JPH03206958A - アルツハイマー症の診断における非神経組織の検査法 - Google Patents
アルツハイマー症の診断における非神経組織の検査法Info
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野１
本発明は一般に、アルツハイマー症の診断および監視（
モニタリング）に関するものである。
モニタリング）に関するものである。
［発明か解決すへき課題１
アルッハイマー症（ＡＤ）は高齢者における進行性の痴
呆症の最も一般的な原因であり、典型的な症状として記
憶の減退、見当識障害、および総合的な知性の後退を含
む神経学的荒廃か徐々に進行する。これはまた、運動不
能、失禁、および体重減少等の肉体的な衰退の症状をも
伴い、しばしば致死的となる。世界中の様々な種族や人
種に観察されており、現在および将来の公衆衛生および
経済に主要な問題を提起している。この疾患による影響
は米国のみても、２００〜３００万人に及ふと見積も与
れている。
呆症の最も一般的な原因であり、典型的な症状として記
憶の減退、見当識障害、および総合的な知性の後退を含
む神経学的荒廃か徐々に進行する。これはまた、運動不
能、失禁、および体重減少等の肉体的な衰退の症状をも
伴い、しばしば致死的となる。世界中の様々な種族や人
種に観察されており、現在および将来の公衆衛生および
経済に主要な問題を提起している。この疾患による影響
は米国のみても、２００〜３００万人に及ふと見積も与
れている。
この問題には、患者の生存期間中に該疾患を明確に診断
することか実際上困難であることか絡んでいる。通常、
アルツハイマー症の明確な診断は、剖検によって脳の状
態をみることて行われる。アルツハイマー症の診断の目
安は脳の特定領域における線維化病巣の形態をとる構造
的変化である。
することか実際上困難であることか絡んでいる。通常、
アルツハイマー症の明確な診断は、剖検によって脳の状
態をみることて行われる。アルツハイマー症の診断の目
安は脳の特定領域における線維化病巣の形態をとる構造
的変化である。
これらの脳病巣は（１）老年斑、（２）アミ口イト血管
障害（小血管へのアミロイトの枕着）、（３）神経線維
の絡まり、（４）変化した神経細胞線維（神経炎性形成
異常）で示される。
障害（小血管へのアミロイトの枕着）、（３）神経線維
の絡まり、（４）変化した神経細胞線維（神経炎性形成
異常）で示される。
［発明の技術分野〕
実際には、かなりの高齢者の脳には、アルツハイマー症
（ＡＤ）に特徴的な小さい線維性脳疾患か幾らかは存在
しており、それは神経内（神経線維の絡まり）、脳細胞
外沈着（老年斑またはアミロイドプラーク）、および髄
膜および脳血管（アミロイド血管障害）沈着として存在
する。近年の化学的、免疫化学的、および分子生物学的
な分析によってβ−アミロイドタンパク質（β−ＡＰ）
またはＡ４と命名された４．２キロダルトン（ｋＤａ）
のタンパク質（約３８〜約４３アミノ酸）が、ＡＤまた
はトリソミー２ｋ（タウン症候群）患者、並びに正常な
加今による高齢者の血管および脳のアミロイトフィラメ
ントのサブユニ，トであることが示された。グレンナー
およびウォン（Ｇｌｅｎｎｅｒ ＆ Ｗｏｎｇ， Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． Ｂ ｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍｕｎ． １ ２ ０ ：８８５−８９０（１
９８４））、グレンナーおよびウオン（Ｇ ｌｅｎｎｅ
ｒ ＆ Ｗｏｎｇ， Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． Ｂ ｉｏ
ｐｈｙｓＲｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １ ２２ ： １
１ ３ １−１ １ ３５（１９８４））、マスター
スら（Ｍａｓｔｅｒｓ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ： ４２４５−４２４
９（１９８５））、セルコーら（ Ｓ ｅｌｋｏｅ，
Ｊ ． Ｎ ｅｕｒｏｃｈｅｍ４６： １８２０−１
８３４（１９８６））、カンら（Ｋａｎｇ， Ｎａｔ
ｕｒｅ ３ ２ ５ ： ７３３−７３ ６（１ ９８
７））およびコリアら（Ｃｏｒｉａ， Ａｍ．Ｊ．Ｐ
ａｔｈｏｌ．１２９・４２２−４２８（１ ９８８））
。これらの分析研究の結果、β一ＡＰは、様々な動物の
多くの組織で正常に産生される大きい前駆体タンパク質
の小フラグメントであることも示された。ヒトにおいて
、β−ＡＰ前駆体タンパク質をコートする遺伝子はヒト
染色体（クロモソーム）２１の長い腕（アーム）に位置
する。
（ＡＤ）に特徴的な小さい線維性脳疾患か幾らかは存在
しており、それは神経内（神経線維の絡まり）、脳細胞
外沈着（老年斑またはアミロイドプラーク）、および髄
膜および脳血管（アミロイド血管障害）沈着として存在
する。近年の化学的、免疫化学的、および分子生物学的
な分析によってβ−アミロイドタンパク質（β−ＡＰ）
またはＡ４と命名された４．２キロダルトン（ｋＤａ）
のタンパク質（約３８〜約４３アミノ酸）が、ＡＤまた
はトリソミー２ｋ（タウン症候群）患者、並びに正常な
加今による高齢者の血管および脳のアミロイトフィラメ
ントのサブユニ，トであることが示された。グレンナー
およびウォン（Ｇｌｅｎｎｅｒ ＆ Ｗｏｎｇ， Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ． Ｂ ｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃ
ｏｍｍｕｎ． １ ２ ０ ：８８５−８９０（１
９８４））、グレンナーおよびウオン（Ｇ ｌｅｎｎｅ
ｒ ＆ Ｗｏｎｇ， Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． Ｂ ｉｏ
ｐｈｙｓＲｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １ ２２ ： １
１ ３ １−１ １ ３５（１９８４））、マスター
スら（Ｍａｓｔｅｒｓ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２ ： ４２４５−４２４
９（１９８５））、セルコーら（ Ｓ ｅｌｋｏｅ，
Ｊ ． Ｎ ｅｕｒｏｃｈｅｍ４６： １８２０−１
８３４（１９８６））、カンら（Ｋａｎｇ， Ｎａｔ
ｕｒｅ ３ ２ ５ ： ７３３−７３ ６（１ ９８
７））およびコリアら（Ｃｏｒｉａ， Ａｍ．Ｊ．Ｐ
ａｔｈｏｌ．１２９・４２２−４２８（１ ９８８））
。これらの分析研究の結果、β一ＡＰは、様々な動物の
多くの組織で正常に産生される大きい前駆体タンパク質
の小フラグメントであることも示された。ヒトにおいて
、β−ＡＰ前駆体タンパク質をコートする遺伝子はヒト
染色体（クロモソーム）２１の長い腕（アーム）に位置
する。
最初のＡＤのβ〜ＡＰの精製および部分アミノ酸配列の
決定は１９８４年にグレンナーおよびウォンによって行
われた［グレンナーおよびウォン（Ｇｔｅｎｎｅｒ ＆
Ｗｏｎｇ． Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． Ｂ ｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒ ｅｓ． Ｃｏｎｍｕｎ．１２０： ８８５−
８９０（１ ９ｓ４））：。彼らは、長期にわたって確
立された絹織からのアミ口イト精製法の改良広を用いて
ＡＤで死亡した患者の髄膜血管からβ一ＡＰを単離した
。彼らは最初の２８個のアミノ酸配列の決定を行ったか
、それは後に３８−４３アミノ酸のタンパク質であるこ
とか示された。彼らか用いた単離法および配列決定のテ
ータは米国特許第４， ６ ６ ６， ８ ２ ９号（
グレンナーら、１９８７年５月１９日発行）に記載され
ている。彼らは、１９８５年に自身が決定した２８アミ
ノ酸配列の最初の１０アミノ酸を含む合成ペプチトを製
造した。次いで、これらの合成ベフ゜チトを、ウサキま
たはマウスにそれそれ〆主射し、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を生産させた。これらの抗体は、Ａ
Ｄおよび正常な加合脳における老年性（アミロイト）斑
点および血管性アミロイＦｉ着の両者を認識したく即ち
、それらと反応した）。
決定は１９８４年にグレンナーおよびウォンによって行
われた［グレンナーおよびウォン（Ｇｔｅｎｎｅｒ ＆
Ｗｏｎｇ． Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． Ｂ ｉｏｐｈｙ
ｓ． Ｒ ｅｓ． Ｃｏｎｍｕｎ．１２０： ８８５−
８９０（１ ９ｓ４））：。彼らは、長期にわたって確
立された絹織からのアミ口イト精製法の改良広を用いて
ＡＤで死亡した患者の髄膜血管からβ一ＡＰを単離した
。彼らは最初の２８個のアミノ酸配列の決定を行ったか
、それは後に３８−４３アミノ酸のタンパク質であるこ
とか示された。彼らか用いた単離法および配列決定のテ
ータは米国特許第４， ６ ６ ６， ８ ２ ９号（
グレンナーら、１９８７年５月１９日発行）に記載され
ている。彼らは、１９８５年に自身が決定した２８アミ
ノ酸配列の最初の１０アミノ酸を含む合成ペプチトを製
造した。次いで、これらの合成ベフ゜チトを、ウサキま
たはマウスにそれそれ〆主射し、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体を生産させた。これらの抗体は、Ａ
Ｄおよび正常な加合脳における老年性（アミロイト）斑
点および血管性アミロイＦｉ着の両者を認識したく即ち
、それらと反応した）。
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
， Ｉ ｎｃ．，によるＰＣＴ出願（国際公開番号ＷＯ
／０３９５１）はβアミロイド前駆体タンパク質をコー
トする、ある種のＤ Ｎ Ａ配列、並ひにそれを脳脊髄
液または血清に用いてアルッハイマー症を診断すること
を目的とするものである。アルツハイマー症が初めて疾
患と認められて以来、８０年以上の間、ＡＤの病理学的
病巣は脳にしか見い出されていない。患者の脳組織の生
検検査は特に危険であるために、ごくまれにしか行われ
ないことから、患者の生存中に簡単かつ安全に診断てき
るよう、有効で危険の少ない方法か求められている。
， Ｉ ｎｃ．，によるＰＣＴ出願（国際公開番号ＷＯ
／０３９５１）はβアミロイド前駆体タンパク質をコー
トする、ある種のＤ Ｎ Ａ配列、並ひにそれを脳脊髄
液または血清に用いてアルッハイマー症を診断すること
を目的とするものである。アルツハイマー症が初めて疾
患と認められて以来、８０年以上の間、ＡＤの病理学的
病巣は脳にしか見い出されていない。患者の脳組織の生
検検査は特に危険であるために、ごくまれにしか行われ
ないことから、患者の生存中に簡単かつ安全に診断てき
るよう、有効で危険の少ない方法か求められている。
［発明の要約］
本発明の第ｌの目的は、アルツハイマー症の診断〆去を
開示することにある。この方ｌ去は、非神経組織の生検
標本を採取し、該標本の少なくとも一部と、β一ＡＰ、
β−ＡＰを含有するβ−ＡＰ前駆体フラグメント、また
は約８個またはそれ以上のアミノ酸からなるβ−ＡＰペ
ブチトフラグメントを認識し得る少なくともｌ個の抗体
と接触させ、標本と抗体との反応程度を監視することか
らなる。
開示することにある。この方ｌ去は、非神経組織の生検
標本を採取し、該標本の少なくとも一部と、β一ＡＰ、
β−ＡＰを含有するβ−ＡＰ前駆体フラグメント、また
は約８個またはそれ以上のアミノ酸からなるβ−ＡＰペ
ブチトフラグメントを認識し得る少なくともｌ個の抗体
と接触させ、標本と抗体との反応程度を監視することか
らなる。
本発明の他の目的は、アルツハイマー症診断用キットて
あって、上記のｌまたはそれ以上の抗体、および抗体と
非神経組織標本との反応の程度および特異性を検出する
ための手段とを有するキットを開示することにある。
あって、上記のｌまたはそれ以上の抗体、および抗体と
非神経組織標本との反応の程度および特異性を検出する
ための手段とを有するキットを開示することにある。
これらの、および他の本発明の目的、並ひにそれらに伴
う作用効果は以下の定義、詳細な説明、実施例および特
許請求の範囲を読めば最も良く理解することができるで
あろう。
う作用効果は以下の定義、詳細な説明、実施例および特
許請求の範囲を読めば最も良く理解することができるで
あろう。
［定義］
本明細書中、「アミロイド」という語句は直径約５０−
１００オングストロームのタンパク様フィラメントを指
し、これは、ある種の染料一結合特性を有し（コンコー
レノト分子と特定の配列順序で結きし、偏光かアミ口イ
トを通過すると緑の複屈折色か観察される。また、チオ
フラビンＳと結合しエビフ゜ルオレノセンスを外付けし
た顕微鏡で監察した時、緑色の蛍光を与える。）、組織
の細胞外空間に次第に蓄積される。その他、アミロイド
にはＸ線回折分析で確立されたように、多くのβプリー
ツシ一トタンパク質立体構造を有するという特徴かある
。アミロイドはこの節で定義するように、それらの存在
する組織やそれらか構成するタンパク質に関係なく、広
範な疾患に見られるタンパク様フィラメントの総称であ
る。上記の定義にかかわらず、本発明では、アルツハイ
マー症およびタウン症候群に特徴的なタイプのアミロイ
ドであって、そのサブユニットタンパク質が下記のβ一
ＡＰであるアミロイドを目的とするものである。
１００オングストロームのタンパク様フィラメントを指
し、これは、ある種の染料一結合特性を有し（コンコー
レノト分子と特定の配列順序で結きし、偏光かアミ口イ
トを通過すると緑の複屈折色か観察される。また、チオ
フラビンＳと結合しエビフ゜ルオレノセンスを外付けし
た顕微鏡で監察した時、緑色の蛍光を与える。）、組織
の細胞外空間に次第に蓄積される。その他、アミロイド
にはＸ線回折分析で確立されたように、多くのβプリー
ツシ一トタンパク質立体構造を有するという特徴かある
。アミロイドはこの節で定義するように、それらの存在
する組織やそれらか構成するタンパク質に関係なく、広
範な疾患に見られるタンパク様フィラメントの総称であ
る。上記の定義にかかわらず、本発明では、アルツハイ
マー症およびタウン症候群に特徴的なタイプのアミロイ
ドであって、そのサブユニットタンパク質が下記のβ一
ＡＰであるアミロイドを目的とするものである。
本明細書中、「β−ＡＰを含有するβ−アミロイド前駆
体タンパク質フラグメント（断片）」という語句は前駆
体タンパク質の一部であってβ−アミロイドタンパク質
よりも大きい、β−アミロイドタンパク質を念有するポ
リペプチトを指す。
体タンパク質フラグメント（断片）」という語句は前駆
体タンパク質の一部であってβ−アミロイドタンパク質
よりも大きい、β−アミロイドタンパク質を念有するポ
リペプチトを指す。
本明細許中、″β−アミロイト前駆体タンパク質」とい
う語句はヒトのクロモソーム（染色体）２１のロングア
ームに位置する遺（云子によって産生されるポリペプチ
トであって、そのβ−アミロイドタンパク質の第３カル
ポキンにβ−アミロイドタンパク質（β−ＡＰ）を含有
するポリペプチトを指す。現在、ヒト中に存在するとい
うことか分かつているβ−アミロイト前駆体タンパク質
形状の具体例として、カン：）ｒＫａｎｇ， Ｎａｔｕ
ｒｅ ３ ２ ５ ： ７３３−７３６（１ ９８７）
］か記載した６９５アミノ酸ポリペプチト、ポンテら［
Ｐ ｏｎｔｅ． Ｎ ａｔｕｒｅ３３ １ ： ５２
５−５２７（１ ９８８）］およびタンシら［Ｔａｎｚ
ｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３ ３ １ ： ５ ２ ８−
５ ３ ０（１９８８）］か記載した７５１アミノ酸ポ
リベプチト、およびキタグチら［Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ，
Ｎａｔｕｒｅ ３ ３ １５３０−５３２（１ ９
８８）］らが記載した７７０アミノ酸ポリペブチドがあ
る。
う語句はヒトのクロモソーム（染色体）２１のロングア
ームに位置する遺（云子によって産生されるポリペプチ
トであって、そのβ−アミロイドタンパク質の第３カル
ポキンにβ−アミロイドタンパク質（β−ＡＰ）を含有
するポリペプチトを指す。現在、ヒト中に存在するとい
うことか分かつているβ−アミロイト前駆体タンパク質
形状の具体例として、カン：）ｒＫａｎｇ， Ｎａｔｕ
ｒｅ ３ ２ ５ ： ７３３−７３６（１ ９８７）
］か記載した６９５アミノ酸ポリペプチト、ポンテら［
Ｐ ｏｎｔｅ． Ｎ ａｔｕｒｅ３３ １ ： ５２
５−５２７（１ ９８８）］およびタンシら［Ｔａｎｚ
ｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３ ３ １ ： ５ ２ ８−
５ ３ ０（１９８８）］か記載した７５１アミノ酸ポ
リベプチト、およびキタグチら［Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ，
Ｎａｔｕｒｅ ３ ３ １５３０−５３２（１ ９
８８）］らが記載した７７０アミノ酸ポリペブチドがあ
る。
本明細書中、「β−アミロイドタンパク質」（βＡＰ）
という語句はＡＤおよびタウン症患者の脳に存在し、老
年性（アミロイド）斑点の中心を構成し、小血管に皮着
する無晶形で非フィラメント状の、実質（組織）に沈着
するタンパク質を指す。
という語句はＡＤおよびタウン症患者の脳に存在し、老
年性（アミロイド）斑点の中心を構成し、小血管に皮着
する無晶形で非フィラメント状の、実質（組織）に沈着
するタンパク質を指す。
β一ＡＰはフィラメント状の重合体形をとることもある
（この形で、この物質はアミロイドの特性に関して述べ
たコンコーレ，ドおよびチオフラビンＳ染料との結合特
性を示す）。それはまた、組織中て非フィラメント状に
なることあり（“プレアミロイト′゜または“アモルフ
ァス”または“拡散”沈着）この形状では検出可能なコ
ンゴーレノドによる複屈折染色を起こさない。髄膜また
は髄膜血管から得られた形のタンパク質部分が米国特許
第４，６ ６ ６， ８ ２ ９号（グランナーら、１
９８７年５月ｌ９日発行）に記載されている。本発明に
おいて用いるβ−ＡＰはグランナーらの特許明細書に記
載の方法によって産生されるタンパク質と実質上ホモロ
ーガスな約３８−４３アミノ酸ペブチドであるか、本発
明にとってはＡＤ患者の大脳皮質から抽出するか、ある
いはＡＤ患者の皮膚（または他の非一神経組織）から抽
出することか好ましい。
（この形で、この物質はアミロイドの特性に関して述べ
たコンコーレ，ドおよびチオフラビンＳ染料との結合特
性を示す）。それはまた、組織中て非フィラメント状に
なることあり（“プレアミロイト′゜または“アモルフ
ァス”または“拡散”沈着）この形状では検出可能なコ
ンゴーレノドによる複屈折染色を起こさない。髄膜また
は髄膜血管から得られた形のタンパク質部分が米国特許
第４，６ ６ ６， ８ ２ ９号（グランナーら、１
９８７年５月ｌ９日発行）に記載されている。本発明に
おいて用いるβ−ＡＰはグランナーらの特許明細書に記
載の方法によって産生されるタンパク質と実質上ホモロ
ーガスな約３８−４３アミノ酸ペブチドであるか、本発
明にとってはＡＤ患者の大脳皮質から抽出するか、ある
いはＡＤ患者の皮膚（または他の非一神経組織）から抽
出することか好ましい。
たたし、本発明には全β一ＡＰ配列の全てまたは一部（
例えば約８またはそれ以上のアミノ酸）を有する合成ペ
ブチドをも含む免疫反応性物質の他の供給源も使用可能
である。とのような形状であれ、β−ＡＰはヒトクロモ
ソーム２１のロングアームにコートされているβ−アミ
口イト前駆体タンバク質と称する大きい糖タンパク質の
一部であって疎水性の３８−４３アミノ酸からなるフラ
グメントである。それはまた、ＳＤＳポリアクリルアミ
トケル電気庫動における相対的な移動度、並びに凝集し
てアミロイドの超構造おまひ着色性を有する重合体フィ
ラメントを与える前駆性によっても特性化される。その
４３アミノ酸配列は、ｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ２１ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａ
ｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ３１ １ １ｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇ
ｌｙ Ｖａｔ４１ １ １ｅ Ａｌａ Ｔｈｒ またはこれと実質上ナモローカスな配列である。
例えば約８またはそれ以上のアミノ酸）を有する合成ペ
ブチドをも含む免疫反応性物質の他の供給源も使用可能
である。とのような形状であれ、β−ＡＰはヒトクロモ
ソーム２１のロングアームにコートされているβ−アミ
口イト前駆体タンバク質と称する大きい糖タンパク質の
一部であって疎水性の３８−４３アミノ酸からなるフラ
グメントである。それはまた、ＳＤＳポリアクリルアミ
トケル電気庫動における相対的な移動度、並びに凝集し
てアミロイドの超構造おまひ着色性を有する重合体フィ
ラメントを与える前駆性によっても特性化される。その
４３アミノ酸配列は、ｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ２１ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａ
ｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ３１ １ １ｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇ
ｌｙ Ｖａｔ４１ １ １ｅ Ａｌａ Ｔｈｒ またはこれと実質上ナモローカスな配列である。
このものは本明細書で完全に引用しているセルコーら［
Ｓｅｌｋｏｅ， Ｊｏｕｎａｌ ｏ「Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ４６： １８２０−１８３４（１９８
６）］の方法（実施例ＩＡ参照）によって大脳皮質から
抽出するか、実施例ＩＢ記載の方法に従って皮膚から抽
出することかできる。
Ｓｅｌｋｏｅ， Ｊｏｕｎａｌ ｏ「Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ４６： １８２０−１８３４（１９８
６）］の方法（実施例ＩＡ参照）によって大脳皮質から
抽出するか、実施例ＩＢ記載の方法に従って皮膚から抽
出することかできる。
本明細書中、「約８個またはそれ以上のアミ／酸からな
るβ−ＡＰペプチドフラグメント」という語句はβ一Ａ
ＰまたはＡＤ患者の皮膚または他の非神経組織に存在す
る形のβ−ＡＰと反応性を有する抗体を産生じ得るβ−
ＡＰフラグメント（または実質上、それとホモローガス
なペプチド）を指す。
るβ−ＡＰペプチドフラグメント」という語句はβ一Ａ
ＰまたはＡＤ患者の皮膚または他の非神経組織に存在す
る形のβ−ＡＰと反応性を有する抗体を産生じ得るβ−
ＡＰフラグメント（または実質上、それとホモローガス
なペプチド）を指す。
ＡＤ診断のための皮膚生検標本または他の非神経組織標
本の調製に関して「簡単な固定化」という語句は｛票本
を、該標本中の分子を交差結合させるか、強力な分子間
または分子内桔合を形成させることにより安定化する試
薬（本明細書中、“固定化剤（フィキサティブ）”とい
う）で処理することをいう。この処理は標本中のタンパ
ク質の構造上の安定性と分解への抵抗性を確立するのに
十分な期間であって、標本中のβ−アミロイドー免疫反
応性抗原の分子形またはコンホメー／ヨンが著しく変化
する程、長期間には行わない。一般に、本発明の簡単な
固定化は１０％中性緩衝化ホルマリン、Ｂｏｕｉｎ溶液
（７０％（ｖ／ｖ）飽和ピクリン酸、１０％（ｖ／ｖ）
飽和ホルマリン、５％（ｖ／ｖ）飽和氷酢酸）の水濱液
、またはＰＬＰ固定化剤（過ヨウ素酸塩Ｊシン−バラホ
ルムアルデヒド：相対濃度０２％．１ ４％：２％（ｗ
／ｖ））等のアルデヒト含有固定化剤による処理を意味
する。処理時間は約１５分間から約６０分間であること
か好ましいが、固定化剤の性質によって、約１ｏ分間の
短時間から、約３時間の長時間に変化させることができ
る。
本の調製に関して「簡単な固定化」という語句は｛票本
を、該標本中の分子を交差結合させるか、強力な分子間
または分子内桔合を形成させることにより安定化する試
薬（本明細書中、“固定化剤（フィキサティブ）”とい
う）で処理することをいう。この処理は標本中のタンパ
ク質の構造上の安定性と分解への抵抗性を確立するのに
十分な期間であって、標本中のβ−アミロイドー免疫反
応性抗原の分子形またはコンホメー／ヨンが著しく変化
する程、長期間には行わない。一般に、本発明の簡単な
固定化は１０％中性緩衝化ホルマリン、Ｂｏｕｉｎ溶液
（７０％（ｖ／ｖ）飽和ピクリン酸、１０％（ｖ／ｖ）
飽和ホルマリン、５％（ｖ／ｖ）飽和氷酢酸）の水濱液
、またはＰＬＰ固定化剤（過ヨウ素酸塩Ｊシン−バラホ
ルムアルデヒド：相対濃度０２％．１ ４％：２％（ｗ
／ｖ））等のアルデヒト含有固定化剤による処理を意味
する。処理時間は約１５分間から約６０分間であること
か好ましいが、固定化剤の性質によって、約１ｏ分間の
短時間から、約３時間の長時間に変化させることができ
る。
しかしながら、従来の長期的な固定化（例えば数週間か
ら数カ月）によってもよい。
ら数カ月）によってもよい。
「腸」という語旬は小腸および大腸（結腸）および直腸
組織を包含する。
組織を包含する。
特許請求の範囲に記載の本発明の目的に従い、「皮膚生
検標本」という語句は皮膚および皮下組織の両者を包含
する。
検標本」という語句は皮膚および皮下組織の両者を包含
する。
［好ましい実施態様の説明コ
本発明は、ＡＤ患者の皮膚、皮下結合組織、および腸等
の非神経器官にβ−ＡＰか注着するという予想外の発見
によるものである。この発見は、ＡＤ患者の脳に必ず見
られるβ〜−アミロイドタンパク質の進行性の枕着か非
神経系組織、とりわけ皮膚および腸にも起きることを初
めて明らかにしたものである。従って、本発明は、通常
、非神経組織標本を検査し、β−ＡＰ（またはβ一ＡＰ
前駆体のβ−ＡＰ含有タンパク質フラグメント）の存在
および量を検出することによるアルッハイマー症（ＡＤ
）診断における検査方法を目的とするものである。本発
明のそれら組織のβ−ＡＰ検出および定量は、痴呆症患
者がＡＤであるとの臨床診断を確認する際に、また、病
状を追跡する場合に有用である。本発明は、例えば、脳
をも含めた組織へのβ−ＡＰｉ着を安定化し、減少し、
または阻害するための薬物による治療中の症状の監視に
適用できる。
の非神経器官にβ−ＡＰか注着するという予想外の発見
によるものである。この発見は、ＡＤ患者の脳に必ず見
られるβ〜−アミロイドタンパク質の進行性の枕着か非
神経系組織、とりわけ皮膚および腸にも起きることを初
めて明らかにしたものである。従って、本発明は、通常
、非神経組織標本を検査し、β−ＡＰ（またはβ一ＡＰ
前駆体のβ−ＡＰ含有タンパク質フラグメント）の存在
および量を検出することによるアルッハイマー症（ＡＤ
）診断における検査方法を目的とするものである。本発
明のそれら組織のβ−ＡＰ検出および定量は、痴呆症患
者がＡＤであるとの臨床診断を確認する際に、また、病
状を追跡する場合に有用である。本発明は、例えば、脳
をも含めた組織へのβ−ＡＰｉ着を安定化し、減少し、
または阻害するための薬物による治療中の症状の監視に
適用できる。
本発明によれば、様々なβ−アミロイドタンパク質（ま
たはβ−アミロイト前駆体タンパク質のβ一ＡＰ含有タ
ンパク質フラグメント）に対して惹起されたモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体を、皮膚、腸または
その池の非神経組織の生検標本を用いるアルッハイマー
症（ＡＤ）患者の診断のためのイムノアッセイに使用す
ることかできる。好ましい態様ではＡＤ大脳皮質から抽
出したβ一ＡＰ抽出物を免疫原とする抗体でこれら標本
を試験する。抽出はセルコーら［Ｓ ｅｌｋｏｅ，
Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
４ ６ ： １ ８ ２ ０ − １８３４（１９８６
）］およびセルコーおよびアブラハムの方法ＪＳｅｌｋ
ｏｅ ＆ Ａｂｒａｈａｍ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １ ３ ７ ： ３ ７−４ ４
（１ ９ ８ ６）］に従って行う。好ましい抽出方法
は後述の実施例ｒＡに記載されている。または、実施例
ＩＢに記載のごとく、β一ＡＰの検出に用いる抗体はア
ルツハイマー症患者の皮膚（または他の非神経組織）か
ら抽出されたβ−ＡＰ抗原により産生された抗体であっ
てよい。あるいは、ＡＤｕ膜血管から抽出したβ一ＡＰ
またはβ一ＡＰの全配列またはその一部を有する合戊ペ
プチトを免疫原として用いてもよいが、アノセイ感度は
通常低い（表Ｉ参照）。
たはβ−アミロイト前駆体タンパク質のβ一ＡＰ含有タ
ンパク質フラグメント）に対して惹起されたモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体を、皮膚、腸または
その池の非神経組織の生検標本を用いるアルッハイマー
症（ＡＤ）患者の診断のためのイムノアッセイに使用す
ることかできる。好ましい態様ではＡＤ大脳皮質から抽
出したβ一ＡＰ抽出物を免疫原とする抗体でこれら標本
を試験する。抽出はセルコーら［Ｓ ｅｌｋｏｅ，
Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
４ ６ ： １ ８ ２ ０ − １８３４（１９８６
）］およびセルコーおよびアブラハムの方法ＪＳｅｌｋ
ｏｅ ＆ Ａｂｒａｈａｍ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １ ３ ７ ： ３ ７−４ ４
（１ ９ ８ ６）］に従って行う。好ましい抽出方法
は後述の実施例ｒＡに記載されている。または、実施例
ＩＢに記載のごとく、β一ＡＰの検出に用いる抗体はア
ルツハイマー症患者の皮膚（または他の非神経組織）か
ら抽出されたβ−ＡＰ抗原により産生された抗体であっ
てよい。あるいは、ＡＤｕ膜血管から抽出したβ一ＡＰ
またはβ一ＡＰの全配列またはその一部を有する合戊ペ
プチトを免疫原として用いてもよいが、アノセイ感度は
通常低い（表Ｉ参照）。
皮膚、腸、または他の非神経組織標本の診断に用いる抗
体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれても
よく、今日では当該技術分野で周知となっている方法で
調製することができる。例えば、実施例ＩＡまたはＩＢ
の抽出物に対するポリクローナル抗体は、実施例ＩＣ記
載のごとくウサギ等の動物を免疫した後、抗体を精製す
ることで調製され、他方、該抽出物に対するモノクロー
ナル抗体は、実施例ＩＤ記載のごとく、コーラーおよび
マイルスタイン［Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６−４９５］の方法に
従ってマウス等の動物を免疫し、その牌臓から牌細胞ヲ
得、それをマウス骨髄腫細胞とハイブリサイズさせてハ
イフ゛リトーマを１尋、３亥ハイフ゛リトーマをスクリ
ーニングし、サブクローニングすることによって調製す
ることかできる。
体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれても
よく、今日では当該技術分野で周知となっている方法で
調製することができる。例えば、実施例ＩＡまたはＩＢ
の抽出物に対するポリクローナル抗体は、実施例ＩＣ記
載のごとくウサギ等の動物を免疫した後、抗体を精製す
ることで調製され、他方、該抽出物に対するモノクロー
ナル抗体は、実施例ＩＤ記載のごとく、コーラーおよび
マイルスタイン［Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６−４９５］の方法に
従ってマウス等の動物を免疫し、その牌臓から牌細胞ヲ
得、それをマウス骨髄腫細胞とハイブリサイズさせてハ
イフ゛リトーマを１尋、３亥ハイフ゛リトーマをスクリ
ーニングし、サブクローニングすることによって調製す
ることかできる。
非神経性β−ＡＰｉ着（今日ては、いわゆる脳における
プレアミ口イト沈着として知与れているものと同様に）
は古典的な、組織化学的アミロイト着色反応、即ちコン
コーレノトおよびチオフラビンＳとの反応において反応
性か弱いが、または全く反応しない：そのようなα着を
簡便かつ最も容易に採取することかできる皮膚か、ＡＤ
のβアミ口イト症部位であると考えられたことはながっ
た；そして、今日、一般的に合成β−ＡＰベプチドに対
する抗体は、その発明者および共同発明者よりもＡＤ研
究者によって多く使用されているか、これらによる皮膚
等の非神経性沈着の検出は、表Ｉに記載されているよう
に、発明者およびその共同発明者によって調製された天
然の脳β一ＡＰに対する抗血清よりもはるかに感度が低
い。これらの、および他の因子により、本発明者らの発
見はまったく予想外のことである。当該技術分野てＡＤ
の脳組織の染色に一般に用いられている合成ベプチト免
疫原に対する抗体には、表ＩにおけるＬおよびＹで表示
されるものかある。これらはグレンナーおよびウォンの
米国特許第４， ６ ６ ６， ８ ２９号に記載され
ているものと同一である。さらに、表■に記載のごとく
、一般的にＡＤ患者の髄膜から抽出された免疫原に対し
て産生された抗体を用いた場合、ＡＤ患者の大脳皮質か
ら抽出された免疫原に対して産土された抗体を用いた場
合よりもβ一ＡＰ沈着は検出されない。これらの観察結
果は、皮膚その他の血管周囲の結合組織に見いたされる
形のβ一ＡＰか、合成β−ＡＰペブチトよりも脳組織固
有のβ−ＡＰ分子とよく類似していることを示唆するも
のである。
プレアミ口イト沈着として知与れているものと同様に）
は古典的な、組織化学的アミロイト着色反応、即ちコン
コーレノトおよびチオフラビンＳとの反応において反応
性か弱いが、または全く反応しない：そのようなα着を
簡便かつ最も容易に採取することかできる皮膚か、ＡＤ
のβアミ口イト症部位であると考えられたことはながっ
た；そして、今日、一般的に合成β−ＡＰベプチドに対
する抗体は、その発明者および共同発明者よりもＡＤ研
究者によって多く使用されているか、これらによる皮膚
等の非神経性沈着の検出は、表Ｉに記載されているよう
に、発明者およびその共同発明者によって調製された天
然の脳β一ＡＰに対する抗血清よりもはるかに感度が低
い。これらの、および他の因子により、本発明者らの発
見はまったく予想外のことである。当該技術分野てＡＤ
の脳組織の染色に一般に用いられている合成ベプチト免
疫原に対する抗体には、表ＩにおけるＬおよびＹで表示
されるものかある。これらはグレンナーおよびウォンの
米国特許第４， ６ ６ ６， ８ ２９号に記載され
ているものと同一である。さらに、表■に記載のごとく
、一般的にＡＤ患者の髄膜から抽出された免疫原に対し
て産生された抗体を用いた場合、ＡＤ患者の大脳皮質か
ら抽出された免疫原に対して産土された抗体を用いた場
合よりもβ一ＡＰ沈着は検出されない。これらの観察結
果は、皮膚その他の血管周囲の結合組織に見いたされる
形のβ一ＡＰか、合成β−ＡＰペブチトよりも脳組織固
有のβ−ＡＰ分子とよく類似していることを示唆するも
のである。
興味深いことに、皮膚および腸に認められるβＡＰ免疫
反応性は髄膜または脳組織に認められるβ−ＡＰのそれ
と、ある種異なった性質を有する。例えば、合或ペプチ
ド抗体による脳沈着のβＡＰ染色はギ酸によって促進さ
れるが、抗体と合成β−ＡＰとの反応性は通常、キ酸に
よる前処理で破壊される。従って、本発明の実施態様で
は、皮膚および腸標本をキ酸を用いて調製せず、また、
実施例■に記載のごとく、数種の固定化剤の１つを用い
て短期間（例えば、約ｌ５〜約１２０分間、好ましくは
約３０分間）の固定化を行うことが好ましい。
反応性は髄膜または脳組織に認められるβ−ＡＰのそれ
と、ある種異なった性質を有する。例えば、合或ペプチ
ド抗体による脳沈着のβＡＰ染色はギ酸によって促進さ
れるが、抗体と合成β−ＡＰとの反応性は通常、キ酸に
よる前処理で破壊される。従って、本発明の実施態様で
は、皮膚および腸標本をキ酸を用いて調製せず、また、
実施例■に記載のごとく、数種の固定化剤の１つを用い
て短期間（例えば、約ｌ５〜約１２０分間、好ましくは
約３０分間）の固定化を行うことが好ましい。
本発明の実施にあたっては、生検によって患者の皮膚、
腸その他の非神経組織から標本を採取する。好ましくは
、不快感を最小限にするために腕の内側表面等の神経終
末が低密度で重大な感覚か殆んとない皮膚部位から１ま
たはそれ以上のパンチ生検を取ることが好ましいか、皮
膚の任意の部分から楕円形の切除生検を採取することも
てきる。
腸その他の非神経組織から標本を採取する。好ましくは
、不快感を最小限にするために腕の内側表面等の神経終
末が低密度で重大な感覚か殆んとない皮膚部位から１ま
たはそれ以上のパンチ生検を取ることが好ましいか、皮
膚の任意の部分から楕円形の切除生検を採取することも
てきる。
腸生検も、当業者周知の方法で同様に得ることができる
。
。
アルツハイマー症（ＡＤ）（またはその他の脳へのβ一
ＡＰ沈着を特徴とする疾患、ダウン症や高齢）が疑われ
る患者の皮膚、腸その他の非神経組織から生検（パンチ
生検または切除生検）によって得た標本を急速凍結し、
以後のβ−ＡＰ抽出、可溶化および定量イムノアッセイ
に用いる。あるいは、非神経組織標本を固定化剤中で変
性した後、免疫組織化学的に検査する。
ＡＰ沈着を特徴とする疾患、ダウン症や高齢）が疑われ
る患者の皮膚、腸その他の非神経組織から生検（パンチ
生検または切除生検）によって得た標本を急速凍結し、
以後のβ−ＡＰ抽出、可溶化および定量イムノアッセイ
に用いる。あるいは、非神経組織標本を固定化剤中で変
性した後、免疫組織化学的に検査する。
皮膚、腸その他の非神経組織からのβ一ＡＰの抽出、可
溶化および定量のためには、標本を凍結せずにバノファ
−で抽出する（例えば実施例ＩＢ記載）か使用まて凍結
保存する、 免疫組織化学的分析のためには、患者の皮膚、腸または
非神経組織生検を短時間の固定化に付すことが好ましい
。そのような短時間固定化の目的は、長期間の固定化に
よってコンホメーション（配座）が変化し、標本中の分
子の抗原部位か破壊される危険性を回避することにある
。例えば、標本を１０％中性緩衝化ホルマリン中、１５
−６０分間固定化した後、標本を生理緩衝液（例えば、
０，０２％ナトリウムアンド含有りん酸緩衝肢生理食塩
水、ｐＨ７．６）にとり、４°Ｃて保存する。別広とし
て、より長時間の固定化を行ってもよいが、本発明の好
ましい実施態様では短時間の固定化（即ち、一般に３時
間以内の固定化）か必要である。
溶化および定量のためには、標本を凍結せずにバノファ
−で抽出する（例えば実施例ＩＢ記載）か使用まて凍結
保存する、 免疫組織化学的分析のためには、患者の皮膚、腸または
非神経組織生検を短時間の固定化に付すことが好ましい
。そのような短時間固定化の目的は、長期間の固定化に
よってコンホメーション（配座）が変化し、標本中の分
子の抗原部位か破壊される危険性を回避することにある
。例えば、標本を１０％中性緩衝化ホルマリン中、１５
−６０分間固定化した後、標本を生理緩衝液（例えば、
０，０２％ナトリウムアンド含有りん酸緩衝肢生理食塩
水、ｐＨ７．６）にとり、４°Ｃて保存する。別広とし
て、より長時間の固定化を行ってもよいが、本発明の好
ましい実施態様では短時間の固定化（即ち、一般に３時
間以内の固定化）か必要である。
ビクリン酸含有固定化剤（例えば、Ｂｏｕｉｎの方法）
やＰＬＰ固定化剤（過ヨウ素酸塩一リンンーパラホルム
アルテヒト）等を使用してもよい。
やＰＬＰ固定化剤（過ヨウ素酸塩一リンンーパラホルム
アルテヒト）等を使用してもよい。
この処理の後、固定化標本を免疫組織化学的染色用に調
製することかできる。例えば、パラフィン等の媒体には
めこみ、ミクロトームで、通常５１５ミクロンの厚みの
切片を得、免疫組織化学的検査用にスライトグラスに載
せる。あるいは、低温槽中てミクロトームを用いて皮膚
、腸または他の非神経組織の固定化凍結標本から凍結切
片を調製することもてきる。血管周囲β一ＡＰ沈着は皮
下領域に多いので、皮膚標本中に幾らかの皮下組織か屁
人することは診断上好ましい。
製することかできる。例えば、パラフィン等の媒体には
めこみ、ミクロトームで、通常５１５ミクロンの厚みの
切片を得、免疫組織化学的検査用にスライトグラスに載
せる。あるいは、低温槽中てミクロトームを用いて皮膚
、腸または他の非神経組織の固定化凍結標本から凍結切
片を調製することもてきる。血管周囲β一ＡＰ沈着は皮
下領域に多いので、皮膚標本中に幾らかの皮下組織か屁
人することは診断上好ましい。
次いで、スライドに載せた、または浮遊させた皮膚（ま
たは他の非神経組織）標本を本明細書に記載し、表■に
示す抗血清またはモ／゛クローナル抗体と接触させる（
反応させる）。第ｌ抗体または第１抗体を免疫原形のβ
−ＡＰに吸収させた後の対照部分、を標本の上に置き約
２〜約４時間、あるいは一夜放置する。その後、標本を
洗浄し、第１抗体と反応性の第２抗体、例えばヤキ抗ウ
サキＩｇｃまたはヤキ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体
と一緒にインキユヘートする。第２抗体を標識してもよ
い。例えば、ベルオキソターセー抗ベルオキシダーセ等
の酵素マーカーと直接結合させるか、ビオチンと結合さ
せた後、ベルオキシターセと結合させたアビンンービオ
チンと反応させる。そのような反応生戊物は３，３′−
シアミノヘンシシン（ＤＡＢ）と一緒にインキユベート
して比色分析することにより検出することかできる。光
学顕微鏡で着色した標本を観察する。
たは他の非神経組織）標本を本明細書に記載し、表■に
示す抗血清またはモ／゛クローナル抗体と接触させる（
反応させる）。第ｌ抗体または第１抗体を免疫原形のβ
−ＡＰに吸収させた後の対照部分、を標本の上に置き約
２〜約４時間、あるいは一夜放置する。その後、標本を
洗浄し、第１抗体と反応性の第２抗体、例えばヤキ抗ウ
サキＩｇｃまたはヤキ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体
と一緒にインキユヘートする。第２抗体を標識してもよ
い。例えば、ベルオキソターセー抗ベルオキシダーセ等
の酵素マーカーと直接結合させるか、ビオチンと結合さ
せた後、ベルオキシターセと結合させたアビンンービオ
チンと反応させる。そのような反応生戊物は３，３′−
シアミノヘンシシン（ＤＡＢ）と一緒にインキユベート
して比色分析することにより検出することかできる。光
学顕微鏡で着色した標本を観察する。
組織化学的切片の他の分析法には、アルカリホスファタ
ーセと結合した第２抗体を用いる方法や、フルオロクロ
ム（ｆ ｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ） （例えばフルオロ
セイン）と結合した第２抗体を用いる方法があり、この
場合、固定化した皮膚、腸、（または他の非神経性組織
）切片と１次抗体との反応をエピフルオレノセンスを備
えた光学顕微鏡で観察する。
ーセと結合した第２抗体を用いる方法や、フルオロクロ
ム（ｆ ｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ） （例えばフルオロ
セイン）と結合した第２抗体を用いる方法があり、この
場合、固定化した皮膚、腸、（または他の非神経性組織
）切片と１次抗体との反応をエピフルオレノセンスを備
えた光学顕微鏡で観察する。
好ましい態様では、ＡＤの皮膚、腸、または他の非神経
性組織標本中のβ一ＡＰα着を検出するための第１抗体
として以下の実施例の記載に従って産生される幾つかの
β−ＡＰ抗体（またはアミ口イト前駆体のβ−ＡＰ含有
タンパク質フラグメントまたは８個またはそれ以上のア
ミノ酸からなるβ−アミ口イトペプチトに対する抗体）
（並ひに表１に例示した抗体）を用いることか好ましい
。
性組織標本中のβ一ＡＰα着を検出するための第１抗体
として以下の実施例の記載に従って産生される幾つかの
β−ＡＰ抗体（またはアミ口イト前駆体のβ−ＡＰ含有
タンパク質フラグメントまたは８個またはそれ以上のア
ミノ酸からなるβ−アミ口イトペプチトに対する抗体）
（並ひに表１に例示した抗体）を用いることか好ましい
。
２つの型のコントロール（対照）かあり、それは第１抗
体一染色標本を次の２種のいずれかと比較することで行
われる。（１）免疫原一吸収第１抗体と反応させた、ま
たは正常なウサキ血清と反応させたＡＤ患者由来の同様
の標本、および（２）第１抗体（即ち、抗一β一ＡＰ）
で染色した正常組織（βＡＰを含有しない）標本。好ま
しい態様では、第１抗体（即ち、抗β一ＡＰ）によって
検出され、β一ＡＰ比着が疑われるものが、（．１）β
−ＡＰ形の第ｌ抗体吸収の後、アッセイで陽性ングナル
を産生ずるか、または（２）無関係な抗血清、無関係な
モノクローナル抗体、または無関係な前免疫血隋によっ
て認識されるかを決定する。β−ＡＰ抗原による第ｌβ
−ＡＰ抗体吸収の完了は、吸収されていない抗体および
吸収された抗体をＡＤ脳組織切片と反応させ、脳内の既
知のβ一ＡＰ含有病巣（例えば老年斑およびアミ口イト
様血管）が吸収された抗体では染色されないことを示す
ことにより確認することかできる。
体一染色標本を次の２種のいずれかと比較することで行
われる。（１）免疫原一吸収第１抗体と反応させた、ま
たは正常なウサキ血清と反応させたＡＤ患者由来の同様
の標本、および（２）第１抗体（即ち、抗一β一ＡＰ）
で染色した正常組織（βＡＰを含有しない）標本。好ま
しい態様では、第１抗体（即ち、抗β一ＡＰ）によって
検出され、β一ＡＰ比着が疑われるものが、（．１）β
−ＡＰ形の第ｌ抗体吸収の後、アッセイで陽性ングナル
を産生ずるか、または（２）無関係な抗血清、無関係な
モノクローナル抗体、または無関係な前免疫血隋によっ
て認識されるかを決定する。β−ＡＰ抗原による第ｌβ
−ＡＰ抗体吸収の完了は、吸収されていない抗体および
吸収された抗体をＡＤ脳組織切片と反応させ、脳内の既
知のβ一ＡＰ含有病巣（例えば老年斑およびアミ口イト
様血管）が吸収された抗体では染色されないことを示す
ことにより確認することかできる。
ＡＤの皮膚、腸、または他の非神経性組織標本中にβ一
Ａ．Ｐ沈着か検出されたならば、固定化標本の場合には
、染色した標本を、好ましくは本発明のキットに付属し
た免疫組織化学的切片標準（負および性対照の両者）と
比較する、あるいは定量的イムノア，セイの場合には、
抗原標準曲線と比較する、そうしない場合にはＡＤ試験
陽性であるか否かを決定するために評価を行う。定量的
競合的イムノアッセイの例は実施例■に記載されている
。
Ａ．Ｐ沈着か検出されたならば、固定化標本の場合には
、染色した標本を、好ましくは本発明のキットに付属し
た免疫組織化学的切片標準（負および性対照の両者）と
比較する、あるいは定量的イムノア，セイの場合には、
抗原標準曲線と比較する、そうしない場合にはＡＤ試験
陽性であるか否かを決定するために評価を行う。定量的
競合的イムノアッセイの例は実施例■に記載されている
。
免疫組織化学分析ては皮膚、腸、または他の非神経性組
織中のβ−ＡＰ免疫反応性注着の量は、経験的な比較ス
ケールまたはＡＤ患者の既知のβ一ＡＰ皮膚（または他
の非神経性組織）注着を同時に評価することて調製され
る基準を用い、顕微鏡で準定量的に評価することができ
る（例えば、〇一不在、１一弱い染色、２一中程度の染
色、３＝強い染色）。あるいはβ一ＡＰの顕微鏡切片と
免疫反応性物質を含有する、大体の交差切片部分をグラ
テイキュール（ｇｒａｔｉｃｕｌｅ）接眼レンズ（また
は他の定量的顕微鏡装置）を用い、例えば、年令を釣り
合わせた、非ＡＤ標本に対する一連のＡＤについてあら
かしめ決定しておいた、そのようなβＡＰｄ着の標準的
領域と比較することにより、決定する。
織中のβ−ＡＰ免疫反応性注着の量は、経験的な比較ス
ケールまたはＡＤ患者の既知のβ一ＡＰ皮膚（または他
の非神経性組織）注着を同時に評価することて調製され
る基準を用い、顕微鏡で準定量的に評価することができ
る（例えば、〇一不在、１一弱い染色、２一中程度の染
色、３＝強い染色）。あるいはβ一ＡＰの顕微鏡切片と
免疫反応性物質を含有する、大体の交差切片部分をグラ
テイキュール（ｇｒａｔｉｃｕｌｅ）接眼レンズ（また
は他の定量的顕微鏡装置）を用い、例えば、年令を釣り
合わせた、非ＡＤ標本に対する一連のＡＤについてあら
かしめ決定しておいた、そのようなβＡＰｄ着の標準的
領域と比較することにより、決定する。
上記の免疫組織化学的な使用以外の好ましい態様では、
ＡＤと推測される患者および年令を釣り合わせた対照か
ら得た皮膚、腸または非神経性組織の生検または凍結し
た生検からβ−ＡＰ（またはβ−アミロイド前駆体のβ
−ＡＰ含有タンパク質フラグメント）を抽出することが
含まれる。βＡＰ（またはβ−ＡＰ含有分子）の抽出お
よびその可溶化は実施例ＩＢ記載の方法にしたがって行
われる。実施例や表■に記載のβ−ＡＰ抗体の診断的イ
ムノアッセイ反応は標準的な方ｔ去て行い得る［キャン
ヘルら（Ｃａｍｐｅｌｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ １ ９ ６ ４ ）参照１
。抽出した、好ましくは可溶化した形状のβ−ＡＰは放
射性イムノアッセイ（ｔＡ）またはエンサイムリンクト
・イムノアブソーバントアソセイ（ＥＬＩＳＡ）に用い
得る。１２５丁、＋４Ｃ、３Ｈ、酵素、発蛍光団または
化学発光分子等の種々の標識を用いることかできる。競
き的または非競合的分析のいずれかを用い、生検標本か
ら得たβ一ＡＰ免疫反応性分子の量と標準曲線とを比較
する。
ＡＤと推測される患者および年令を釣り合わせた対照か
ら得た皮膚、腸または非神経性組織の生検または凍結し
た生検からβ−ＡＰ（またはβ−アミロイド前駆体のβ
−ＡＰ含有タンパク質フラグメント）を抽出することが
含まれる。βＡＰ（またはβ−ＡＰ含有分子）の抽出お
よびその可溶化は実施例ＩＢ記載の方法にしたがって行
われる。実施例や表■に記載のβ−ＡＰ抗体の診断的イ
ムノアッセイ反応は標準的な方ｔ去て行い得る［キャン
ヘルら（Ｃａｍｐｅｌｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ １ ９ ６ ４ ）参照１
。抽出した、好ましくは可溶化した形状のβ−ＡＰは放
射性イムノアッセイ（ｔＡ）またはエンサイムリンクト
・イムノアブソーバントアソセイ（ＥＬＩＳＡ）に用い
得る。１２５丁、＋４Ｃ、３Ｈ、酵素、発蛍光団または
化学発光分子等の種々の標識を用いることかできる。競
き的または非競合的分析のいずれかを用い、生検標本か
ら得たβ一ＡＰ免疫反応性分子の量と標準曲線とを比較
する。
下記の表Ｉは組織のβ−アミロイド沈着を検出した６個
の別個の、充分に特性化された天然または合戎β一ＡＰ
に対する抗血清、即ち抗血隋Ａ、Ｃ，Ｆ，Ｙ，Ｐｈおよ
びＬを示すものである。抗血清ＡおよびＣはセルコーら
［Ｓ ｅｌｋｏｅ， Ｊ ． Ｎ ｅｕｒｏｃｈｅｍ
．４６ ： １８２０−１８３４（１９８６）］および
セルコーら［Ｓｅｌｋｏｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２ ３ ５ ： ８７３−８７７（１ ９８７）］の記
載にしたかってＡＤの皮質のβ−ＡＰ免疫原に対して産
生され、抗血清Ｌは後者文献記載の合成β−アミ口イト
免疫原に対して産生されたものである。抗血清Ｆおよび
ｐｈはジョアンンらＥＪｏａｃｈｉｍ， Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７４ ： １００−Ｉ Ｌ ｌ
（１９８７）ｉ記載のＡＤａ膜血管β−アミロイド免疫
原に対して産生されたものである。抗血清Ｙは下記実施
例■記載の方法て産生されたものである。
の別個の、充分に特性化された天然または合戎β一ＡＰ
に対する抗血清、即ち抗血隋Ａ、Ｃ，Ｆ，Ｙ，Ｐｈおよ
びＬを示すものである。抗血清ＡおよびＣはセルコーら
［Ｓ ｅｌｋｏｅ， Ｊ ． Ｎ ｅｕｒｏｃｈｅｍ
．４６ ： １８２０−１８３４（１９８６）］および
セルコーら［Ｓｅｌｋｏｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２ ３ ５ ： ８７３−８７７（１ ９８７）］の記
載にしたかってＡＤの皮質のβ−ＡＰ免疫原に対して産
生され、抗血清Ｌは後者文献記載の合成β−アミ口イト
免疫原に対して産生されたものである。抗血清Ｆおよび
ｐｈはジョアンンらＥＪｏａｃｈｉｍ， Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７４ ： １００−Ｉ Ｌ ｌ
（１９８７）ｉ記載のＡＤａ膜血管β−アミロイド免疫
原に対して産生されたものである。抗血清Ｙは下記実施
例■記載の方法て産生されたものである。
さらに表Ｉには比較のために６個の無関係な抗血清、即
ち、抗体Ｐ，ＤＪ，Ｇ，Ｔ，ＡＡおよびＣＢ７か記載さ
れている。抗血清Ｐはイハラ、アブラハムおよびセルコ
−Ｊｌ ｈａｒａ， Ａ ｂｒａｈａｍ， Ｓ ｅ
ｌｋｏｅ， Ｎａｔｕｒｅ ３０４ ： ７２７−７
３０（１ ９８３）］により報告された。抗血清ＤＪは
セルコーベル、ポドリスニー、プライス、コーク［サイ
エンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３５ ： ８７３−８
７７（１ ９８７）］により報告された。抗血清Ｇはダ
ールｌＢｒａｉｎ Ｒｅｓ．， ５７ ３４
３ ３６０（１９７３）コにより報告された。抗
血清Ｔはカルバイオケム（ＣａＩｂｉｏｃｈｅｍ）から
得た。抗血ＡＡはシラハマ、コーエンおよびスキナーＩ
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉ ｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ ７ ７−３ ０ ２（１
９ ８ ４）；’ｉこｌ己載された。モノクローナル抗
体ＣＢ７はンユ、スキナー、シラーマおよびコーエンＪ
Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ． ４６．１３２６（１９８７）］
によって報告された。
ち、抗体Ｐ，ＤＪ，Ｇ，Ｔ，ＡＡおよびＣＢ７か記載さ
れている。抗血清Ｐはイハラ、アブラハムおよびセルコ
−Ｊｌ ｈａｒａ， Ａ ｂｒａｈａｍ， Ｓ ｅ
ｌｋｏｅ， Ｎａｔｕｒｅ ３０４ ： ７２７−７
３０（１ ９８３）］により報告された。抗血清ＤＪは
セルコーベル、ポドリスニー、プライス、コーク［サイ
エンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３５ ： ８７３−８
７７（１ ９８７）］により報告された。抗血清Ｇはダ
ールｌＢｒａｉｎ Ｒｅｓ．， ５７ ３４
３ ３６０（１９７３）コにより報告された。抗
血清Ｔはカルバイオケム（ＣａＩｂｉｏｃｈｅｍ）から
得た。抗血ＡＡはシラハマ、コーエンおよびスキナーＩ
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉ ｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ ７ ７−３ ０ ２（１
９ ８ ４）；’ｉこｌ己載された。モノクローナル抗
体ＣＢ７はンユ、スキナー、シラーマおよびコーエンＪ
Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ． ４６．１３２６（１９８７）］
によって報告された。
β−ＡＰに対する抗体の特異性を確認するために、それ
らを高度に精製したβ一ＡＰに吸収させた。β−ＡＰ特
異抗体はこの吸収の前には組織沈着を認識（検出）した
か、吸収後には認識せず、これらが皮膚または腸の枕着
を実際に認識していることが確認された。同様に、この
抗体はβ−ＡＰ特異抗原に吸収される前には脳のβ−ア
ミ口イト沈着を染色したが後には染色しなかった。抗原
に吸収された、および“対照一吸収”部分ぐいずれも、
１ ５ ９ｍＭ ＮａＣＬ ５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（（ｐＨ ７．６）中）を、ＡＤ脳切片、ＡＤ皮膚切
片またはＡＤ腸切片、およびβ−ＡＰ含有抗原のドット
プロットと、同時に反応させた。例えば、抗血清Ａの場
合には界面活性剤で抽出したＡＤ犬脳皮質由来の老年斑
中核（コア）の部分精製画分（実施例ＩＡ参照）を吸収
剤として用い：“対照吸収”にはコア画分（例えば、リ
ポフスチン顆粒、コラーケン、および微小血管断片）を
不純物として含有する正常な高齢者の大脳皮質から同様
にして調製した両分を用いた。それらの各実験において
ＡＤ老年斑コア吸収はＡＤ患者の脳、皮膚、皮下の無晶
形βＡＰｉ着による斑および血管性アミロイドの染色を
著しく戚少または消失させた。吸収対照はこれらの免疫
反応になんらの影響を及ぼさなかった。
らを高度に精製したβ一ＡＰに吸収させた。β−ＡＰ特
異抗体はこの吸収の前には組織沈着を認識（検出）した
か、吸収後には認識せず、これらが皮膚または腸の枕着
を実際に認識していることが確認された。同様に、この
抗体はβ−ＡＰ特異抗原に吸収される前には脳のβ−ア
ミ口イト沈着を染色したが後には染色しなかった。抗原
に吸収された、および“対照一吸収”部分ぐいずれも、
１ ５ ９ｍＭ ＮａＣＬ ５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（（ｐＨ ７．６）中）を、ＡＤ脳切片、ＡＤ皮膚切
片またはＡＤ腸切片、およびβ−ＡＰ含有抗原のドット
プロットと、同時に反応させた。例えば、抗血清Ａの場
合には界面活性剤で抽出したＡＤ犬脳皮質由来の老年斑
中核（コア）の部分精製画分（実施例ＩＡ参照）を吸収
剤として用い：“対照吸収”にはコア画分（例えば、リ
ポフスチン顆粒、コラーケン、および微小血管断片）を
不純物として含有する正常な高齢者の大脳皮質から同様
にして調製した両分を用いた。それらの各実験において
ＡＤ老年斑コア吸収はＡＤ患者の脳、皮膚、皮下の無晶
形βＡＰｉ着による斑および血管性アミロイドの染色を
著しく戚少または消失させた。吸収対照はこれらの免疫
反応になんらの影響を及ぼさなかった。
無関係な抗原に吸収させた後では、表Ｉ記載の他のβ一
ＡＰ抗血清によっても同様の結果を得た。
ＡＰ抗血清によっても同様の結果を得た。
前免疫血清、第２抗体単独および様々な高度免疫血清（
表■参照）は、精製した２重らせんフィラメント（ＰＨ
Ｆ）、ｔａｕタンパク質、ヒト線維性神経膠（ダリア）
酸性タンパク質、およびヒトトランスサイレチン（ｔｒ
ａｎｓｔｈｙｒｅｔ ｉｎ，プレアルブミン）はいずれ
も皮膚β−ＡＰｉ着を特異的に染色することはなかった
。６個のβ−アミロイド抗血清はそれらの非神経性β一
ＡＰ沈着の検出における感度、正確な染色パターンにお
いて大きく相違している。
表■参照）は、精製した２重らせんフィラメント（ＰＨ
Ｆ）、ｔａｕタンパク質、ヒト線維性神経膠（ダリア）
酸性タンパク質、およびヒトトランスサイレチン（ｔｒ
ａｎｓｔｈｙｒｅｔ ｉｎ，プレアルブミン）はいずれ
も皮膚β−ＡＰｉ着を特異的に染色することはなかった
。６個のβ−アミロイド抗血清はそれらの非神経性β一
ＡＰ沈着の検出における感度、正確な染色パターンにお
いて大きく相違している。
ＡＤ大脳皮質から抽出したアミ口イドフィラメン１から
ＨＰＬＣＭ製した天然の４．２ｋＤａβ一ＡＰに対して
惹起された抗血清Ａは最も高感度のテテクタ−（検出剤
）であった。任意の特定の１抗体からえた標準的な希釈
物の標識における強度は場合ごとに異なっており、特定
のＡＤ症例の１個の皮膚切片に認められるβ一ＡＰ沈着
相互間でさえ相違していたが、ＨＰＬＣ精製髄膜血管β
一ＡＰ（表ｒにおけるＦおよびＰｈ）および合成β−１
−３８ペブチド（表工におけるＹ）に対する抗血清の感
度はかなり低かった。
ＨＰＬＣＭ製した天然の４．２ｋＤａβ一ＡＰに対して
惹起された抗血清Ａは最も高感度のテテクタ−（検出剤
）であった。任意の特定の１抗体からえた標準的な希釈
物の標識における強度は場合ごとに異なっており、特定
のＡＤ症例の１個の皮膚切片に認められるβ一ＡＰ沈着
相互間でさえ相違していたが、ＨＰＬＣ精製髄膜血管β
一ＡＰ（表ｒにおけるＦおよびＰｈ）および合成β−１
−３８ペブチド（表工におけるＹ）に対する抗血清の感
度はかなり低かった。
（以下余白）
表Ｉ記載の感受性の評価は同一ＡＤ患者の這接した皮膚
切片のβ一ＡＰの相対的な検出に基つく。
切片のβ一ＡＰの相対的な検出に基つく。
評価はベルオ牛ンターセ／ジアミ／−ヘンシシン（ＤＡ
Ｂ）免疫検出システムに基づき、種々の抗体を用いた場
音の皮膚のβ一ＡＰ沈着検出における相違を例示するこ
とを意図したものである。評価は使用した特定の免疫組
織化学的条件下において次の意味を有する 高一中程度
〜強度の褐色の（ＤＡＢ−陽性）免疫反応生或物；中＝
中または中〜弱い褐色反応生成物；最小一褐色反応生成
物か殆と検出されない。特定の抗体について高と評価さ
れたものか結果の容易な解釈という点で好ましい。
Ｂ）免疫検出システムに基づき、種々の抗体を用いた場
音の皮膚のβ一ＡＰ沈着検出における相違を例示するこ
とを意図したものである。評価は使用した特定の免疫組
織化学的条件下において次の意味を有する 高一中程度
〜強度の褐色の（ＤＡＢ−陽性）免疫反応生或物；中＝
中または中〜弱い褐色反応生成物；最小一褐色反応生成
物か殆と検出されない。特定の抗体について高と評価さ
れたものか結果の容易な解釈という点で好ましい。
表■は４１人のヒト対象（１１人．ＡＤ，２６人．非Ａ
Ｄ、４人；ダウン症）の皮膚、皮下組織または結腸の試
験結果である。４人以外の全員は剖検により神経病理学
的に正確な診断を下されていた。１１のＡＤ症例の内８
症例は明確に、２人は僅かで不確かな、β−ＡＰ一反応
性の非神経性沈着を示した。一方、２６人の非ＡＤＩ象
の内３人のみか、明確に非神経性β−ＡＰ反応性を示し
、彼らは全員７７才以上であった。４人のタウン症患者
の皮膚標本の内、２個は陽性、２個は不明であった。剖
検ての証明以外に、１人のＡＤと１人の健常人の前腕の
パンチ生検を試験し、前者はβＡＰ着色を示し、後者は
示さなかった。
Ｄ、４人；ダウン症）の皮膚、皮下組織または結腸の試
験結果である。４人以外の全員は剖検により神経病理学
的に正確な診断を下されていた。１１のＡＤ症例の内８
症例は明確に、２人は僅かで不確かな、β−ＡＰ一反応
性の非神経性沈着を示した。一方、２６人の非ＡＤＩ象
の内３人のみか、明確に非神経性β−ＡＰ反応性を示し
、彼らは全員７７才以上であった。４人のタウン症患者
の皮膚標本の内、２個は陽性、２個は不明であった。剖
検ての証明以外に、１人のＡＤと１人の健常人の前腕の
パンチ生検を試験し、前者はβＡＰ着色を示し、後者は
示さなかった。
真皮のβ−ＡＰ免疫反応性沈着は、上皮／真皮連結部の
下方に、時折、小血管または腺要素に近付いて斑点状に
分布していた。着色物質は細胞外の網状真皮の結合組織
線維間に位置しているようであった。小血管、特に細動
脈の周囲に幾つかの虎着が見られた。大部分の血管およ
び他の皮膚構造（汗腺および脂腺；毛嚢；毛幹：平滑筋
；上皮：ケラチン）は着色しないので、さらに反応の特
異性の証明を試みた。結腸の皮下組織および粘膜下組織
には、明らかに細胞外の、微小血管周辺および血管周囲
結合組織内にβ一ＡＰ反応性が見いたされた。腸（大腸
および小腸）のβ一ＡＰ沈着は脳および髄膜と類似して
血管位置に明確に起きるので、観察が最も容易である。
下方に、時折、小血管または腺要素に近付いて斑点状に
分布していた。着色物質は細胞外の網状真皮の結合組織
線維間に位置しているようであった。小血管、特に細動
脈の周囲に幾つかの虎着が見られた。大部分の血管およ
び他の皮膚構造（汗腺および脂腺；毛嚢；毛幹：平滑筋
；上皮：ケラチン）は着色しないので、さらに反応の特
異性の証明を試みた。結腸の皮下組織および粘膜下組織
には、明らかに細胞外の、微小血管周辺および血管周囲
結合組織内にβ一ＡＰ反応性が見いたされた。腸（大腸
および小腸）のβ一ＡＰ沈着は脳および髄膜と類似して
血管位置に明確に起きるので、観察が最も容易である。
観察された皮膚沈着の大部分は無晶形てあり、外観は非
線維状で、ＡＤ脳およびある種のタノチ型の遺伝的脳血
管βアミ口イト血症患者の脳に存在する広範な拡散性β
−ＡＰ沈着と幾分似通っていた。非神経性注着は、その
切片を、ある脳β−Ａｐｈｔｔの染色を促進するき酸で
処理すると、合成β一ＡＰに対する抗体との反応性を失
った（表１ ｔ１７）Ｖ）。コンコーレノトまたはチオ
フラビンＳでは皮膚沈着は検出されなかった。
線維状で、ＡＤ脳およびある種のタノチ型の遺伝的脳血
管βアミ口イト血症患者の脳に存在する広範な拡散性β
−ＡＰ沈着と幾分似通っていた。非神経性注着は、その
切片を、ある脳β−Ａｐｈｔｔの染色を促進するき酸で
処理すると、合成β一ＡＰに対する抗体との反応性を失
った（表１ ｔ１７）Ｖ）。コンコーレノトまたはチオ
フラビンＳでは皮膚沈着は検出されなかった。
これらの結果は、必ずＡＤの脳に起きる進行性β−アミ
ロイドタンパク質注着か脳以外の組織にも起きることを
初めて証明したものである。天然または合成β−ＡＰに
対する４抗体（表ＩのＡ５Ｃ，ＦおよびＹ〉は、β一Ａ
Ｐ抗原吸収の前には組織化着を認識したが、吸収後は認
識しなかった。
ロイドタンパク質注着か脳以外の組織にも起きることを
初めて証明したものである。天然または合成β−ＡＰに
対する４抗体（表ＩのＡ５Ｃ，ＦおよびＹ〉は、β一Ａ
Ｐ抗原吸収の前には組織化着を認識したが、吸収後は認
識しなかった。
脳のβ−アミロイド染色も同しく消失した。今日までに
試験されたβ−ＡＰ以外のタンパク質に対する抗血清は
非神経性沈着を標識しなかった。
試験されたβ−ＡＰ以外のタンパク質に対する抗血清は
非神経性沈着を標識しなかった。
当然なから、上記の好ましい実施態様の詳細な説明およ
び後述する実施例は単なる例示であって、制限的なもの
ではない。当業者には様々な改変か明らかであり、従っ
て、本発明は特許請求の範囲の記載およびそれと法的に
同等と見なされる範囲のみに限定されるものである。
び後述する実施例は単なる例示であって、制限的なもの
ではない。当業者には様々な改変か明らかであり、従っ
て、本発明は特許請求の範囲の記載およびそれと法的に
同等と見なされる範囲のみに限定されるものである。
天一ユ 抗体の要約
Ｆ
Ｙ
精製された〜４ｋＤ βＡＰ
ＡＤＭ膜からＨＰＬＣ
精製された〜４ｋＤ βＡＰ
合戊βＡ Ｐ ，．．ペプチト
中
中
Ｌ
ｘＰ
ＸＤＪ
ｘＧ
！Ｔ
ｘＡＡ
合成βＡＰ，−２８ペブチド
２重ラセンフィラメントｆｌｌ体
ウシ脳由来の熱一安定化ＭＡＰｓ
（ｔａｕをも含む）
ダリア線維酸性タンパク質
ヒトトランスサイレチン
ＡＡアミロイド線維単離体
最小
無
無
モノクローナル抗体
”Ｃ Ｂ ７
ＡＡアミロイド線維単離体
無
Ｘ 無関係な高度免疫血ｉ＊（実施例■および■参照）
であり単なる対照にすきない。
であり単なる対照にすきない。
抗血清ＡおよびＣはセルコー（Ｓ ｅｌｋｏｅ）、アブ
ラハム（ Ａ ｂｒａｈａｍ）、ポトリスニー（Ｐ ｏ
ｄｌ ｉｓｎｙ）、タフィー（Ｄｕｆｆｙ）、ンヤーナ
ル・オブ・ニューロケミストリ−（ Ｊ ， Ｎ ｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ． ）、４６、１８２０−１８３４（１
９８６）、およびセルコー（Ｓ ｅｌｋｏｅ）、ヘル（
Ｂｅｌｌ）、ポトリスニー（ Ｐ ｏｄｌｉｓｎ’／）
、プライス（Ｐ ｒｉｃｅ）、コーク（Ｃ ｏｒｋ）、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３５、８７３−８７
７（１ ９８７）に記載されている。
ラハム（ Ａ ｂｒａｈａｍ）、ポトリスニー（Ｐ ｏ
ｄｌ ｉｓｎｙ）、タフィー（Ｄｕｆｆｙ）、ンヤーナ
ル・オブ・ニューロケミストリ−（ Ｊ ， Ｎ ｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ． ）、４６、１８２０−１８３４（１
９８６）、およびセルコー（Ｓ ｅｌｋｏｅ）、ヘル（
Ｂｅｌｌ）、ポトリスニー（ Ｐ ｏｄｌｉｓｎ’／）
、プライス（Ｐ ｒｉｃｅ）、コーク（Ｃ ｏｒｋ）、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３５、８７３−８７
７（１ ９８７）に記載されている。
抗血清Ｌはセルフ−（Ｓｅｌｋｏｅ）、ヘル（Ｂｅｌｌ
）、ポトリス＝ 一（Ｐｏｄｌｉｓｎｙ）、プライス（
Ｐ ｒｉｃｅ）、コーク（Ｃ ｏｒｋ）、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３５、８７３−８７７（１ ９
８７）に記載されている。
）、ポトリス＝ 一（Ｐｏｄｌｉｓｎｙ）、プライス（
Ｐ ｒｉｃｅ）、コーク（Ｃ ｏｒｋ）、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３５、８７３−８７７（１ ９
８７）に記載されている。
抗血清ＦおよびＰｈはンヨアシン（ Ｊ ｏａｃｈｉｍ
）、タフィー（Ｄｕｆｆｙ）、モーリス（Ｍｏｒｒｉｓ
）、セルコ−− （Ｓｅｌｋｏｅ）、ブレイン・リサー
チ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）、４７４、１００−４１
１（１９８８）に記載されている。
）、タフィー（Ｄｕｆｆｙ）、モーリス（Ｍｏｒｒｉｓ
）、セルコ−− （Ｓｅｌｋｏｅ）、ブレイン・リサー
チ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）、４７４、１００−４１
１（１９８８）に記載されている。
抗血清Ｙは本明細書の実施例ＩＣに記載されている。
抗血清Ｐはイハラ（Ｉ ｈａｒａ）、アブラハム（Ａ
ｂｒａｈａｍ）、セルコー（Ｓ ｅｌｋｏｅ）、不イチ
ャ（Ｎ ａｔｕｒｅ）、３０４、７２７−７３０（１
９８３）に記載されている。
ｂｒａｈａｍ）、セルコー（Ｓ ｅｌｋｏｅ）、不イチ
ャ（Ｎ ａｔｕｒｅ）、３０４、７２７−７３０（１
９８３）に記載されている。
抗血ｉＤＪはセルコー（Ｓ ｅｌｋｏｅ）、ヘル（Ｂｅ
ｌｌ）、ボドリスニ−（ Ｐ ｏｄｌｉｓｎｙ）、プラ
イス（Ｐ ｒｉｃｅ）、コーク（Ｃｏｒｋ）、サイエン
ス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３５、８７３−８７７（１
９８７）に記載されている。
ｌｌ）、ボドリスニ−（ Ｐ ｏｄｌｉｓｎｙ）、プラ
イス（Ｐ ｒｉｃｅ）、コーク（Ｃｏｒｋ）、サイエン
ス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、２３５、８７３−８７７（１
９８７）に記載されている。
抗血７ｌＩＧはタール（Ｄａｈｌ）、ブレイン・リサー
チ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）、５７、３４３−３６０（
１９７３）に記載されている。抗血清ＴはＣ ａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍから人手した。
チ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）、５７、３４３−３６０（
１９７３）に記載されている。抗血清ＴはＣ ａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍから人手した。
抗血清ＡＡはシラハ７ （Ｓ ｈｉｒａｈａｍａ）、コ
ーへ冫（Ｃｏｈｅｎ）およびスキンナ−（Ｓ ｋｉｎｎ
ｅｒ）、アドハンシイーズ・イン・イムノヒストケミス
トリ−（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２７７−３０２（１９８４
）に記載されている。
ーへ冫（Ｃｏｈｅｎ）およびスキンナ−（Ｓ ｋｉｎｎ
ｅｒ）、アドハンシイーズ・イン・イムノヒストケミス
トリ−（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２７７−３０２（１９８４
）に記載されている。
モノクローナル抗体ＣＢ７はジュ（Ｊｕ）、ス牛ンナー
（Ｓ ｋｉｎｎｅｒ）、／ラハマ（Ｓ ｈｉｒａｈａｍ
ａ）およびコーヘン（ＣＯｈｅｎ）、フェテレーンヨン
・フロンーティングズ（Ｆ ｅｄ． Ｐ ｒｏｃ． ）
、４６、＋３２６（１９８７）｛こ３己載されている。
（Ｓ ｋｉｎｎｅｒ）、／ラハマ（Ｓ ｈｉｒａｈａｍ
ａ）およびコーヘン（ＣＯｈｅｎ）、フェテレーンヨン
・フロンーティングズ（Ｆ ｅｄ． Ｐ ｒｏｃ． ）
、４６、＋３２６（１９８７）｛こ３己載されている。
下記表Ｈに本発明のＡＤ診断方法を示す。免疫反応性か
証明されたものは一般にＡＤ診断可能であり、表中、＋
値で表示されている。
証明されたものは一般にＡＤ診断可能であり、表中、＋
値で表示されている。
壺一』：４］大のヒト対象から得た非神経組織標本にお
けるβＡＰ免疫反応 アルンハイマー症 皮膚 Ａ−８８−４６ ８９Ｆ Ｘ１３、３Ｑ ８５Ｍ Ａ８ｇ−７７ ８４Ｍ Ａ８ｇ−２１８ ８２Ｍ Ａ８５−１９６ ７８Ｍ ＡＤ（＞５）工′ ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ＡＤ（６） ＡＤ（１４） ＡＤ（２） ＡＤ（７） ＡＤｓｌ．ＡＡ ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ［生存患者］ ＡＤ ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤ ｓｌ． ＡＡ， 急性ＣＶＡ ＡＤ，顕著なＡＡ ＋ ＋ ＋ Ａ８６−５５ ７７Ｆ Ａ８７−２３７ Ａ８７−４８ Ａ８９−１０ Ａ８９−１４ 腸： Ａ８８−４６ ８９Ｆ Ａ８８−１５９ ８７Ｆ 高齢病人 皮膚： Ａ８７−１４４ ８３Ｆ Ａ８ｇ−２３３ ８２Ｆ Ａ８８−５２ ８１Ｍ Ａ８ｇ−１３０ ７９Ｍ Ａ８９−４０ ７８Ｍ Ａ８ｇ−１２５ ７７Ｆ 入Ｄ／ＰＤ（１） 八Ｄ（７） ＡＤ（４） ＡＤ（５） ＡＤ（８） ＡＤ／ＰＤｉ′， ｍｏｄ． ．Ａ，Ａ ＡＤ， ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤｓｌ．ＡＡ ＡＤ ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤ ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤ（＞５） ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ＡＤｓｌ．ＡＡ ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ＡＤ（＞５） ＡＤ．顕著なＡＡ ＰＤ，痴号（５） Ｎｏ ＰＤ， ｓｌ． ｓｐ，
ｎｏ ＡＡ ＰＤ（８） 痴呆（１） 黒質／淡蒼球 ｄｅｇｅｎ． ， ｎｏ ｓｐ ｓｌ．ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ ｉりｔ Ｒｅｍｏｔｅ ｐｏｌｉｏ， ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ 精神遅滞 Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ， ｓｌ． ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ挫傷 ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ， ｍｏｄ ｓｐ；ｓｌ．ＡＡ 陽 Ａ８８−１２５ ７７Ｆ Ａ８ｇ−１９４ ６２Ｆ 高齢健常人 床直 Ａ８７−４５ ８０Ｍ Ａ８７−１４７ ７６Ｍ Ａ８７−３０２ ７２Ｆ Ａ８８−３４７ ７２Ｍ Ｘ１３６２ ６４Ｍ 非高齢健常人 床！・ Ａ８７−２６８ ６１Ｆ Ａｌｌｌ９−３ ６０Ｍ Ａ８８−３７６ ５６Ｆ Ａ８８−２５９ ５５Ｆ ＾８８−２５８ ４９Ｍ Ａ８８−３５８ ４５Ｍ Ａ８３−３６７ ４５Ｆ Ａ８３−２５６ ４２Ｍ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ 癌 正常 正常 正常 正常 正常 正常 脳腫瘍 正常 正常 正常 正常 正常 脊髄損傷 Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ． ｍｏｄ ｓｐ；ｓｌ．ＡＡ 転移癌 ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ 稀なｓｐ， ｓｌ． ＡＡ Ｎｏ ｓｐ． ｍｏｄ． ＡＡ Ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｎｏ ｓｐ＋ ｓｌ． ＡＡ ［生存患者］ 正常 グリア芽腫 正常 ＮＤ 正常 正常 正常 外傷性 ミエロパンー Ａ８ｇ−２８Ｏ Ａ８ｇ−３６８ Ａ８８−３００ Ａ８８−１５９ 場゛ Ａ８ｇ−１８３ Ａ８８−１６０ 脳ｑ重瘍 正常 正常 早熟 グリア芽腫 正常 ＮＤ 胚マトリ，クス ｈｅｍｏｒｒ 正常 正常 正常 正常 １／ およその疾患の持続期間（年） ２／ＡＤおよびＰＤ両者の典型的な神経病理学的所見タ
ウン症候群 図直 Ａ８０−４０ ４４Ｆ ダウン症候群 Ｍｏ
ｄ． ｓｐ， ｓ Ｉ． ＡＡＡ８５−１４０ ３
８Ｍ ダウン症候群 Ｍｏｄ． ｓｐ， ｎｏ Ａ
ＡＡ８６−９８ ３６Ｆ タウン症候群 Ｍ
ｏｄ． ｓｐ， ｓ １． ＡＡＡ７７−６１
２５Ｍ タウン症候群 Ｍｏｄ． ｓｐ， ｎｏ
ＡＡＡＤ：アルッハイマー症，ＰＤ：パー牛ンソン症，
ＡＡ：アミロイド脈管障害，ＣＶＡ：脳血管異常ＳＰ：
新皮質老年斑＋ｍｏｄ．：中，ｓｌ．：僅か，＋：特異
的染色が明確，一・染色されず±：僅かまたは不明確な
染色，ＮＤ：測定せず。
けるβＡＰ免疫反応 アルンハイマー症 皮膚 Ａ−８８−４６ ８９Ｆ Ｘ１３、３Ｑ ８５Ｍ Ａ８ｇ−７７ ８４Ｍ Ａ８ｇ−２１８ ８２Ｍ Ａ８５−１９６ ７８Ｍ ＡＤ（＞５）工′ ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ＡＤ（６） ＡＤ（１４） ＡＤ（２） ＡＤ（７） ＡＤｓｌ．ＡＡ ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ［生存患者］ ＡＤ ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤ ｓｌ． ＡＡ， 急性ＣＶＡ ＡＤ，顕著なＡＡ ＋ ＋ ＋ Ａ８６−５５ ７７Ｆ Ａ８７−２３７ Ａ８７−４８ Ａ８９−１０ Ａ８９−１４ 腸： Ａ８８−４６ ８９Ｆ Ａ８８−１５９ ８７Ｆ 高齢病人 皮膚： Ａ８７−１４４ ８３Ｆ Ａ８ｇ−２３３ ８２Ｆ Ａ８８−５２ ８１Ｍ Ａ８ｇ−１３０ ７９Ｍ Ａ８９−４０ ７８Ｍ Ａ８ｇ−１２５ ７７Ｆ 入Ｄ／ＰＤ（１） 八Ｄ（７） ＡＤ（４） ＡＤ（５） ＡＤ（８） ＡＤ／ＰＤｉ′， ｍｏｄ． ．Ａ，Ａ ＡＤ， ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤｓｌ．ＡＡ ＡＤ ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤ ｍｏｄ． ＡＡ ＡＤ（＞５） ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ＡＤｓｌ．ＡＡ ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ ＡＤ（＞５） ＡＤ．顕著なＡＡ ＰＤ，痴号（５） Ｎｏ ＰＤ， ｓｌ． ｓｐ，
ｎｏ ＡＡ ＰＤ（８） 痴呆（１） 黒質／淡蒼球 ｄｅｇｅｎ． ， ｎｏ ｓｐ ｓｌ．ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ ｉりｔ Ｒｅｍｏｔｅ ｐｏｌｉｏ， ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ 精神遅滞 Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ， ｓｌ． ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ挫傷 ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ， ｍｏｄ ｓｐ；ｓｌ．ＡＡ 陽 Ａ８８−１２５ ７７Ｆ Ａ８ｇ−１９４ ６２Ｆ 高齢健常人 床直 Ａ８７−４５ ８０Ｍ Ａ８７−１４７ ７６Ｍ Ａ８７−３０２ ７２Ｆ Ａ８８−３４７ ７２Ｍ Ｘ１３６２ ６４Ｍ 非高齢健常人 床！・ Ａ８７−２６８ ６１Ｆ Ａｌｌｌ９−３ ６０Ｍ Ａ８８−３７６ ５６Ｆ Ａ８８−２５９ ５５Ｆ ＾８８−２５８ ４９Ｍ Ａ８８−３５８ ４５Ｍ Ａ８３−３６７ ４５Ｆ Ａ８３−２５６ ４２Ｍ Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ 癌 正常 正常 正常 正常 正常 正常 脳腫瘍 正常 正常 正常 正常 正常 脊髄損傷 Ｒｅｍｏｔｅ ＣＶＡ． ｍｏｄ ｓｐ；ｓｌ．ＡＡ 転移癌 ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ 稀なｓｐ， ｓｌ． ＡＡ Ｎｏ ｓｐ． ｍｏｄ． ＡＡ Ｎｏ ｓｐ， ｎｏ ＡＡ Ｎｏ ｓｐ＋ ｓｌ． ＡＡ ［生存患者］ 正常 グリア芽腫 正常 ＮＤ 正常 正常 正常 外傷性 ミエロパンー Ａ８ｇ−２８Ｏ Ａ８ｇ−３６８ Ａ８８−３００ Ａ８８−１５９ 場゛ Ａ８ｇ−１８３ Ａ８８−１６０ 脳ｑ重瘍 正常 正常 早熟 グリア芽腫 正常 ＮＤ 胚マトリ，クス ｈｅｍｏｒｒ 正常 正常 正常 正常 １／ およその疾患の持続期間（年） ２／ＡＤおよびＰＤ両者の典型的な神経病理学的所見タ
ウン症候群 図直 Ａ８０−４０ ４４Ｆ ダウン症候群 Ｍｏ
ｄ． ｓｐ， ｓ Ｉ． ＡＡＡ８５−１４０ ３
８Ｍ ダウン症候群 Ｍｏｄ． ｓｐ， ｎｏ Ａ
ＡＡ８６−９８ ３６Ｆ タウン症候群 Ｍ
ｏｄ． ｓｐ， ｓ １． ＡＡＡ７７−６１
２５Ｍ タウン症候群 Ｍｏｄ． ｓｐ， ｎｏ
ＡＡＡＤ：アルッハイマー症，ＰＤ：パー牛ンソン症，
ＡＡ：アミロイド脈管障害，ＣＶＡ：脳血管異常ＳＰ：
新皮質老年斑＋ｍｏｄ．：中，ｓｌ．：僅か，＋：特異
的染色が明確，一・染色されず±：僅かまたは不明確な
染色，ＮＤ：測定せず。
実施例
実施例Ｉ 免疫原および抗体の産生
六 大脳皮質からのβ−アミロイドタンパク質の煉世
アルッハイマー症で死亡した患者を解剖し脳を摘出して
−７０゜Ｃて凍結した。脳からのβ一ＡＰ抽出には、β
−アミロイト沈着が著しい脳組織（βＡＰ斑および微小
血管β一ＡＰの両者）のみを用いた。神経原線維の絡み
と老年斑アミロイドコアかトテ／ル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）に不溶性であることに基っ＜、ホ速かっ定量的な
光学顕微鏡アノセイ注を開発し、以下のようにしてβ一
ＡＰに富む脳組織を検出した。凍結した大脳皮質（５０
−１００ｉｙ）を１０の典型的な脳領域から切除し２％
ＳＤＳバｙ７ア （２％ ＳＤＳ／Ｏ．１Ｍβ−メル
カプトエタノール（β−ＭＥ）／５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（（ｐＨ ７． ６）内で短時間ホモンシナイズし
、１００゜Ｃて５分間加熱し、１０，０００９で５分間
ペレソト化した。ベレットを２％ＳＤＳバッファ−５０
μｇに再懸冫蜀し、アルブミンて被覆したスライトに載
せ、コンコーレノトの１％水溶液で染色した。偏光顕微
鏡を用い、複屈折性のコアおよび／または絡みの数を数
えるか、または半定量的（例えばＯ−４＋ ； Ｏはコ
アなし、４＋はコア多数を意味する）評価によることも
てきる。アミ口イドコアの精製に際してこのアノセイの
改良法、即ち０．２％コンコーレノト ５μｇを画分５
μＱと混合し、血球計数計にかけ、各工程におけるコア
精製収率を正確に計算した。
−７０゜Ｃて凍結した。脳からのβ一ＡＰ抽出には、β
−アミロイト沈着が著しい脳組織（βＡＰ斑および微小
血管β一ＡＰの両者）のみを用いた。神経原線維の絡み
と老年斑アミロイドコアかトテ／ル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）に不溶性であることに基っ＜、ホ速かっ定量的な
光学顕微鏡アノセイ注を開発し、以下のようにしてβ一
ＡＰに富む脳組織を検出した。凍結した大脳皮質（５０
−１００ｉｙ）を１０の典型的な脳領域から切除し２％
ＳＤＳバｙ７ア （２％ ＳＤＳ／Ｏ．１Ｍβ−メル
カプトエタノール（β−ＭＥ）／５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（（ｐＨ ７． ６）内で短時間ホモンシナイズし
、１００゜Ｃて５分間加熱し、１０，０００９で５分間
ペレソト化した。ベレットを２％ＳＤＳバッファ−５０
μｇに再懸冫蜀し、アルブミンて被覆したスライトに載
せ、コンコーレノトの１％水溶液で染色した。偏光顕微
鏡を用い、複屈折性のコアおよび／または絡みの数を数
えるか、または半定量的（例えばＯ−４＋ ； Ｏはコ
アなし、４＋はコア多数を意味する）評価によることも
てきる。アミ口イドコアの精製に際してこのアノセイの
改良法、即ち０．２％コンコーレノト ５μｇを画分５
μＱと混合し、血球計数計にかけ、各工程におけるコア
精製収率を正確に計算した。
直前に記載したアッセイで著しくβ−ＡＰ含有アミロイ
ト沈着に富む領域から凍結大脳皮質（２０−１００ ｙ
ｐｇ）を遺択した。組織から肉眼で見える血管および髄
膜断片を切除し、小刀で刻み、５倍容量の２％ＳＤＳバ
ッファ−中て２時間インキユベートした［セルコーら（
Ｊ ． Ｎ ｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４６ ： １
８２０−１ ８３４（１ ９８６）の図１参照］。
ト沈着に富む領域から凍結大脳皮質（２０−１００ ｙ
ｐｇ）を遺択した。組織から肉眼で見える血管および髄
膜断片を切除し、小刀で刻み、５倍容量の２％ＳＤＳバ
ッファ−中て２時間インキユベートした［セルコーら（
Ｊ ． Ｎ ｅｕｒｏｃｈｅｍ． ４６ ： １
８２０−１ ８３４（１ ９８６）の図１参照］。
懸濁液をホモジナイズ（ Ｄ ｏｕｎｃｅ，乳棒Ｂ，２
０ストローク）し、１００′Ｃで１０分間インキユヘー
トし、１００μ肩のナイロンメッシュふるい（Ｎ ｉｔ
ｅｘ）にかけた。ろ液を３００９て３０分間遠心した。
０ストローク）し、１００′Ｃで１０分間インキユヘー
トし、１００μ肩のナイロンメッシュふるい（Ｎ ｉｔ
ｅｘ）にかけた。ろ液を３００９て３０分間遠心した。
上浦（多里の神経線維のからみか他の脛在物とともに含
まれている）を、神経椋維のからみを分離精製するため
に凍結した。０．１％ＳＤＳ溶ｌ夜（０１％ＳＤＳ／１
５０ｍＭ ＮａＣ（！／０．２％ＮａＮ３）中で３回
、ペレノトを洗浄し、ペレ，ト化（３００ｇ、ｌＯ分間
）した。このペレ，トをホモシナイズし、ふるいにかけ
（３５μ次Ｎ ｉｔｅｘ）、ｌ％Ｓ Ｄ Ｓ ／ ５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ中、シヨ糖ａ度１．２Ｍ，１．４Ｍ，
１．６Ｍ，１．８Ｍのシヨ糖勾配を用いてＳ Ｗ ２
８ Ｂ ｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｅｒで７， ２ ０
０ ｏ９て６０分間遠心した。各境界面を採取し０．１
％ＳＤＳ溶冫夜で５倍希釈し、３００９で３０分間ペレ
ノト化した。上記のようにして各ペレットの少量を分析
し、コア豊富について評価した。大多数のＡＤ症例て、
１．６／１．８Ｍおよび１．４／１．６Ｍショ糖勾配境
界面か最も豊富であった。これらの層から得たペレノト
を以後の使用まで４℃で保存した。１．６／１．８Ｍお
よび１．４／１．６Ｍシヨ糖勾配境界面は精製すること
なく、広範な音波処理の後、完全または不完全フロイン
トアジーパントと一緒に免疫原として用いるか、濃き酸
により可溶化した後、凍結乾燥し、ハノファーに再せ濁
し、さらにＨＰＬＣてβ一ＡＰを精製して免疫原として
用いることがてきる。または下記の免疫原精製広で精製
しても良い。
まれている）を、神経椋維のからみを分離精製するため
に凍結した。０．１％ＳＤＳ溶ｌ夜（０１％ＳＤＳ／１
５０ｍＭ ＮａＣ（！／０．２％ＮａＮ３）中で３回
、ペレノトを洗浄し、ペレ，ト化（３００ｇ、ｌＯ分間
）した。このペレ，トをホモシナイズし、ふるいにかけ
（３５μ次Ｎ ｉｔｅｘ）、ｌ％Ｓ Ｄ Ｓ ／ ５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ中、シヨ糖ａ度１．２Ｍ，１．４Ｍ，
１．６Ｍ，１．８Ｍのシヨ糖勾配を用いてＳ Ｗ ２
８ Ｂ ｅｃｋｍａｎ ｒｏｔｅｒで７， ２ ０
０ ｏ９て６０分間遠心した。各境界面を採取し０．１
％ＳＤＳ溶冫夜で５倍希釈し、３００９で３０分間ペレ
ノト化した。上記のようにして各ペレットの少量を分析
し、コア豊富について評価した。大多数のＡＤ症例て、
１．６／１．８Ｍおよび１．４／１．６Ｍショ糖勾配境
界面か最も豊富であった。これらの層から得たペレノト
を以後の使用まで４℃で保存した。１．６／１．８Ｍお
よび１．４／１．６Ｍシヨ糖勾配境界面は精製すること
なく、広範な音波処理の後、完全または不完全フロイン
トアジーパントと一緒に免疫原として用いるか、濃き酸
により可溶化した後、凍結乾燥し、ハノファーに再せ濁
し、さらにＨＰＬＣてβ一ＡＰを精製して免疫原として
用いることがてきる。または下記の免疫原精製広で精製
しても良い。
勾配処理後のコア画分をＤ ｏｕｎｃｅナモ／ナイズ（
乳棒Ｂ、１０−２０ストローク）し、３５ｕｍのＮｉｔ
ｅｘでふるい、直くにＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ Ｆ ＡＣＳ ４４０セルソータ−（ｃｅｌｌ ｓ
ｏｒｔｅｒ）に適用した。各画分（フラクション）をＦ
ＡＣＳ上、進入（フォワード）角の光散乱（粒子径）測
定、および蛍光度測定で分析した。単離したコアのサイ
ズ域に応じて直径〜５−３０μｍの粒子をそれ以上およ
び以下の粒子から分離すると同時に、５−３０ｌｌｚの
粒子をオートフルオレッセンス（自己蛍光）の明暗に応
じて２つの亜群に分離するよう、装置を設定した。標本
を２，０００−５，０００粒子／秒の速度で０．１％Ｓ
ＤＳ溶液中、８０μ尻ノズルおよびアルゴンを用い、最
大励起４８８ｎｍて、５８０ｎｍの偏光フィルター、次
いて５８０ｎｍロングパスフィルターでｌ肖光をヒ゜ノ
クアノフ゜すること（こより分類した。
乳棒Ｂ、１０−２０ストローク）し、３５ｕｍのＮｉｔ
ｅｘでふるい、直くにＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ Ｆ ＡＣＳ ４４０セルソータ−（ｃｅｌｌ ｓ
ｏｒｔｅｒ）に適用した。各画分（フラクション）をＦ
ＡＣＳ上、進入（フォワード）角の光散乱（粒子径）測
定、および蛍光度測定で分析した。単離したコアのサイ
ズ域に応じて直径〜５−３０μｍの粒子をそれ以上およ
び以下の粒子から分離すると同時に、５−３０ｌｌｚの
粒子をオートフルオレッセンス（自己蛍光）の明暗に応
じて２つの亜群に分離するよう、装置を設定した。標本
を２，０００−５，０００粒子／秒の速度で０．１％Ｓ
ＤＳ溶液中、８０μ尻ノズルおよびアルゴンを用い、最
大励起４８８ｎｍて、５８０ｎｍの偏光フィルター、次
いて５８０ｎｍロングパスフィルターでｌ肖光をヒ゜ノ
クアノフ゜すること（こより分類した。
最初のＦＡＣＳ分類の後、画分をコアに関して分析し、
大量の分類されたコアを含有する鈍いオートフルオレノ
センス画分を蛍光で免疫標識した。
大量の分類されたコアを含有する鈍いオートフルオレノ
センス画分を蛍光で免疫標識した。
この目的のためには表１記載のβ一ＡＰ抗体、または同
様の抗体を用いることかできる。例えば、部分精製コア
（上記の／ヨ糖勾配で調製した）を、ラノトまたはウサ
キでアミロイトコア抗体を惹起するための免疫原として
用いた。初期注射（完全フロイントアシュハント中〜２
００ｌｌｌ？タンパク質）の後、４回の追加免疫（それ
ぞれ、不完全フ口イントアジュハント中５０〜１００μ
いによって、ラ，ト血清をＳＤＳ単離コアて〜ｌ：２．
ｏ００希釈てラヘルした。血清に正常な高齢者小脳のＳ
ＤＳ不溶性画分のホモジ不一トを一夜、ｌ・ｌＯＯＯ倍
希釈で吸収させた。第ＩＦＡＣＳコア画分を吸収した抗
血清（または表Ｉのβ一ＡＰ抗血清）と一緒にＴＢＳ（
１ ５０ｍＭ ＮａＣＱ，５０ｍＭＴ ｒｉｓ（ｐＨ
７ ． ６ ））中でインキュベート（４°Ｃ１ １８
時間）した。ラヘルしたコアをペレノト化し、ＴＢＳで
２回洗浄し、ローダミン結合ヤギ抗ウサキＩｇＧ抗体（
１ ２０、２時間）でラヘルし、２回洗浄した。コアを
蛍光顕微鏡で観察し、簡単にホモジナイズし、ＦＡＣＳ
中で２回目の分類に付した。分析では通常、２つの別個
の蛍光集団、５−３０μｍ粒子（またはより明るい蛍光
／ヨルダーを有する単一ピーク）が示され、これらを分
離した。より明るい画分は高純度のコアを含有そしてお
り、これを１％ＳＤＳ中、ｔｏｏ０ｃで５分間加熱して
ＩｇＧを除去し、３〜４回洗浄し（３００ｇ、１０分間
）４゜Ｃで保存した。光学顕微鏡および電子顕微鏡で粒
子の純度を測定した。
様の抗体を用いることかできる。例えば、部分精製コア
（上記の／ヨ糖勾配で調製した）を、ラノトまたはウサ
キでアミロイトコア抗体を惹起するための免疫原として
用いた。初期注射（完全フロイントアシュハント中〜２
００ｌｌｌ？タンパク質）の後、４回の追加免疫（それ
ぞれ、不完全フ口イントアジュハント中５０〜１００μ
いによって、ラ，ト血清をＳＤＳ単離コアて〜ｌ：２．
ｏ００希釈てラヘルした。血清に正常な高齢者小脳のＳ
ＤＳ不溶性画分のホモジ不一トを一夜、ｌ・ｌＯＯＯ倍
希釈で吸収させた。第ＩＦＡＣＳコア画分を吸収した抗
血清（または表Ｉのβ一ＡＰ抗血清）と一緒にＴＢＳ（
１ ５０ｍＭ ＮａＣＱ，５０ｍＭＴ ｒｉｓ（ｐＨ
７ ． ６ ））中でインキュベート（４°Ｃ１ １８
時間）した。ラヘルしたコアをペレノト化し、ＴＢＳで
２回洗浄し、ローダミン結合ヤギ抗ウサキＩｇＧ抗体（
１ ２０、２時間）でラヘルし、２回洗浄した。コアを
蛍光顕微鏡で観察し、簡単にホモジナイズし、ＦＡＣＳ
中で２回目の分類に付した。分析では通常、２つの別個
の蛍光集団、５−３０μｍ粒子（またはより明るい蛍光
／ヨルダーを有する単一ピーク）が示され、これらを分
離した。より明るい画分は高純度のコアを含有そしてお
り、これを１％ＳＤＳ中、ｔｏｏ０ｃで５分間加熱して
ＩｇＧを除去し、３〜４回洗浄し（３００ｇ、１０分間
）４゜Ｃで保存した。光学顕微鏡および電子顕微鏡で粒
子の純度を測定した。
他の方法を用いてＡＤ大脳皮質からアミロイドフィラメ
ントを調製することもてきる。これはセルコーおよびア
ブラハムのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ○ｇ
ｙ １３４ ： ３７４−４（１９８６）に記載され
ている。この方法では神経性２重らせんフィラメントと
細胞外アミロイトフィラメントの混合物が得られる。後
者エレメントはこの方法で産生された画分を非常に多く
含有するのでそれを用いて好都合に本発明の免疫原とし
て使用するβ−ＡＰを調製することかてきる。実際、こ
の方法て調製された両分から抽出されたＨ Ｐ Ｌ Ｃ
精製β−ＡＰを免疫原として用い、ＡＤ皮膚および他の
非神経性組織のβ一ＡＰＩｉｌ：着を高感度で検出する
抗血清Ａ（表Ｉ）を調製した。上記の半定量コンコーレ
ノドアノセイに基ついて凍結脳冠切片から、多量の血管
性アミロイド沈着およびアミロイド斑沈着を有する凍結
大脳皮質（２０−１００９）を切除した。髄膜、灰白物
質および肉眼て見える血管を注意深く除去し、皮質を小
刀で刻んた。組織を５倍容量の２％ＳＤＳハノファ−（
２％ＳＤＳ／０．１Ｍ β−ＭＥ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ）（ｐＨ７．６））中で２時間インキユヘート
し、ガラスホモジナイザ−（Ｄｏｕｎｃｅ）とルーズフ
ィ／ティング乳棒Ｂを用い、１０−２０ストロークでホ
モノナイズした。ホモジ不一トを、１００’Ｃで５分間
加熱し、１１０μ肩のナイロンメ／シュふるい（Ｎｉｔ
ｅｘ）にかけた。ろ径〜１５−２０μｍ）、幾らかの血
管断片、幾与かのりポフスチン顆粒、及ひその池の大き
い不純物と一緒にホモシ不−ト中の大部分の老年性アミ
ロイト斑コアを含有するペレ，トを、アミロイドコアを
別々に精製するために−７００Ｃて保存した。
ントを調製することもてきる。これはセルコーおよびア
ブラハムのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ○ｇ
ｙ １３４ ： ３７４−４（１９８６）に記載され
ている。この方法では神経性２重らせんフィラメントと
細胞外アミロイトフィラメントの混合物が得られる。後
者エレメントはこの方法で産生された画分を非常に多く
含有するのでそれを用いて好都合に本発明の免疫原とし
て使用するβ−ＡＰを調製することかてきる。実際、こ
の方法て調製された両分から抽出されたＨ Ｐ Ｌ Ｃ
精製β−ＡＰを免疫原として用い、ＡＤ皮膚および他の
非神経性組織のβ一ＡＰＩｉｌ：着を高感度で検出する
抗血清Ａ（表Ｉ）を調製した。上記の半定量コンコーレ
ノドアノセイに基ついて凍結脳冠切片から、多量の血管
性アミロイド沈着およびアミロイド斑沈着を有する凍結
大脳皮質（２０−１００９）を切除した。髄膜、灰白物
質および肉眼て見える血管を注意深く除去し、皮質を小
刀で刻んた。組織を５倍容量の２％ＳＤＳハノファ−（
２％ＳＤＳ／０．１Ｍ β−ＭＥ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ）（ｐＨ７．６））中で２時間インキユヘート
し、ガラスホモジナイザ−（Ｄｏｕｎｃｅ）とルーズフ
ィ／ティング乳棒Ｂを用い、１０−２０ストロークでホ
モノナイズした。ホモジ不一トを、１００’Ｃで５分間
加熱し、１１０μ肩のナイロンメ／シュふるい（Ｎｉｔ
ｅｘ）にかけた。ろ径〜１５−２０μｍ）、幾らかの血
管断片、幾与かのりポフスチン顆粒、及ひその池の大き
い不純物と一緒にホモシ不−ト中の大部分の老年性アミ
ロイト斑コアを含有するペレ，トを、アミロイドコアを
別々に精製するために−７００Ｃて保存した。
上清をバスツールピペットで吸引し角度固定ローターに
より１ ０ ０， ０ ０ ０ｙで３０分間遠心した。
より１ ０ ０， ０ ０ ０ｙで３０分間遠心した。
ヘレノトを１％ＳＤＳハノファ−（１％ＳＤＳ／０．１
Ｍβ−ＭＥ／ ５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７． ６
）中、約１ｘＱ／ｔ． ５ − ２． ０ｇ出発物質大
脳皮質の比率で再暫濁し、タイトフィ，ティング（Ａ）
Ｄｏｕｎｃｅ乳鉢で再度ホモジナイズした。
Ｍβ−ＭＥ／ ５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７． ６
）中、約１ｘＱ／ｔ． ５ − ２． ０ｇ出発物質大
脳皮質の比率で再暫濁し、タイトフィ，ティング（Ａ）
Ｄｏｕｎｃｅ乳鉢で再度ホモジナイズした。
得られた懸濁液をシヨ糖０．４Ｍにし、３８ｍＱのＢ
ｅｃｋｍａｎ ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ超遠心管内で不連
続シヨ糖勾配：２．０Ｍシヨ糖５村、１．４Ｍシヨ糖８
スｆ２，１．２Ｍシヨ糖８村、および１．０Ｍシヨ糖７
ｘ（（いずれも１％Ｓ Ｄ Ｓ／ ５ ０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓＨＣ（バッファ一中）の頂上に適用した。直ぐにグラ
ジエントをＳ Ｗ ２ ８ Ｂ ｒｏｔｅｒで１４５．
０００９なり明確な以Ｆのハントか観察された：１．Ｏ
Ｍノ３糖喘の頂上と１．０／１．２Ｍ境界面に褐色ハン
ト、１．２／１．４および１．４／２．０Ｍ境界面に灰
白色ハント、および非常に小さいペレ，トか存在してい
た。各画分をパスツールピペノトで採取し、１％ＳＤＳ
ハ，ファーで少なくとも５倍希釈し、角度固定ローター
て１０，０００？て６０分間ペレノト化した。
ｅｃｋｍａｎ ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ超遠心管内で不連
続シヨ糖勾配：２．０Ｍシヨ糖５村、１．４Ｍシヨ糖８
スｆ２，１．２Ｍシヨ糖８村、および１．０Ｍシヨ糖７
ｘ（（いずれも１％Ｓ Ｄ Ｓ／ ５ ０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓＨＣ（バッファ一中）の頂上に適用した。直ぐにグラ
ジエントをＳ Ｗ ２ ８ Ｂ ｒｏｔｅｒで１４５．
０００９なり明確な以Ｆのハントか観察された：１．Ｏ
Ｍノ３糖喘の頂上と１．０／１．２Ｍ境界面に褐色ハン
ト、１．２／１．４および１．４／２．０Ｍ境界面に灰
白色ハント、および非常に小さいペレ，トか存在してい
た。各画分をパスツールピペノトで採取し、１％ＳＤＳ
ハ，ファーで少なくとも５倍希釈し、角度固定ローター
て１０，０００？て６０分間ペレノト化した。
そのような／ヨ糖勾配画分をさらに精製するためにペレ
，トを１％ＳＤＳハノファ−１１ＩＱに再暫濁し、３０
秒間音波処理（Ｋｏｎｔｅｓ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、出
力８、チューン（調整）４）し、１４，ＯＯＯ９で３０
分間遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｙｐｅ４ ０ ｒｏ
ｔｏｒ）。
，トを１％ＳＤＳハノファ−１１ＩＱに再暫濁し、３０
秒間音波処理（Ｋｏｎｔｅｓ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、出
力８、チューン（調整）４）し、１４，ＯＯＯ９で３０
分間遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｙｐｅ４ ０ ｒｏ
ｔｏｒ）。
リポフスチンとＰＨＦ断片の大きい凝集物を含有するベ
レノトを捨て、上清を１７６．０００９で６０分間遠心
した。この最終ペレノトを電子顕微鏡で観察すると方向
がランタムな小さいＰＨＦ断片とアミロイトフィラメン
トか存在する比較的均質な領域が認められた。リボフス
チンの小断片と微細で高密度の顆粒が不純物として残存
していたが、リポフスチン混在は非音ｌ皮処理ンヨ糖勾
配画分中よりも少なかった。音波処理Ｐ Ｉ｛ Ｆおよ
びアミｃイト線維フィラメントは高速ペレ，ト化の後の
コンコーレノド染色の際の緑色の複屈折を保持していた
。
レノトを捨て、上清を１７６．０００９で６０分間遠心
した。この最終ペレノトを電子顕微鏡で観察すると方向
がランタムな小さいＰＨＦ断片とアミロイトフィラメン
トか存在する比較的均質な領域が認められた。リボフス
チンの小断片と微細で高密度の顆粒が不純物として残存
していたが、リポフスチン混在は非音ｌ皮処理ンヨ糖勾
配画分中よりも少なかった。音波処理Ｐ Ｉ｛ Ｆおよ
びアミｃイト線維フィラメントは高速ペレ，ト化の後の
コンコーレノド染色の際の緑色の複屈折を保持していた
。
ＡＤ患者の皮膚浣着を認識するためのβ一ＡＰ抗体の産
生に用いる免疫原も皮膚自身から調製され得る。まず、
皮膚標本の凍結または固定化切片を表Ｉ記載のごとき抗
体を用いて免疫組織化学的に検査しβ一ＡＰ沈着の程度
を測定する。病理学的にＡＤと確認された死亡患者から
解剖によって得たβ一ＡＰに富む新鮮または新鮮一凍結
皮膚標本を十分に細かく刻み、生理バッファ一（りん酸
緩衝化生理食塩水）中でホモジナイズする。分別遠心の
のち、上清と皮膚の不溶性物質を分離した。
生に用いる免疫原も皮膚自身から調製され得る。まず、
皮膚標本の凍結または固定化切片を表Ｉ記載のごとき抗
体を用いて免疫組織化学的に検査しβ一ＡＰ沈着の程度
を測定する。病理学的にＡＤと確認された死亡患者から
解剖によって得たβ一ＡＰに富む新鮮または新鮮一凍結
皮膚標本を十分に細かく刻み、生理バッファ一（りん酸
緩衝化生理食塩水）中でホモジナイズする。分別遠心の
のち、上清と皮膚の不溶性物質を分離した。
例えば、表１記載の抗体等を用い、エンザイムリンクト
・イムノアブソーバントアソセイ（ＥＬＩＳＡ）または
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって上清のβ−Ａ
Ｐ存在を分折する。上浦にβ−ＡＰ免疫活性の存在か認
められたならば、皮膚からβ−ＡＰ分子に富む画分を得
るために、さ与に通常のクロマトグラフィーおよびアフ
イニテイー結合法の両者て分画することができる。初回
の遠心の不溶性ペレノトかイムノア，セイによってβＡ
Ｐ反応性を示したならば、ペレノトをある種の界面活性
剤および／または塩（例えば１−２％ｔｒｉｔｏｎＸ
− １ ０ ０Ｘ１−２％ ドテシル硫酸ナトリウム、
６Ｍ塩酸グアニジン、または６Ｍ尿素）で分別抽出する
。次いて不廖性ペレットの各抽出物をイムノア，セイで
β−ＡＰ免疫反応性に関して試験する。特定の抽出物に
可溶化β−ＡＰが検出されれば、この抽出物をさ与にク
ロマトグラフイ−（例えばＨＰＬＣ）および／またはア
フイニテイー結合法で精製することかできる。この方法
で得たβ−ＡＰに富む画分をウサギに注射してポリクロ
ーナル抗体を産生させるか、マウスに注射してハイブリ
ドーマ広でモノクローナル抗体を製造する。
・イムノアブソーバントアソセイ（ＥＬＩＳＡ）または
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって上清のβ−Ａ
Ｐ存在を分折する。上浦にβ−ＡＰ免疫活性の存在か認
められたならば、皮膚からβ−ＡＰ分子に富む画分を得
るために、さ与に通常のクロマトグラフィーおよびアフ
イニテイー結合法の両者て分画することができる。初回
の遠心の不溶性ペレノトかイムノア，セイによってβＡ
Ｐ反応性を示したならば、ペレノトをある種の界面活性
剤および／または塩（例えば１−２％ｔｒｉｔｏｎＸ
− １ ０ ０Ｘ１−２％ ドテシル硫酸ナトリウム、
６Ｍ塩酸グアニジン、または６Ｍ尿素）で分別抽出する
。次いて不廖性ペレットの各抽出物をイムノア，セイで
β−ＡＰ免疫反応性に関して試験する。特定の抽出物に
可溶化β−ＡＰが検出されれば、この抽出物をさ与にク
ロマトグラフイ−（例えばＨＰＬＣ）および／またはア
フイニテイー結合法で精製することかできる。この方法
で得たβ−ＡＰに富む画分をウサギに注射してポリクロ
ーナル抗体を産生させるか、マウスに注射してハイブリ
ドーマ広でモノクローナル抗体を製造する。
Ｃ．ポリクローナル抗体の製造
本発明の好ましいポリクローナル抗体調製用βＡＰの製
造のために、それそれ上記のごとくにしてＡＤ脳から調
製した部分精製または精製アミロイト斑コアまたは２重
らせんフィラメント／アミロイトフィラメントー豊富画
分を６．８ＭグアニシンＳＣＮ処理し、次いで透折し、
凍結乾燥するか、８８％ぎ酸処理の後、凍結乾燥した。
造のために、それそれ上記のごとくにしてＡＤ脳から調
製した部分精製または精製アミロイト斑コアまたは２重
らせんフィラメント／アミロイトフィラメントー豊富画
分を６．８ＭグアニシンＳＣＮ処理し、次いで透折し、
凍結乾燥するか、８８％ぎ酸処理の後、凍結乾燥した。
凍結乾燥物をｌ％ＳＤＳに溶かし、３７゜Ｃで３０分間
インキユヘートした後、ｔｏ，ｏｏｏｙで遠心した。連
続的に２個のＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷカラム（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）を連結してなるＳ ｐｅｃｔｒａ−Ｐ ｈｙｓ
ｉｃｓ ８７００ＨＰＬＣ／ステムに適用し、０１％Ｓ
Ｄ Ｓ／ １ ５ ０ｍＭりん酸Ｎａ（ｐＨ６．８）
で平衡化し、０．５ｍ１２／分で処理した。２２０ｎｍ
でタンパク質を検出し、キルフォード２０１フラクショ
ンコレクターでピークを集めた。
インキユヘートした後、ｔｏ，ｏｏｏｙで遠心した。連
続的に２個のＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷカラム（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）を連結してなるＳ ｐｅｃｔｒａ−Ｐ ｈｙｓ
ｉｃｓ ８７００ＨＰＬＣ／ステムに適用し、０１％Ｓ
Ｄ Ｓ／ １ ５ ０ｍＭりん酸Ｎａ（ｐＨ６．８）
で平衡化し、０．５ｍ１２／分で処理した。２２０ｎｍ
でタンパク質を検出し、キルフォード２０１フラクショ
ンコレクターでピークを集めた。
両タイプのβ−アミロイド線維製品（精製アミ口イトコ
アまたは単離したＰＨＦ／アミロイトフィラメント製品
）は同様のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、分子量約３
−７ｋＤａおよび１１−１５ｋＤａの２本のタンパク質
の主ピークを与える（セルコーらのＪ ｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４ ６ ： １
８２０−１８３４（１９８６）、図５参照）。これら｝
ＪＰＬＣ画分の両者または１方をウサキ（ボリクローナ
ル抗体の産生のために）またはマウス（通常のハイブリ
トーマ法によるモノクローナル抗体の産生のために）の
免疫原として用いることかできる。例えば、き酸可溶化
アミ口イドコアまたはき酸可溶化ＰＨＦ／アミロイドフ
ィラメント画分のいずれかの、］．１−１ ５ｋＤａ
ＨＰＬＣタンパク質画分２５０μ２を用い、ウサキを免
疫することかできる。このようにして得られた抗血清は
表Ｉの抗血清ＡおよびＣである。
アまたは単離したＰＨＦ／アミロイトフィラメント製品
）は同様のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、分子量約３
−７ｋＤａおよび１１−１５ｋＤａの２本のタンパク質
の主ピークを与える（セルコーらのＪ ｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４ ６ ： １
８２０−１８３４（１９８６）、図５参照）。これら｝
ＪＰＬＣ画分の両者または１方をウサキ（ボリクローナ
ル抗体の産生のために）またはマウス（通常のハイブリ
トーマ法によるモノクローナル抗体の産生のために）の
免疫原として用いることかできる。例えば、き酸可溶化
アミ口イドコアまたはき酸可溶化ＰＨＦ／アミロイドフ
ィラメント画分のいずれかの、］．１−１ ５ｋＤａ
ＨＰＬＣタンパク質画分２５０μ２を用い、ウサキを免
疫することかできる。このようにして得られた抗血清は
表Ｉの抗血清ＡおよびＣである。
抗体産生のための免疫原調製の別法は、β−ＡＰの部分
または完全な配列を有する合成ペブチドを製造し、種々
の担体（キーホールリンベソトヘモンアニン、ウサキ”
血ｌ青アルブミン、エテ゛スチン）と結合させ、完全ま
たは不完全フロイントアジュハント中で常広通りウサギ
を免疫することを含む。
または完全な配列を有する合成ペブチドを製造し、種々
の担体（キーホールリンベソトヘモンアニン、ウサキ”
血ｌ青アルブミン、エテ゛スチン）と結合させ、完全ま
たは不完全フロイントアジュハント中で常広通りウサギ
を免疫することを含む。
この方法て得られる抗血清は表１の抗血清ＹおよびＬで
ある。
ある。
Ｄ．モノクローナル抗体の製造
モ／クローナル抗体の製造のための注射スケシュールは
以下の通りである。抗原を完全フロイントアンユハント
中、約１０μｙ／ｍ（ｌのエマルションとし、腹腔内に
注射した。初期注射の１５および２８日後に抗原約５μ
９の不完全フロイントアシュバント中エマルジョンを腹
腔内に注射する。２１日間マウスを休息させた後、抗原
約１０μｑを腹腔内に注射する。３日後にマウスの牌臓
を融合させる。
以下の通りである。抗原を完全フロイントアンユハント
中、約１０μｙ／ｍ（ｌのエマルションとし、腹腔内に
注射した。初期注射の１５および２８日後に抗原約５μ
９の不完全フロイントアシュバント中エマルジョンを腹
腔内に注射する。２１日間マウスを休息させた後、抗原
約１０μｑを腹腔内に注射する。３日後にマウスの牌臓
を融合させる。
融合工程には以下の材料を用いる，高濃度のグルコース
を含有するダルヘッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）
：ベーリンカーマンハイム（西独）カら入手したポリエ
チレングリコール１５００，融合のスクリーン；ウシ胎
児血清（ＦＢＳ）、ＪＲサイエンティフィノク（ウソト
ランド、カリフォルニア）から八手；２００ｍＭ組織培
養グレートのグルタミン １０−２Ｍの組織培養グレー
ドのヒポキサンチン：２００μ２／村の組織培養グレー
トのアサセリン（Ａ ｚａｓｅｒｉｎｅ） ； ０ ．
９ ３％の塩化アンモニウム．３％テキストラン（高
分子量画分），ｌＭ組織培養グレートＨＥＰＥＳハッフ
ァ一、ｐＨ７．２；３５ｘＣの滅菌ペトリ皿：滅菌ピン
セノトおよび解剖用ハサミ；１５個の〆威菌した蓋付き
９６ウエル平底組織培養プレート；１２チャンネルビペ
ノトおよびそのための滅菌チノプ；２個の顕微鏡用の、
端をスリガラスにした滅菌スライドガラス，アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレク／ヨン（ロノクビレ、メ
アリーランド）から得たＳＰ２／０細胞。
を含有するダルヘッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）
：ベーリンカーマンハイム（西独）カら入手したポリエ
チレングリコール１５００，融合のスクリーン；ウシ胎
児血清（ＦＢＳ）、ＪＲサイエンティフィノク（ウソト
ランド、カリフォルニア）から八手；２００ｍＭ組織培
養グレートのグルタミン １０−２Ｍの組織培養グレー
ドのヒポキサンチン：２００μ２／村の組織培養グレー
トのアサセリン（Ａ ｚａｓｅｒｉｎｅ） ； ０ ．
９ ３％の塩化アンモニウム．３％テキストラン（高
分子量画分），ｌＭ組織培養グレートＨＥＰＥＳハッフ
ァ一、ｐＨ７．２；３５ｘＣの滅菌ペトリ皿：滅菌ピン
セノトおよび解剖用ハサミ；１５個の〆威菌した蓋付き
９６ウエル平底組織培養プレート；１２チャンネルビペ
ノトおよびそのための滅菌チノプ；２個の顕微鏡用の、
端をスリガラスにした滅菌スライドガラス，アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレク／ヨン（ロノクビレ、メ
アリーランド）から得たＳＰ２／０細胞。
融合の日に、２個の異なる培地を調製する。１つはＤＭ
ＥＭ４００ｍ（１、ＦＢＳ １００ｚ（！，２００ｍＭ
グルタミン ５ｍＱ，ＬＭ ＨＥＰＥＳバッファ一（
ｐＨ ７． ２）７． ５スＱおよび１０−”Ｍヒボキ
サンチン５村を含有する増殖培地である。もう１つの培
地は増殖培地７５対に２００μ９／叶アザセリン７５０
μＣを添加した遺択培地である。
ＥＭ４００ｍ（１、ＦＢＳ １００ｚ（！，２００ｍＭ
グルタミン ５ｍＱ，ＬＭ ＨＥＰＥＳバッファ一（
ｐＨ ７． ２）７． ５スＱおよび１０−”Ｍヒボキ
サンチン５村を含有する増殖培地である。もう１つの培
地は増殖培地７５対に２００μ９／叶アザセリン７５０
μＣを添加した遺択培地である。
マウスを殺し、１０秒間７０％エタノールに浸ける。マ
ウスをフローフート（Ｆｌｏｗ ｈ○Ｏｄ）に入れ、無
菌状態て牌臓を摘出し、増殖培地５ｍＱを含有する５ｘ
Ｑペトリ皿に入れる。牌臓をスライトのすりカラス端の
間に分散する。牌細胞懸濁岐を１５ｘ１２の滅菌試験管
に入れる。ペトｌ，Ｊ皿を増殖培地１０ｍ（ｌで洗浄し
、同じ＜１５，ｖ（試験管に入れる。
ウスをフローフート（Ｆｌｏｗ ｈ○Ｏｄ）に入れ、無
菌状態て牌臓を摘出し、増殖培地５ｍＱを含有する５ｘ
Ｑペトリ皿に入れる。牌臓をスライトのすりカラス端の
間に分散する。牌細胞懸濁岐を１５ｘ１２の滅菌試験管
に入れる。ペトｌ，Ｊ皿を増殖培地１０ｍ（ｌで洗浄し
、同じ＜１５，ｖ（試験管に入れる。
Ｓ Ｐ ２／Ｏ細胞を計数する。通常、密度は約５０万
細胞／村以上、９０万／村以下である。一般に細胞の生
存性はトリパンブルー排除注て測定したとき、約９５％
以上である。次いて、約５０００万個の細胞を滅菌した
５０ｍＱ試験管に入れる。
細胞／村以上、９０万／村以下である。一般に細胞の生
存性はトリパンブルー排除注て測定したとき、約９５％
以上である。次いて、約５０００万個の細胞を滅菌した
５０ｍＱ試験管に入れる。
次いで、牌細胞およびＳ Ｐ ２／Ｏ細胞の両方をクリ
ニカル遠心機で５ ０ ０ ｘ９で１０分間遠心する。
ニカル遠心機で５ ０ ０ ｘ９で１０分間遠心する。
牌細胞から上清を分け、４゜Ｃで塩化アンモニウム８村
に再懸濁する。これを水上で５分間インキユベートする
。
に再懸濁する。これを水上で５分間インキユベートする
。
Ｓ Ｐ ２／Ｏ細胞をそのままのＤＭＥＭ１５ｘｆｆに
再懸濁する。牌細胞の５分間インキュベーソヨンの完了
後、牌細胞＠濁肢を破片ベレットから分離し、ＳＰ２／
Ｏ細胞に加える。この細胞混合物にＤ Ｍ Ｅ Ｍを加
えて総量２５ｍ（ｌとする。この牌ＳＰ２／ＯＩ［Ｉ１
胞混音物に３％デキストラン２５＋（２を加え、５分間
インキユヘートする。細胞を５ｏＯ×９で１０分間遠心
する。
再懸濁する。牌細胞の５分間インキュベーソヨンの完了
後、牌細胞＠濁肢を破片ベレットから分離し、ＳＰ２／
Ｏ細胞に加える。この細胞混合物にＤ Ｍ Ｅ Ｍを加
えて総量２５ｍ（ｌとする。この牌ＳＰ２／ＯＩ［Ｉ１
胞混音物に３％デキストラン２５＋（２を加え、５分間
インキユヘートする。細胞を５ｏＯ×９で１０分間遠心
する。
ペレノトから上清を取り、ペレットをボルテ，クス（転
倒）してゆるめる。ＰＥＧ１５００ １ｚ＆を加える
。次いで、試験管をホルテノクスし１分間、ゆっくり回
転させる。これが実際の融合工程である。
倒）してゆるめる。ＰＥＧ１５００ １ｚ＆を加える
。次いで、試験管をホルテノクスし１分間、ゆっくり回
転させる。これが実際の融合工程である。
試験管にＤＭＥＭ２５ｉ（を加え、１分間インキユヘー
トする。インキュヘーンヨンの後、増殖培地２５ｕ（を
加え、■分間インキユヘートする。
トする。インキュヘーンヨンの後、増殖培地２５ｕ（を
加え、■分間インキユヘートする。
細胞を５ ０ ０ Ｘｇで遠心する。
ベレノトを遭択培地７５ｘ（！に再懸濁する。１２チャ
ンネルのピペノトを用いて１５個の９６ウェルプレート
の各ウェルに５ｏμｇを入れる。
ンネルのピペノトを用いて１５個の９６ウェルプレート
の各ウェルに５ｏμｇを入れる。
融合の２日後、各ウェルに増殖培地５０μｇを入れる。
融合５日後、５０μｇを除去し、融合物に増殖培地１０
０μｇを加える。融合後７日目から融合後１０日目の間
に肉眼でハイブリッドが観察される。この時点で、融合
物に増殖培地１００μＱを加える。一般に１０日目位か
ら、スクリーニングを始める。１０日目にまたハイフ゛
リノトか観察されない場合には培地１５０ｍＱを除去し
新鮮な増殖培地１５０ｘＱを加える。
０μｇを加える。融合後７日目から融合後１０日目の間
に肉眼でハイブリッドが観察される。この時点で、融合
物に増殖培地１００μＱを加える。一般に１０日目位か
ら、スクリーニングを始める。１０日目にまたハイフ゛
リノトか観察されない場合には培地１５０ｍＱを除去し
新鮮な増殖培地１５０ｘＱを加える。
上記の免疫組織化学的方法て生存可能なハイブリトーマ
上清をβ−ＡＰ皮膚モノクローナル抗体に関してスクリ
ーニングする。
上清をβ−ＡＰ皮膚モノクローナル抗体に関してスクリ
ーニングする。
実施例■ 病理学的に確認されたＡＤ患者の観察最初の
実験では、７年間の臨床上典型的なＡＤであって、皮質
および髄膜小動脈の顕著なβ−ＡＰ陽性アミロイド血管
症を含む、重篤なＡＤ脳病巣を有する７８才男性の非角
化肛門周囲皮膚（皮膚および皮下組織を含む）を剖検で
採取した。ホルマリン固定化切片と、β一ＡＰの残基１
−３８（カンらのＮａｔｕｒｅ ３２５ ： ７３３−
７３６（１９８７）に記載されたβ−ＡＰの残基５９７
−６３４）の合戊ベプチドに対して惹起された抗血清（
表１の抗体Ｙ）との反応は、真皮の結合組織および小動
脈周囲空間に多病巣性に浣着した無晶形物質を特巽的か
つペプチト阻害的にラヘルした。病理学的にＡＤと確認
された数人の他の患者から得たこのブロノクに近接する
切片および皮膚標本（表■）を、次いで、幾つかの、充
分に特性化された純化天然β一ＡＰに対する抗体（表Ｉ
のＡ，Ｃおよび／またはＦ）、合或β一ＡＰペプチドに
対する抗体（表ＩのＹ）または無関係のタンパク質に対
する抗体（表Ｉ）を用いて試験した。試験したβＡＰ抗
体は、ＡＤ患者の真皮および皮下組織中の無晶形タンパ
ク質沈着物を特異的に免疫標識した（表■）。検出感度
は抗血清相互でかなり変化した。
実験では、７年間の臨床上典型的なＡＤであって、皮質
および髄膜小動脈の顕著なβ−ＡＰ陽性アミロイド血管
症を含む、重篤なＡＤ脳病巣を有する７８才男性の非角
化肛門周囲皮膚（皮膚および皮下組織を含む）を剖検で
採取した。ホルマリン固定化切片と、β一ＡＰの残基１
−３８（カンらのＮａｔｕｒｅ ３２５ ： ７３３−
７３６（１９８７）に記載されたβ−ＡＰの残基５９７
−６３４）の合戊ベプチドに対して惹起された抗血清（
表１の抗体Ｙ）との反応は、真皮の結合組織および小動
脈周囲空間に多病巣性に浣着した無晶形物質を特巽的か
つペプチト阻害的にラヘルした。病理学的にＡＤと確認
された数人の他の患者から得たこのブロノクに近接する
切片および皮膚標本（表■）を、次いで、幾つかの、充
分に特性化された純化天然β一ＡＰに対する抗体（表Ｉ
のＡ，Ｃおよび／またはＦ）、合或β一ＡＰペプチドに
対する抗体（表ＩのＹ）または無関係のタンパク質に対
する抗体（表Ｉ）を用いて試験した。試験したβＡＰ抗
体は、ＡＤ患者の真皮および皮下組織中の無晶形タンパ
ク質沈着物を特異的に免疫標識した（表■）。検出感度
は抗血清相互でかなり変化した。
確詔されたｌＯ人のＡＤ患者の内、７人に、皮膚の明確
な免疫反応性が認められた。２人のＡＤ患者は発色かあ
いまいてあり、１人は発色しなかった。
な免疫反応性が認められた。２人のＡＤ患者は発色かあ
いまいてあり、１人は発色しなかった。
免疫反応の特異性を厠定するために、試験した各β−Ａ
Ｐ抗血清の抗原に吸収させた、および“対照吸収”部分
と、ＡＤ脳、ＡＤ皮膚および抗原ノトノトプロットと同
時に反応させた。例えば抗血清Ａの場合には、老年斑コ
アの部分精製ＳＤＳ抽出物を吸収剤として用い；対ｐ９
吸収にはコアフラク／ヨンの不純物（リポフスチン顆粒
、コラーケンおよび微小血管断片）を含有する正常な皮
質から同様に調製したフラクションを用いた。そのよう
な各実験において、斑コア吸収によってＡＤ脳、皮膚お
よび皮下無晶形沈着のプラークおよび血管アミロイドに
おける着色、およびトソトブロソト上の抗原における着
色か著しく消滅されるか、絶滅された；これらの実験は
同一バノチの吸収抗血清を用いて同時に行った。対照吸
収は変化を来さなかった。他のβ一ＡＰ抗血清でも同様
の結果を得た。前免疫血清、第２抗体単独および精製Ｐ
ＨＦ（Ｐ）、ｔａｕタンパク質（ＤＪ）、グリア原線維
酸性タンパク質（Ｇ）、トランスサイレチン（プレアル
ブミン）（Ｔ）またはアミロイドＡＡタンパク質に対す
る高度免疫抗体（同じくアミロイドＡＡタンパク質に対
するマウスモノクローナル抗体）のいずれも皮膚沈着を
ラベルしなかった。
Ｐ抗血清の抗原に吸収させた、および“対照吸収”部分
と、ＡＤ脳、ＡＤ皮膚および抗原ノトノトプロットと同
時に反応させた。例えば抗血清Ａの場合には、老年斑コ
アの部分精製ＳＤＳ抽出物を吸収剤として用い；対ｐ９
吸収にはコアフラク／ヨンの不純物（リポフスチン顆粒
、コラーケンおよび微小血管断片）を含有する正常な皮
質から同様に調製したフラクションを用いた。そのよう
な各実験において、斑コア吸収によってＡＤ脳、皮膚お
よび皮下無晶形沈着のプラークおよび血管アミロイドに
おける着色、およびトソトブロソト上の抗原における着
色か著しく消滅されるか、絶滅された；これらの実験は
同一バノチの吸収抗血清を用いて同時に行った。対照吸
収は変化を来さなかった。他のβ一ＡＰ抗血清でも同様
の結果を得た。前免疫血清、第２抗体単独および精製Ｐ
ＨＦ（Ｐ）、ｔａｕタンパク質（ＤＪ）、グリア原線維
酸性タンパク質（Ｇ）、トランスサイレチン（プレアル
ブミン）（Ｔ）またはアミロイドＡＡタンパク質に対す
る高度免疫抗体（同じくアミロイドＡＡタンパク質に対
するマウスモノクローナル抗体）のいずれも皮膚沈着を
ラベルしなかった。
真皮に検出されたβ一ＡＰ免疫反応性沈着は上皮／真皮
連結部下方に、時には小血管または斤腺や皮脂腺等の腺
成分に近接してバ，チ状に、多病県性で分布しているよ
うてあった。着色物質は網状真皮の結合組織線維の間の
、細胞外に存在するようてあった。それは真皮の正常コ
ラーケンとエラスチン（弾力）線維の間に見いたされた
。幾つかの皮着は小血管の血管周囲に見いたされた。そ
れらの沈着に関与する微小血管は僅かであった：大多数
の血管や他の皮膚構造（斤腺および皮脂腺：毛嚢，毛幹
：平屑筋：上皮）はまったく着色せず、さらに免疫反応
性について試験した。真皮下組織中、無晶形β一ＡＰ反
応性物質は、時折微小血管の周囲、結合組織内、または
筋肉線維束周囲の細胞外に存在するようてあった。観察
された大多数の枕着は、ＡＤ脳および正常な高齢者の脳
、および遺伝性のタノチ型脳血管β−アミ口イド症（Ｄ
ｕ１ｎｅｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
，ＵＳＡ ８４ ： ５９９１−５９９４（１９８７
））の脳に存在するやや拡散したプレアミロイド沈着に
類似した無晶形で非一線維性の外観を呈していた。しか
しながら、α着は、その切片を、通常、合成β一ＡＰ抗
体による脳の広範なβ一ＡＰ沈着の免疫染色を促進する
物質であるき酸で処理するど、合成β−ＡＰに対する抗
体との反応性を失った（表ＩのＹ）。皮膚の免疫反応性
β一ＡＰ沈着は古典的なアミ口イト染色、フンコーレノ
トおよびチオフラビンＳては検出されなかった（あるい
はそれＳとの反応は非常に弱かった）。最近、ヤマダら
はＡＤ患者の皮膚はコンコーレノトで染色されないと報
告した（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ
７ ７ ： １ ３ ６ − １ ４ １ （１９８
８））。
連結部下方に、時には小血管または斤腺や皮脂腺等の腺
成分に近接してバ，チ状に、多病県性で分布しているよ
うてあった。着色物質は網状真皮の結合組織線維の間の
、細胞外に存在するようてあった。それは真皮の正常コ
ラーケンとエラスチン（弾力）線維の間に見いたされた
。幾つかの皮着は小血管の血管周囲に見いたされた。そ
れらの沈着に関与する微小血管は僅かであった：大多数
の血管や他の皮膚構造（斤腺および皮脂腺：毛嚢，毛幹
：平屑筋：上皮）はまったく着色せず、さらに免疫反応
性について試験した。真皮下組織中、無晶形β一ＡＰ反
応性物質は、時折微小血管の周囲、結合組織内、または
筋肉線維束周囲の細胞外に存在するようてあった。観察
された大多数の枕着は、ＡＤ脳および正常な高齢者の脳
、および遺伝性のタノチ型脳血管β−アミ口イド症（Ｄ
ｕ１ｎｅｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
，ＵＳＡ ８４ ： ５９９１−５９９４（１９８７
））の脳に存在するやや拡散したプレアミロイド沈着に
類似した無晶形で非一線維性の外観を呈していた。しか
しながら、α着は、その切片を、通常、合成β一ＡＰ抗
体による脳の広範なβ一ＡＰ沈着の免疫染色を促進する
物質であるき酸で処理するど、合成β−ＡＰに対する抗
体との反応性を失った（表ＩのＹ）。皮膚の免疫反応性
β一ＡＰ沈着は古典的なアミ口イト染色、フンコーレノ
トおよびチオフラビンＳては検出されなかった（あるい
はそれＳとの反応は非常に弱かった）。最近、ヤマダら
はＡＤ患者の皮膚はコンコーレノトで染色されないと報
告した（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ
７ ７ ： １ ３ ６ − １ ４ １ （１９８
８））。
実施例■ 生存患者での観察
６年間の臨床上典型的なＡＤ患者（８５才、男）の前腕
から直径３ｚｘのパンチ生検を採取し、１０％中性緩衝
化ホルマリン中で短時間（３０分間）固定化し、免疫組
織化学的に検査した。
から直径３ｚｘのパンチ生検を採取し、１０％中性緩衝
化ホルマリン中で短時間（３０分間）固定化し、免疫組
織化学的に検査した。
簡単な局部麻酔（１％リドカイン＋エピ不フィリン）注
射の後、前腕内側からパンチ生検穿孔器で皮膚標本を採
取した。本目的には、直径３ｘＩＩＩ〜７ｕのパンチ生
検か適当である。生検標本は皮膚組織約８０％と皮下組
織約２０％からなる。皮膚標本を中性緩衝化１０％ホル
マリンに約３０分間固定化した。次いで標本をホルマリ
ンから取り出し、生理学的バノファ−（０．０２％ナト
リウムアンド含有りん酸ナトリウム緩衝化生理食塩水、
ｐＨ７．６）に入れ、４℃で保存した。次いで、皮膚標
本をパラフィンにはめこみ、ミクロトームで切断した。
射の後、前腕内側からパンチ生検穿孔器で皮膚標本を採
取した。本目的には、直径３ｘＩＩＩ〜７ｕのパンチ生
検か適当である。生検標本は皮膚組織約８０％と皮下組
織約２０％からなる。皮膚標本を中性緩衝化１０％ホル
マリンに約３０分間固定化した。次いで標本をホルマリ
ンから取り出し、生理学的バノファ−（０．０２％ナト
リウムアンド含有りん酸ナトリウム緩衝化生理食塩水、
ｐＨ７．６）に入れ、４℃で保存した。次いで、皮膚標
本をパラフィンにはめこみ、ミクロトームで切断した。
直径約５〜約ｌ５μ尻の切片を通常の組織学的接着剤で
顕微鏡用スライドガラスに載せた。
顕微鏡用スライドガラスに載せた。
抗血清Ａ（表１）との反応および第２のヤギ抗ウサキＩ
ｇＧ抗体／アビンンービオチンペルオキンダーセ検出シ
ステムにおける反応によって、生存患者から得た皮膚標
本は、明視野光学顕微鏡で観察したとき、容易に認めら
れる特異的なβ一ＡＰ免疫染色を与えた。天然または合
或β−ＡＰに対する種々の抗体（表Ｉ）を用いると、抗
体Ａ，ＣおよびＦは、上記実施例■で剖検ＡＤ皮膚切片
に関して記載したと同様の組織学的特徴を有する一見、
無品形の細胞外タンパク質様沈着を中〜強度に着色した
。抗体Ｙは緩〜中程度の着色を与えた。抗血清をＡＤア
ミロイトコアの部分精製フラクンヨンに吸収させると、
抗体Ａ，ＣおよびＦによる真皮染色は消失したか、アミ
ロイドコアを含有しない脳機能対照で吸収させると、染
色は変化しなかった。合成β−ＡＰて抗体Ｙを吸収させ
ると同様の消失か認められた。皮膚切片を濃き酸（８８
％）で前処理する（５−１０分間）とβ−ＡＰ免疫反応
か消失した。ＤＡＢを用いる最終発色段階の間中、しば
しば顕微鏡で着色反応を観察して皮膚のβＡＰｉ着の適
正な免疫反応を保証した：正対照として、同時に染色し
た、免疫反応性β一ＡＰ沈着を含有することかあらかじ
め証明された剖検ＡＤ皮膚切片、および解剖によって得
たＡＤ脳を用いた。
ｇＧ抗体／アビンンービオチンペルオキンダーセ検出シ
ステムにおける反応によって、生存患者から得た皮膚標
本は、明視野光学顕微鏡で観察したとき、容易に認めら
れる特異的なβ一ＡＰ免疫染色を与えた。天然または合
或β−ＡＰに対する種々の抗体（表Ｉ）を用いると、抗
体Ａ，ＣおよびＦは、上記実施例■で剖検ＡＤ皮膚切片
に関して記載したと同様の組織学的特徴を有する一見、
無品形の細胞外タンパク質様沈着を中〜強度に着色した
。抗体Ｙは緩〜中程度の着色を与えた。抗血清をＡＤア
ミロイトコアの部分精製フラクンヨンに吸収させると、
抗体Ａ，ＣおよびＦによる真皮染色は消失したか、アミ
ロイドコアを含有しない脳機能対照で吸収させると、染
色は変化しなかった。合成β−ＡＰて抗体Ｙを吸収させ
ると同様の消失か認められた。皮膚切片を濃き酸（８８
％）で前処理する（５−１０分間）とβ−ＡＰ免疫反応
か消失した。ＤＡＢを用いる最終発色段階の間中、しば
しば顕微鏡で着色反応を観察して皮膚のβＡＰｉ着の適
正な免疫反応を保証した：正対照として、同時に染色し
た、免疫反応性β一ＡＰ沈着を含有することかあらかじ
め証明された剖検ＡＤ皮膚切片、および解剖によって得
たＡＤ脳を用いた。
表Ｉに記載したように、一般にβ−ＡＰ検出程度はＡＤ
皮質から得たβ一Ａ’Ｐ抗原に対して惹起された抗血清
Ａで皮膚標本を処理した場合に最も強く、合或β１−２
８抗原に対して惹起された抗血清Ｌで標本を処理しいた
場合に最も弱い。しかしながら、後者のβ一ＡＰの合成
断片（アミノ酸１２８かさなる）や８個またはそれ以上
のアミノ酸を含有する、より小さいβ−ＡＰ断片は、Ａ
Ｄ患者における皮膚β−ＡＰｉ着の検出に有用なペプチ
ト抗体を産生ずるための免疫原として用いることかでき
る。β−．Ａ Ｐ （またはβ−ＡＰを含有するβ−ア
ミ口イト前駆体タンパク質のβ−ＡＰ含有断片）の様々
な部分か、皮膚のβ−ＡＰ免疫検出のための抗体の製造
における特異抗原として役立ち得る。
皮質から得たβ一Ａ’Ｐ抗原に対して惹起された抗血清
Ａで皮膚標本を処理した場合に最も強く、合或β１−２
８抗原に対して惹起された抗血清Ｌで標本を処理しいた
場合に最も弱い。しかしながら、後者のβ一ＡＰの合成
断片（アミノ酸１２８かさなる）や８個またはそれ以上
のアミノ酸を含有する、より小さいβ−ＡＰ断片は、Ａ
Ｄ患者における皮膚β−ＡＰｉ着の検出に有用なペプチ
ト抗体を産生ずるための免疫原として用いることかでき
る。β−．Ａ Ｐ （またはβ−ＡＰを含有するβ−ア
ミ口イト前駆体タンパク質のβ−ＡＰ含有断片）の様々
な部分か、皮膚のβ−ＡＰ免疫検出のための抗体の製造
における特異抗原として役立ち得る。
β一ＡＰ以外の抗原に対する一連の無関係な高度免疫血
清（表１および実施例■）、並ひに第２抗体（ヤキ抗ウ
サキＩｇＧ）単独、は生検皮膚標本のβ一ＡＰ反応性沈
着に正の特異的な染色反応を示さなかった。
清（表１および実施例■）、並ひに第２抗体（ヤキ抗ウ
サキＩｇＧ）単独、は生検皮膚標本のβ一ＡＰ反応性沈
着に正の特異的な染色反応を示さなかった。
実施例■ 他の非神経性組織の検査
表Ｉ記載の■またはそれ以上のβ一ＡＰ抗体、並びに無
関係な抗血清対照を用いてＡＤ患者の幾つかの非神経性
組織を免疫細胞化学的に検査した。
関係な抗血清対照を用いてＡＤ患者の幾つかの非神経性
組織を免疫細胞化学的に検査した。
神経病理学的にＡＤと確認された２人のＡＤ患者の腸粘
膜下結合組織、とりわけ小血管周囲および血管壁にβ−
ＡＰ反応性物質の／ｉ：着か検出された。
膜下結合組織、とりわけ小血管周囲および血管壁にβ−
ＡＰ反応性物質の／ｉ：着か検出された。
そのような血管沈着は、明らかな痴呆症を示さないか脳
にＡＤに特徴的な多数の老年斑を有する高齢者（７７才
）の小腸にも認められた。免疫反応性物質の幾らかは結
合組織線維間の細胞外に位置するようてあった。腸粘膜
下の血管染色はＡＤ脳および髄膜に共通して認められる
血管および血管周囲染色と似通っていた。β−ＡＰ抗体
をＡＤ脳アミロイトファに吸収させると顕著に減少され
、または消滅されたか、対照脳部分の単離フラクソヨン
に吸収させると、反応は変化しなかった。
にＡＤに特徴的な多数の老年斑を有する高齢者（７７才
）の小腸にも認められた。免疫反応性物質の幾らかは結
合組織線維間の細胞外に位置するようてあった。腸粘膜
下の血管染色はＡＤ脳および髄膜に共通して認められる
血管および血管周囲染色と似通っていた。β−ＡＰ抗体
をＡＤ脳アミロイトファに吸収させると顕著に減少され
、または消滅されたか、対照脳部分の単離フラクソヨン
に吸収させると、反応は変化しなかった。
腸のβ−ＡＰｉ着の存在のための免疫化学的試験法
アルツハイマー症、他の神経性疾患、または高齢で死亡
した患者の結腸または小腸切片を解剖により採取し、通
常の固定化剤（例えば、１０％中性緩衝化ホルマリン）
中で固定化した。次いて、切片をバラフィン（または他
の媒質）にはめこみ、マイクロトームを用いて顕微鏡標
本（例えば、切片）を調製し、顕微鏡用スライドグラス
に載せた。
した患者の結腸または小腸切片を解剖により採取し、通
常の固定化剤（例えば、１０％中性緩衝化ホルマリン）
中で固定化した。次いて、切片をバラフィン（または他
の媒質）にはめこみ、マイクロトームを用いて顕微鏡標
本（例えば、切片）を調製し、顕微鏡用スライドグラス
に載せた。
当業者問知の常ｌ去に従い脱パラフィン処理と水分補給
を行った後、天然または合成β一ＡＰタンパク質に対す
る抗体（例えば、表Ｉ記載）と標本を接触（反応）させ
た。例えば、抗体ＡはＴｒｉｓ緩衝かまたはりん酸緩衝
化生理食塩水で１・２５０希釈して用いた。この希釈第
１抗体または、β−ＡＰ免疫原の形の第１抗体に吸収さ
せた後の対照部分のいずれかを結腸または腸切片の上に
おき、約２４時間または一夜インキユヘートした。次い
で、切片をハノファ−で洗浄し、一次抗体と反応性の第
２抗体、例えば、ヤキ抗ウサギＩｇＧ抗体とインキユヘ
ートした。第２抗体は市販されており、ビオチンと直接
結合させたものである。この反応に次いで、切片を洗浄
し、それらを市販のべルオキソダー七と結合したアビジ
ンービオチン複合体（ヘクターラホラトリー バーリン
ガム、ＣＡ）に暴露した。この反応の後、３，３ −ジ
アミノーベンジジンおよび過酸化水素と一緒にインキユ
ベートし、比色分析によって反応生成物を検出した。
を行った後、天然または合成β一ＡＰタンパク質に対す
る抗体（例えば、表Ｉ記載）と標本を接触（反応）させ
た。例えば、抗体ＡはＴｒｉｓ緩衝かまたはりん酸緩衝
化生理食塩水で１・２５０希釈して用いた。この希釈第
１抗体または、β−ＡＰ免疫原の形の第１抗体に吸収さ
せた後の対照部分のいずれかを結腸または腸切片の上に
おき、約２４時間または一夜インキユヘートした。次い
で、切片をハノファ−で洗浄し、一次抗体と反応性の第
２抗体、例えば、ヤキ抗ウサギＩｇＧ抗体とインキユヘ
ートした。第２抗体は市販されており、ビオチンと直接
結合させたものである。この反応に次いで、切片を洗浄
し、それらを市販のべルオキソダー七と結合したアビジ
ンービオチン複合体（ヘクターラホラトリー バーリン
ガム、ＣＡ）に暴露した。この反応の後、３，３ −ジ
アミノーベンジジンおよび過酸化水素と一緒にインキユ
ベートし、比色分析によって反応生成物を検出した。
免疫染色の強度を測定し、この反応の適正な反応時間を
決定するために、発色反応の間中、明視野光学顕微鏡で
標本を観察した。次いて、標本を洗浄し、乾燥しカバー
カラスを標本の上に置いた。
決定するために、発色反応の間中、明視野光学顕微鏡で
標本を観察した。次いて、標本を洗浄し、乾燥しカバー
カラスを標本の上に置いた。
そのような免疫染色した腸切片の免疫反応性βＡＰの分
析のために、明視野オプティノクスを備えた標準的な光
学顕微鏡でスライトを観察した。
析のために、明視野オプティノクスを備えた標準的な光
学顕微鏡でスライトを観察した。
第１抗体で染色された切片と、β一ＡＰ免疫原に吸収し
た後の第１抗体で染色された隣接する切片とを比較した
。（免疫原に関しては、表■の第２欄参照。）結腸のβ
一ＡＰ沈着は小血管壁と周囲の粘膜内結合組織に観察さ
れた。褐色の反応生底物はしばしば小血管（小動脈等）
の外壁の曲がりくねった袖と類似していた。解剖でアル
ッハイマー症と確認された２人の死亡患者の腸切片につ
き、試験した両症例でそのような血管および血管周囲の
粘膜の結腸沈着が認められた（表■参照）。他の疾患で
死亡した２人の患者から得た腸切片のうち、高齢者（７
７才またはそれ以上）から得た切片のみにβ−ＡＰ免疫
反応性沈着を有する腸粘膜下血管が幾らか認められた。
た後の第１抗体で染色された隣接する切片とを比較した
。（免疫原に関しては、表■の第２欄参照。）結腸のβ
一ＡＰ沈着は小血管壁と周囲の粘膜内結合組織に観察さ
れた。褐色の反応生底物はしばしば小血管（小動脈等）
の外壁の曲がりくねった袖と類似していた。解剖でアル
ッハイマー症と確認された２人の死亡患者の腸切片につ
き、試験した両症例でそのような血管および血管周囲の
粘膜の結腸沈着が認められた（表■参照）。他の疾患で
死亡した２人の患者から得た腸切片のうち、高齢者（７
７才またはそれ以上）から得た切片のみにβ−ＡＰ免疫
反応性沈着を有する腸粘膜下血管が幾らか認められた。
６３才以下の患者から得た腸標本はこれらの実験て血管
周囲β−ＡＰ７ｉ′着を示さなかった。
周囲β−ＡＰ７ｉ′着を示さなかった。
ＡＤ患者および非ＡＤ患者から得た結腸および小腸標本
についてさＳに免疫組織化学的実験を行い、免疫染色し
た両切片を上記のようにして予め陽性であることか判明
した既知の結腸標本と比較した。新しい切片の各々を、
予め陰性であることか既知の結腸標本とも比較した。
についてさＳに免疫組織化学的実験を行い、免疫染色し
た両切片を上記のようにして予め陽性であることか判明
した既知の結腸標本と比較した。新しい切片の各々を、
予め陰性であることか既知の結腸標本とも比較した。
光学顕微鏡観察によるβ−ＡＰ免疫反応性物質の位置の
同定は、この、結腸および小腸の粘膜下結合組織内の選
択された血管内においてのみ容易であった。ＡＤ患者お
よびある正常な高齢者からのβ−ＡＰ陽性切片中、多く
の腸血管かβ−ＡＰ反応性を欠いていたが、幾つかはベ
ルオキシターゼ陽性（褐色）免疫反応性沈着を含有して
いた。血管周囲および粘膜のより深部の結合組織にもい
くらかの免疫反応性β−ＡＰｉ着が観察された。
同定は、この、結腸および小腸の粘膜下結合組織内の選
択された血管内においてのみ容易であった。ＡＤ患者お
よびある正常な高齢者からのβ−ＡＰ陽性切片中、多く
の腸血管かβ−ＡＰ反応性を欠いていたが、幾つかはベ
ルオキシターゼ陽性（褐色）免疫反応性沈着を含有して
いた。血管周囲および粘膜のより深部の結合組織にもい
くらかの免疫反応性β−ＡＰｉ着が観察された。
上記の実験に加えて、抗体Ｙ（表■参照）を希釈度１
５００、抗体ＣおよびＦを希釈度１・２ＳＯて用いて、
ＡＤおよび，ＩＩＥＡＤ腸切片についてさらに実験を行
った。他の点に関しては、これらの実験と同様の方法、
並ひに正対照および負対μ，召を用いた。
５００、抗体ＣおよびＦを希釈度１・２ＳＯて用いて、
ＡＤおよび，ＩＩＥＡＤ腸切片についてさらに実験を行
った。他の点に関しては、これらの実験と同様の方法、
並ひに正対照および負対μ，召を用いた。
本実施例記載のＡＤおよび非ＡＤ患者由来の腸標本を用
いる実験の結果は表Ｈに例示されている。
いる実験の結果は表Ｈに例示されている。
実施例Ｖ 対照試験
正常な加令の場合にも脳血管および脳β一ＡＰ枕着か起
きるので、４１人のヒト対象から得た神経性組織標本を
比較した：１１人．ＡＤ、２６人非ＡＤ、４人；トリソ
ミ−２１（ダウン症）（表■参照）。４人以外の全員は
剖検による詳細な神経病理学的検査で正確に神経学的診
断を下されていた。１１のＡＤ症例の内８症例は神経病
理学的染色でβ−ＡＰ一反応性の真皮沈着を示した。
きるので、４１人のヒト対象から得た神経性組織標本を
比較した：１１人．ＡＤ、２６人非ＡＤ、４人；トリソ
ミ−２１（ダウン症）（表■参照）。４人以外の全員は
剖検による詳細な神経病理学的検査で正確に神経学的診
断を下されていた。１１のＡＤ症例の内８症例は神経病
理学的染色でβ−ＡＰ一反応性の真皮沈着を示した。
方、１４人の６３才以下の非痴呆症全員の皮膚からはβ
一ＡＰ免疫反応性物質が検出されなかった。
一ＡＰ免疫反応性物質が検出されなかった。
ＡＤでない７人の高齢神経学的疾患患者の内４人は陰性
であり、３人は陽性であった。５人の正常な高齢者（≧
６３才）の内、３人は陰性であり、２人が皮膚に僅かに
着色する不明確なβ一ＡＰ反応性物質の存在を示した。
であり、３人は陽性であった。５人の正常な高齢者（≧
６３才）の内、３人は陰性であり、２人が皮膚に僅かに
着色する不明確なβ一ＡＰ反応性物質の存在を示した。
高齢の病人と正常対象における沈着の組織学的特徴は実
施例■記載のΔＤ患者のそれと同様であった。
施例■記載のΔＤ患者のそれと同様であった。
実施例■ 診断用キット
表Ｈの結果は本発明かＡＤの検査に診断上有用であるこ
とを示すものである。アルッハイマー症の診断用キット
は、例えば、下記の試薬（２０アッセイキット用に代表
的な量および濃度を記載した）を別個にパ，ケージング
（包装）シテモヨイ。
とを示すものである。アルッハイマー症の診断用キット
は、例えば、下記の試薬（２０アッセイキット用に代表
的な量および濃度を記載した）を別個にパ，ケージング
（包装）シテモヨイ。
試薬 含量 濃度 供給源ホルマリン
５村 １０％ 一〜抗β一ＡＰ抗体
５籾 １０ｒｔｒ９／７１（ｌ 不ズミモノクロ
ーナルＩｇＧ 抗マウスＩｇＧ ５村 ５０μｇ／触 ヤギ（ビ
オチン標識） アビシンＨＲＰ りん酸緩衝化 食塩水 ５ｒｐＱ Ｏ， ５ ｔｔ ９／ ｒｔｒ１２２５
村 当業者にとっては自明のことであるか、上記の試薬のａ
度および量は個々の適用に応じて変化される。
５村 １０％ 一〜抗β一ＡＰ抗体
５籾 １０ｒｔｒ９／７１（ｌ 不ズミモノクロ
ーナルＩｇＧ 抗マウスＩｇＧ ５村 ５０μｇ／触 ヤギ（ビ
オチン標識） アビシンＨＲＰ りん酸緩衝化 食塩水 ５ｒｐＱ Ｏ， ５ ｔｔ ９／ ｒｔｒ１２２５
村 当業者にとっては自明のことであるか、上記の試薬のａ
度および量は個々の適用に応じて変化される。
実施例■ 皮膚または池の非神経性組織のβ−アミロイ
ド反応性の定量 β一ＡＰ反応性の定量的競合的イムノアッセイは以下の
ごとく構戊し得る・１）結合したβ一ＡＰ含有物質（例
えば、天然の、純化β−ＡＰ，または合戊β一ＡＰまた
は組織から単離したβ〜ＡＰフィラメント）、２）標識
した抗β〜ＡＰ抗体、および３）標準曲線を作成するた
めの一連のβＡＰタンパク質標準。これらの成分を個別
に包装することが好ましい。抗体の“標識′゛は、当該
技術分野で通常用いられる、酵素（西洋ワサビベルオキ
／ターセ、アルカリホスファターゼ）、発蛍光団または
放射性同位元素等である。
ド反応性の定量 β一ＡＰ反応性の定量的競合的イムノアッセイは以下の
ごとく構戊し得る・１）結合したβ一ＡＰ含有物質（例
えば、天然の、純化β−ＡＰ，または合戊β一ＡＰまた
は組織から単離したβ〜ＡＰフィラメント）、２）標識
した抗β〜ＡＰ抗体、および３）標準曲線を作成するた
めの一連のβＡＰタンパク質標準。これらの成分を個別
に包装することが好ましい。抗体の“標識′゛は、当該
技術分野で通常用いられる、酵素（西洋ワサビベルオキ
／ターセ、アルカリホスファターゼ）、発蛍光団または
放射性同位元素等である。
種々の濃度のβ一ＡＰタンパク質と一緒に、既知量の抗
β−ＡＰタンパク質をプレインキユベーションした後、
上清を固相に結合したβ一ＡＰと一緒にインキユベーシ
ョンする。結合した標識の検出の後、競合的標準曲線を
作成し、これを用いて未知の皮膚（または他の非神経性
組織）抽出物中の可溶化β−ＡＰ（またはβ一ＡＰ含有
β一ＡＰフラグメント）の濃度を定量する。
β−ＡＰタンパク質をプレインキユベーションした後、
上清を固相に結合したβ一ＡＰと一緒にインキユベーシ
ョンする。結合した標識の検出の後、競合的標準曲線を
作成し、これを用いて未知の皮膚（または他の非神経性
組織）抽出物中の可溶化β−ＡＰ（またはβ一ＡＰ含有
β一ＡＰフラグメント）の濃度を定量する。
この定量的イム／アノセイは、β−ＡＰか実際は溶ｌ夜
状になっていない微細化皮膚漂本せ濁物（即ち、β−Ａ
Ｐか依然として不溶性のままである）を用いても行うこ
とかできる。
状になっていない微細化皮膚漂本せ濁物（即ち、β−Ａ
Ｐか依然として不溶性のままである）を用いても行うこ
とかできる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、非神経組織の生検標本を採取し； 標本の少なくとも一部と、β−アミロイドタンパク質、
β−アミロイドタンパク質を含有するβ−アミロイドタ
ンパク質前駆体フラグメント、または約８アミノ酸また
はそれ以上の個数のアミノ酸からなるβ−アミロイドペ
プチドフラグメントを認識し得る少なくとも１個の抗体
とを接触させ；接触させた標本と抗体との反応の程度を
監視する工程からなるアルツハイマー症の診断における
検査法。 ２、非神経組織生検標本が皮膚または腸の生検標本であ
って、抗体がβ−アミロイドタンパク質またはβ−アミ
ロイドタンパク質を含有するβ−アミロイドタンパク質
前駆体フラグメントに対する抗体である請求項１記載の
方法。 ３、抗体がアルツハイマー症患者またはダウン症候群患
者から得られたβ−アミロイドタンパク質またはβ−ア
ミロイドタンパク質を含有するβ−アミロイドタンパク
質前駆体フラグメントに対する抗体である請求項１記載
の方法。 ４、抗体が該患者の大脳皮質から得られたβ−アミロイ
ドタンパク質またはβ−アミロイドタンパク質を含有す
るβ−アミロイドタンパク質前駆体フラグメントに対す
る抗体である請求項３記載の方法。 ５、抗体が該患者の皮膚または他の非神経組織から得ら
れたβ−アミロイドタンパク質またはβ−アミロイドタ
ンパク質を含有するβ−アミロイドタンパク質前駆体フ
ラグメントに対する抗体である請求項３記載の方法。 ６、接触および監視工程が、標本からβ−アミロイドタ
ンパク質を抽出し、その中のβ−アミロイドタンパク質
含有量を測定するための標準的な分析を行うことで実施
される請求項２記載の方法。 ７、接触および監視工程が、皮膚標本と抗体とを免疫組
織化学的に反応させた後、標本中の反応を検出すること
で行われる請求項２記載の方法。 ８、さらに、抗体をあらかじめβ−アミロイドタンパク
質含有抗原に吸収させ； あらかじめ吸収させた抗体と、皮膚標本の抗体に接触し
ていない部分または同一患者から得た第２の皮膚標本と
を接触させ； あらかじめ吸収させた抗体と、皮膚標本の一部または第
２の皮膚標本との反応の程度を測定することからなるコ
ントロール試験をも行うことを含む請求項７記載の方法
。 ９、抗体がポリクローナル抗体である請求項３記載の方
法。 １０、抗体がモノクローナル抗体である請求項３記載の
方法。 １１、非神経組織の生検標本を採取し； 生検標本からのβ−アミロイドタンパク質、またはβ−
アミロイドタンパク質を含有するβ−アミロイドタンパ
ク質前駆体フラグメントの抽出に適した方法で該生検標
本から抽出物標本を得；所望により、抽出物中のβ−ア
ミロイドタンパク質またはβ−アミロイドタンパク質を
含有するβ−アミロイドタンパク質前駆体フラグメント
を可溶化して溶液標本を得； 抽出物標本または溶液標本を、β−アミロイドタンパク
質、β−アミロイドタンパク質を含有するβ−アミロイ
ドタンパク質前駆体フラグメントあるいは８個またはそ
れ以上のアミノ酸からなるβ−アミロイドタンパク質の
ペプチドフラグメントに対する抗体と接触させ； 抽出物標本または溶液標本中での、抗体と、β−アミロ
イドタンパク質またはβ−アミロイドタンパク質を含有
するβ−アミロイドタンパク質前駆体フラグメントとの
反応の程度を監視する工程からなるアルツハイマー症の
診断における検査法。 １２、非神経組織が皮膚または腸であり、抗体がアルツ
ハイマー症またはダウン症候群患者から得たβ−アミロ
イドタンパク質またはβ−アミロイドタンパク質を含有
するβ−アミロイドタンパク質前駆体フラグメントに対
するものである請求項１１記載の方法。 １３、抗体が該患者の大脳皮質から得られたタンパク質
に対するものである請求項１２記載の方法。 １４、抗体が該患者の皮膚または他の非−神経組織から
得られたタンパク質に対するものである請求項１２記載
の方法。 １５、抗体がポリクローナル抗体である請求項１２記載
の方法。 １６、抗体がモノクローナル抗体である請求項１２記載
の方法。 １７、抗体がポリクローナル抗体である請求項１３記載
の方法。 １８、抗体がモノクローナル抗体である請求項１３記載
の方法。 １９、抗体がポリクローナル抗体である請求項１４記載
の方法。 ２０、抗体がモノクローナル抗体である請求項１４記載
の方法。 ２１、アルツハイマー症の診断に用いるキットであって
： β−アミロイドタンパク質、β−アミロイドタンパク質
を含有するβ−アミロイドタンパク質前駆体フラグメン
ト、または少なくとも約８個のアミノ酸からなるβ−ア
ミロイドタンパク質フラグメントを認識し得る抗体；お
よび抗体と非神経組織標本との反応程度の検出手段とを
有するキット。 ２２、抗体がアルツハイマー症患者から得られたβ−ア
ミロイドタンパク質に対する抗体である請求項２１記載
のキット。 ２３、抗体が該患者の大脳皮質から得られたβ−アミロ
イドタンパク質に対する抗体である請求項２２記載のキ
ット。 ２４、抗体が該患者の皮膚または他の非神経組織から得
られたβ−アミロイドタンパク質またはβ−アミロイド
タンパク質を含有するβ−アミロイドタンパク質前駆体
フラグメントに対する抗体である請求項２２記載のキッ
ト。 ２５、さらに、β−アミロイドタンパク質、β−アミロ
イドタンパク質を含有するβ−アミロイドタンパク質前
駆体フラグメント、または少なくとも約８個のアミノ酸
からなるβ−アミロイドタンパク質フラグメントをも含
有する請求項２３記載のキット。 ２６、さらに、β−アミロイドタンパク質またはβ−ア
ミロイドタンパク質を含有するβ−アミロイドタンパク
質前駆体フラグメント、または少なくとも８個のアミノ
酸からなるβ−アミロイドタンパク質フラグメントをも
含有する請求項２４記載のキット。 ２７、競合的イムノアッセイに用いるように設計されて
おり、さらに、固相を有し、その固相にタンパク質、タ
ンパク質フラグメントまたはペプチドフラグメントが結
合している請求項２５記載のキット。 ２８、競合的イムノアッセイに用いるように設計されて
おり、さらに、固相を有し、その固相にタンパク質、タ
ンパク質フラグメントまたはペプチドフラグメントが結
合している請求項２６記載のキット。 ２９、対照として、既知量のタンパク質、タンパク質フ
ラグメント、またはペプチドフラグメントを有する請求
項２５記載のキット。 ３０、対照として、既知量のタンパク質、タンパク質フ
ラグメント、またはペプチドフラグメントを有する請求
項２６記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/410,138 US5262332A (en) | 1989-04-05 | 1989-09-19 | Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue |
| US410138 | 1989-09-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03206958A true JPH03206958A (ja) | 1991-09-10 |
Family
ID=23623388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24860690A Pending JPH03206958A (ja) | 1989-09-19 | 1990-09-17 | アルツハイマー症の診断における非神経組織の検査法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03206958A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008519988A (ja) * | 2004-11-12 | 2008-06-12 | ファイザー・インク | アミロイド−ベータペプチドを測定する方法 |
-
1990
- 1990-09-17 JP JP24860690A patent/JPH03206958A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008519988A (ja) * | 2004-11-12 | 2008-06-12 | ファイザー・インク | アミロイド−ベータペプチドを測定する方法 |
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