JPH03183496A - ヒトα↓２―プラスミンインヒビタープロ領域のアミノ酸配列、そのＤＮＡ配列およびそれを用いた蛋白の発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、ヒトα２−プラスミンインヒビター（以下、
ヒトα２　　ＰＩという）プロｆＩ域の新規なアミノ酸
配列、それをコードするＤＮＡ配列、およびそれをリー
ダーシーフェンスとして用いるヒトα２〜ＰＩの発現方
法に関するものである。

〈従来技術〉 ヒトα２　　ＰＩは、青水と緒井によって最初に単離・
精製され、線維素溶解酵素のプラスミン（ｐｌａｓｍｉ
ｎ　）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害する強力なプ
ラスミンインヒビタ−であり、１１．７％の糖鎖を含む
分子量的６７．０００の１本鎖の糖蛋白質であることが
知られている［Ｍ、　Ｍｏｒｏ＋　　＆Ｎ、　Ａｏｋｉ
　　；　Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ
ａｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　２５１．　５９５
６−５９６５　（１９７６）参照］。

本発明者らは、すでに特開昭６３−７９５９６号、特開
昭６３−１５７９８４号および特開昭６４−２５７７号
において、提案した通り、ヒト肝細胞のｃＤ　Ｎ　Ａラ
イブラリーより、ヒトα２　　ＰＩの相補ＤＮＡ　（以
下ｃＮＤＡという）を単離し、その構造からヒトα２−
ＰＩのアミノ酸配列を決定した。このヒトα２ＰＩのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａを用いることによりヒトα２ＰＩを細胞を用
いて発現させ、有利に生産させることが可能となった。

ここで天然型ヒトα２　　ＰＩのアミノ酸配列は第１図
の通りである。第１図において、−３９番めのアミノ酸
から−１３番めのアミノ酸部分は、ヒトα２　　ＰＩの
プレ領域、−１２番めのアミノ酸から一１番目のアミノ
酸部分は、ヒトα２　　ＰＩのプロ領域という。これら
のプレープロ領域はヒトαｚ　　ＰＩが細胞から分泌さ
れる過程において、まずプレ領域が、次にプロ領域が酵
素によって切断されるものと考えられている。従って、
ヒト血中に存在する成熟α２　　ＰＩは第１図における
１番めのアミノ酸から４５２番めのアミノ酸からなるも
のである。

しかしながら、ｃＤ　Ｎ　Ａを用いたヒトα２−Ｐｌの
発現方法によって得られた蛋白の中には成熟ヒトα２　
　ＰＩのアミノ末端にプロベブヂドが付加された蛋白が
混在していることがわかった（Ｙ。

Ｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
　１０６．　７０３−７０７（１９８９）参照）。

〈発明の目的〉 そこで、本発明者らは細胞からヒトα２−ＰＩを発現さ
せる方法において、成熟ヒトα２　　ＰＩと同じアミノ
末端を有する蛋白を得ることを目的として鋭意研究を重
ねた結果、ヒトα２−ＰＩのプロ領域のアミノ酸配列を
改変することによって、成熟ヒトα２−ＰＩと同じアミ
ノ末端を有する蛋白を得ることが可能となることを見い
出したものである。

〈発明の構成〉 すなわち本発明はヒトα２−ＰＩプロ領域においてアミ
ノ酸配列の−４番めと−１番めのアミノ酸がそれぞれ独
立にＡｒｇ又はＬｙｓであることを特徴とするヒトα２
−ＰＩプロ領域のアミノ酸配列、該アミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列および該ＤＮＡ配列をリーダーシーフ
ェンスとして用いることを特徴とするヒトα２−ＰＩの
発現方法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のヒトα２　　ＰＩプロ領域におけるアミノ酸配
列の改変は、−４番目と−１番めのアミノ酸、−３番め
から一１番目のアミノ酸または−４番め、−２番目およ
び−１番めのアミノ酸をそれぞれ独立に塩基性のアミノ
酸に改変することである。塩基性のアミノ酸としてはＡ
ｒｇ又はＬｙＳが挙げられる。ここで、改変部位として
は、−４番めから−１番めのアミノ酸のすべてをそれぞ
れ独立に塩基性のアミノ酸に改変することが好ましく、
４番目から１番めのアミノ酸のすべてをＡｒｃに改変す
ることが特に好ましい。

４番めと−１番めのアミノ酸をそれぞれ独立に塩基性の
アミノ酸に改変した場合、−３番目目のアミノ酸は特に
指定しないが、中性アミノ酸であっても良く、その場合
、Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ、　Ｖａｌ。

Ａｌａ、　Ｌｅｕ、　　Ｉ　ｌｅ、などが挙げられる。

また−２番めのアミノ酸は特に指定しないが、ｍ単性ア
ミノ酸であることがより望ましく、またＴｈｒであって
も良い。

＝４番め、−２番め、−１番めのアミノ酸をそれぞれ独
立に塩基性のアミノ酸に改変した場合、３番めのアミノ
酸は特に指定しないが、中性アミノ酸テアッテも良く、
Ｐｒｏ、　Ｐｈｅ、　Ｖａｔ、　Ａｌａ。

ｌｅＵ、）ｌｅなどが挙げられる。またＧｌｎであって
も良い。

上記本発明のヒトα２−ＰＩプロ領域のアミノ酸配列は
そのアミノ酸末端側にヒトα２．ＰＩブレ領域のアミノ
酸配列を結合し、そのカルボキシル基末端側にヒト成熟
α２−ＰＩのアミノ酸配列を結合して、ヒトα２　　Ｐ
Ｉの発現に用いられる。

このとき、ヒトα２　　ＰＩブレ領域のアミノ酸配列ま
たは成熟ヒトα２　　ＰＩのアミノ酸配列は天然型と同
じものであってもよいし、改変されていてもよい。

本発明の改変されたプロ領域を含むヒトα２−ＰＩのア
ミノ酸配列は、例えば遺伝子操作技術を利用して対応す
るＤＮＡ配列を適当な発現用ベクターに組み込み、宿主
となる動物細胞をトランスフェクトし、得られる形質転
換細胞を培養することにより、目的とする蛋白を製造す
ることができる。

本発明のプロ領域を含むヒトα２−ＰＩをコードするＤ
ＮＡ配列は、ヒトの染色体から単離したもの［口ｉｒｏ
ｓａｗａ　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８５．　６８３６−６
８４０（１９８８）　］又はヒトの細胞から１１１１ｉ
シたメッセンジャーＲＮＡを鋳型として生合成されたも
の［３ｕ＊ｉ　Ｙ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　　１００．　１３９９−１４０２（１９８６）
　］を改変したものであってもよく、或いは本発明のプ
ロ領域を含むヒトα２　　ＰＩのアミノ酸配列に従って
純粋に合成されたものであってもよい。

ここで、本発明で用いられるアミノ酸配列およびＤＮＡ
配列の具体例としては、例えば第３図に示ずもの等が挙
げられるが、このＤＮＡ配列は、ヒト染色体由来のα２
　　ＰＩ遺伝子断片におけると同様に、適宜１つ又はそ
れ以上のイントロンが介在していてもよい。また、上記
ＤＮＡ配列は、同じアミノ酸をコードする限り他のコド
ンと入れ替わっていてもよい。

以上述べた如くして造成される本発明のヒトα２−Ｐｌ
をコードするＤＮＡ配列は、宿主ベクター系に応じて適
当に選ばれた発現用ベクターに組み込まれる。

そのような発現ベクターに使用するプロモーター系には
特に制限はないが、アデノウィルスプロモーターＳＶ４
０プロモーター（初期、後期）、メタロチオネインプロ
モーター等があげられる。エンハンサ−は、使用しなく
ても良いが、高効率に発現させるためには用いることが
望ましい。また、ポリＡ付加シグナルはヒトα２　　Ｐ
ＩのｃＤ　Ｎ　Ａに含まれているものでも良いが、他の
蛋白のシグナルを用いても可能である。

発現に用いる動物細胞は、肝細胞、腎Ｉｔ胞などが好ま
しいが、必ずしもこの限りではない。具体的にはＢＨＫ
−２１（ベイビーハムスター腎；［３ａｂｙ　Ｈａｍｓ
ｔｅｒ　　Ｋｉｄｎｅｙ　＞細胞、Ｃ１−１０（チャイ
ニーズハムスター叩出；　ＣｈｉｎｅＳｅ　　口ａｌｓ
ｔｅｒ□ｖａｒｙ）細胞、２９３（ヒト腎）細胞、チャ
ンリバー　（Ｃｈａｎｇ　　ｌ　１ｖｅｒ；ヒト肝）細
胞、目ｅＬａ（ヒト子宮脛癌）細胞１口ｅｐＧ２（ヒト
肝癌）ｌ［＋胞などが掲げられる。

発現ベクターへの導入方法はボッターらのエレクトロポ
レーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　）（
ｐ　ｏｔｔｅｒ口、　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、
　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ　、　Ｓ　、　Ａ　、　８１．７１６１　（１９８４
）参照）やウィグラーらのリン酸カルシウム法（Ｗｉａ
ｌｅｒ　　Ｍ、　ｅｔａｌ、、Ｃｅ１ｌ　１４．　７２
５（１９７８）参照〉によっておこなうことができる。

かくして得られる形質転換細胞は、それぞれのｍ胞に適
合した条件下に常法で培養し、その培養液から目的とす
る本発明の蛋白を回収することができる。

次に本発明の発現ベクターの作製方法について詳細に説
明する。

ブＯペプチド改変型ヒトα２−ＰＩの発現ベクターの作
製には、天然型のヒトα２−ＰＩをコードするｃＤ　Ｎ
　Ａクローンｐｐｉ１４２を、その基礎に用いた。この
ｐｐＨ４２は本発明者らが先に出願した特開昭６４−２
５７７号公報に記載された方法によってヒト肝細胞由来
のｃＤ　Ｎ　Ａライブラリーをスクリーニングして得ら
れたものである。

ヒトα２−ＰＩのプロペプチド部分の改変は、天然型の
ｃＤＮＡクローンを基にしておこなうことができる。そ
の改変は合成りＮＡを用いたカセット変異法よっても良
いし、オリゴヌクレオチドディレクティドインビトロミ
ュータジェネシス法（Ｑ　ｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

ｍｕｔａｇｅｎｅｓｔｓ　ｇ＋ｅｔｈｏｄ　）によッテ
も可能である。

今回我々は、合成りＮＡを用いたカセット変異法によっ
て改変をおこなった。第２図に示すようにヒトα２　　
ＰＩのＣＤ　Ｎ　Ａの開始コドンＡＴＧの八から３′下
流側へ１７６番目にあるＢａ１１までを合成［）ＮＡフ
ラグメントと置換する方法によった。

即ち、下記合成りＮＡ（Ｉ）〜（Ｖｌ）５′ ＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡ　　ＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴ　　Ｃ
ＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡ　　ＧＣＴＧ
ＧＴＣＣＴＧ　　ＣＣＴＧＣＡＡＧＧ３′　　・・・（
Ｉ） ５′ ＣＣ０ＣＴＯＣＴＣＣ ＧＴＧＴＴＣＴＣＣＣ ＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣ ＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣ ＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣ ＡＧＣＴＡＮＮＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮＮＡＡＣ ３′　　・・・（ＩＩ） ５’　　ＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧ　　ＴＧＴＣＣＣＣＡＣ
Ｔ　　ＴＡＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡ　　
ＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧ３′　　・
・・（ｎｌ） ５’　　ＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴ
ＧＧＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＧＡＧＧＡＧ　ＧＧＴＡＡ
ＧＴＧＧＧ　ＧＡＣＡ　　３’　・　（ｒＶ）５′ ＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧ　　ＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮ　　Ｎ
ＮＮＮＮＴＡＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＣＡＡ　　ＧＧＧＣ
ＴＣＣＡＴＧ　ＧＣＧＣＴＣＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＣ
ＡＣ３’　　　・　ｍ５’　　ＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧ　
　ＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣ
ＡＣＣＡＧＧ　ＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡ　　ＧＣＡＧＣＧ
ＣＣＡＴＧＴＴＣＧ　　３’ ・・・（Ｖｌ＞ を合成し、アニールさせることによって、下記ＤＮＡフ
ラグメント（■）トーー（Ｉ　） ＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡ ＣＴＴＧＴ ＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴ ＡＣＣＧＣＧＡＣＧＡ ＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣ ＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧ ＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡ ＧＡＣＣＡＣＧＡＧＴ ＧＣＴＧＧＴＣＣＴＧ ＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣ ＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣ ＧＧＡＣＧＴＴＣＣＧ ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＧ ＧＧＧＡＣＧＡＧＧＣ ＴＧＴＴＣＴＣＣＣＣ ＡＣＡＡＧＡＧＧＧＧ ＴＧＴＧＡＧＣＧＣＣ ＡＣＡＣＴＣＧＣＧＧ ＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴ ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡ ＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡ ＡＣＣＣＧＧＣＣＧＴ ＧＣＴＡＮＮＮＮＮＮ ＣＧＡＴＮＮＮＮＮＮ ＮＮＮＮＮＮＡＡＣＣ ＮＮＮＮＮＮＴＴＧＧ ＡＧＧＡＧＣＡＧＧＴ ＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡ ＧＴＣＣＣＣＡＣＴＴ ＣＡＧＧＧＧＴＧＡＡ ＡＣＣＣＴＣＣＴＣＡ ＴＧＧＧＡＧＧＴＧＴ ＡＧＴＴＧＧＧＣＡＡ ＴＣＡＡＣＣＣＧＴＴ ＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴ ＧＧＴＣＣＴＣＧＧＡ ＧＧＴＧＧＣＣＡＧ ＣＣＡＣＣＧＧＴＣＴ　　ＴＡＡ （ＩＶ）−→ ・・・（■〉 を得ることができる。ここでＮで示した１２塩基対のＤ
ＮＡは、本発明に於けるプロ領域の−４番めから−１番
めのアミノ酸をコードする部分に相当し、ユニバーサル
コドンを用いて適当なアミノ酸をコードし、合成りＮＡ
　（ＩＩ＞と合成ＤＮＡ　（Ｖ）は互いに相補鎖となる
ような組合せから選ぶことができる。このＤＮＡフラグ
メントＮを、プラスミドベクター例えばｐｓ　Ｖ　２−
ｎｅｏのＢａ１口■。

ＥＣ０ＲＩサイトにクローニングし、これをＥｃｏＲｌ
、Ｂａ１Ｉｒ切断し、ヒトα２−ＰＩをコードするＣＤ
　Ｎ　Ａの開始コドンＡＴＧのＡから３′下流側へ１７
６番目にある３ａｌ■よりも３′下流域のＣＤ　Ｎ　Ａ
フラグメントを組込むことにより、目的とするプロペプ
チド改変型のヒトα２−Ｐ１発現ベクターを作製するこ
とができる。

〈発明の効果〉 本発明はヒトα２−ＰＩのプロＧＩＩ４のアミノ酸配列
の一部を塩基性のアミノ酸に改変することによってプロ
ペプチドと血中成熟蛋白とのプロセシングをより一層容
易に進行させることが可能となつたのである。このよう
にして得られたヒトα２−ＰＩは、成熟ヒトα２−ＰＩ
と同じアミノ末端を有しており、ヒトαｚ　　ＰＩの欠
損症等に対する補充療法に有効に用いることができる。

〈実施例〉 以下、実施例を掲げて本発明を説明する。

なお、本明細書及び図面において、アミノ酸。

ポリペプチドはＩＬ７ＰＡＣ−ＩＬＩＢ生化学委員会（
ＣＢＮ＞で採用された方法により略記するものとし、た
とえば下記の略号を用いる。

Ａｌａｌ−−アラニン ＡｒＣＩＬ−アルギニン Ａｓｎ１−−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン 口ｉｓ　　Ｌ−ヒスチジン １１ｅＬ−インロイシン １−ｅｕＬ−ロイシン ＬｙｓＬ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ｐｈｅＬ−フェニルアラニン ｐｒｏＬ−プロリン ３ｅｒＬ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれ塩基の種類で略記するものとし、た
とえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。〉Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）実施例１ プロペブチ改　型ヒトα２−ブースミンインヒビターの
　　ベクター（ ［ＤＮＡの合成］ ９０６〉 の作製 合成りＮＡＳ３０１ ＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡ　　ＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴ　　Ｃ
ＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡ　　ＧＣＴＧ
ＧＴＣＣＴＧ　　ＣＣＴＧＣＡＡＧＧ合成りＮＡＳ３０
２ ＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣ ＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣ ＡＣＧＴＣＧＴＡＡＣ ＧＴＧＴＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＴＧＧＧ
ＣＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＧＴＡＧ合成りＮＡＳ３０３ ＣＡＧＧＡＧＣＡＧＧ ＡＡＧＴＴＧＧＧＣＡ ＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴ ＡＣＣＡＧＧＡＧＣＣ ＴＡＣＣＣＴＣＣＴＣ ＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧ 合成りＮＡＳ３０４ ＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣ ＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣ ＴＧＧＴＴＧＣＣＣＡ ＡＣＴＴＧＡＧＧＡＧ ＧＧＴＡＡＧＴＧＧＧ ＡＣＡ 合成りＮＡ　　５３０５ ＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧ ＧＣＣＧＧＣＣＣＡＡ ＧＧＧＡＧＡＡＣＡＣ ＧＴＴＡＣＧＡＣＧＴ ＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧ ＣＴＡＣＧＴＡＧＣＴ ＧＣＧＣＴＣＡＣＡＧ 合成りＮＡＳ３０６ ＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧ ＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧ ＴＴＣＧ ＣＣＴＴＧＣＡＧＧＣ ＡＧＣＣＣＣＣＡＧＡ ＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴ ＧＣＡＧＣＧＣＣＡＴ 上記６種のＤＮＡをＤＮＡシンセサイザー（Ａ　１ｌｐ
ｌｉｅｄ　　Ｂ　１ｏｓｙｓｔｅ■Ｓ社製〉によって合
或し、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって精製した。

［ｐｓＶ２０ｏ７の作製１ Ｓ　　３０２．　　Ｓ　　３０３．　　Ｓ　　３０５．
　　Ｓ　　３０６各々１μ９にそれぞれ１０×キナーゼ
用バツフアー（０，５ＭＴ　ｒｉｓ−口Ｃ１（９口　７
．６）　　、　　０．１Ｍ　　Ｍ（ｌ　Ｃ１ｚ　　、　
　５０１Ｍジチオスレイトール、１ｓＭスペルミジン。

１　　ｍＭ　　ＥＤＴＡ）５μ旦、　　０．２Ｍ　　Ａ
ＴＰ溶液２．５μ文を加え水を加えて最終４８μ旦とし
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２μ皇（２０ユニツト
〉を加え、３７℃で約２時間反応させた後、フェノール
・クロロホルム混液（１：１）５０ｕ文で２回蛋白抽出
除去した。この各々の水溶液から５μ文（０，１μｇ）
ずつ取り混合し、これにさらに５μ文の３３０１（０，
１μｇ）と５μ文の３３０４（０，１μ３〉を加え、９
０℃で５分間加熱し、室温まで約１０時間かけて徐々に
冷却し、各々の合成りＮＡをアニールさせ、合成りＮＡ
フラグメント溶液とした。

一方、ｐｓ　Ｖ　２−ｎｅｏベクター（３ｉｍｏｎｓｅ
ｎ　Ｃ。

Ｃ，ａｎｄ　Ｌ　ｅｖｉｎｓｏｎ　Ａ、　Ｄ、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８０．２４９５（１９８
３）参照）を、ＥｃｏＲＩ、Ｂａ１ＨＩで完全消化し、
０．９％　７　カ０−スゲル電気泳動でその約４，５ｋ
ｂの大フラグメント（以下ｐＳ　Ｖ　２−ｎｅｏ／　Ｅ
　、　８　ヘクター　７７　’ｊ　）（ントと呼ぶ）を
回収した。

前記合成りＮＡフラグメント溶液３μ匹（０，０６７μ
９　）とｐＳ　Ｖ　２−ｎｅｏ／　Ｅ　、　Ｂベクター
フラグメント５μＮ　（０，１μｇ）とを混合し、リガ
ーゼ反応キット（Ｔａｋａｒａ　Ｌ　ｉｇａｔｉｏｎ　
Ｋ　ｉｔ　；宝酒造製製〉のＡ溶液３２μ１．Ｂ溶液８
μ文を加えて１６℃で３０分間反応さて連結させプラス
ミドｐＳＶ　２００７を得た。

［１）ＰＩ　　１４２／Ｅ、　Ｂａｔフラグメントの取
得］プラスミドｐＰ　Ｉ　１４２５０ｕ　ＪｌをＥｃｏ
Ｒｌ、Ｂａｌ工で完全消化し、１．２％のアガロースゲ
ル電気泳動で分離し、約４００ｂｐのＤＮＡフラグメン
ト（以下ｐＰＩ　　１４２／Ｅ、　Ｂａｔフラグメント
と呼ぶ）を約１μｇ得た。

［ＥＩＳＶ２００７／Ｅ、　Ｂａ１７７グメントの取得
］ｐＳ　Ｖ　２００７　２０ｕｇを１０１Ｍ　　Ｔ　ｒ
＋ｓ−口Ｃ１（９口　７．５）　、　１０１Ｍ　　Ｍ＜
ｌ　Ｃ１ｚ　、　１　１Ｍジチオスレイトールの溶液１
４９μ見に溶かし、Ｂａ１１１μＮ（３ユニツト〉を加
え、３７℃で１時間反応させて部分消化した。−旦フエ
ノール・クロロホルム混液（１：１）で蛋白を除去し、
エタノール沈澱した後、ＥＣ０ＲＩで完全消化した。０
．９％アガロースゲル電気泳動で約５．１ｋｂのＤＮＡ
フラグメント（以下ｐｓ　Ｖ　２００７／　Ｅ　、　Ｂ
　ａｌフラグメントと呼ぶ〉を約５μｇ得た。

［＋）ＳＶ２０５７の作製］ ｐｓ　Ｖ　２００７／　Ｅ　、　Ｂ　ａｔフラグメント
０．６μｊ７とｐｐ　Ｉ　　１４７／Ｅ、　Ｂａｔフラ
グメント　０．７μｉｉｐとをリガーゼ反応キットを用
いて連結し、プラスミド１）ＳＶ２０５７を得た。

［１）ＳＶ　　０５７の作製］ １）Ｓ　Ｖ　２０５７　１０μ９をＢａ１Ｈ１，口ｉｎ
ｄ　ｍで完全消化し、０．９％アガロースゲル電気泳動
で分離し、約３，５ｋｂのＤＮＡフラグメントを回収し
た。

このＤＮＡフラグメントをフレノウラージフラグメント
（Ｋ　Ｉｅｎｏｗ　Ｌ　ａｒｏｅ　　Ｆ　ｒａｕｅｎｔ
　）　、Ｅ　。

ｃｏｌｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハ
イム製）を用いて端末を平滑化し、リガーゼ反応キット
を使用して両端末を連結させ、プラスミド＋）ＳＶＯ５
７を得た。

［１）Ｐ　Ｉ　　１４２／Ｅフラグメントの取得］プラ
スミドｐＰ　Ｉ　１４２２５μグをＥＣ０ＲＩで完全消
化し、０．９％のアガロースゲル電気泳動で分離しその
約１．７ｋｂのＤＮＡフラグメント〈以下ｐＰ１　１４
２／Ｅフラグメントと呼ぶ〉を約４μｍ８た。

［ｐＰＩ９０６の作製］ プラスミド１）ＳＶ　０５７　１０μ９をＥＣ０ＲＩで
完全消化し、その後アルカリフォスファターゼ（Ｂ　ａ
ｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔ
ａｓｅ　；　Ｂ　Ａ　Ｐ　）（ベーリンガーマンハイム
製〉３ユニツトを用いて３７℃で９０分間反応させ両端
末を脱リン酸させた。

フェノール・クロロホルム（１：１）で蛋白を除去した
後−旦エタノール沈澱させた。このＤＮＡフラグメント
０．５μ９と　Ｐ１１４２／Ｅフラグメント０．３μグ
とをリガーゼ反応キットを用いて連結させた。得られた
プラスくドを３ａｌ工で完全消化する方法で、正しくヒ
トα２−ＰＩＣＤＮＡをコードする向きにｐＰＩ　　１
４２／Ｅフラグメントが組み込まれたものを選別し、＋
）ＰＩ９０６とした。

実施例２ ｐｐ１９０６の２９３細胞へのトランスフェクション１
）Ｐ　Ｉ　９０６１０μ（ｊとｐｓ　Ｖ　２−ｎｅｏ３
　ｕ　９とをトランスフェクションキット（ファルマシ
ア製。

Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｅｃｔ　　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　
Ｋｉｔ）を用いて、そのプロトコールに従いトランスフ
ェクションした。２日間１０％ＦＣ８ｏ−ＭＥＭ培地で
培養した後、細胞濃度を希釈してまき直し、１０％ＦＣ
３゜５００μ’ｊ／ｌｄ　　Ｇ　４１８．　ｏ　−ＭＥ
Ｍを用いて培養し、約２週間後、十数個のコロニーを得
た。トランスフェクション後２日後のα２ＰＩ産生量は
約０．２μｇ／ｄであった。

実施例３ ＋）Ｐ１９０６の８）−ＩＫ細胞へのトランスフェクシ
ョｐＰ　Ｉ　９０６１０μｇとｐ８　Ｖ　２−ｄｈｆｒ
　３　μＳＦとをトランスフェクションキット（ファル
マシア製。

セルフエクトトランスフェクションキット：Ｃｅ１ｌ　
Ｐｈｅｃｔ　　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を
用いて、そのプロトコールに従いトランスフェクション
した。２日間１０％ＦＣ８ｏ−ＭＥＭ培地で培養した。

２日後のα２ＰＩ産生量は約０．２μｇ／Ｍｌであった
。細胞濃度を括釈してまき直し、１０％ＦＣ３，２５０
ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）、ｏ　−ＭＥＭ培地で
培養し、約２週間後、数十個のコロニーを得た。各コロ
ニーを単離し、培養土酒中のα２ＰＩ産生母を測定し、
１．５μｇ／Ｉｄの産生量のクローンｐＰＩ　　９０６
／ＢＨＫ−４を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトα２　　ＰＩのＯＮ八へ基配列、及びヒト
α２　　ＰＩのアミノ酸−次配列を示す。 第２図はプロベクチド改変型ヒトα２−ＰＩの発現ベク
ターの作製方法を示す。 第３図は１）ＰＩ９０６に組み込んだプロペクチド改変
型ヒト−プラスミンインヒビターをコードする遺伝子の
一例を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトα＿２−プラスミンインヒビタープロ領域に
   おいて、アミノ酸配列の−４番めと−１番めのアミノ酸
   がそれぞれ独立にＡｒｇ又はＬｙｓであることを特徴と
   するヒトα＿２−プラスミンインヒビタープロ領域のア
   ミノ酸配列。
2. （２）ヒトα＿２−プラスミンインヒビタープロ領域に
   おいて、アミノ酸配列の−３番めから−１番めのアミノ
   酸が、それぞれ独立にＡｒｇ又はＬｙｓであることを特
   徴とするヒトα＿２−プラスミンインヒビタープロ領域
   のアミノ酸配列。
3. （３）ヒトα＿２−プラスミンインヒビタープロ領域に
   おいて、アミノ酸配列の−４番め、−２番めおよび−１
   番目のアミノ酸がそれぞれ独立にＡｒｇ又はＬｙｓであ
   ることを特徴とするヒトα＿２−プラスミンインヒビタ
   ープロ領域のアミノ酸配列。
4. （４）ヒトα＿２−プラスミンインヒビタープロ領域に
   おいて、アミノ酸配列の−４番めから−１番めのアミノ
   酸が、それぞれ独立にＡｒｇ又はＬｙｓであることを特
   徴とするヒトα＿２−プラスミンインヒビタープロ領域
   のアミノ酸配列。
5. （５）請求項１〜４記載のいずれか１項のアミノ酸配列
   をコードするＤＮＡ配列。
6. （６）請求項５記載のＤＮＡ配列を用いることを特徴と
   するヒトα＿２−プラスミンインヒビターの発現方法。