦ、Ｌｅｅ　（Ｊｏｆ　
　Ｉｍｍｕｎ、　　　１４２巻、ｔ９０９〜１９１５頁
、１９８９年）は骨髄白血病細胞の増殖と分化の調整に
おけるＩＬ−６の役割について記載した。

Ｐ、Ａ、Ｇｕｅｒｎｅら（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ
、　　　８３巻、５８５〜５９２頁、１９８９年）は、
特に高い濃度のＩＬ６が関節炎患者に見出され、明らか
にこれらの症候群の進行に重要な役割を演していること
を示している。

Ｃ，Ｅ、Ｈａｃｋ　（Ｂｌｏｏｄ、７４巻、Ｎａ　１５
．１７０４〜１７１０頁、１９８９年）は、インターロ
イキン−６か敗血性ショックの病態生理学において重要
な役割を果たすことを最初に示した。彼らはその研究中
、敗血性ショックの患者の大多数に、対照集団に比パ＼
てＩ　Ｌ−６濃度の大きな上昇か見られることを発見し
たのである。全身性狼癒紅斑患者のＩＬ−６濃度につい
ての研究て、Ａ、Ｊ、Ｇ、Ｓｗａａｋら（Ｒｈ　ｅ　ｕ
ｍａ　ｔ　ｏ　ＩＩｎｔ、　　　８巻、２６３〜２６８
頁、１９８９年）はＩＬ−６の量と急性期タンパク応答
との間の相関性を見出した。これらの研究及び他の研究
により、ＩＬ−６はおそらく肝細胞による急性期タンパ
クの産生誘導の原因となっているであろうことか示され
ている。

キャッスルマン（Ｋａ　ｓ　ｔ　ｌ　ｅｍａｎ’　　ｓ
）症候群はリンパ球異常増殖、形質細胞浸潤、熱、貧血
、高γグロブリン症を特徴とする疾患である。

Ｔ、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉら（Ｂｌｏｏｄ、４巻、１３６
０〜１３６７頁、１９８９年）は、この疾患において血
清中のＩＬ−６！１度と疾患の臨床的態様との間に明瞭
な相関関係かあり、ＩＬ−６を様々な臨床的徴候の発生
にとって重要な要素として考えなければならないことを
示すことかてきた。

Ｔ　　Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ　（ＦＥＢｓ　　Ｌｅｔｔ。

２５０巻、６０７〜６１０頁、１９３９年）をめぐる同
じ研究集団は、ＩＬ−６か腎臓細胞癌腫の自己分泌増殖
因子てあり、これら腫瘍細胞の増殖を抗ＩＬ−６抗血清
により阻害し得ることを示すことかできた。骨髄腫細胞
の決定的増殖因子としてのＩＬ−６の役割は多くの研究
集団によって研究されている。

Ｘ、Ｇ、Ｚｈａｎｇら（Ｂｌｏｏｄ、７４巻、１１〜１
３頁、１９８９）は、ｉｎ　　ｖｉｔｒ。

ての骨髄腫細胞のＩＬ−６応答かｉｌ　　ｖｉｖ。

ての増殖状態と、従って疾患の重さと直接相関関係かあ
ることを示すことかできた。

Ｌ、Ｂｅｒｇｉｎら（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ１７０巻、６
１３〜６１８頁、１９８９年）は、ＩＬ−６か悪性の成
熟細胞に作用するたけてなく、多発生骨髄腫における悪
性形質細胞前駆体の増殖と分化を促進することを示すこ
とかできた。

Ｔ、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら（Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、
８３〜８５頁、１９８８年）は、ＩＬ−６依存性骨髄腫
細胞の増殖を抗ＩＬ−６抗体で阻害し得ることを初めて
実験的に証明することかできた。

ＰＣＴ公報ＷＯ３８１００２０６には、ＩＬ−６の調製
と使用か記載されており、公知の方法においてＩＬ−６
を使用すればポリクローナル抗体やモノクローナル抗体
か得られることも指摘されている。しかしながら、この
ような抗体の調製法は記載されていない。同様に、化学
的・物理的パラメータで抗体か定義されているわけては
なく、またこのような抗体を産生し得る細胞か寄託され
ているわけてもない。この点て再現性のある教示かされ
ているわけてはない。つまり、このＰＣＴ公報の開示は
純粋に推論的な考察にすぎないのである。

本発明の目的はＩＬ−６依存性細胞の増殖を効率的に阻
害又は抑制することのできるモノクローナル抗体を調製
することである。これらのモノクローナル抗体は治療的
にも予防的にも低用量て使用することかてき、処置の間
も何らの二次的効果も生しないのである。

二の目的は、Ｃ，ＭｉｌｓｔｅｉｎとＧ、Ｋ。

ｈｌｅｒにより開発された公知の融合法を使用し、ＩＬ
−６に対するマウスモノクローナル抗体を水生する新し
いハイブリトーマ細胞株を単離することにより達成され
る。

ＢＥ−４（ＩｇＧ２ｂ）　、ＢＥ−８（ＩｇＧｌ）及び
ＢＦ−６（ＩｇＧ１）とそれぞれ呼ばれるこれらの細胞
株は、Ｆｒｅｎｃｈ　　Ｎａｔｉ。

ｎａｌ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｆｏｒ　　Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　（ＣＮＣＭ）に、それぞれＩ
／９１１、Ｉ／９１３及びＩ／９１２という番号で寄託
されており、これらからマウス免疫グロブリンのクラス
変換した変種を単離することかできる。たとえば、Ｉｇ
Ｇ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、１ｇＧ３、ＩｇＧ１及び他の免疫
グロブリンクラスなとである。

モノクローナル抗体ＢＥ−４とＢＥ−８はヒト及びマウ
ス細胞株上のＩＬ−６受容体への結合に対して、ＩＬ−
６と競合し、ＩＬ−６依存性細胞株の増殖を阻害する。

両抗体ともに受容体に結合しているＩＬ−６を認識する
ことかでき、またＢＥ−４とＢＥ−８はＩＬ−６分子上
の異なるエピドープを認識するものであることか示され
ている。

モノクローナル抗体ＢＦ−６も同様にＩＬ−６を認識す
るが、ＩＬ−６受容体への結合をＩＬ６と競合するもの
ではなく、またＴＬ−６依存性細胞の増殖を阻害し得る
ものてもない。ＢＦ−６は受容体に結合しているＩＬ−
６を認識する能力を有しており、ＢＥ−４とＢＥ−８に
より認識されるエピドープとは異なるエピドープを認識
するものであることか示されている。

それ故、このモノクロナール抗体は多発性骨髄腫、骨髄
性白血病、キャッスルマン症候群、全身性狼癒紅斑、腎
臓細胞癌腫、関節炎のような疾患、及びＩＬ−６依存性
であることか示されている池の疾患の治療に適している
。

このモノクローナル抗体は、純物質として、毒素（たと
えばリシンＡ又はサボリン）もしくは放射性物質もしく
は池の薬物に結合して、又はリポソーム中にカプセル化
して使用してもよい。

抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８又はＢＦ−６を含有する薬物は
液状又は凍結乾燥状にしてもよい。安定化のためにタン
パク、糖、糖アルコール、アミノ酸及び粘度増強剤を使
用してもよく、また緩衝化のために無機酸、好ましくは
生理学的媒体（ＰＢＳ　　ｐ８７．４）中リン酸ナトリ
ウムを使用してもよい。

この抗体は治療目的のために０．５〜５■／ｒｆＬｌ、
好ましくは１■／−の濃度で使用され、概して全身的に
投与されるか、局所的な投与も排除されるものではない
。

モノクローナル抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６は
同様に、受容体、細胞表面又は体液中のＴＬ−６を同定
するための診断薬として用いることもできる。このよう
な使用においては、抗体は蛍光物質等に結合していても
よい。同様に体液中のＩＬ−６を測定するためのＥＬＩ
ＳＡ又はラノオイムノアッセイにこの抗体を用いること
もてきる。

本発明に係るモノクローナル抗体は、これを出発として
、ヒト起源（ヒト免疫グロブリン）の−定ドメイン、ネ
ズミ起源（ネズミ免疫グロブリン）可変領域、特に超可
変領域のみとのキメラ抗体を製造するのに適している。

ＩＬ−６依存性疾患の治療のためには、このキメラは純
物質として、あるいは毒素、放射性物質、池の薬物に結
合して、もしくはリポソーム中にカプセル化して使用し
てもよい。

本発明を以下の例により詳細に説明する。

■　モノクローナル抗体の調製 雌Ｂａ１ｂ／ｃマウスを２週問おきに４回、各回１０　
Ｉｉｇの組替えＩＬ−６を腹腔内投与して免疫ｒヒした
。４回目の免疫化は静脈内投与により行い、稗細胞を４
日後に抽出１７、融合した。融合は次のよう（こして行
った。

免疫化した脾細胞を・Ｘ６３Ａｇ８６５３ネズミ骨髄腫
細胞と５．１の比率でポリエチ・レンゲリコールの存在
下で融合した（Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊｏｆ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　　　１２３巻、１５４８頁、１９７８年）。

この細胞株はｔｈｅ　　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ａｎｉｍａｌ　　Ｃｅ１ｌ　
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　（ＥＣＡＣＣ）、ＰＨＬＳ　　Ｃ
ｅｎｔｒｅ　　ｆｏｒ　　Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄＲ，ｅｓｅａｒｃｈ、Ｐ
ｏｒｔｏｎ　　Ｄｏｗｎ。

５ａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＦ３　０
ＪＧ、ＵＫに、ＥＣＡＣＣＮα８５０１１４　２０の下
て寄託されている。

融合細胞群濁液を一回洗浄し、選択培地中て培養した（
ＲＰＭＩ　　１６４０．１０％熱不活化ウマ血清、４ｍ
Ｍグルタミン、ヒポキサンチン１３．６■／ｌ、アミノ
プテリン０．１７■／β及び１０μｇ／ｍｌインシュリ
ン）。

１０日後、ハイブリドーマ増殖を示した培養の融合上澄
液の抗ＩＬ−６モノクローナル抗体の産生をテストした
。

この目的のため、１００μｌのハイブリドーマ上澄液を
、あらかじめ１１０００ｎの抗マウス免疫グロブリンに
より４°Ｃて一晩被覆したＥＬＩＳＡプレートて、１時
間インキュベートした。

個々のウェルを３回洗浄後、各々１００ｄのＰＢＳ中１
１００ｎのビオチン化したＩＬ−６を用いて室温で１時
間インキュベートした。再び３回洗浄後、ストレブタビ
ジン　パーオキシダーゼとの反応を室温で１時間行い、
もう−度洗浄して、基質（ＤＰＯ）とのインキュベーシ
ョンを行った。

その後プレートの４０５ｎｍでの光学濃度を測定した。

陽性のクローンを、限定希釈法（シーディング（ｓｅｅ
ｄｉｎｇ）密度０．２細胞／培養）を用いた４段階のク
ローニングの後に調べ、クローンＢＥ−４、ＢＥ−８及
びＢＦ−６を単離した。

ＢＥ−４はマウスＩｇＧ２ｂ抗体、ＢＦ−６とＢＥ−８
はＩｇＧ１抗体であり、いずれもｋ（カッパ）Ｌ鎖を有
しており、組替えＩＬ−６への顕著な結合を示すもので
ある。

抗ＩＬ−６モノクローナル抗体ＢＥ＝４、ＢＥ−８及び
ＢＦ−６はＢａ１ｂ／ｃマウスにＢＥ４、ＢＥ−８及び
ＢＦ−６ハイブリドーマ細胞をそれぞれ腹腔内注射する
ことにより、ｉｎ　　ｖｉＶ○で大量に産生された。ハ
イブリトーマ細胞注射の一週間前に、０．５ｍｌのフロ
イントの不完全補助液をマウスの腹腔に注入した。ハイ
ブリドーマ細胞注射の８〜１４日後に腹水を抽呂するこ
とかてきた。

硫酸アンモニウム（４５％飽和）により腹水からモノク
ローナル抗体を沈殿させ、０．０２ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ
　（ｐＨ７，７）で再緩衝させ、Ｑ−セファロースカラ
ムに結合させた。このカラム上でモノクローナル抗体を
０．０２ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，７）中１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０で洗浄した後、ｏ、３５Ｍ　　Ｎａｃｌ溶液
（ｐＨ７，７）てカラムから溶離させた。

治療の目的でモノクローナル抗体を生理的ＰＢＳ緩衝液
（リン酸緩衝食塩水）て再緩衝させた。

■、モノクローナル抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−
６の生物活性 細胞株Ｂ９はＩＬ−６に依存したマウスハイブリドーマ
株であり、その性質はり、Ａ、ｖａｎＡａｒｄｅｎによ
り記載されている（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　　１７巻、１４１１頁、１９８７
年）。細胞株Ｂ９をＲＰＭｌ１６０８中て、１０％ウシ
胎児血清とメルカプトエタノールとともに、１ｍｌあた
り２ｐｇのＩＬ−６を添加して３日間培養する。その後
１６時間の間、Ｈ２−チミジンを添加する。その後細胞
を集め、洗浄し、ベータカウンターで測定する。

以下の実験では、１ＴＬｌあたり２ｐｇのＩＬ−６を添
加するとともに、様々な濃度の抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８
及びＢＦ−６も添加した。ＤＮＡ合成は、細胞増殖又は
細胞阻害の指標としてのＨ３−チミジン取込みとして放
射活性を検呂することにより測定した。

この結果は明らかに、細胞増殖の指標としてＨチミンン
の取込み、従ってＤＮＡ合成か、ＢＥ−４及びＢＥ−８
を用いるとテストしたＢ９培養よイ、）も幾分低いこと
を示している。これらの抗体は細胞株Ｂ９のＩＬ−６依
存性増殖を阻害するか、ＢＦ−６は細胞株Ｂ９の増殖を
阻害することはできなし）。

ＩＬ−６のヨウ素化 ｌＯμｒのホウ酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐ　Ｈ８，０）
中５ｕｇのＩＬ−６をｌｍＣ４の１１２５　（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社のＢｏｌｔｏｎ　　ａｎｄ　　Ｈｕｎｔｅｒ
試藁、コート１Ｍ５８６）とともにＯ′Ｃて１５分間イ
シキュヘートした。次に反応を５００μｒのグリシ＞　
（０，１Ｍホウ素緩衝液（ｐＨ８，５）中０．２Ｍ）を
用いて５分間で停止した。

遊離１１２５と結合ｌ１２５を、あらかじめＰＢＳｌ”
６ウシアルブミンで平衡にしておいたＰＤＩＯカラム（
ファルマンア社製、Ｇ−２５）に通して分離した。ｌｎ
ｇのＩＬ−６の比活性は１１０３２０ｃｐてあった。

１カツプあたり２．５ＸＩＯ’個のＵ２２６株の細胞を
、様々な濃度の１１２５−ＩＬ−６と５００倍過剰の非
標識ＩＬ−６とともに、総体積ｌイのＰＢ３１％中４°
Ｃて９０分間インキュベートシた。

その後３回洗浄の後、測定を行った。

結合ＩＬ−６ （最大） １、５　ｎ　ｇ ０．０５７Ｘ　１０−１２ ｍＭ。

０、０６３ 一細胞当たりの受容対数 ２．５　　Ｘｌ０６ スカツチヤート分析により、細胞株Ｕ２２６については
ＫＤ値は８．７Ｘ１０−”Ｍであり、−細胞あたりの受
容体数は１３６８０であることか示された。

競合の研究 ｌウェルあたり２．５　Ｘ　１０　’個のＵ２２６細胞
を０．１μｆ　（０，３３μｇ）の放射標識ＩＬ−６と
インキュベートし、陽性の対照とした。ｃｐｍ計数は３
２６９±１５６てあり、これをＩＬ−６の全結合に対す
る値とした。

５００倍過剰の非標識［、−６を０．１μｌ（０，３３
μｇ）の放射標識ＩＬ−６に添加したところ、非特異的
結合に対する値として２５３ｃｐｍか観測された。これ
から３０１６ｃｐｍという値か特異的結合の１００％に
相当することがわかる。

ｌμｇ／ｒｒＬｌのＢＥ−４、ＢＥ−８又はＢＦ−６を
添加した他は同様の実験を放射標識ＩＬ−６を用いて行
ったところ、次の値か得られた。

ＢＥ−４：　　１１％ＩＬ−６結合 ＢＥ−８：　　１４％ＩＬ−６結合 ＢＰ−６二　９２％ＩＬ−６結合 この実験は明らかに、ＢＥ−４とＢＥ−８は工Ｌ−６の
受容体に対してその特異的結合を阻害することかできる
か、ＢＦ−６はこの結合を阻害できないことを示してい
る。

各々について４０ｍｇの精製モノクローナル抗体を１８
０μｍのＰＢＳ中てＮ　ａ　１２５１　（０，５ｍＣ１
）とインキュベートした。その後、１０ｍ１（０，４■
／イ）のクロラミンＴを添加し、１分後にｌＯμｌの亜
硫酸水素ナトリウム（０，５μｇ／ｍｊ）を添加して反
応を停止した。このように標識したモノクローナル抗体
を遊離ヨウ素からクロマトグラフィー（セファデックス
Ｇ−２５）により分離した。

スカッチャート分析ては、Ｍ２５−ＢＥ−４、Ｍ”　−
ＢＥ−８及びＩ”−ＢＦ−６をＥＬＩＳＡで用いた。即
ち、 （イ）１カツプあたり１１０００ｎのＢＥ−４又はＢＦ
−８又はＢＰ−６でプレートを４°Ｃて一晩インキユベ
ートし、 （ロ）その後ＰＢ３５％アルブミンで飽和を行（ハ）そ
の後ｌｏｎｇのＩＬ−６により４°Ｃて２時間インキュ
ベーションを行った後、様々な濃度のヨウ素化抗体及び
、ある濃度に対してはまた、一連の非標識抗体をも４°
Ｃて９０分間インキユヘートし、 （ニ）３回洗浄して測定を行った。

Ｕ２６６２６６細胞いた測定は次のようにして行った。

ヨウ素化ＩＬ−６の代わりに、１０個６の細胞あたり２
０ｎｇという一定量のＩＬ−６を用いた他は実施例４と
同様にインキュベーションを３７°Ｃて３０分間行った
後、様々な濃度のヨウ素化モノクローナル抗体を添加し
て４°Ｃて６０分間インキュベートした。

結果　　　比活性 ＢＥ−４１ｎｇ＝４６６４ｃｐｍ ＢＥ−８１ｎｇ＝４５７１ｃｐｍ ＢＦ−６１ｎｇ＝４５１０ｃｐｍ ８Ｆ−６８Ｅ−４０，８Ｘｌ０−９Ｍ　　　１５１８０
ＢＢ−４ＢＦ−６２，７Ｘｌ０−’Ｍ　　　　１５１６
８ＢＥ−４ＢＥ−８０，Ｉ　　Ｘｌ０−’Ｍ　　　１４
８０２ＵＬ　２６６ ＩＬ−６＋抗体 ２６６ 受容体数 ＢＥ−４ ＢＦ−６ ＢＥ−８ ３、９Ｘ　１０−’Ｍ ４．７　　Ｘｌ０−’Ｍ ２．５　　ｘｔｏ−’Ｍ １７３３ ７１６８ ３４２５ ＥＬＩＳＡスカッチャードは、全抗体について、この系
で結合したＩＬ−６は同一の濃度を示している。即ち、
得られたＫＤ値は合理的な値を示してでいる。

細胞株はＵ２６６上の受容体に結合したＩＬ−６のＫＤ
値はＥＬＴＳＡで得られた定数と異なっている。これは
受容体に結合した後はＩＬ−６の三次元構造に若干の変
化か起こることにより説明される。

ＢＥ−４とＢＥ−８かＢＦ−６よりも受容体結合ＩＬ−
６の識別に劣るという発見は、ＢＥ−４とＢＥ−８とは
分子上の活性部位を同定し、受容体でのＩＬ−６ダイマ
ーしか認識できないか、ＢＦ−６はダイマー形状は別と
してモノマー形状を認識することかできるということて
説明することかできる。

実施例７：　　ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６間の競
合実験 炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）中て４°Ｃて一晩インキュ
ベー１・することによりＴ　Ｌ　−６（ｔＩｉｇ　／ｃ
ｕｐ）をＥＬＩＳＡプレートに結合させた。その後、プ
レートをＰ　Ｂ　３５　％アルブミンて鉋和させ、４回
洗浄した。放射標識したＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−
６をそれぞれ異なる実験において添加し、インキュベー
トした。さらに、各放射標識抗体をまた１倍、１０倍、
１００倍過剰の非標識抗体てインキュベートした。

この実験は各抗体はそれ自身とのみ競合するたけてあっ
て、ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６の間に置換かない
ことを示している。これは三種の抗体すへてか異なるエ
ピドープを有していることを意味している。

実施例８：　　ＩＬ−６の測定のためのサンドイッチＥ
ＬＩＳＡ （イ）ＢＥ−８（１０００ｎｇ／ｃｕｐ／１００μｌ）
により４°Ｃて一晩飽和し、 （ロ）ＰＢ３５％アルブミンにより室温で９０分間飽和
し、 （ロ）ヒト血清中ての様々な濃度のＩＬ−６とともに３
７°Ｃて２時間インキュベートし、（ニ）ビオチン化Ｂ
Ｅ−４（６，５μｇ／ｃｕｐ１００μＩ、ＰＢＳ、Ｔｗ
ｅｅｎＯ，５％）により室温で９０分間インキュベート
し、 （ホ）基質を添加し、測定した。

ｎｇ　［Ｌ−６／ｃｕｐ／１００ｍ１　　　　　光学濃
度１００　　　　　　　　　　　　　１、８０７１０　
　　　　　　　　　　　　１．５６６１　　　　　　　
　　　　　　１．３５６０、５　　　　　　　　　　　
０．９２１０、２５　　　　　　　　　　　０．５７３
０、１２５　　　　　　　　　　０．４０１０、０６２
　　　　　　　　　　０．３１１０、０３１　　　　　
　　　　　０．２１２０、０１５　　　　　　　　　　
０．１９００、００８　　　　　　　　　　　０．１９
５０、００４　　　　　　　　　　　０．１７０バック
グラウンド：光学濃度０．１５０テストの感度は血清中
０．３　ｎ　ｇ／ｄののＩＬ−６である。

１カツプあたり２ＸＩＯ＠個のＧＢ株の細胞を、様々な
濃度の天然ＩＬ−６と様々な濃度の抗体ＢＥ−８ととも
にＨ３−チミジンを添加して５日間インキュヘートした
。

！Ｌ−６ ０／ｍ１ ７６４　　　　１０２１３　　　５６４３２　　　７８
４２１１１９　　　　　１１０　　　　７２３７　　　
７７６１０２２２　　　　　２８０　　　　５９４　　
　７３１９７２１２　　　　　２０６　　　　２５６　
　　６１０４０１９６　　　　　２２４　　　　２３０
　　　３８８５９ＩＵ　　ＩＬ’−６：　　５０％最大
増殖を誘起させるのに必要なＩＬ−６の量 抵体ＢＥ−４についても同一の結果が得られた。

これらの結果はＩＬ−６依存性ヒト細胞株ＧＢ上におけ
るＢＥ−８及びＢＥ−４による天然ＩＬ−６（ヒトリン
パ球由来）の著しい阻害を示している。

Ｉ［１，ＢＥ−４を用いた初期的臨床結果最終段階の多
発性骨髄腫と診断され、２日て１ｉあたり５０，０００
〜１００，０００個の割合て形質細胞腫細胞の数か増加
していく患者を精製ＢＥ−４で処置した。

投与量は全４日にわたり１日あたり１０■（全投与量：
４０■）であった。抵抗は、１％ヒトアルブミンの食塩
水溶液中１　ｍｇ／−の濃度で３０分間注入された。治
療中いかなる副作用も見られなかった。

臨床的所見：熱か急速に下かり通常の体温に戻った。最
初の投与後すぐに全患者 とも重病感か消失した。

血液学的所見：腫瘍塊（形質細胞腫細胞）か最初の注入
後ただちに減少し、細胞 数が１７ｎｌあたり１００，０００個 からｔｙあたり４０，０００個に なり、全処置期間を通して安定し ていた。

Ｓ相（前分割相）における細胞数は処置により３０％か
ら１０％に減少した。

これらの初期的臨床結果は多発性骨髄腫疾患の最終段階
にある患者について得られた。そのため、疾患の初期的
段階て処置をすれば、腫瘍塊は池の処置の可能性（たと
えば骨髄移植）か表われるほどに減少し得ることか期待
てきる。

今日までにこれらの患者のための有望な治療法は得られ
ていないのて、ＩＬ−６に対するモノクローナル抵抗を
用いた治療は、この致命的な疾患の治療に新風をもたら
すものであろう。

異なるエピドープを認識し、ともにＩＬ−６の活性を阻
害する抵体ＢＥ−４とＢＥ−８を組合わせて処置するこ
とにより、−層の改良か得られるてあろう。

あるいは、抗体ＢＥ−４、ＢＥ−８及びＢＦ−６は毒素
と結合させることもてき、これによりＩＬ−６活性のブ
ロックとは別に、形質細胞腫をその細胞上の受容体・＼
ＩＬ−６を固定することにより破壊することか可能とな
る。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウスの免疫化脾細胞をマウス骨髄腫細胞と融合
   することによるハイブリドーマ細胞株の製造方法におい
   て、脾細胞を融合に先立ってインターロイキン−６に対
   して免疫にし、融合細胞から三種の異なる細胞株、即ち
   Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ／９１３（ＢＥ−８）のハ
   イブリドーマ細胞株、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ／９
   １１（ＢＥ−４）及びＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ／９
   １２（ＢＦ−６）のハイブリドーマ細胞株を同定、単離
   し、これらの細胞株がヒトインターロイキン−６を認識
   するモノクローナル抗体を産生し、異なる細胞株に応じ
   てインターロイキン−６分子上の異なるエピドープに各
   々結合するものであることを特徴とする製造方法。
2. （２）ハイブリドーマ細胞株がＸ６３Ａｇ８６５３ネズ
   ミ骨髄腫細胞により得られることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. （３）モノクローナル抗体がヒトインターロイキン−６
   に対して特異的な結合作用を有することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）細胞株ＢＥ−４とＢＥ−８により産生された抗体
   がヒトの細胞及びネズミの細胞のインターロイキン−６
   受容体に結合し得ることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
5. （５）モノクローナル抗体がキメラを形成し、一定部が
   ヒトＩｇからなり、可変部、特に超可変部がネズミＩｇ
   からなることを特徴とする特許請求第１項記載の方法。
6. （６）モノクローナル抗体が毒素及び（又は）化学療法
   剤に結合していることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の方法。
7. （７）インターロイキン６依存性疾患、特に腫瘍疾患、
   自己免疫疾患、あらゆる感染症、急性期応答障害の治療
   、予防及び診断のための、特許請求の範囲第１項記載の
   方法により得られたモノクローナル抗体の使用。