JPH0321160B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 被同定細菌試料を細菌酵素に対する基質と共
に培養し、該試料の細菌酵素の測定とそれらと該
基質との相互作用により検出可能な生成物を生成
させることによつておこなう試験の組合せに該試
料を付す細菌の同定方法において、付加的な時間
を必要とするトリプトフアナーゼとデオキシリボ
ヌクレアーゼの場合を除いて、細菌の増殖に依存
することなく、以下の酵素ａ〜ｚのすべてを該試
験において利用することによつて構成酵素を定量
的に測定し、測定結果を統計的方法により予決さ
れたスタンダードと比較して細菌種を同定するこ
とを特徴とする細菌の同定方法： (a) リパーゼ (b) α−グルコシダーゼ (c) β−グルコシダーゼ (d) β−キシロシダーゼ (e) β−グルクロニダーゼ (f) β−ガラクトシダーゼ (g) 全細胞酸性ホスフアターゼ (i) 細菌細胞透過性障壁を破壊する試薬の存在下
での酸性ホスフアターゼ (i) DL−アラニル−β−ナフチルアミン特異ペ
プチダーゼ (j) Ｌ−アルギニル−β−ナフチルアミン特異ペ
プチダーゼ (k) Ｎ−γ−Ｌ−グルタミン−β−ナフチルアミ
ン特異ペプチダーゼ (l) グリシル−β−ナフチルアミン特異ペプチダ
ーゼ （ｍ） Ｌ−４−ヒドロキシプロピル−β−ナフ
チルアミン特異ペプチダーゼ （ｎ） Ｌ−ロイシル−β−ナフチルアミン特異
ペプチダーゼ （ｏ） Ｌ−ロイシル−４−メトキシ−β−ナフ
チルアミン特異ペプチダーゼ （ｐ） Ｌ−リジル−β−ナフチルアミン特異ペ
プチダーゼ （ｑ） Ｌ−プロリル−β−ナフチルアミン特異
ペプチダーゼ （ｒ） Ｌ−ピロリドニル−β−ナフチルアミン
特異ペプチダーゼ （ｓ） アラニル−ｐ−ニトロアニリン特異ペプ
チダーゼ （ｔ） グルタミン−ｐ−ニトロアニリン特異ペ
プチダーゼ （ｕ） ジアセチル／アセトイン生成酵素 （ｖ） ｐ−ニトロフエニルアラリン・アンモニ
ア−リアーゼ （ｗ） トリプトフアナーゼ （ｘ） デオキシリボヌクレアーゼ （ｙ） グルタメート・デカルボキシラーゼ （ｚ） チトクロム・オキシダーゼ。 明細書 本発明はバクテリアの同定法に関する。 臨床微生物研究所はしばしば臨床標本中に病原
菌の確認試験、および更に、処置の選択、例えば
伝染病と抗争するために使用される抗菌剤の選択
において臨床医に指針を与えると考えられる菌種
の同定が依頼される。 常套の細菌同定方法は未知の微生物が特定の微
生物分類に帰属するか否かを基礎とする一連の試
験に依存している。これらの試験は、細菌の種々
の基質を代謝する能力、基質媒体中の変化（例え
ばPH変化を変色指示薬の使用によつて検出しても
よい）によつて測定される代謝によつて細菌を分
類する試験を含んでいる。しかしながらこの様な
代謝試験にとつて、細菌を、通常完全な生育媒体
中で生育することが必要であり、これは相当時間
がかかるので、標本が研究所に到着した日に細菌
の同定を行なうことが殆んど不可能である。もし
常套の細菌同定法が使用されるならば、しばし
ば、標本到着の後48−72時間までその同定が不可
能な場合がある。一方、臨床医によつて指定され
た処置はせいぜい予測にすぎず、最初は正しくな
いことがありそれによつて病気の持続および患者
の状態の悪化を伴なうことがある。従つて、正し
い処置、例えば抗菌剤が遅滞なく指示されるよう
病気の原因となる細菌の同定の迅速化が強く要請
されている。 つい最近、極く限定された範囲において同定の
ための細菌の生育に依存するが、より多くの部分
は細菌中に最初に存在するか、あるいは比較的短
時間、例えば２，３時間後に生ずる酵素の測定に
依存する細菌の同定法が提案された。これらの試
験は、従前のものより早く、時には試料を受け取
つた日に細菌の同定を行なうことを可能にする。
しかしながらこれらの細菌の同定法は通常、ある
限定された群内の細菌の同定を可能にするにすぎ
ず、したがつて予備同定を行なう必要があり、こ
れは通常細菌の培養を必要とし、使用すべき特殊
な同定法の選択が必要となる。 新しい細菌同定法が工夫された。この方法は純
粋に有機体中に存在する酵素の測定に依存するも
のであり、かつ附加的、便宜的に通常遭遇する極
めて広範囲の細菌を非常に早く同定し得る単一の
同定法を提供する。 本発明は： (a) リパーゼ (b) α−グルコシダーゼ (c) β−グルコシダーゼ (d) β−キシロシダーゼ (e) β−グルクロニダーゼ (f) β−ガラクトシダーゼ (g) 全細胞アシド・ホスフアターゼ (i) 細菌細胞透過性障壁を破壊する試薬の存在下
でのアシド・ホスフアターゼ (i) DL−アラニル−β−ナフチルアミン特異
（specific）ペプチダーゼ (j) Ｌ−アルギニル−β−ナフチルアミン特異ペ
プチダーゼ (k) Ｎ−γ−Ｌ−グルタミル−β−ナフチルアミ
ン特異ペプチダーゼ (l) グリシル−β−ナフチルアミン特異ペプチダ
ーゼ （ｍ） Ｌ−４−ヒドロキシプロピル−β−ナフ
チルアミン特異ペプチダーゼ （ｎ） Ｌ−ロイシル−β−ナフチルアミン特異
ペプチダーゼ （ｏ） Ｌ−ロイシル−４−メトキシ−β−ナフ
チルアミン特異ペプチダーゼ （ｐ） Ｌ−リジル−β−ナフチルアミン特異ペ
プチダーゼ （ｑ） Ｌ−プロリル−β−ナフチルアミン特異
ペプチダーゼ （ｒ） Ｌ−ピロリドニル−β−ナフチルアミン
特異ペプチダーゼ （ｓ） アラニル−ｐ−ニトロアラニン特異ペプ
チダーゼ （ｔ） グラタミル−ｐ−ニトロアニリン特異ペ
プチダーゼ （ｕ） ジアセチル／アセトイン生成酵素 （ｖ） ｐ−ニトロフエニルアラニン・アンモニ
ア−リアーゼ （ｗ） トリプトフアナーゼ （ｘ） ジオキシリボヌクレアーゼ （ｙ） グルタメート・デカルボキシラーゼ （ｚ） チトクロム・オキシダーゼ の測定用試験の組合せに細菌をかけるバクテリア
の同定法を含む。 本発明の工程は通常臨床的に遭遇する殆んどの
細菌を含む極めて広範囲の細菌の同定に使用でき
る。特にこの工程は、通常遭遇する細菌類：アエ
ロモナス、アシネトバクター、アルカリゲネス、
ボルダテラ、シトロバクター、エドワルドジー
ラ、エンテロバクター、エツシエリツヒア、フラ
ボバクテリウム、ハフニア、クレブジーラ、プロ
ビデンシア、プロテウス、シウドモナス、サルモ
ネラ、セラテイア、シゲラ、スタフイロコツカス
およびストレプトコツカスに使用してもよい。例
えば本発明方法は次の細菌種の同定に使用した。 アエロモナス・ヒドロフイラ アエロモナス・ホルミカンス アシネトバクター・カルコアセテイウス・バ
ル・アニトラタス アシネトバクター・カルコアセテイウス・バ
ル・ロウオフイ アルカリゲネス・フアエカリス ボルダテラ・ブロンチセプテイカ シトロバクター・フロイデイイ シトロバクター・コセリ エドワルドシーラ・タルダ エンテロバクター・アエロゲネス エンテロバクター・アグロメランス エンテロバクター・クロアサエ エシエリヒア・コリ フラボバクテリウム・メニンゴセプテイクム ハフニア・アルベイ クレブジーラ・オキシトカ クレブジーラ・ニウモニアエ（センス・ラト） クレブシーラ・リノスクレロマテイス プロビデンシア・アルカリフアシエンス プロビデンシア・スツアルテイイ プロテウス・ミラビリス プロテウス・モルガニイ プロテウス・レトゲリ プロテウス・ブルガリス シウドモナス・アエルギノーザ シウドモナス・セパシア シウドモナス・フルオレセンス セルテイア・マレセンス セラテイア・ルビタエア セラテイア・リクエフアシエンス スタフイロコツカス・アウレウス スタフイロコツカス・エピデルミデイス スタフイロコツカス・サブロフイテイクス ストレプトコツカスsp. しかしながら本発明の方法は上記のもの以外の
他の細菌種の同定に使用してもよいことは理解さ
れるであろう。 一般に用いられる酵素の測定法は比較的短かい
インキユベーシヨン時間、例えば分光分析等によ
つて測定するに十分な生成物を得るのに約10分か
ら約２時間、通常約30〜約90分（約40℃に於て）
しか必要とせず、従つて本発明方法は細菌の迅速
な同定を可能にする。一般に本発明の工程で測定
される酵素は、ある場合には細菌合成速度の極め
て早い誘発酵素である場合もあるが、関連細菌に
本質的な酵素であると信じられている。従つて採
用する試験は本質的な酵素の測定に対し一般にう
まく適用される。しかしながらトリプトフアナー
ゼとデオキシリボヌクレアーゼの測定は通常２〜
2.5時間のインキユベーシヨンを必要とする細菌
の生育が必要なようにみえる。 一般に本発明方法に使用される細菌酵素測定用
試験は、有機体の生長に特徴的には依存しない懸
案の酵素の測定に適したいかなる試験法を含んで
いてもよくまた懸案の酵素用の当業者にとつて公
知の非生育酵素測定試験を含んでいてもよい。 これらの試験は、通常、酵素を特定の基質と相
互作用するその能力によつて測定する種類のもの
である。基質と酵素との相互作用は、インキユベ
ーシヨンにおいて、通常、直接または最初の酵素
生成物から化学的な合成を含む後処理の後に検出
できる生成物を与える。 酵素の相互作用による生成物はフルオリメトリ
ーまたは比色分析法を含む分光分析法により測定
してもよい。例えば特定の酵素基質は、酵素との
相互作用においてフルオリメトリー的にモニター
されるウムベリフエロンを生ずるウムベリフエリ
ル誘導体を含んでいてもよく、また基質は、酵素
との相互作用において比色分析法でモニターされ
る着色生成物を生ずるニトロフエニル、ニトロア
ニリンまたは類似の誘導体を含んでいてもよい。 単独のケースでは酵素存在を例えば酵素と基質
の相互作用が着色生成物または変色を生ずるとき
は単なる肉眼による観察で測定してもよい。 基質との相互作用による酵素の直接生成物を分
光分析により、測定してもよい酵素の例はチトク
ロムオキシダーゼであり、例えばチトクロムオキ
シダーゼによつて酸化されて紫色になる指示薬テ
トラフエニル・テトラメチル−ｐ−フエニレン−
ジアミンTMPD）と試料との相互作用によつて
測定してもよい。同様に、アシド・ホスフアター
ゼ、ベーターグルコシダーゼおよびフエニルアニ
リン・デアミナーゼは例えばニトロフエニル誘導
体（これは通常、インキユベーシヨンに続いて酵
素−基質混合物をアルカリで処理し、酵素反応の
最適PHより上にPHをあげることによりニトロフエ
ニル着色を高める必要があるけれども）を使用す
ることにより分光分析的に測定してもよい。 モニター前に酵素と基質との反応後の後処理を
必要とする生成物を分光分析的に測定してもよ
い。例えばロイシン・デアミナーゼのごときアン
モニア生成型酵素は酵素相互作用によつて生じた
アンモニアをネスラー試薬のごとき発色試薬と反
応させ、この色を比色分析法でモニターすること
により測定してもよい。生成したアンモニアを酵
素−基質反応混合物で直接測定してもよく、ある
いは例えばアツセイ前に反応混合物から透析によ
つて除去してもよい。 また、例えば、ジアセチル生成酵素は後処理の
後に酵素生成物の分光分析的モニターによつて測
定してもよい。特にジアセチル生成酵素はジアセ
チル／アセトンの存在確認試験であるフオゲス−
プロスカウアー（Voges−Proskauer）技術によ
つて測定される。 さらに、グルタメート・デカルボキシラーゼ活
性は酵素とグルタミン酸の相互作用によつて生ず
る二酸化炭素を比色分析的に測定することにより
測定してもよい。例えば二酸化炭素は、硫酸のご
とき酸の添加の後、反応混合物を疎水性の膜を通
して、二酸化炭素による酸性の変化により変色す
る緩衝指示薬中に透析することにより比色分析的
に測定する。 他の酵素も適当な手段により測定すればよい。
例えば特定のベプチダーゼ基質はナフチルアミン
またはニトロアニリン誘導体の使用により測定す
る。生ずるナフチルアミンはフルオリメトリーに
より直接またはジアゾニウム・カプリング後の比
色分析により測定できる。 酵素測定のために使用される試験は所望により
例えば試験の有機体特異選択性を増加するために
変えてもよい。即ち本発明方法にはホスフアター
ゼ活性の測定用の二つの試験が含まれている。そ
の一つは全細胞アシド・ホスフアターゼ活性用の
ものであり、一つは細菌細胞の透過性障壁を破壊
する試薬の存在下でのアシド・ホスフアターゼ活
性測定用のものである。適当な試薬はいずれを使
用してもよいがセトリマイド（Cetrimide：セチ
ル：トリメチル−アンモニウム・ブロマイド）お
よびリゾザイム（lysozyme）、特に併用が特に好
ましい。この様な試薬の使用は、例えばブロテウ
ス（Proteus）細菌のアシド・ホスフアターゼ活
性を選択的に減少させ、クレブジーラ
（Klebsiella）細菌のそれを増加させる効果を有
する。 本発明は本発明方法に使用するための試薬キツ
トを含む。このキツトは典型的には本発明の方法
で測定することの望まれている各酵素用の特定の
基質を別々に含んでいる。従つて、例えば本発明
の工程に使用するための基本的なキツトは前に記
載した(a)−（ｚ）測定用の隔離した特異的基質を
含む。好ましくはこれらの基質は相当する酵素と
の相互作用において着色した生成物を与え、比色
分析モニターを可能にするようなものである。加
えてこのキツトは適当な緩衝剤や他の試薬、例え
ば発色試薬等を酵素基質と共に含んでいてもよ
い。 本発明の方法は一般に尿、喉綿棒、たん、傷に
当てた布、便および血液等を含む臨床標本中の細
菌の同定に適用できる。細菌は同定に先立つて標
本から単離する。例えば細菌の培養基を標本から
調製し、同定すべき有機体のコロニーを十分な生
育期間、例えば通常約18時間後培養基から採取
し、適当な形態、例えば懸濁液（suspension）に
し、本発明方法による測定に供する。しかしなが
ら、特に好ましい態様は、本発明方法を臨床標本
から直接得た試料、例えば尿試料から直接得た試
料上で、細菌の生育および単一コロニーの単離の
必要なしに遂行することが予測される。 しかしながら、細菌酵素のアツセイに先行し
て、細菌含有試料を、それが臨床標本から直接得
られたものか細菌の生育後、単一コロニーとして
得られたものかにかかわらず、場合によつては細
菌の透過性障壁を破壊する処理にかけて、アツセ
イ用酵素を放出させてもよい。細菌の透過性障壁
を破壊するために適当ないかなる処理を使用して
もよい。一般にはβ−ガラクトシダーゼおよびア
シド・ホスフアターゼのごときチトプラズマまた
はペリプラズマ酵素の測定中は、細菌の透過性障
壁の前破壊は望ましいが、膜に関連があると思わ
れるデアミナーゼのごとき他の酵素は、酵素活性
を維持するために細菌細胞をそのままにしておい
てもよい。 本発明方法の酵素アツセイ試験は、当業者にと
つて公知の連続流および不連続の試料分析技術を
含む適宜の方法または手段で実施してもよい。一
つの態様としてケム−オー−マツト（Kem−Ｏ
−Mat）システムのごとき不連続分析器を用い
る。他の態様では酵素を自動化した連続分析技術
によつてアツセイしてもよい。この様な連続流分
析法においては、細菌の種類によつて蛋白濃度が
異なると云う観点から、蛋白の測定を併用するの
が好ましく、その結果細菌の絶対的な相対酵素活
性が測定できる。同様に蛋白アツセイは有機体の
濃度による吸光度に対する分光アツセイにおける
ブランクの測定値を提供し得る。 酵素測定中、用いられる条件は所望により変え
てもよい。例えば連続流分析技術において有機体
の試薬に対する相対濃度を高くしてもよい。例え
ば試薬に対する試料の比は約１：３から約３：１
の範囲で酵素と基質の相互作用において形成され
る生成物の水準を高め、より低い細菌の懸濁濃度
において酵素の測定を可能にする。同様に、好ま
しくは比較的高い温度、例えば約40℃ないしそれ
以上の温度を試料と基質のインキユベーシヨンに
採用し相互作用の速度を増加してもよい。好まし
くは、連続流技術を用いてもし各酵素用単一チヤ
ネルを含む装置を採用するならば非常に早い段
階、特に試料が研究室に届いて約１時間以内に、
細菌の同定を行なうことが可能である。 しかしながら、さらに好ましい態様では、本発
明の工程を記験カードまたは多数の縦穴もしくは
隔室（これらは本法の各酵素試験に対する特異的
な酵素基質および所望ならば発色剤のごとき他の
試薬を別々に含んでいる）を備えた他の適当な装
置を用いて行なつてもよい。 試料の使用に際し、通常細菌の懸濁を各隔室に
加え、比較的短かいインキユベーシヨン期間（好
ましい態様では約20分から約２時間まで）の後の
検出可能な（例えば着色した）生成物が発現する
か否かで細菌試料中に相当する酵素があるか無い
かを示す。この様な装置も本発明の技術的範囲に
含まれ、特に好ましい態様では酵素試験の応答か
ら直接酵素種を同定する自動化した、好ましくは
コンピユータ化した分光分析走査技術を含む自動
化技術により扱かうようにしてもよい。 本発明方法は例えば、細菌のある種の群の同定
を強化するために試験(a)−（ｚ）として先に述べ
たものの他に細菌酵素の測定用の付加的な試験と
結合してもよい。したがつて、例えば、本方法は
エンテロバクテリアの同定を助けるため細菌のカ
タラーゼの測定用試験を含んでもよい。さらに本
方法は細菌ウレアーゼ活性の測定用試験を含んで
いてもよい。 特殊な態様では、本方法は通常遭遇する細菌
群、エツシエリヒア、クレブジーラspp、プロテ
ウスおよびシウドモナスsppを迅速に区別するた
めの細菌同定法を含んでいてもよい。この方法で
は上記群の一つの細菌を含む試料を細菌のアシ
ド・ホスフアターゼ、ベーター−ガラクトシダー
ゼ、グルタメイト・デカルボキシラーゼ、フエニ
ルアラニン・デアミナーゼ、チトクロム・オキシ
ダーゼ、ジアセチル生成酵素およびウレアーゼの
測定試験の組合せに処してもよい。26の試験(a)−
（ｚ）と結合する完全な同定方法に関連して前述
したごとくこの限定された７種の試験の組合せを
細菌群、エツシエリヒア、クレブジーラspp.、プ
ロテウスおよびシウドモナスspp.を実質的に迅速
に区別するために使用しもてもよい。 本発明はまたこの７種の試験に使用するための
キツトを含む。この基本キツトは典型的にはアシ
ツド・ホスフアターゼ、ジアセチル生成酵素、ベ
ーター−ガラクトシダーゼ、グルタメイト・デカ
ルボキシラーゼ、フエニルアラニン・デアミナー
ゼ、チトクロム・オキシダーゼおよびウレアーゼ
活性用特異基質を別々に含んでいる。 一般に本発明方法は同定を受ける細菌の酵素活
性の輪郭の測定に依存しており、本発明に従つた
選ばれた酵素試験、即ち試験(a)−（ｚ）の組合わ
せまたは限定された７種の試験の組合わせが細菌
に対する特有の“指紋”を与える。この細菌の各
種または群に対する特有の指紋を予め同定した細
菌、例えば培養コレクシヨンから得られた細菌の
酵素活性のプロフアイルを参照して測定してもよ
い。酵素活性のプロフアイルは定量的または定法
的に測定してもよい。未知細菌の酵素輪郭を予め
同定した細菌のそれと比較することによつて同定
を容易にするためにデーター処理技術の採用が望
ましい。例えば識別できる官能分析、例えばエ
ス・ピー・エス・エス・パケツジ（スタテイステ
イカル・パツケイジ・ホア・ソシアル・サイエン
ス）の使用によつて得られる結果の処理が有用で
あることがわかつた。 本発明方法は典型的には非常に迅速な細菌の同
定を可能にし、通常臨床的に遭遇するこれらの細
菌の大部分を含む非常に広範囲の細菌の同定に対
し、単一の工程のみが必要とされるにすぎない。
この単一工程の用意は好都合に予備試験の必要性
およびそれが引き起す望ましくない遅延を取り除
く。 本発明をさらに添附の図面に言及する以下の記
載および例における説明によつて記載する。 第１図は本発明方法におけるニトロフエノール
放出酵素の連続流分析に使用する多岐管
（manifold）の概略図である。 第２図はアンモニア放出酵素の分析用の同様の
多岐管の概略図である。 第３図はジアセチル生成酵素分析用の同様の多
岐管の概略図である。 第４図はグルタメート・デカルボキシラーゼ分
析用の同様の多岐管の概略図である。 第５図はチトクロム・オキシダーゼおよび蛋白
のアツセイ用の同様の多岐管の概略図である。 第６図は第１図から第５図の多岐管を含む本発
明方法を実施するための、３個のチヤネルを組合
わせた連続流分析システム用フローチヤートの概
略図である。 第７図はフルオレツセント的に活性な生成物を
放出する基質を用いる酵素の連続流分析用に使用
する多岐管の概略図である。 細菌のアシド・ホスフアターゼ、ベーター−ガ
ラクトシダーゼ、グルタメート・デカルボキシラ
ーゼ、ロイシン・デアミナーゼ、フエニルアラニ
ン・デアミナーゼ、チトクロム・オキシダーゼ、
ウレアーゼおよびジアセチル生成酵素の測定試験
は第１図から第５図に概略的に示した酵素測定多
岐管を含む三個の結合システム（フローチヤート
を第６図に示す）を用いる連続流分析技術によつ
て行なわれる。 以下のごとくして種々の酵素の測定を行なう： ニトロフエニル基質を利用する酵素（ベーター
−ガラクトシダーゼ、フエニルアラニン・デアミ
ナーゼおよびアシド・ホスフアターゼ）。 第１図に示された多岐管をニトロフエニル基
質、即ちベーター−ガラクトシダーゼ、フエニル
アラニン・デアミナーゼおよびアシド・ホスフア
ターゼを用いる酵素の測定用に使用する。 有機体懸濁流１を第一単一混合コイル（SMC）
３中で空気分割緩衝流２と混合し、第二SMC５
中で基質流４と混合し、40℃の油浴６中に維持さ
れたガラス・コイル中で18分間インキユベイトし
た。強アルカリ溶液７（1.9MNH₄OH、
0.68MNaOH、トライトン−Ｘ−100 0.3ｇ／ｌ）
の添加によつて反応を中止する。この強アルカリ
溶液は放出されたｐ−ニトロフエニル分子用発色
剤としても作用する。この流れを次いで脱泡し、
光度計８中の20mmフロー・セルを通過させ、
405nmにおけるベーター−ガラクトシダーゼおよ
びアシド・ホスフアターゼに対する吸光度および
480nmにおけるフエニルアラニン・デアミナーゼ
に対する吸光度を測定した。得られた吸光度の読
みをレコーダー１０上に記録する。第１図中、囲
まれた領域１１に与えられた数字は種々の試薬お
よび試薬流に対して用いられる流速である。 使用される種々の緩衝液および基質を以下の表
−１に示す。

【表】 フエニルアラニン・デアミナーゼとDL−β−
（ｐ−ニトロフエニル）−アラニン基質の相互作用
は480nmにおける吸光度により測定される生成物
であるｐ−ニトロフエニルピルビン酸を生成する
と信じられている。 アンモニア放出酵素（ロイシン・デアミナーゼ
およびウレアーゼ） 第２図に関するアンモニア放出酵素、即ち、ロ
イシンデアミナーゼとウレアーゼのアツセイに使
用される方法はバスコムとグラントハム（1975年
“微生物アツセイ法”ボード・アンド・ラブロツ
ク編集第20−54頁、アカデミツク・プレス・ニユ
ーヨーク）にもとづいているが異なつた大きさの
管を使用する。基質から放出されたアンモニアは
0.005MHCl受入れ液流中に透析により収集した
アンモニアにネスラー試薬を加えることによりア
ツセイする。有機体／基質流中で直接アンモニア
を測定する試みはベース・ラインの移動（drift）
およびスタンダードの非再現性のわずらわしさの
ために不満足である。ウレアーゼ活性はトリス・
マレエートまたはりん酸塩緩衝剤を、それらの存
在がベースラインに雑音を入れるので用いず、酵
素は蒸溜水の存在のみ（PH約4.7−5.0）で測定す
る。両方のアツセイにおいてNH₄Cl溶液をスタ
ンダードとして使用する。使用される基質は、
0.5Mりん酸塩・硼酸塩中の５ｍM1−ロイシン
（PH8.0）および新鮮な蒸溜水中の100ｍＭ尿素で
ある。ネスラー試薬は上記刊行物にバスコムおよ
びグラントハムによつて記載されたごとくして調
製し毎日の新しいガラス蒸溜水中に１：10に稀釈
する。光度計には20mmのフロー・セルを使用し、
420nmで吸光度を測定する。 第２図における種々の成分の作用と与えられた
情報の関連性は第１図に類似している。破断線の
矢印１２は透析することなく透析器１３を横切る
流れの方向を示す。 ジアセチル−生成酵素 ジアセチル生成酵素の測定のためにアセトイ
ン／ジアセチルの存在に対するフオーゲス−プロ
スカウアー反応が第３図に示された多岐管に於て
使用される。使用される方法はカマウンらによつ
て記載された方法（クラン・ケム（Clin.Chem.）
1972，18，355−357）から発達したものである。
基質溶液は0.3Mピルビン酸ナトリウム、0.1M酢
酸緩衝液（PH4.5）、0.1ｍＭチアミン・ピロホス
フエイトおよびクレアチン２ｇ／ｌを含む。１−
ナフトール発色剤を2M水酸化ナトリウム中に溶
解する（25ｇ／ｌ）。ジアセチル溶液をスタンダ
ードとして使用する。吸光度は20mmフロー・セル
を用い420nmで測定する。 グルタメイト・デカルボキシラーゼ 第４図のごとくしてグルタメイト・デカルボキ
シラーゼを基質との相互作用によつて測定する： 相互作用によつてCO₂を生成し、これを反応混
合物からクレゾールレツドの緩衝液に透析し、該
CO₂の存在によつて該指示薬に色の変化を生じさ
せる。使用される方法はレクレルク（Annls.Inst.
Pasteur，Paris（1967）112，713−731）、モラン
およびウイルター（1976J.Food Sci.41，165−
167）によつて記載されたものおよびテクニコ
ン・メソドロジー・AA（Technicon
Methodology AA 11−08）に基礎を置いてい
る。テクニコン標準炭酸ナトリウムを使用する。
使用される基質は0.1M酢酸塩緩衝液（PH3.8）、
0.05Mグルタミン酸ナトリウムおよびりん酸ピリ
ドキサール20mg／ｌを含有する。試料と基質のイ
ンキユベーシヨンの後、ブリジー35（Brij−35：
30％テクニコン）１ml／ｌを含む0.5M硫酸稀釈
液を加てPHを変え、親水性の透析膜を通す透析に
よつて生成したCO₂の除去を助ける。使用される
指示薬は0.4Mトリス、アンモニア溶液28μl／ｌ、
ブリジ35 20μl／ｌおよびクレゾール・レツド20μ
ｇ／ｌを含む。吸光度は10mmフロー・セル中、
420nmで測定する。 チトクローム・オキシダーゼおよびプロテイ
ン・アツセイ チトクロム・オキシダーゼと蛋白質を第５図に
示す多岐管装置を使用してアツセイする−この装
置は第１図から第４図に於けるのと同様の情報と
類似の機能を持つた要素を有している。 チトクロム・オキシダーゼ活性のアツセイに使
用する試薬は、第一単一混合コイルの前に導入さ
れる0.05Mトリス・マレエイト緩衝液（PH6.0）
および第二単一混合コイルの前に導入される
0.001％（Ｗ／ｖ）アスコルビン酸にとかした0.5
ｍＭ NN N′N′−テトラメチル−ｐ−フエニレ
ン・ジアミン・ジヒドロクロリドである。使用さ
れるインキユベイシヨン時間は室温で17分であ
り、吸光度は10mmフロー・セル中で550nmで測定
する。 蛋白質アツセイ 使用される蛋白質アツセイはロウリイーら
（1951、J.Biol.Chem.193，265−275）のそれにも
とづいている。但し、上記刊行物にバスコムおよ
びグラントハムが記載しているごとくより小さい
管を使用する。使用される試薬は酒石酸ナトリウ
ム・カリウム（10ｇ／ｌ）２mlをCuSO₄・5H₂O
（５ｇ／ｌ）２ml、および0.37MNaCO₃（無水物）
含有0.2MNaOH46mlをこの順に混合して日々調
製したアルカリ性銅溶液である。このアルカリ銅
試薬は第一単一混合コイルの前に導入する。ホリ
ン−シオカルト試薬（Folin−ciocalto）（BDH）
を日々蒸溜水で１：８に稀釈し第二単一混合コイ
ルの前に導入する。使用されるインキユベーシヨ
ン時間は室温で17分であり、吸光度を10mmフロ
ー・セル中で、660nmで測定する。スタンダード
として牛（Bovine）血清アルブミン溶液を用い
る。クロロホルムの２、３滴を酒石酸ナトリウ
ム、炭酸塩および蛋白質標溶液に加え、微生物汚
染を防ぐ。 上に記載の酵素アツセイは結合した連続流分析
システム、即ち第６図に示す三つのチヤンネルを
含むフローチヤート中で行なう。この三つのチヤ
ンネルは同時に稼動する：一つのチヤンネル(A)は
ニトロフエニル誘導体を利用する酵素のアツセイ
用であり、第二のチヤンネル(B)はプロテインとチ
トクロム・オキシダーゼのアツセイ用であり、第
三のチヤンネル(C)はジアセチル生成、アンモニア
生成およびCO₂生成（グルタメート・デカルボキ
シラーゼ）酵素のアツセイ用である。NH₃とCO₂
生成物を反応混合物から透析し、ネスラーと１−
ナフトール発色剤をインキユベイシヨンコイルと
第三SMCの間の適当な所で加える。単一試料プ
ルーブ（probe）からの流れを三分し、各チヤン
ネルＡ，ＢおよびＣに細菌の懸濁液を供給する。
基質と緩衝溶液を管を介して連続流中に供給しな
がらこのバクテリア懸濁液を回転式試料プレート
Ｄ上のカツプに維持する。 全細菌懸濁液をまず三種の酵素即ちチヤンネル
Ａ，ＢおよびＣそれぞれにつき一種の活性に対し
て試験する。サイクルが完了したとき、基質、緩
衝剤および試料のラインを次の三種の試験バツチ
用試薬に手動で移動させ、細菌のサンプリングを
再開する。基質ライン中に蒸留水を入れたコント
ロール・ランを含めて４回この試験を繰返し、ア
シド・ホスフアターゼ、チトクロム・オキシダー
ゼ、ロイシン・デアミナーゼおよびウレアーゼ・
アツセイにおける細菌懸濁液の吸光度を得る。 実施例 １ 異なつた細菌の総計199の懸濁液を添附図面に
示した連続流装置を用い上述の方法によつて試験
した。細菌をマコンキー寒天プレート
（MacConkey：デイフコ・ラボラトリーズまた
はテイシユー・カルチユア・サービシズ）上、37
℃で一夜培養した慣用の尿標本から単離する。同
種のコロニー外観を示すプレートのみを使用す
る。 ５mlの塩水（Saline）中にそれぞれ10個のコロ
ニーを含む細菌懸濁液を別々の場所に調製し、こ
れを自動システムにかけ、自動化した同定法が試
料のコロニー外観に関する情報なしで行なわれる
ことを確認する。0.1mlを各懸濁液から抜きとり、
５ml培養肉汁に加え、次いで37℃で２時間マトバ
ーン（Matburn）回転ミキサー上でインキユベ
ートした。これらの懸濁液は常套の試験手段の選
ばれたセツトへの接種およびその後の試験用に保
存するため培養寒天スロープへの接種用に使用さ
れる。残つた塩水懸濁液は自動化工程によつて直
接試験する。セトリマイド（Cetrimide）および
リゾチーム（Lysozyme）をアシド・ホスフアタ
ーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ・アツセイ用緩
衝液に入れ、基質の添加前に室温で２１／２分間、 塩水の有機体懸濁液と混合して細菌の透過性障壁
の破壊を達成する。この処理は試験された全ての
グラム陰性菌の340nmにおける吸光度を半減す
る。 自動化工程の採用によつて得られた結果を表−
２に示し、常套の方法、コワンおよびスチール
（CowanおよびSteel：1974“マニマアル・ホア・
ザ・アイデンテイフイケイシヨン・オブ・メデイ
カル・バクテリア”第２版、ユニバーシイテイ
ー・プレス、ケンブリツジ）の方法に従つて細菌
をあらかじめ同定することによつて得られた結果
と比較する。

【表】 実施例 ２ 異なつた有機体の総計96の懸濁液を上記実施例
１の自動化方法および前の記載により試験する。
但し、本件では各懸濁液は塩水１mlに有機体の一
つのコロニーを含む。適用した自動化試験方法は
実施例１におけるのと同様であるが、コントロー
ル・ランは少なく、比較のため類似の常套の試験
を各懸濁液の一部について行なつた。得られた結
果を成功率に換算して表−３に示す。表は実施例
１の自動化試験の成功率に対する結果も含んでい
る。

【表】 これから明らかなごとく実施例１の自動化シス
テムで達成された一致率は98％である。同定され
ない３種の菌種はアシド・ホスフアターゼ活性の
みを示すクレブジーラsppの一菌種、ベーター−
グルコシダーゼ活性のみを示すイー・コリーの一
菌種およびチトクローム・オキシダーゼ活性の結
果を利用することのできないシウドモナスsppの
一菌種を含む。これらの三種の有機体の全ては最
初は同定されないものとして分類されるが繰返し
試験に於ては正確に同定される。即ち、蛋白アツ
セイ試験と共に使用される８種の酵素活性試験の
選定で、四つの細菌群、即ちエツシエリヒア、ク
レブジーラspp、プロテウスspp.、シウドモナス
spp.全てを自動化試験法により正確に同定するこ
とが可能である。 実施例２において達成された成功率は実施例１
のそれと同じ位良好である。即ち、９個の自動化
試験の採用により、単一のコロニーからある種の
細菌を同定することが可能である。 実施例 ３ カルチユアー・コレクシヨンおよび新たに単離
した菌種の総計304の懸濁液を以下に記載のごと
く本発明の全26試験によつて試験した。 カルチユアー・コレクシヨン菌種はタイプ・カ
ルチユアーのナシヨナル・コレクシヨン、コリン
デイルのザ・コンピユーター・トライアルおよび
セント・メリーズ・ホスピタル・メデイカル・ス
クールのバクテリオロジー・デパートメントから
のもので全て常套の方法で同定され特徴のわかつ
たものである。新しい菌種は日常の尿標本から単
離されエイ・ピー・アイ（API）・ストリツプ・
20Eを用いて同定された。全菌種は塩化ナトリウ
ムを添加しないマクコンキイ寒天プレート上で37
℃で１晩培養した（デイフコ・ラボラトリーおよ
びテイシユ・カルチユア・サービス）。４ml殺菌
塩水中に８コロニーを懸濁した細菌懸濁液を全酵
素アツセイに使用した。 ３種の異なつた分析システムを用いて酵素活性
を測定した。実施例１に記載したごとく、連続流
システムを用いてチトクロム・オキシダーゼ、グ
ルタメイト・デカルボキシラーゼおよび蛋白質含
量を測定した。表−４に掲げた酵素の検出のため
半自動連続流法を第７図に示した連続流多岐管を
用いるフルオリメトリーによつて使用した。不連
続分析装置（Kem−Ｏ−Mat）を用いて表−５
に掲げる試験を行なつた。 半自動化法において緩衝基質溶液（200μl）と
細菌懸濁液（200μl）を手動でオート・アナライ
ザーのカツプに加えた。細菌と基質の混合物を40
℃で90分インキユベートし、フルオレツセンスを
第７図において詳述した連続流多岐管を用いるニ
ユートン・サンプラーに附着したロカルト・フル
オリメーターに秤量する。このシステムは１時間
当り100個の試料の測定を可能にする。供試酵素
および試薬の組成を表−４(a)および４(b)に示す。

【表】 全ての基質をコツホ・ライト（Koch Light）
により供給した。これらの基質をメトキシエタノ
ール中に溶解し適当な緩衝液で掲示の最終濃度に
稀釈した。

【表】 全ての基質をジメチル・サルフアイド中に溶解
し、0.1mMの最終基質濃度（トリス・ホスフエ
ート緩衝液0.1M、PH8.0、硝酸第一コバルト2M
含有）に稀釈した。連続流多岐管に使用する試薬
は0.1Mトリス・ホスフエート緩衝液（PH8.0）で
ある。 不連続分析器、ケム−オー−マツト（カウンタ
ー．エレクトロニクス）を用い、表−５に掲げた
試験を行なつた。この細菌懸濁液をサンプル・カ
ツプに入れ、緩衝液を稀釈注射器で加え、基質と
試薬（反応最終生成物の発色剤用）を試薬注射器
で加える。試料量を増加し、細菌懸濁液を含むキ
ユーベツテ（cuvettes）のインキユベイシヨン時
間を長くするために、緩衝液と基質をケム−オー
−マツトの外でインキユベイトした。全部で32個
のキユーベツテの同時挿入とその除去のためにキ
ユーベツテ交換器を用いた。二つのプログラム・
カートリツジを用い各試験を行なつた。プログラ
ム・カートリツジ１は細菌懸濁液、緩衝液、コフ
アクターおよび基質を各キユーベツテに分配する
ためおよび各キユーベツテの最初の吸光度を読む
ために用いた。次いでキユーベツテを移動し40℃
のインキユベーター中に入れた。稀釈および試薬
注射器およびプローベをすすぎ、次の酵素試験の
ための試薬で満たした。各酵素試験のキユベツテ
をインキユベーシヨンした後、分析器に戻した。
プログラム・カートリツジ２は第二試薬の添加お
よび最終吸光度を読むために使用した。試薬組成
の詳細を表−５に示す。全試験のために稀釈剤
350μlおよび試薬１70μlを各キユベツテに分配し
た。細菌の懸濁液をDNAアーゼ（DNAase）試
験用に50μl単位でおよび他の全ての試験のために
は25μl単位で分配した。最短インキユベーシヨン
時間はトリプトフアナーゼおよびDNAアーゼ用
が２時間、VPおよびPNPA用が１時間半、残り
の試験用が１時間であつた。インキユベイシヨン
時間の終りに試薬２を基質と細菌懸濁液を含むキ
ユベツテにVP，PNPA，PNPP，PNPP＋Ｃ＋
ＬおよびPNPG＋Ｃ＋Ｌ試験に対して50μl単位で
およびINDOLE試験に対しては350μl単位で加え
た。最終吸光度は第２試験添加後２分に読んだ。
但し、VPとINDOLEは20分後に読んだ。三種の
異なつた分析システムからの吸光度測定値を酵素
活性および各酵素試験における各有機体懸濁液の
特異的酵素活性を計算するためコンピユーターに
供給した。

【表】 結果の分析 35菌種に分かれる304の培養菌をケム−オー−
マツトおよび総計26の試験と蛋白質アツセイにお
ける連続流システムによつて試験した。数値の見
落し、培養菌の混合および常套の試験による同定
の疑わしさのために31菌種を取り除いた。残りの
273培養菌を主としてカルチユア・コレクシヨン
菌種である210から221の培養菌を含む公知のセツ
ト（トレイニング・セツト（Training Set））と
主として培養尿標本から新らしく単離し、尿標本
を受け取つた後の日に試験した52〜73の培養菌の
未知セツト（テスト・セツト（Test Set））に分
けた。 SPSSソフトウエアーを用いる識別官能分析
（Giscrininant function analysis（DFA））を用
いてトレイニングおよびテスト・セツトの両方を
同定した。 35菌種を表−６に示すごとく17の属または各属
の範囲内で種もしくは種の群に副分割されたもの
に分割した。

【表】

【表】 各類別化（grouping）は全26試験（バリアブ
ルズ（variables））および多数の限定されたバリ
アブルズのセツトを用いるDFAにかけ、データ
ーの最良の数学的処理を決定した。 26バリアブルズの全てが含まれたときの種々の
組合せにおけるトレイニング・セツトとテスト・
セツトで得られる予備同定での百分率の一致を表
−７に示す。

【表】 最も高い一致にパーセントは25B類別化のトレ
イニング・セツトおよび25A類別化のテスト・セ
ツトで得られた。DFAから選択されたバリアブ
ルズの排除の一致パーセントに及ぼす影響を22B
と25B群を用い表−８と９に示す。

【表】

【表】
シダーゼ

【表】 両方の場合において、PNAG試験の排除は80
％の一致を示す属の数におけると同様、合計のパ
ーセントの一致におけるわずかな増加をもたら
す。これはPNAG試ー験から生ずる結果におけ
る実験的な不正確さによるものと信じられる。コ
ンピユータ選定によるか視察によるかを問わず更
に試験を排除することは一致のパーセントにおけ
る許容し得ない一層の減少を生ずる。 分離することが困難なことのわかつた属はプロ
テウス・レツトゲリ、アシネトバクター・アニト
ラツスおよびエンテロバクター／セラチア種であ
る。これは多分、培養に長時間保持した菌種
（Streins）の使用の結果である。 これらの菌種のあるものは、常套のAPI20およ
びＲ／Ｂ管キツトの両方によつて試験したとき、
好ましい同定を示さず、多数の菌種においては、
一つのシステムの結果は第２のものとは一致しな
かつた。 多くの菌種、好ましくは新しく単離したものが
これらの分類における困難性を解決するために必
要とされる。 しかしながら得られた結果は、本発明の完全な
工程が非常に広範囲の異なつた細菌の同定に80％
以上の正確さを与えることを示している。もし予
め同定した細菌の大きくかつより代表的な群から
の酵素のプロフイル・インフオーメーシヨンが比
較のため利用し得るならば、この正確さをより向
上させることができる。