DK160323B

DK160323B - Fremgangsmaade til identifikation af bakterier og reagenssaet til brug ved fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK160323B
Application number: DK556780A
Authority: DK
Inventors: Shoshana Bascomb
Original assignee: Nat Res Dev
Priority date: 1979-05-02
Filing date: 1980-12-30
Publication date: 1991-02-25
Also published as: DK160323C; EP0018825B1; DK556780A; JPH0321160B2; WO1980002433A1; US4603108A; GB2048302A; EP0018825A1; DE3070143D1; GB2048302B; JPS56500399A

Description

i

DK 160323 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til identi i kation af bakterier og et reagenssæt til brug ved fremgangsmåden.

Klinisk bakteriologiske laboratorier anmodes hyppigt om at foretage tests for tilstedeværelsen af patogene bakterier i kliniske prøver og 5 desuden om at identificere, hvilken type bakterier det drejer sig om, for at hjælpe klinikeren ved valget af, hvilken behandling, fx. antibiotisk, der skal anvendes til bekæmpelse af infektionen.

Sædvanlige bakterieidentifikationsprocedurer hviler på en serie karakteriseringstests på basis af hvilke den ukendte organisme henføres 10 til en defineret bakteriegruppe. Disse tests indbefatter tests, ved hvilke bakterier klassificeres efter deres evne til at metabolisere forskellige substrater, idet metabolisme bestemmes ved resulterende ændringer i substratmediet, fx. pH-ændringer, som kan påvises ved anvendelse af farvede indikatorer. Til sådanne metabolismetests er det imidler-15 tid nødvendigt at dyrke bakterien, sædvanligvis i komplet vækstmedium, og dette kræver betydeligt tidsforbrug, således at det sjældent er muligt at identificere bakterien samme dag, som prøven når til laboratoriet. Ofte er definitiv identifikation ikke mulig før 48 - 72 timer efter modtagelse af prøven, hvis der anvendes konventionelle bakterieiden-20 tifikationsmetoder. I mellemtiden kan den af klinikeren foreskrevne behandling i bedste fald kun være et gæt, og den kan i begyndelsen være ukorrekt med den følge, at infektionen vedvarer, og patientens tilstand forværres. Der er derfor et presserende behov for forøgelse af hastigheden, hvormed bakterier, som forårsager infektioner, identificeres, såle-25 des at den korrekte behandling, fx. antibiotisk, kan foreskrives uden uønsket forsinkelse.

Der er for ganske nylig blevet foreslået bakterieidentifikationsmetoder, hvor identifikationen kun i begrænset udstrækning hviler på bak-teriedyrkning, men mere er afhængig af bestemmelse af enzymer, som fra 30 starten er til stede i bakterien eller induceres efter et forholdsvis kort tidsrum, fx. nogle få timer, og disse tests gør det muligt at foretage bakterieidentifikation tidligere end hidtil, af og til samme dag som prøven er modtaget. Hver af disse bakterieidentifikationsmetoder muliggør imidlertid i almindelighed kun identifikation af bakterier inden 35 for visse begrænsede grupper, og det er derfor nødvendigt at gennemføre en foreløbig identifikation, der sædvanligvis kræver bakteriedyrkning, til udvælgelse af den specielle identifikationsmetode, som skal anvendes.

2

DK 160323 B

Der er nu frembragt en ny bakterieidentifikationsmetode, som udelukkende eller næsten udelukkende hviler på bestemmelse af enzymer, som er til stede i organismerne, og desuden fordelagtigt tilvejebringer en enkelt identifikationsprocedure, ved hvilken et meget bredt spektrum af 5 almindeligt forekommende bakterier kan identificeres meget hurtigt.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til brug ved identifikation af bakterier, ved hvilken bakterier underkastes en kombination af tests til bestemmelse af bakterieenzymer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at testene udføres til kvantitativ 10 bestemmelse af hvert af følgende enzymer (a) - (z): (a) lipase (b) a-glucosidase (c) /J-glucosidase 15 (d) /J-xyl osidase (e) /J-glucuronidase (f) Ø-galactosidase (g) hel-cel le sur phosphatase (h) sur phosphatase i nærværelse af midler, som bryder bakterie- 20 cellepermeabilitetsbarrieren (i) DL-alanyl-/J-naphthyl aminspecifik peptidase (j) L-arginyl-Ø-naphthylaminspecifik peptidase (k) N-y-L-glutamyl-jS-naphthylaminspecifik peptidase (l) glycyl-/J-naphthylaminspecifik peptidase 25 (m) L-4-hydroxyprolyl-j8-naphthylaminspecifik peptidase (n) L-leucyl-/J-naphthyl aminspecifik peptidase (o) L-leucyl-4^methoxy-/J-naphthylaminspecifik peptidase (p) L-lysyl-/J-naphthyl aminspeci fi k peptidase (q) L-prolyl -/J-naphthyl aminspeci fik peptidase 30 (r) L-pyrrolidonyl-^-naphthyl ami nspecifik peptidase (s) alanyl-p-nitroanilinspecifik peptidase (t) glutamyl-p-nitroanilinspecifik peptidase (u) di acetyl/acetoinproducerende enzymer (v) p-nitrophenylalanin ammoniaklyase 35 (w) tryptophanase (x) deoxyribonuklease (y) giutamatdecarboxylase (z) cytochromoxidase, DK 160323 B i 3 j og at testene omfatter inkubation af bakterieprøven med substrater for enzymerne i et tidsrum, der, undtagen hvad tryptophanase og deoxyribonuclease angår, er passende for bestemmelse af konstitutive enzymer, og at testene med samme undtagelser ikke afhænger af vækst af bakterierne und-5 er testen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til identifikation af et meget bredt spektrum af bakterier indbefattende de fleste af de bakterier, som man sædvanligvis står over for inden for det kliniske område. Fremgangsmåden kan specielt anvendes til identifikation af de al-10 mindeligt forekommende bakteriegrupper: Aeromonas, Acinetobacter, Alca-ligenes, Bordatella, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Hafnia, Klebsiella, Providencia, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus og Streptococcus. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er fx. blevet anvendt til identifika-15 tion af følgende bakteriearter:

Aeromonas hydrophila Aeromonas formi cans

Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus 20 Acinetobacter calcoaceticus var. Iwoffii Alcaligenes faecal i s Bordatella bronchiseptica Citrobacter freundii Citrobacter koseri 25 Edwardsiella tarda

Enterobacter aerogenes Enterobacter agglomerans Enterobacter cloacae Escherichia col i 30 Flavobacterium meningosepticum

Hafnia alvei Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae (sensu lato)

Klebsiella rhinoscleromatis 35 Providencia alcalifaciens

Providencia stuartii Proteus mirabilis Proteus morganii 4

DK 160323 B

Proteus rettgeri Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas cepacia 5 Pseudomonas fluorescens

Serratia marescens Serratia rubidaea Serratia liquefaciens Staphylococcus aureus 10 Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus saprophyticus Streptococcus sp.

Det må imidlertid bemærkes, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen 15 også kan anvendes til identifikation af andre bakteriearter ud over de ovenfor anførte.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt meget hurtigt at identificere bakterier, idet de anvendte enzymbestemmelsestests i almindelighed kun kræver en forholdsvis kort inkubationsperiode, fx. fra ca.

20 10 minutter op til ca. 2 timer, sædvanligvis fra ca. 30 til ca. 90 minutter ved ca. 40°C, for at give en tilstrækkelig mængde produkt til påvisning, fx. ved spektroskop!ske målinger. Det menes, at de enzymer, som påvises under fremgangsmåden ifølge opfindelsen, i almindelighed er konst i tut i ve enzymer for den pågældende bakterie, selvom enzymerne i to 25 tilfælde omtalt nedenfor kan være inducerede enzymer, for hvilke bakte-riesyntesehastighederne er meget høje. De tests, der anvendes, er derfor i almindelighed hensigtsmæssigt tilpasset bestemmelse af konstitutive enzymer. Uden præjudice for det foregående synes bestemmelse af trypto-phanase og deoxyribonuclease imidlertid at kræve bakterievækst, hvilket 30 sædvanligvis kræver inkubation i et tidsrum på 2 - 2,5 timer.

I almindelighed kan de tests, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af bakterieenzymer, omfatte en hvilken som helst egnet test til bestemmelse af de pågældende enzymer, som karakteristisk ikke afhænger af vækst af organismerne under testen, og som 35 kan omfatte de ikke-dyrknings enzymbestemmelsestests for de pågældende enzymer, som er velkendte inden for området.

Disse tests er sædvanligvis af den type, hvor enzymet bestemmes efter dets evne til at undergå en interaktion med et specifikt substrat.

i 5

DK 160323 B

Ved interaktion mellem enzymet og substratet ved inkubation opstår der sædvanligvis et produkt, som kan bestemmes kvantitativt enten direkte eller efter yderligere behandling, som kan omfatte kemisk syntese ud fra det indledende enzymprodukt.

5 Produktet af enzyminteraktionen kan påvises ved spektrometriske må linger, herunder fluorimetri eller kolorimetri. Fx. kan det specifike enzymsubstrat omfatte et umbel1 iferylderi vat, som ved interaktion med enzymet frembringer umbelliferon, som registreres fluorimetrisk, eller substratet kan omfatte et nitrophenyl- eller nitroanilinderivat eller et 10 derivat af lignende type, som ved interaktion med enzymet frembringer et farvet produkt, som registreres kolorimetrisk.

Et eksempel på et enzym, som kan påvises ved spektrometrisk måling af det direkte produkt af enzyminteraktion med et substrat er cytochrom-oxidase, fx. ved interaktion af en prøve med tetramethyl-p-phenylen-dia-15 min (TMPD), en indikator, som oxideres af cytochromoxidasen og giver en purpurfarvning ved tilstedeværelse af cytochromoxidase i prøven. Også sure phophataser, /?-galactosidaser og phenyl al anindeaminaser kan påvises spektrometrisk, fx. under anvendelse af nitrophenylderivater, omend det normalt er nødvendigt at behandle enzym-substratbi andingen med alkali 20 efter inkubationen for at frembringe nitrophenolfarvningen ved hævning af pH-værdien til over enzymreaktionens pH-optimum.

Produkter, som kræver yderligere behandling efter enzymreaktion med substratet før registrering, kan påvises spektrometrisk. Fx. kan ammoni-akfrigørende enzymer såsom leucindeaminase påvises ved omsætning af den 25 ved enzyminteraktionen frigjorte ammoniak med et farvefremkaldende reagens såsom Nessler's reagens og registrering af den resulterende farve ved kolorimetrisk måling. Den frigjorte ammoniak kan måles direkte i en-zymsubstratreaktionsblandingen eller kan, fx. ved dialyse, fjernes fra reaktionsblandingen før analyse.

30 Også fx. di acetyl producerende eller acetoinproducerende enzymer kan bestemmes ved spektrometrisk registrering af enzymprodukter efter yderligere behandling. Sådanne enzymer kan bestemmes ved Voges-Proskauer teknikken til testning for tilstedeværelse af diacetyl/acetoin. Teknikken skelner ikke mellem produktion af acetoin (CHgCOCHOHCHj) og dets 35 oxidationsprodukt, diacetyl (CH3COCOCH3).

Desuden kan glutamatdecarboxylaseaktivitet bestemmes ved kolorimetri sk bestemmelse af det som et resultat af interaktion mellem enzymet og glutaminsyre frigjorte carbondioxid. Fx. bestemmes carbondioxid kolo- 6

DK 160323 B

rimetrisk ved dialyse fra reaktionsblandingen efter tilsætning af syre, fx. HgSO^, gennem en hydrofob membran til en forpufret indikator, der skifter farve som resultat af den ændring i surhedsgraden, som skyldes carbondioxidet.

5 Andre enzymer kan bestemmes ved passende teknikker, fx. bestemmes substratspecifikke peptidaser ved anvendelse af naphthylamin- eller ni-troanili nderivater, idet den frembragte naphthylamin bestemmes enten direkte ved fluorimetri eller ved kolorimetri efter diazoniumkobling.

De til bestemmelse af enzymerne anvendte tests kan varieres efter 10 ønske, fx. til forøgelse af testenes organismespecifkke selektivitet.

Der er således i fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholdt to tests til bestemmelse af phosphataseaktivitet, en for hel-celle sur phosphata-seaktivitet og en for sur phosphataseaktivitet i nærværelse af midler, som bryder bakteriecellepermeabilitetsbarrieren. Der kan anvendes et 15 hvilket som helst passende middel, selvom cetrimid (cetyltrimethylammo-niumbromid) og lysozym, især i kombination, foretrækkes specielt. Anvendelsen af et sådant middel har fx. den virkning selektivt at formindske sur phosphataseaktiviteten for celler af Proteus bakterier og forøge den for Klebsiella celler.

20 Opfindelsen omfatter reagenssæt til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Sådanne sæt er ejendommelige ved, at de omfatter separate specifikke substrater for hvert af de enzymer, som det ønskes at bestemme ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Således omfatter fx. et grundsæt til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen separate, speci-25 fikke substrater til bestemmelse af de tidligere anførte enzymer (a)-(z). Disse substrater er fortrinsvis således, at de giver kromogene eller fluorogene produkter ved interaktion med tilsvarende enzymer for fordelagtigt at tillade kolorimetrisk eller fluorimetrisk registrering. Sættene kan derudover også omfatte passende pufferopløsninger og andre 30 reagenser, fx. farvefremkaldende eller fluorescensfremkaldende reagenser.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i almindelighed anvendelig til identifikation af bakterier i kliniske tests, herunder urinprøver, halsskrab og spyt, sårskrab, afføring og blodprøver. Bakterier kan isoleres 35 fra prøverne før identifikationen. Fx. fremstilles bakteriekulturer ud fra prøverne, og kolonier af de organismer, som skal identificeres, udvindes fra kulturerne efter en tilstrækkelig vækstperiode, fx. normalt ca. 18 timer, og oparbejdes til for bestemmelse ved fremgangsmåden iføl- i DK 160323 B ^ 7 ! ge opfindelsen passende form, fx. suspensionsform. I særligt foretrukne udførelsesformer regner man imidlertid med, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen vil blive gennemført på prøver hidrørende direkte fra kliniske prøver, fx. på prøver hidrørende direkte fra urinprøver, uden behov for 5 dyrkning af bakterier og isolering af enkeltkolonier.

Før analyse af bakterieenzymer kan de bakteriehol dige prøver imidlertid, hvadenten de er fremkommet direkte fra kliniske prøver eller fremkommet som enkeltkolonier efter bakteriedyrkning, i visse tilfælde underkastes behandling til brydning af bakteriernes permeabilitetsbar-10 riere og frigørelse af enzymerne til analyse. Der kan til brydning af bakteriepermeabilitetsbarrieren anvendes en hvilken som helst passende behandling. En sådan forudgående brydning af bakteriepermeabilitetsbar-rieren kan i almindelighed være ønskværdig under bestemmelse af cyto-plasmi ske og periplasmi ske enzymer, såsom j8-galactosidaser og sure 15 phosphataser, selvom andre enzymer, såsom deaminaser, som synes at være membranassocierede, kan kræve, at bakteriecellerne holdes intakte, for at enzymaktiviteten kan opretholdes.

Enzymanalysetestene ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan gennemføres ved hjælp af en hvilken som helst egnet metode eller indret-20 ning, herunder analyseteknikker, hvortil der benyttes kontinuert gennemstrømning eller adskilte prøver, såsom de der er velkendte inden for området. I en udførelsesform anvendes der en analysator til adskilte prøver såsom "Kem-O-Mat" systemet. I en anden udførelsesform kan enzymerne analyseres ved hjælp af automatiserede kontinuerte gennemstrømningsana-25 lyseteknikker. Ved sådanne kontinuerte gennemstrømningsanalysemetoder kan det være ønskværdigt at medtage en proteinbestemmelse i betragtning af forskellige bakteriers afvigende proteinkoncentrationer, således at bakteriernes specifikke enzymaktiviteter kan bestemmes. En proteinanalyse kan også tilvejebringe et mål for blindprøven, i spektro-metriske 30 analyser for absorbansen, der skyldes koncentrationen af organismerne.

De betingelser, der anvendes under enzymbestemmelser, kan varieres efter ønske. Fx. kan den relative organisme til reagenskoncentration ved kontinuerte gennemstrømningsanalyseteknikker hæves, fx. kan et prøve til reagensforhold i intervallet fra 1:3 op til 3:1 benyttes, for at forøge 35 niveauet af de produkter, som dannes ved interaktion mellem enzymet og substratet, og dermed muliggøre enzympåvisning ved lavere bakteriesuspensionskoncentrationer. Endvidere kan der fortrinsvis anvendes forholdsvis forhøjede temperaturer, fx. en temperatur på ca. 40°C, under 8

DK 160323 B

inkubationen af prøve og substrat til forøgelse af interaktionshastighe-den. Fortrinsvis er det under anvendelse af kontinuerte gennemstrømningsteknikker muligt at opnå bakterieidentifikation på et meget tidligt stadium, specielt inden for ca. 1 time efter, at prøven er nået frem til 5 laboratoriet, fx. hvis der anvendes et apparat omfattende en enkelt kanal til hver enzymprøve.

I yderligere fortrukne udførelsesformer kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen imidlertid gennemføres under anvendelse af testkort eller andet passende apparatur omfattende et antal fordybninger eller rum, som 10 hver for sig indeholder specifikke enzymsubstrater til hver af fremgangsmådens enzymtests og andre reagenser efter behov, fx. farvefremkaldelsesreagenser. Under brug sættes prøven, sædvanligvis en bakteriesuspension, til hvert rum, og et påviseligt produkt udvikles efter en forholdsvis kort inkubationsperiode, fx. fra 20 minutter op til 2 timer 15 i foretrukne udførelsesformer og om nødvendigt efter tilsætning af far-vefremkaldel sesreagenser. Mængden af de tilsvarende enzymer i bakterieprøven bestemmes derefter. Et sådant apparat kan i specielt foretrukne udførelsesformer være indrettet til behandling ved hjælp af automatiserede teknikker indbefattende automatiserede, fortrinsvis computerisere-20 de, spektrometriske scanningteknikker, som identificerer bakteriearterne direkte ud fra resultaterne af enzymprøverne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan indbefatte yderligere tests til bestemmelse af bakterieenzymer ud over dem, der er nævnt tidligere som tests (a)-(z), fx. til styrkning af identifikationen af visse bakte-25 riegrupper. Således kan fremgangsmåden omfatte en test til bestemmelse af bakterieureaseaktivitet.

Opfindelsen tilvejebringer desuden en bakterieidentifikationsmetode til brug ved hurtig differentiering af de almindeligt forekommende bakteriegrupper Escherichia, Klebsiella spp, Proteus spp og Pseudomonas 30 spp, ved hvilken en prøve omfattende bakterier af en af disse grupper underkastes en kombination af tests til bestemmelse af enzymer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der udføres tests til bestemmelse af hvert af følgende enzymer: sur phosphatase i nærvær af et middel, der bryder bakteriecellepermeabilitetsbarrieren, diacetyl/acetoinproduceren-35 de enzymer, jS-galactosidase, glutamatdecarboxylase, phenyl alanindeaminase, cytochromoxidase og urease. Igen inkuberes bakterieprøven med substrater for enzymerne i et tidsrum, der er passende for bestemmelse af konstitutive enzymer, hvorpå eksempler er givet ovenfor, og testene af-

DK 160323 B

9 t ! hænger ikke af vækst af bakterier under testen. Denne mere begrænsede kombination af syv tests kan anvendes til hurtig differentiering af bak-teriegrupperne Escherichia, Klebsiella spp, Proteus spp og Pseudomonas spp, i hovedsagen som beskrevet tidligere under henvisning til den fulde 5 identifikationsmetode omfattende de 26 tests (a)-(z).

Opfindelsen omfatter også sæt til brug ved denne syvtestmetode.

Grundsættet omfatter typisk adskilte, specifikke substrater for sur phosphatase, diacetyl/acetoinproducerende enzymer, /i-galactosidase, glu-tamatdecarboxylase, phenylalanindeaminase, cytochromoxidase og ureaseak-10 tivitet.

I almindelighed hviler fremgangsmåderne ifølge opfindelsen på bestemmelse af enzymaktivitetsprofilerne for de bakterier, som er under identifikation, og i overensstemmelse med opfindelsen giver den udvalgte kombination af enzymtests, dvs. test (a)-(z) eller den begrænsede kombi-15 nation af 7 tests typisk et unikt "fingeraftryk" for bakterien. De unikke "fingeraftryk" for hver art eller gruppe af bakterier kan bestemmes ved henvisning til enzymaktivitetsprofilerne af tidligere identificerede bakterier, fx. ud fra bakterier opnået fra kultursamlinger. Enzymaktivitetsprofiler bestemmes kvantitativt. Det er ønskeligt at anvende databe-20 handlingsteknikker for at lette identifikationen ved sammenligning af ukendte bakteriers enzymprofiler med profilerne af tidligere identificerede bakterier. Eksempelvis har behandling af resultater opnået ved dis-kriminantfunktionsanalyse, fx. under anvendelse af SPSS systemet (Statistical Package for Social Sciences) vist sig særlig nyttig.

25 Fremgangsmåderne ifølge opfindelsen muliggør typisk meget hurtig identifikation af bakterier, idet der kun kræves en enkelt procedure til identifikation af et meget bredt spektrum af bakterier omfattende de fleste af de bakterier, man sædvanligvis møder klinisk. Denne tilvejebringelse af en enkelt procedure har den fordel, at man undgår behovet 30 for en præliminær test og den uønskværdige forsinkelse, som en sådan test forårsager.

Opfindelsen belyses nærmere i den efterfølgende beskrivelse og eksemplerne under henvisning til tegningen, hvor figur 1 er en skematisk fremstilling af en manifold anvendt til 35 kontinuert gennemstrømningsanalyse af nitrophenolfrigørende enzymer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, figur 2 er en skematisk fremstilling af en lignende manifold til analyse af ammoni akfrigørende enzymer,

DK 160323 B

10 figur 3 er en skematisk fremstilling af en lignende manifold til analyse af di acetyl producerende enzymer, figur 4 er en skematisk fremstilling af en lignende manifold til analyse af glutamatdecarboxylase, 5 figur 5 er en skematisk fremstilling af en lignende manifold til analyse af cytochromoxidase og protein, figur 6 er en skematisk fremstilling af et strømningsdiagram for et kombineret, kontinuert tre-kanal-gennemstrømningsanalysesystem til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen og omfattende de i figur 1-5 10 viste manifolde, og figur 7 er en skematisk fremstilling af en manifold anvendt til kontinuert gennemstrømningsanalyse af enzymer under anvendelse af substrater, som frigør produkter med fluorescerende aktivitet.

Tests til bestemmelse af bakteriel sur phosphatase (i nærvær af et 15 middel, der bryder bakteriecellepermeabilitetsbarrieren), /?-galactosida-se, glutamatdecarboxylase, leucindeaminase, phenyl alanindeaminase, cytochromoxidase, urease og diacetyl/acetoinproducerende enzymer gennemføres ved kontinuerte gennemstrømningsanalyseteknikker under anvendelse af et kombineret trekanal system, for hvilket der er anført et strømningsdia-20 gram i figur 6 og omfattende enzymbestemmelsesmani folde som vist skematisk i figur 1-5.

De forskellige enzymbestemmelser gennemføres som følger:

Enzymer, der udnytter nitrophenylsubstrater (fl-galactosidase, phenyl -25 alanindeaminase og sur phosphatase)

Den i figur 1 viste manifold anvendes til bestemmelse af enzymer, der udnytter nitrophenylsubstrater, dvs. Ø-galactosidase, phenylalanin-deaminase og sur phosphatase.

En strøm af organismesuspension 1 blandes med en 1uftsegmenteret 30 pufferstrøm 2 i den første enkelte blandingsspole (SMC) 3, og blandes så med substratstrømmen 4 i en anden SMC 5 og inkuberes i 18 minutter i en glasspole, der holdes i et oliebad 6 på 40°C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af en stærk, alkalisk opløsning 7 (1,9 M NH^OH, 0,68 M NaOH, "Triton-X-100" 0,3 g/1), der også virker som farvefremkalder for det 35 frigjorte p-nitrophenylmolekyle. Strømmen afbobles så og ledes gennem en 20 mm gennemstrømningscelle (F/C) i et fotometer 8, og absorbansen måles ved 405 nm for /}-galactosidase og sur phosphatase og ved 480 nm for phenyl al anindeaminase. De opnåede absobansaflæsninger registreres på en re- DK 160323 B !

ii I

j gistrator 10. De i de lukkede arealer 11 i figur 1 angivne tal er de anvendte strømningshastigheder for de forskellige reagens- og reaktant- 1 strømme. !

De forskellige anvendte pufferopløsninger og substrater er anført 5 nedenfor i tabel I.

Tabel I

Enz.yms.ystemer testet med n i trophenyl substrater 10 Puffer

Enzym Substrat Ion pH Tilsætninger

Sur phosphatase p-nitrophenyl- 0,1 M Na 5,6 200 /ig/ml phosphat acetat cetrimid og 1,5 mM lysozym 15 Ø-galactosidase p-nitrophenyl- 0,1 Η K 7,4 200 /ig/ml /}-D-galacto- phosphat cetrimid og pyranosid lysozym

0,5 mM

Phenylalanin- DL-0-(p-nitro- 0,1 Μ K 8,0 ingen 20 deaminase phenyl)-alanin phosphat

0,5 mM

Det menes, at interaktionen mellem phenyl alanindeaminase og DL-β-(p-nitrophenyl)-alaninsubstratet giver anledning til fremstilling af p-25 nitrophenyl-pyrodruesyre, som er det produkt, der måles med absorbans ved 480 nm.

Ammoni akfrigørende enzymer (leucindeaminase og urease)

Der henvises til figur 2, hvor den til analyse af ammoniak-frigø-30 rende enzymer, dvs. leucindeaminase og urease, anvendte metode er baseret på metoden ifølge Bascomb og Grantham (1975 "Some Methods for Microbiological Assay" ed. Board & Lovelock pp 20-54, Academic Press, N.Y.), men under anvendelse af rør af en anden dimension. Ammoniak frigjort fra substraterne analyseres ved tilsætning af Nessler's reagens 35 til ammoniak, som er blevet opsamlet ved dialyse, til en 0,005 M HC1 recipientstrøm. Forsøg på at måle ammoniaken direkte i organisme/substrat-strømmen giver ikke tilfredsstillende resultat p.g.a. besværlig basis!i -ni edri ft og ikke-reproducerbarhed af standarderne. Ureaseaktiviteten be- 12

DK 160323 B

stemmes i fravær af Tris, maleat eller phosphatpuffer, da deres tilstedeværelse forårsager en urolig basislinie, og enzymet måles i nærværelse af destilleret vand alene (pH omkring 4,7-5,0). NH^Cl opløsninger anvendes som standarder i begge analyser. De anvendte substrater er 5 mM 5 L-leucin i 0,5 M phosphatpuffer, pH 8,0, og 100 mM urinstof i frisk destilleret vand. Nessler's reagens fremstilles som beskrevet af Bascomb og Grantham i den ovenfor nævnte publikation og fortyndes daglig 1:10 i frisk destilleret vand. I fotometret benyttes en 20 mm gennemstrømnings-celle (F/C), og absorbansen måles ved 420 nm.

10 I figur 2 er funktionerne af de forskellige komponenter og relevan-cen af den givne information ligesom i figur 1. Den stiplede pil 12 viser strømningsretningen ved by-pass over dialysatoren 13 uden dialyse.

Di acetyl/acetoi nproducerende enzymer 15 Voges-Proskauer reaktionen for tilstedeværelse af acetoin/di acetyl anvendes i den i figur 3 illustrerede manifold til bestemmelse af diacetyl /acetoinproducerende enzymer. Den anvendte målemetode er udviklet ud fra den af Kamoun et al (Clin. Chem. 1972, 18, 355-357) beskrevne metode. Substratopløsningen indeholder 0,3 M natriumpyruvat, 0,1 M acetat-20 puffer (pH 4,5), 0,1 mM thiaminpyrophosphat og creatin 2 g/1. 1-naphthol farvefremkaldel sesreagenset opløses (25 g/1) i 2 M natriumhydroxid. Som standarder anvendes di acetyl opløsninger. Absorbans måles i det røde område af spektret ved 525 nm under anvendelse af en 20 mm gennemstrømningscene (F/C).

25 GIutamatdecarboxylase GIutamatdecarboxylase bestemmes under henvisning til figur 4 ved interaktion med substrat indeholdende glutamat til frembringelse af C02, som dialyseres fra reaktionsblandingen til en forpufret cresolrødtopløs-30 ning, hvor dets tilstedeværelse forårsager en farveændring af indikatoren. Den anvendte metode er baseret på de metoder, der er beskrevet af Ledere (Annis. Inst. Pasteur, Paris (1967) 112, 713-731), Moran og Witter (1976 J. Food Sci. 41, 165-167) og Technicon Methodology AA 11- 08. Der benyttes "Technicon" natriumcarbonatstandarder. Det anvendte 35 substrat indeholder 0,1 M acetatpuffer (pH 3,8), 0,05 M natriumglutamat og pyridoxalphosphat 20 mg/1. Efter inkubation af prøven og substratet tilsættes 0,5 M svovlsyrefortyndingsmiddel indeholdende "Brij-35" (30% "Technicon") 1 ml/1 for at sænke pH-værdien og medvirke til fjernelse af 13

DK 160323 B

det producerede CO2 ved dialyse gennem en hydrofob dialysemembran. Det anvendte farvereagens indeholder 0,4 mM Tris, ammoniakopløsning 28 μΐ/ΐ, "Brij-35" 20 μΐ/ΐ og cresolrødt 20 /ig/l. Absorbans måles ved 420 nm i en 10 mm gennemstrømningscelle (F/C).

5

Cytochromoxidase og proteinanalyse

Cytochromoxidase og protein analyseres under anvendelse af det mani foldapparat, der er illustreret i figur 5, som indeholder lignende information og komponenter med lignende funktioner som manifoldene i figur 10 1-4.

De reagenser, der anvendes til analyse af cytochromoxidaseaktivitet er 0,05 M Tris-maleatpuffer, pH 6,0, indført før den første enkelte blandingsspole, 0,5 mM N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamin.dihydro-chlorid i 0,001% (vægt/vol) ascorbinsyre indført før den anden enkelte 15 blandingsspole. Det anvendte inkubationstidsrum er 17 minutter ved stuetemperatur, og absorption måles ved 550 nm i en 10 mm gennemstrømnings-celle (F/C).

Proteinanalyse 20 Den anvendte proteinanalyse er baseret på analysen ifølge Lowry et al (1951, J. Biol. Chem., 193, 265-275) og som beskrevet af Bascomb og Grantham i den ovenfor nævnte publikation, idet der dog anvendes mindre rør. De anvendte reagenser er alkalisk kobberopløsning fremstillet daglig ved blanding af 2 ml natriumkaliumtartrat (10 g/1) med 2 ml 25 CuS04.5H20 (5 g/1) og 46 ml 0,2 M NaOH indeholdende 0,37 M Na^ (vandfri), i den beskrevne rækkefølge. Det alkaliske kobberreagens indføres før den første enkelte blandingsspole. Folin & Ciocalteu's-reagens (BDH) fortyndes daglig 1:8 i destilleret vand og indføres før den anden enkelte blandingsspole. Den anvendte inkubationsperiode er 17 minutter ved 30 stuetemperatur, og absorption måles ved 660 nm i en 10 mm gennemstrømningscelle. Som standarder anvendes okseserumalbuminopløsninger. Nogle få dråber chloroform sættes til natriumtartrat-, carbonat- og protein-standardopløsningerne for at hindre mikrobiel kontaminering.

De ovenfor beskrevne enzymanalyser gennemføres i et kombineret, 35 kontinuert gennemstrømningsanalysesystem, for hvilket strømningsdiagrammet er illustreret i figur 6, og omfattende tre kanaler, som bringes i funktion samtidig: En kanal (A) til analyse af enzymer, der udnytter nitrophenylderivater, en anden kanal (B) til analyse af protein og cyto- 14

DK 160323 B

chromoxidase og en tredje kanal (C) til analyse af diacetyl/acetoinproducerende, ammoni akproducerende og COg-producerende (giutamatdecarboxy-lase) enzymer. NHg- og COg-produkterne dialyseres fra reaktionsblandingerne, og Nessler's og 1-naphtol farvefremkaldel sesreagenser tilsættes, 5 hvor det er hensigstmæssigt, mellem inkubationsspolen og den tredje SMC. Strømmen fra den enkelte prøvesonde opdeles i tre, hvorved hver af kanalerne A, B og C forsynes med bakteriesuspensioner. Bakteriesuspensionerne holdes i bægre på en roterende prøveplade D, mens substrater og pufferopløsninger leveres i kontinuerte strømme via rørene.

10 Alle bakteriesuspensioner prøves først for aktivitet af tre enzymer, et i hver af kanalerne A, B og C. Når denne cyklus er komplet, omstilles substrat-, puffer- og prøveledningerne manuelt til reagenser til den næste portion af tre prøver, og bakterieprøveudtagningen startes igen. Denne proces gentages fire gange indbefattende kontrolkørsler med 15 destilleret vand i substratledningerne til opnåelse af bakteriesuspensionernes absorbansværdier ved sur phosphatase-, cytochromoxidase-, leu-cindeaminase- og ureaseanalyserne.

Eksempel 1 20 Ialt 199 suspensioner af forskellige bakterier undersøges ved den ovenfor skitserede fremgangsmåde under anvendelse af det kontinuerte gennemstrømningsapparat, der er illustreret på tegningen. Bakterierne isoleres fra rutineurinprøver dyrket natten over ved 37°C på MacConkey agarplader (Difco Laboratories eller Tissue Culture Services). Kun pla-25 der med en homogen koloniforekomst anvendes.

Bakteriesuspensioner, hver især omfattende ti kolonier i 5 ml saltvand fremstilles et sted for sig selv og bringes til det automatiserede system for at sikre, at den automatiserede identifikation gennemføres uden noget kendskab til udseendet af kolonierne i prøverne. En 0,1 ml 30 alikvot fjernes fra hver suspension og sættes til 5 ml næringssubstrat, som derefter inkuberes ved 37°C i 2 timer på en "Matburn" rotationsblander. Disse suspensioner anvendes til inokulering af et udvalgt sæt konventionelle testmedier og en næringsagarskråkultur til opbevaring for yderligere afprøvning. Den resterende saltvandssuspension testes direkte 35 ved den automatiserede metode. Cetrimid og lysozym sættes til pufferopløsningerne til sur phosphatase- og Ø-galactosidaseanalyserne og blandes med saltvandsorganismesuspensionerne i Z\ minut ved stuetemperatur før tilsætning af substratet for at få brudt bakteriepermeabilitetsbarrie- 15

DK 160323 B

ren. Denne behandling halverede absorbansen ved 340 nm for alle undersøgte Gram-negative bakterier.

De resultater, der opnåedes ved anvendelse af den automatiserede metode, er anført nedenfor i tabel II, og de sammenlignes i tabel III 5 med resultater opnået ved konventionelle teknikker, ud fra hvilke bakterierne identificeres ved at følge Cowan og Steel's metode (1974 "Manual for the identification of Medical Bacteria", 2. udgave, University Press, Cambridge).

10 Tabel II

Fordeling af positive resultater (¾) ved automatiserede tests ifølge opfindelsen E. coli Klebsiella Proteus Pseudo-15 spp. spp. monas spp.

Antal stammer 125 39 16 19

Automatiserede prøver

Sur phosphatase 1 95 100 0 20 Diacetyl/acetoinproduce- rende (Voges-Proskauer) 0 51 0 0 /J-galactosidase 94 82 0 0

Glutamatdecarboxylase 99 0 62 0

Leucindeaminase 0 8 94 0 25 Cytochromoxidase 0 O 0 95

Phenyl alanindeaminase 2 0 100 0

Urease 0 62 75 10

Det fremgår af tabel II, at leucindeaminase kan udelades, da det 30 har i det væsentlige samme funktion som phenyl alanindeaminase.

Eksempel 2

Ialt 96 suspensioner af forskellige organismer prøves ved den automatiserede metode, som er beskrevet ovenfor i eksempel 1 og den forudgå-35 ende beskrivelse, bortset fra, at hver suspension i dette tilfælde omfatter en enkelt organismekoloni i 1 ml saltvand. Den benyttede automatiserede prøvemetode er den samme som i eksempel 1, dog med færre kontrolkørsler, og der gennemføres på lignende måde konventionelle tests på 16

DK 160323 B

alikvoter af hver suspension til sammenligningsbrug. De opnåede resultater i form af grad af success er anført nedenfor i tabel III, som også indeholder resultater for graden af success ved de automatiserede tests i eksempel 1.

5

Tabel III

Overensstemmelse mellem automatiseret og konventionel identifikation E. coli Klebsiella Proteus Pseudo- I alt 10 spp. spp. monas spp.

Antal undersøgte stammer 15 Eksempel 1 125 39 16 19 199

Eksempel 2 61 22 3 5 96

Korrekt identifikation ved automatiseret analyse (%) 20 Eksempel 1 99 97 100 95 98

Eksempel 2 100 100 100 100 100

Som det fremgår, er den overensstemmelsesgrad, der opnåedes med det automatiserede system i eksempel 1, 98¾. De tre stammer, som ikke iden-25 tificeres, omfatter en stamme af Klebsiella spp., som kun udviser sur phosphataseaktivitet, en stamme af E. coli, som kun udviser Ø-galactosi-daseaktivitet og en stamme af Pseudomonas spp., for hvilken der ikke er tilgængelige cytochromoxidaseaktivitetsresultater. Alle tre organismer er oprindeligt klassificeret som uidentificerede og de identificeres 30 korrekt ved gentagen prøvning. Tabel III viser således, at det er muligt korrekt at identificere alle 4 bakteriegrupper, nemlig Escherichia,

Klebsiella spp., Proteus spp. og Pseudomonas spp. ved den automatiserede prøvemetode.

Successgraden, som opnåedes i eksempel 2, var ligeså god som den, 35 der opnåedes i eksempel 1. Det er således muligt at identificere nogen bakterier ud fra en enkelt koloni ved anvendelse af ovennævnte autoati-serede tests.

17

DK 160323 B

Ekempel 3

Ialt 304 suspensioner af kultursamlinger og frisk isolerede stammer testedes ved den fulde 26 tests metode ifølge opfindelsen som beskrevet nedenfor.

5 Kultursamlingstammerne var fra National Collection of Type

Cultures, Computer Trial Laboratory ved Col i ndale og Bacteriology Department, St. Mary's Hospital Medical School og var alle blevet karakteriseret og identificeret ved hjælp af konventionelle metoder. Friske stammer isoleredes fra rutineurinprøver og identificeredes under anvend-10 else af "API strip 20E". API står for Analytical Profile Index, og "API strip 20 E" er et velkendt testudstyr, som fremstilles af Ayerst Laboratories, der er et datterselskab af American Home Products Corp.

Alle stammer dyrkedes natten over ved 37°C på "MacConkey" agarplader uden tilsat natriumchlorid (Difco Laboratory and Tissue Culture 15 Service). Til alle enzymanalyser anvendtes bakteriesuspensioner af 8 kolonier i 4 mm sterilt saltvand.

Enzymaktiviteter måltes under anvendelse af 3 forskellige analytiske systemer. Det kontinuerte gennemstrømningssystem, som beskrevet i eksempel 1, anvendtes til bestemmelse af aktivitet af cytochromoxidase, 20 glutamatdecarboxylase og proteinindhold. En halvautomati seret, kontinuert gennemstrømningsmetode anvendtes til påvisning af de i tabel IV (a) anførte enzymer ved fluorimetri under anvendelse af den i figur 7 viste kontinuerte gennemstrømningsmanifold. En analysator til adskilt analyse ("Kem-0-Mat") anvendtes til gennemførelse af de i tabel V anførte tests.

25 Ved den halvautomatiserede metode sattes forpufret substratopløs ning (200 /il) og bakteriesuspension (200 /il) manuelt til "Auto Analyzer" skåle. Bakterie- og substratblandingen inkuberedes i 90 minutter ved 40°C og fluorescensen måltes i et "Lochart" fluorimeter forbundet til et "Newton" prøveudtagningsapparat under anvendelse af en kontinuert gen-30 nemstrømningsmanifold som specificeret i figur 7. Dette system tillod måling af 100 prøver per time. De afprøvede enzymer og sammensætningen af reagenserne er anført i tabel IV(a) og IV(b).

35 18

DK 160323 B

Tabel IV(a) - Hydro!aser

Enzym Forpufret substrat Kone. .Manifoldreagens

Puffer Substrat mM

5 _

Lipase Tris-HCl 4-methylumbelliferyl 0,05 HC1, 20 mM

pH 9,0,0,05 M nonanoat

a-gluco- Tris- 4-methylumbelliferyl- 0,2 HC1, 20 mM

sidase phosphat a-D-glucopyranoside

10 pH 8,0, 0,1 M

Ø-gluco- Tris- 4-methylumbelliferyl- 0,5 HC1, 20 mM

sidase phosphat /f-D-glucopyranosid

pH 8,0, 0,1 M

/3-xylosi- Tris- 4-methylumbelliferyl- 0,2 HC1, 20 mM

15 dase phosphat /3-D-xylopyranosid

pH 8,0, 0,1 M

j3-glucu- natrium- 4-methylumbelliferyl- 0,5 glycin- ronidase acetat Ø-D-glucuronid puffer

pH 5,6, 0,1 M pH 8,8, 1 mM

20

Alle substrater leveredes af Koch Light. De opløstes i methoxyetha-nol og fortyndedes med passende puffer til de anførte si utkoncentrationer.

25 Tabel IV(b) - Substrater anvendt til peptideaseanalyser

Substrat Leverandør DL-alanin-/J-naphthylamidhydrochlorid Sigma L-arginin-^-naphthylamidhydrochlorid (arg-NAP) Sigma 30 Ν-γ-L-glutamyl-Ø-naphthylamid Sigma

Glycyl-j8-naphthylamidhydrochlorid Koch Light L-4-hydroxyprolyl-/f-naphthylamid (OH-pro-NAP) Sigma L-leucyl-j8-naphthylamidhydrochlorid (leu-NAP) Sigma L-leucyl -4-methoxy-j8-naphthyl amidhydrochlorid 35 (leu-4-m-NAP) Sigma L-lysyl-^-naphthylamidcarbonat Koch Light L-prolyl-^-naphthylamidhydrochlorid (pro-NAP) Sigma L-pyrrolidonyl-j8-naphthylamid (pyr-NAP) Sigma

DK 160323B

19

Alle substrater opløstes i dimethyl sulfoxid og fortyndedes til en substratsiutkoncentration på 0,1 mM med 0,1 M Tris-phosphatpuffer, pH

8.0, indeholdende koboltonitrat (2 μΜ). Det reagens, der anvendtes i den 5 kontinuerte gennemstrømningsmanifold var 0,1 M Tris-phosphat-puffer, pH

8.0.

Analysatoren til adskilt analyse, "Kem-O-Mat", (Coulter Electronics) anvendtes til gennemførelse af de i tabel V anførte tests. Bakteriesuspensionerne anbragtes i prøvebægrene, puffere tilsattes med 10 fortyndingssprøjten, substrater og reagenser (til fremkaldelse af reaktionsslutprodukternes farve) tilsattes med reagenssprøjten. For at forøge prøvekapaciteten og forlænge inkubationsperioderne, inkuberedes ku-vetter indeholdende bakteriesuspensioner, puffer og substrat uden for "Kem-0-Mat". Kuvetteskifteren anvendtes til samtidig indsætning af alle 15 32 kuvetter og til fjernelse af dem. Til gennemførelse af hver test anvendtes to programpatroner. Programpatron 1 anvendtes til fordeling af bakteriesuspensioner, puffer, cofaktorer og substrat til hver kuvette og til aflæsning af begyndelsesabsorbansen for hver kuvette. Kuvetterne fjernedes så og anbragtes i en inkubator ved 40°C. Fortyndingsmiddel- og 20 reagenssprøjter og sonder skylledes og fyldtes med reagenserne til den næste enzymtest. Efter inkubation sattes kuvetterne til hver enzymtest tilbage i analysatoren. Programpatron 2 anvendtes til tilsætning af det andet reagens og til aflæsning af slutabsorbansen. Detaljerne vedrørende reagenssammensætningen er anført i tabel V. Til alle prøver sattes 350 25 μΐ fortyndingsmiddel og 70 μΐ reagens 1 til hver kuvette. Bakteriesuspensioner fordeltes i 50 μΐ portioner til DNAase-testen og i 25 μΐ portioner til alle andre tests. De minimale inkubationsperioder var for tryptophanase og DNAase 2 timer, for VP og PNPA 1½ time og 1 time for de resterende tests. Ved inkubationsperiodens afslutning sattes reagens 2 30 til de kuvetter, der indeholdt substrat og bakteriesuspension i 50 μΐ portioner til VP, PNPA, PNPP, PNPP+C+L og PNP6+C+L testene og i 350 μΐ portioner til INDOLE-testen. Slutabsorbansen aflæstes 2 minutter efter tilsætning af det andet reagens undtagen ved VP og INDOLE-testene, hvor aflæsningen skete efter 20 minutter. Absorbansmålinger fra de tre for-35 skellige analytiske systemer indfødtes i en computer til beregning af en enzymaktivitet og specifik enzymaktivitet for hver organismesuspension ved hver enzymtest.

i

DK 160323 B

O £1) 0) lo xj ~a c c i— α> cu 0 T3 Ό -C r— r—

+j O O

-C -C -£I

Q. CU CU

co to ~o c c c 1 ·ι— -i—

a I I

Ό C T3 C

0) O -r-Ο

Ό X +-> X +J

C O -i- O -r- CU S- S- S- S- •σ ό h "O t— r- >» = >> = O _C I— i— -c s di \ i i £ σ> \ ω 3 o cn i i soen "O -I— I I ·!— £= c z oo i c o: co

•i— O O *· I i O O

CM E CO O I I E to O

z ε z i < ε z CO O n) o I I tC r.

c <0 Z = I Z = CU Z Z O I I z o O) CO O I I CO o CO Z O) CO 1—II i cn CO —< O) ». #. i I I Λ r* i

0C CM i—c O X r—< O X

<U i I

CO O i— I

fli S— I >) r“ i— +> 'i- i ε >> +> >> *i- i O <0 c co

X C C S- +j CU -C

O I -I- Ό 3 -C Q.

-Q Q.C C >5 -—- i— Ό CL (0 S- —' -I- c0 .C Z O) i- o o

CO I C r— "O O I r— S- -C

0 <50.10 CO *i- CQ —1 -r- +J O.

^ ’—1 O li— Ir— —' I C -r- E

3 O _I CO —It- >- (O C 3 2(0 Q «—x Ε Ό O i i- £ C Z i— ZcO-i-ZS- Q.S.

^ CU E Z >> ε O S- ε +J +-> O) EC S-O*r-Zc0 co «o· cu lo +-> r— m c ec CU *· O -C »> *r- _C ·> I i—

0£ O i—c Q. CO C O CO "d" LO "O

— i— r— +J O I I II I \ ~ CD CO CO 4-) -P +-> CU -p cu cn i--o>z eo co co-σζιβ-σ

* CU C 3 -C -C -C C =4 +-> C CO

1— Μ- (B S- O) Q. O. O. -I- CU ΤΟ) 4- XJ >, O CO CO CO CM CJ CM

"O 3 r— CL O O O CO

o CL O ε - .c © .c o -CO r- Ε CO | -P -E 3 r— Q_ ^ Q- ^ Q- ^ -P 3 ^ i— o ε o æ t \ ε oo ε co co <o i- m o CM CO fl o L tt 3 3 CO J- S- co

D) CU C +-> -r- Z ·ι- Z i- Z -P -P Z Z

C O -i- ro i—i i— Q. i— Q. S-O.-I-C0Q.

•i-c0Ei— CO C0 I— C C CU

"O - C —_ -X ~ .X ~ - O -"Ο

C Zinz-I-O) S- S- Z S- -P Z S- C

>5 ~ -p z cu z cu cu i— ω ω P LO «4 LO CO LO 4_ <+_ X 4_ o CO <4- T3 S- O i—i Φ CM »—i 4— r—i 4_ O 4- .Ω © 4- i—

O - Z •'i- ·· ^ 3 «>3 3 O » 3 O

U- O O. O CJ «3- O Ol O O. O O- -X O O. -3

S- —s C

CU —' C C -ι-

Ε Q- -i- O. i— CU

1 >> > C Z -r- CO I

C N --- C0Q.CC0O—«

•i- C i— ·—· CO "O S- -X CD CU

O QJ ·—' CO O··- -P <C CO

+-> C i— CU S- +-> τ-4-ZCO

CUCUO >, CO -P O. C i- O- -P

CJTO-r- C c0 i- CU I U — CO

CO C P (U >) CQ. Q. CU -C

\ 0) JC -C r— I I O. CU CL

I— 5-C0 CL ε O. -X 1— CO CO CO

>> CU CU 03 I -i- X COO

pus- s- ·>- i— 4- *—- ε C "O -C —- Φ CU 3 P C >j -i- <C «0 -i- -r- Q. Q- > U TD O- 1-0 C O P r— P Q.

O. CO O I C £ CO O) Z 3-r- Q. S- Z

ί- -I- S- > I ε r— Q.Q.I— CCU3CL.

CL Q CL Q. CO <C co ^· CD CO O. CO '—

O LO O

LO i—i i—i CM

DK 160323 B

•to

CL

O) s- o 0> c C Φ o O -O 2 +» *r 5 ·- T 2 2_ d) S- 1 -J- -3 o 1— <u i— ® , c Ξ C = TO S ^ 1 X- •r C C· *“ O* (.

Q) T- ·*— >> 73 -o O o J= h- ® r- Ό r— 4J OO _ XI -r-I O O) - c 0 o x o g e <M £ £ £ 2 £ 2 5 - ί v T3 +J 1 "O 1 pj

-C Σ! r— >> S ^ 0)Ο->,> O

§030? ε 00 d5 gi ω ' ? •r-VO 3 O 0 ^ o c 'ro -1- n o« o 0 O CO» > r— i— I ^ ~ iω 0 i * 0 > £ § j ϋ g «»« B- * g =~ >1^! w aisrtuo ΐωο ^ ® ! "2

σ> too too .. c° c ,JE

(οσ>ι—Γΐ en i '—1 = ε α> «·. ο ι ·> 0 1 oO'-E1 =

Qi f-i X --1 -C X fv.r-it0 ^ rt ί ο το ^ 1 1 -r- r- r— 00

_,>,+j >1 ο σ IT

'Tens c c m"0 x.

-+^ cu .c curt -25 ΠΞ

«».eo. -e S- 0. « E

η Έ. μ a. >, ο > +-3 ΟΟ ο ο. +-3 , ^ S- c_ _c ί-ο 0.+-3 * σ +j ο. +J+J >5 0 , - -. c *r· O i· i* s= rt +J0) > c a. s- σ. « —ir- 0 r— I rt I?1 Σ +° 71 ®rtic £ a E £ ^ m .p. I o> ^7* ^ a; m το 00¾. cm to t_ r-. * D: r- , 2

Or- 0 \ ‘ ±1

ο V I O r— O) S- £ P

4Ι3Φ0 rtdjooi m «►- a* _ ?* £2 t- rt to r-- -E to - ^ *ίο ^ 21 b i Γ- φ2τοο w -r ό o r-. 10 c a- ω x: £ >> +3 φ u ‘r- ~ O -r-Or-CO « V, " C -f= Ξ

n rt „ Ε Ο Γ— JO r ε r \ -J r > .- I- fl)l- *r- +3 *TT

"O £ VO -r- X« Q. Lf) -i— O O) 1— Ο "X; ® ® ® 2 3 - i. « ni E - s- TOO+JiJ=''CT)r-> x: __i = -i- ιλ +j ε 3ΐ^+^εοο·>-ίθΦ ιφίεσι— oj cm vi 5- ©>,»·>- Q)>> ? f gft.8NJia.8 r 7

C ZEC-^OIiTcr^OC - 2 I Ο -TOEE^3 O

>S (1)<ϋ fO 0)<D aJOl— 2* +? (O l· ό rzco^-TO *'Z:-P\cur^er»r-EX;·- = ti o i J- ,_ 0<4-i— I— O-CnTOO O O O 00 1-- -ΙΟ r 3 o \ cn r 3 O \ cn Φ J· 5 2* n -n L< w 5i £ o G- 5= woo D-x: cno q-lot-o o.IX>to—^ γ- ο.

o (/1 σι c •r— · φ to a)

oo C CT

® ® a> 2“ « 1 5 I 1 £ 3 t? I? I- I ”1 O O OO O-UJ-r- 5 5 x=+ rt + o -j i- QUQ.Q- i— ό C? 'Zr > Q- rt Ο- Ω- Ο X ^ s_ 3 0- I Q- ,s— ’—« 0J <—1 ol ¢7)--- ca — I— '—' 1=1 * Ο ΙΛ O Ld

in S ^ CM CM

22

DK 160323 B

Analyse af resultater 304 kulturer inden for 35 arter testedes både med "Kem-O-Mat" og kontinuerte gennemstrømningssystemer ved ialt 26 tests og en proteinanalyse. 31 stammer blev udelukket fra beregningerne p.g.a. manglende vær-5 dier, blandede kulturer og tvivlsom identitet ved konventionel prøvning.

De resterende 273 kulturer blev opdelt i et kendt sæt (øvelsessæt) omfattende mellem 210 og 221 kulturer hovedsagelig af kultursamlingsstammer og et ukendt sæt (testsæt) af 52-73 kulturer, hovedsagelig stammer, som fornylig var isoleret fra dyrkede urinprøver, og de testedes dagen 10 efter modtagelse af urinprøven.

Til identifikation af såvel øvelses- som testsæt anvendtes diskri-minantfunktionsanalyse (DFA) under anvendelse af SPSS software. De 35 arter opdel tes enten i 17 slægter eller underopdeltes inden for hvert slægt i arter eller grupper af arter som vist i tabel VI.

15

Tabel VI

Opdeling og kodning af taksionomlske bakteriegrupper ved diskriminant-funktionanalyse (DFA)

20 Kode anvendt ved DFA

Nummer på grupper

Taksionomisk bakteriebetegnelse 17 22A 22B 25A 25B 35

Escherichia 1 1 1,2 1,2 1,2 1

Klebsiella pneumoniae sensu lato 2 2 3 3 3 2 25 Klebsiella rhinoschleromatis 223443

Klebsiella oxytocum 223334

Proteus mirabilis 334555

Proteus morganii 334666

Proteus rettgeri 30 0 0 07 30 Proteus vulgaris 33 4 7 7 8

Pseudomonas aeruginosa 445889

Pseudomonas cepacia 45 6 9 9 10

Pseudomonas fluorescens 46 7 8 8 11

Staphylococcus epidermedis 578 11 11 12 35 Staphylococcus aureus 57 8 10 10 13

Staphylococcus saprophyticus 57 8 11 11 14

Taksionomisk bakteriebetegnelse 17 22A 22B 25A 25B 35

Streptococcus 68 9 12 12 15

DK 160323 B

23

Citrobacter freundii 7 9 10 13 13 16

Citrobacter koseri 7 10 11 14 14 17

Providencia alkalifaciens 8 11 12 15 15 18

Providencia stuartii 8 11 12 15 15 19 5 Serratia marcescens 9 12 13 16 16 20

Serratia rubidaea 9 12 13 16 16 21

Serratia liquefaciens 9 12 0 16 0 22

Acinetobacter calcoaceticus va.

anitratus 10 13 14 17 17 23 10 Acinetobacter calcoaceticus va.

Iwoffii 10 13 14 17 17 24

Alcaligenes faecal is 11 14 15 18 18 25

Alcaligenes bronchisepticus 11 15 16 19 19 26

Flavobacterium meningosepticum 12 16 17 20 20 27 15 Enterobacter aerogenes 13 17 18 21 21 28

Enterobacter cloacea 13 18 19 22 22 29

Enterobacter agglomerans 13 17 18 21 21 30

Hafnia alvei 14 19 20 23 23 31

Salmonella 15 20 0 0 0 32 20 Edwardsiella tarda 16 21 21 24 24 33

Aeromonas hydrophila 17 22 22 25 25 34

Aeromonas formicans 17 22 22 25 25 35

Hver gruppering underkastedes DFA under anvendelse af alle 26 tests 25 (variable) og et antal begrænsede sæt af variable for at bestemme den bedste matematiske behandling af datamaterialet.

De procentuelle overensstemmelser med tidligere identifikation opnået med øvelses- og testsættene i de forskellige kombinationer er vist i tabel VII, hvor alle 26 variable er anvendt.

30 35 24

DK 160323 B

Tabel VII

Virkning af taksionoroisk gruppering ved DFA på identifikationsformåen ved anvendelse af alle 26 variable 5 Øvelsessæt Testsæt

Nr. på Antal Overens- Antal Overens- grupper stammer stemmel se, % stammer stemmel se, % 17 215 74,5 64 45,2 10 22A 215 78,9 64 45,9 22B 215 80,9 68 47,2 25A 221 81,4 52 50,0 25B 215 82,3 58 48,3 35 215 70,3 64 56,9 15

Den højeste overensstemmelsesprocent opnåedes i øvelsessættet med gruppering 25B og i testsættet med gruppering 35. Virkningen på overensstemmelsesprocenten ved udeladelse af udvalgte variable fra DFA er vist i tabel VIII og IX under anvendelse af grupperingerne 22B og 25B. Med 20 "variable" menes enzymtest (a) til (z).

Tabel VIII

Virkning af udeladelse af udvalgte variable ved DFA på identifi kations-formåen ved anvendelse af gruppering 22B 25 Antal Overens- Variable udeladt ud over dem, der er udeladt variable stemmel se % i den foregående linie 26 80,9

25 81,4 PNAG

30 24 80,5 VP

23 75,8 INDOLE

22 76,3 PNAA

21 74,4 giutamatdecarboxylase

20 73,0 PNPA

35 15 67,4 arg-NAP, leu-NAP, pro-NAP, Ø-glucuro- nidase, DNAase 10 51,2 0H-pro-NAP, leu-4-m-NAP, pyr-NAP, α-glucosidase, j8-glucosidase

DK 160323 B

25

Tabel IX(a)

Virkning af udeladelse af udvalgte variable ved DFA på identifikations-formåen ved anvendelse af gruppering 25B

5 Antal variable 26 25 24 23 23

Antal Bakteriestammer slægt % overensstemmelse 10 23 Escherichia 95,6 91,3 91,3 91,3 91,3 24 Klebsiella 87,5 87,5 87,5 87,5 83,3 26 Proteus 69,2 65,4 65,4 65,4 65,4 17 Pseudomonas 94,1 94,1 94,1 94,1 94,1 19 Staphylococcus 84,2 84,2 78,9 78,9 78,9 15 7 Streptococcus 85,7 85,7 85,7 85,7 85,7 13 Citrobacter 84,6 84,6 84,6 84,6 84,6 17 Providencia 94,2 94,2 94,2 82,3 94,2 21 Serratia 71,4 71,4 71,4 66,6 61,9 10 Acinetobacter 70,0 80,9 70,0 70,0 60,0 20 7 Alcaligenes 100 100 100 100 100 2 Flavobacterium 100 100 100 100 100 22 Enterobacter 68,2 68,2 63,6 63,6 63,6 5 Hafnia 100 100 100 100 100 6 Edwardiella 100 100 100 100 100 25 9 Aeromonas 77,8 77,8 77,8 77,8 77,8 _ Alle arter 83,8 84,8 82,0 81,4 81,0

228 Udeladte tests ingen PNAG PNAG PNAG PNAG

VP VP a-glucosidase PNPA j9-xylosidase 30 35 26

DK 160323 B

Tabel IX(bl

Virkning af antal tests på % overensstemmelse med konventionel identifikation.

Antal variable 5 26 25 24 23 23

Procentuel overensstemmelse Antal slægter af hver kategori 90-100 77767 10 80 - 89,9 4 5 3 4 3 70 - 79,9 3 2 4 3 2 60 - 69,9 2 2 2 3 4 I begge tilfælde resulterer udeladelse af PNAG-prøven i en lille 15 forøgelse i den totale procentuelle overensstemmelse og i antallet af slægter, som viser >80% overensstemmelse. Det menes, at dette skyldtes forsøgsmæssige unøjagtigheder i resultaterne hidrørende fra PNAG-testen. Udeladelse af yderligere tests, enten ved computerudvælgelse eller ved inspektion, forårsager yderligere formindskelse af overensstemmelsespro-20 centen, hvilket er uacceptabelt.

De taksionomiske grupper, som viste sig vanskelige at adskille, er Proteus rettgeri, Acinetobacter anitratus og Enterobacter/Serratia arterne. Dette skyldes muligvis anvendelse af stammer, som i for lang tid har været opbevaret i kultur.

25 Nogle af disse stammer viste ikke "god identifikation" med de konventionelle "API 20" og "R/B" rørsæt, "API 20" er omtalt tidligere, og "R/B" rørsættet er et system udviklet til identifikation af medlemmer af Enterobacteriaceae familien, som markedsføres af Flow Laboratories, Inc.

For et antal stammer var resultaterne med det ene system ikke i over-30 ensstemmelse med resultaterne med det andet.

Det er derfor nødvendigt med flere stammer, fortrinsvis frisk isolerede stammer, for at løse problemerne med disse taksionomiske grupper.

De opnåede resultater viser imidlertid, at den fulde fremgangsmåde ifølge opfindelsen giver mere end 80% nøjagtighed i identifikationen 35 over et meget bredt spektrum af forskellige bakterier. Det menes, at denne nøjagtighed kan forøges, hvis enzymprofil information fra en stor og mere repræsentativ gruppe tidligere identificerede bakterier er tilgængelig for sammenligning.

Claims

1. Fremgangsmåde til anvendelse ved identifikation af bakterier, ved hvilken bakterier underkastes en kombination af tests til bestemme!-5 se af bakterieenzymer, KENDETEGNET ved, at der udføres tests til kvantitativ bestemmelse af hvert af følgende enzymer (a) - (z): (a) lipase (b) a-glucosidase 10 (c) Ø-glucosidase (d) ^-xylosidase (e) ^-glucuronidase (f) /J-galactosidase (g) hel-celle sur phosphatase 15 (h) sur phosphatase i nærværelse af midler, som bryder bakteri ecel1epermeabi1 i tetsbarri eren (i) DL-alanyl-^-naphthylaminspecifik peptidase (j) L-arginyl-/3-naphthylaminspecifik peptidase (k) N-y-L-glutamyl-/3-naphthylaminspecifik peptidase 20 (1) glycyl-/J-naphthylaminspecifik peptidase (m) L-4-hydroxyprolyl-jS-naphthylaminspecifik peptidase (n) L-leucyl-jS-naphthylaminspecifik peptidase (o) L-leucyl-4-methoxy-/i-naphthylaminspecifik peptidase (p) L-lysyl -y3-naphthyl aminspecifi k peptidase 25 (q) L-prolyl-jS-naphthylaminspecifik peptidase (r) L-pyrrolidonyl-Ø-naphthylaminspecifik peptidase (s) alanyl-p-nitroamilinspecifik peptidase (t) glutamyl-p-nitroanilinspecifik peptidase (u) diacetyl/acetoinproducerende enzymer 30 (v) p-nitrophenylalanin ammoniaklyase (w) tryptophanase (x) deoxyribonuklease (y) giutamatdecarboxylase (z) cytochromoxidase, og at testene omfatter inkubation af bakterieprøven med substrater for enzymerne i et tidsrum, der undtagen, hvad tryptophanase og deoxyribonuklease angår, er passende for bestemmelse af konstitutive enzymer, og at 35 DK 160323 B testene med samme undtagelser ikke afhænger af vækst af bakterierne under testen.

2. Fremgangsmåde til brug ved hurtig differentiering af bakterier 5 fra grupperne Escherichia, Klebsiella spp., Proteus spp. og Pseudomonas spp., ved hvilken en prøve omfattende bakterier fra en af disse grupper underkastes en kombination af tests til bestemmelse af bakterieenzymer KENDETEGNET ved, at der udføres tests til kvantitativ bestemmelse af hvert af følgende enzymer: sur phosphatase i nærvær af et middel, der 10 bryder bakteriecellepermeabilitetsbarrieren, /J-galactosidase, glutamat-decarboxylase, phenylalanindeaminase, cytochromoxidase, di acetyl/aceto-inproducerende enzymer og urease, at testene omfatter inkubation af bakterieprøven med substrater for enzymerne i et tidsrum, der er passende for bestemmelse af konstitutive enzymer, og at testene ikke afhænger af 15 vækst af bakterierne under testen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at inkubationsperioden er ca. 2 timer bortset fra tryptophanase- og deoxyribonucleasete-stene (w) og (x). 20

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at inkubationsperioden er fra ca. 10 minutter op til ca. 2 timer.

5 KENDETEGNET ved, at der til identifikation af bakterieprøven anvendes en enkelt procedure, hvor kun den anførte kombination af tests anvendes.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 3, KENDETEGNET ved, at trypto-25 phanase- og deoxyribonucleasetestene (w) og (x) udføres med en inkubationsperiode på 2-2,5 timer.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, KENDETEGNET ved, at bakteriekulturerne fremstilles ud fra kliniske 30 prøver og kolonier af bakterier, som skal identificeres, udvindes fra kulturerne efter en tilstrækkelig vækstperiode og bringes på en passende form for bestemmelse ved proceduren ifølge det foregående krav.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, KENDE-35 TEGNET ved, at den udføres på en prøve hidrørende fra en enkelt bakteriekoloni frembragt ved forkultur af en klinisk prøve.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, DK 160323 B KENDETEGNET ved, at inkubationen under testene gennemføres ved en temperatur på ca. 40°C.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav,

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, KENDETEGNET ved, at kontinuert gennemstrømningsanalyseteknik an- 10 vendes.

11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, KENDETEGNET ved, at den udføres under anvendelse af et apparat omfattende et antal rum, som hver for sig indeholder specifikke enzymsubstrater og 15 at prøve sættes til hvert rum og enzymerne bestemmmes kvantitativt ved måling af produkterne i rummene om nødvendigt under anvendelse af andre reagenser.

12. Sæt omfattende reagenser til brug ved en fremgangsmåde ifølge 20 krav 1 eller 2, KENDETEGNET ved, at det omfatter separate specifikke substrater for hvert af de i krav 1 eller 2 definerede enzymer.

13. Sæt ifølge krav 12, KENDETEGNET ved, at enzymsubstraterne frembringer produkter, der kan måles ved fluorimetri eller colorimetri. 25

14. Sæt ifølge krav 13, KENDETEGNET ved, at det omfatter et eller flere farvefremkaldende eller fluorescensfremkaldende reagenser.

15. Sæt ifølge krav 12, 13 eller 14, KENDETEGNET ved, at det omfat-30 ter passende puffere og andre reagenser.

16. Sæt ifølge et hvilket som helst af kravene 12-15, KENDETEGNET ved, at det omfatter et antal fordybninger eller rum, som adskilt indeholder specifikke enzymsubstrater for hver af enzymtestene i fremgangs- 35 måden, og at det er tilpasset automatiseret spektrometrisk scanningteknik.