JPH03147799A - 新規なオリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子診断のＤＮＡプローブとして使用できる
新規なミニサテライトＤＮＡに関する。

近年ＤＮＡプローブを用いた種々の遺伝子診断法が開発
されてきている。遺伝子診断の目的にはｌ）遺伝病の早
期診断、２）いわゆるＤＮＡフィンガープリント法とよ
ばれる親子鑑別や犯罪捜査への応用、３）ウィルスや細
菌感染症の原因菌の高感度の診断などがあげられる。

これらのうち、ＤＮＡフィンガープリント法はひろく個
人識別に用いることができる。その方法としては、目的
の遺伝子の全部又は一部をＤＮＡプローブとして、その
遺伝子上の変異を直接検出する方法、遺伝子周辺の部位
の制限酵素部位の変異を利用した制限酵素断片多形（Ｒ
ＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｌｃｔｌｏｎ　ｆ’ｒａｇＩｌｅｎ
ｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｌｓａ）解析法
があげられ、また遺伝子の非コード部分にしばしば見い
出される反復配列ＤＮＡをプローブとして利用すること
もできる。

このような、いわゆるミニサテライトＤＮＡは、個人識
別や家系識別にも利用できることが報告されている（例
えば、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

ｖｏｌ、ｔａ、　１０９５３−１０９７１．１９１１８
；　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２３５゜１６１Ｂ−１
６２２，１９８７）。ミニサテライトＤＮＡとは、１０
から１００塩基配列が一つの反復単位で、それらがタン
デムに繰り返したいわゆる反復配列ＤＮＡである。反復
度は、多いものでは１０００回にも及び、この反復度が
個々の対立遺伝子で異なることにより、バリエーション
を獲得している（総説：小南凌、実験医学、　Ｖｏｌ、
　７．　Ｎ（Ｌ２．　ｐ、２Ｂ−３０１９８９）。

これらのＤＮＡフィンガープリント法によって検出可能
な遺伝子上の変異のパターンはメンデル遺伝により親か
ら子に伝えられていく。これを利用して、より正確な親
子診断が可能とされ、またＤＮＡポリメラーゼ増幅（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：　
ＰＣＲ）と組み合わせた高感度測定法により、毛根や精
液、血液、皮膚片等の微量サンプルからこれら個人ごと
に異なるパターンを利用して犯罪者や被害者の同定がで
きる犯罪捜査への応用が可能となる。

本発明により提供されるミニサテライトＤＮＡはヒト血
漿中に含まれる、線溶系の制禦に関与するプロテアーゼ
インヒビターの一種である、α２−プラスミンインヒビ
タ−の遺伝子の近傍に本発明者により見い出された塩基
配列である。

ヒトα２−プラスミンインヒビタ−は、正常人の血液中
に通常６■／ｄＡ程度検出され、血栓溶解作用を持つプ
ラスミンを阻害して、血栓溶解の昂進を抑え、ひいては
炎症や癌の転移などの様々な異常な生理現象の防止に寄
与していると考えられている。

本発明者等は、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−の遺
伝子を単離し、その発現を調節する上流領域を解析した
ところ、４５ヌクレオチドのＤＮＡ配列がタンデムに繰
り返している頭載を見い出した。さらに、その領域を含
むＸｂａｌ／ＢａｍＨＩ断片をＣＡＴアッセイ用のプラ
スミドベクターにクローニングし、ヘルペス単純ウィル
スのチミジンキナーゼのプロモーター活性に与える影響
を調べたところ、その活性を抑制するサイレンチー様の
機能を見い出した。その配列は、 ＣＮＧＧＡ　ＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＸＧＹ　Ｘ
ＧＣＹＴ　ＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧ　Ｉ　Ｘ
（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ！たはｃ、Ｘは、Ａまタハ、Ｘ１
．ｔ、ＣまたはＧＳＺ、Ｉｔ、ＡまたはＣである） である。

この配列を持つオリゴヌクレオチドを標識してプローブ
とし、ヒト染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で清化してア
ガロースゲル中で電気泳動したものとサザンブロッドハ
イプリダイゼーションを行うことにより、制限酵素切断
断片のパターンの違いを検出したり、この反復配列のコ
ピー数を／Ｉｐ１定することができる。

本発明者等がヒトα２プラスミンインヒビタ−遺伝子の
近隣に見い出したミニサテライト配列は、４５ヌクレオ
チドからなり、その中には少なくとも７か所のヘテロガ
スな部位がみられる。これは、ポリメレースチェインリ
アクシッン法によって、直接的に配列を決定することに
より、より特λ性の高い個人、家系識別に利用できる可
能性もある。

ヒトα２−プラスミンインヒビタ−の遺伝子断片として
特開昭６４−２５７７　（昭和６４年１月６日公開）が
開示されているが、この出願において開示されている塩
基配列はｃＤＮＡのそれでありリーダ配列の最初のメチ
オニン残基（成熟α２−プラスミンインヒビタ−蛋白の
アミノ末端のアスパラギン残基を＋１としたとき一３９
番目のアミノ酸残基に相当する）から下流に関する。本
発明者はα２−プラスミンインヒビタ−の染色体の遺伝
子をクローニングし、第１エクソンのさらに上流に本発
明で開示されたミニサテライトＤＮＡ配列を見い出し、
本発明を完成させたものである。

これらのＤＮＡプローブの標識は、一般にはラジオアイ
ソトープ（Ｒ１）が感度の良さから最も用いられている
が、最近では酵素や化学ルミネッセンス発光体で標識す
る非Ｒ１法も操作上の安全の高さ、特別な施設を必要と
しないことなどから用いられるようになった。Ｒ１標識
俵としてはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２
ｐを５′　一端に標識する方法、あるいはＤＮＡポリメ
ラーゼＩとＤＮａｓｅＩを組み合わせて３２Ｐ−標識デ
オキシトリメクレオチドを標識するニックトランスレー
ション法があり、これらの標識方法は市販の専用キット
（例えばアメリカのＢｃｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　日本ではコスモノ
くイオ株式会社より市販されている）を用いて実施でき
る。また、非Ｒ１標識および検出方法にはホースラデイ
ツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　：　ｈｏｒｓｅｒａ
ｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｌｄａｓｅ）でＤＮＡを標識しＨ
ＲＰにより触媒されるルミノール酸化反応に伴なうケミ
カルルミネッセンスを検出する方法、ビオチン化ｄＵＴ
Ｐで標識したＤＮＡをアビジン−アルカリフォスファタ
ーゼコンプレックスによる化学呈色反応で検出する方法
があげられ、これら標識方法は市販のキット（例えばア
マジャム社より市販されている）を用いて実施すること
ができる。

またこれらのプローブＤＮＡは、数１０個の塩基長を有
する比較的短いオリゴヌクレオチドの場合は市販のＤＮ
Ａ合成機（例えば米国アプライドバイオシステム社のＡ
　Ｂ　１３８１Ａ）により化学合成もできる。また塩基
鎖が長い場合には適当な遺伝子の断片をクローン化して
分離精製することもできる。標識ＤＮＡプローブが、安
定したハイブリダイズを形成し、特異的なシグナルを発
生させるためには、１２個以上のオリゴヌクレオチドで
あれば、検出可能だが、より非特異的な反応のバックグ
ラウンドをおさえて、シャープで正確なパターンを検出
させるためには１２〜１７個以上、好ましくは２０個以
上の長さを有するオリゴヌクレオチドが使用できる。

したがって、本発明のプローブは、 の塩基配列またはその相補鎖のうち、 どこを開始 点としてもよいが少なくとも１２個の塩基配列を含んで
いればよい。

本発明をより具体的に説明するために以下に実施例を示
す。しかし、本大施例は、本発明を限定するものではな
い。

実施例　１ ヒトα２−プラスミンインヒビタ−遺伝子のクローニン
グおよび同遺伝子上流域による繰り返しＤＮＡ配列の決
定 ヒト肝臓ＤＮＡから調製したＤＮＡからファージλＬ４
７．１を用いて、ヒト遺伝子ライブラリーを作成し、ヒ
トα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡをプローブと
し、スクリーニングを行った。得られたポジティブクロ
ーンの制限酵素マツピング、塩基配列の決定を行い、ヒ
トα２プラスミンインヒビタ−ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｔｏ
ｎｅら、ｊ。

Ｂ１ｏｃｈｅａ＋、　１０２．１０３３−１０４１（１
９８７））の配列と比較し、ヒトα２−プラスミンイン
ヒビタ−遺伝子のエクソンの位置を決定した。エクソン
のＤＮＡ配列はｃＤＮＡのそれと１か所を除いて完全に
一致した。

その１か所とは、コーディング領域の１番目のＡＴＧの
Ａから数えて２２番目のヌクレオチドで、ｃＤＮＡでは
Ｔであるのが、染色体遺伝子ではＣであった。この領域
は、リーダーペプチドに相当する部分である。また、同
遺伝子の上流域に４５ｂｐを１反復単位としてタンデム
に繰り返している領域を見い出した。その位置は、コー
ディング領域の１番目のＡＴＧのＡを＋１とすると、−
３８６１から−２８８７にかけての領域であった。図１
に、Ｇ２−プラスミンインヒビタ−遺伝子の制限酵素地
図、エクソンの位置、４５ｂｐ反復配列の位置及びその
塩基配列を示した。

ＤＮＡの調製 ヒト肝臓から、Ｍａｎｉａｔｌｓ、　Ｔ、ら、　ＭＯＩ
ＯｅｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、（１９８２）に記載された
方法に従って調製した。

ヒト遺伝子ライブラリーの作成 ヒト肝臓から調製したＤＮＡを制限酵素５ａｕ３ＡＩで
部分消化し、ショ糖密度勾配遠心法により分画した。１
０ｋｂから２０ｋｂに相当するＤＮＡ断片をλＬ４７．
１ベクター（アマジャムより購入）に組み込み、Ｍａｎ
ｌａｔｉｓ、　Ｔ、ら、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｌｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂ、、（１９８２）に記載されている方法に従って、
１ｎ　ｖｌｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇを行った。タイ
トレージョンの結果、約ｌＸｌ０Ｂ個の独立なファージ
が存在した。

スクリーニング プラークハイブリダイゼーション法によって前記のヒト
遺伝子ライブラリーのスクリーニングを行った。基本的
には、ＭａｎｌａＬｉｓ、　Ｔ、ら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｌｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、。

（１９１１２）に記載されている方法に従った。プロー
ブは、Ｔｏｎｅら、　　Ｊ、　Ｂｌｏｃｈｅｉ、　　１
０２．１０３３−１０４１（１９８７）に記載されてい
る、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−ｃＤＮＡを使用
した。プローブの標識は、〔α−３２Ｐ）ｄＣＴＰを用
いたニックトランスレーションにより行った。約１×１
０６個のプラークをニトロセルロースフィルターに転写
した後、プローブとハイブリダイゼーションを行い、洗
浄後、オートラジオグラフィーを行うことによって、ポ
ジティブクローンを検出した。

ＤＮＡ塩基配列の決定 上記のポジティブクローンよりＤＮＡを調製し、適当な
制限酵素で消化し、制限酵素マツピングを行った後、各
々の制限酵素による断片をｐＵｃｌｌｌ　　ｐＵｃ１１
９．　　ｐＨ３Ｇ３９ｇ、またはｐＨ３Ｇ３９９（全て
宝酒造社製）のポリリンカ一部位にクローニングした。

キロシーフェンス用デレージョンキット（宝酒造社製）
を用いて、前記リコンビナントプラスミドのデレーショ
ンミュータントを作成し、ｐＵｃｌｌｇまたハｐ　Ｕ　
Ｃ１１９１，：クローニングしたものに関しては、Ｖｉ
ｅｌｒａ、　Ｊ、ら。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１５
２．３−１１（１９８７）に記載されている方法に従っ
て１本鎖ＤＮＡを調製し、ｐＨＳＧ３９ｇまたはｐ　Ｈ
Ｓ　Ｇ　３９９にクローニングしたものに関しては、Ｍ
　１３ｍｐ１ｇまたはＭ　１３＊ｐ１９（宝酒造社製）
に再クローニングした後１本鎖ＤＮＡを：Ａ製し、Ｓａ
ｎｇｃｒ、　Ｆ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１４゜１２
０５−１２１０（１９８１）に記載された方法に従って
、ＤＮＡの塩基配列を決定した。

実施例　２ ミニサテライトＤＮＡ配列をプローブとしたヒト遺伝子
の解析 ヒトα２−プラスミンインヒビタ−遺伝子塩基配列の解
析により、４５ｂｐミニサテライトＤＮＡの９９ｂｐ上
流と１５ｂ、下流にＢｓｔＸＩ２！２部位が存在するこ
とがわかった。血漿中のＧ２−プラスミンインヒビタ−
濃度に関する健常者で血縁関係の知られていない者９人
の染色体ＤＮＡをＢ　５ｔＸＩで消化した後、４５ｍａ
ｒの核酸プローブを用い、サザンブロットハイブリダイ
ゼーションを行い、コピー数および制限酵素切断断片の
電気泳動パターンを解析した。

ＤＮＡの調製 デキストラン比重差遠心により、３０ｍ１の血液から得
られた白血球を、１００ｍＭ　　ＥＤＴ、Ａ、５０ｍＭ
　　ＴｒｉｓｌＩＨＣＮ　　ｐ）Ｉｇ、ｏ、　５００１
／ｍｌプロティンキナーゼに、　０．５％　ＳＤＳ溶液
中に懸濁し、５５℃で一晩インキユベーションした。フ
ェノール及びクロロホルムで抽出した後、ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝溶液中に溶解した。

核酸プローブ 下記の塩基配列を有する４５ｓｅｒのオリゴヌクレオチ
ド ＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣ
ＣＴＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＣＧをＤＮＡ合
成機（ＡＢ　Ｉ、　３８０Ａ）で合成した。

この４５ｓｅｒ、　５０ｐＩＩｏＮを、（γ−３２ｐ）
ＡＴＰ３．７ＭＢｑ　（１８５Ｔ　Ｂｑ／ｍｗｏｊ７　
）　、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位、５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｌｓ−ＨＣＲｌ）Ｈ８，０，１０ｍＭ　　Ｍ
ｇ（ｊ！　　　５ｍＭジチオスレ２゜ イトールを含む最終審ｆｆ１３０μｇの溶液中で、３７
℃。

１時間インキュベーションすることによって、５′末端
を３２Ｐで標識した。標識後、この溶液を５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ５０カラムクロマトグラフイにかけ、遊離のヌ
クレオチド及び〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰを、標識した４５
ｓｅｒと分離した。

サザンプロットハイプリダイゼーション前記、白血球か
ら調製したゲノムＤ　Ｎ　Ａ　１５■をＢ　５ｔＸＩで
消化し、０．８％アガロースゲル板中で電気泳動し、Ｂ
ｌｏｄｙｎｅナイロン膜（Ｐａｌｌ　Ｂｉ。

５ｕｐｐｏｒｔ、　Ｅａｓｔ　Ｈｌｌｌｓ、　Ｎ、Ｙ、
）へ、その説明書に記載された方法に従って移した。ｌ
）０℃で２時間インキュベーションし、ナイロン膜にＤ
ＮＡを固定した後、同説明書に従って、４５ｓｅｒの核
酸プローブと４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行
った。

洗浄及び露出 ナイロン膜を同説明書に記載された方法に従って洗浄し
、サランラップで覆った後、フィルム、増感スクリーン
と共に一８０℃で２４〜６６時間露出下においた。

結　　果 Ｂｓｔ）Ｑで消化したゲノムＤＮＡのパターンとして、
各サンプルそれぞれ２本のバンドが見られた。

バンドの位置からその長さを算出すると、鎖長が約８．
０．３．８．３．４．１．６．１．５ｋｂの５ＦＩｉ類
であった（図２に示した）。４５ｂｐのコピー数は以下
のようにして計算した。４５ｂｐミニサテライトＤＮＡ
の両末端からＢｓｔｘＩ切断部位までの長さ（上流側９
０ｂｐ。

下流側２２ｂｐ）をそれぞれの鎖長から引いて、これを
４５で割った。この計算によると、コピー数は大きい方
から、約１７５．８２．７３．３３．３１となり、これ
らの値は、それぞれのバンドのＸ線フィルム上の黒化度
とほぼ一致した。

検体（ａ　−ｉ　）のそれぞれの鎖長及びコピー数を表
１に示す。

表　　　１ 結果は、父親及び母親由来のミニサテライトのコピーが
各１種類づつ存在することを示している。

また、各個人から得られた制限酵素切断断片のパターン
は各々いくつかのグループに分かれた。

【図面の簡単な説明】

図１はα２−プラスミンインヒビタ−遺伝子の制限酵素
マツプ、エクソンの位置、４５ｂｐミニサテライトＤＮ
Ａの位置及びその塩基配列を示しており、黒い長方形は
エクソンを、白い長方形はミニサテライトＤＮＡを表し
ている。 図２は、９人の染色体ＤＮＡをＢ　５ｔＸＩで消化した
後、４５ｓｅｒの核酸プローブを用い、サザンプロット
ハイプリダイゼーションを行ったときのオートラジオダ
ラムである。矢印はバンドの位置を、数字はその長さを
示している。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の塩基配列またはその相補鎖のうち、少なく
   とも連続した１２個の好ましくは２０個以上の塩基配列
   を含むことを特徴とする標識オリゴヌクレオチドプロー
   ブ。 【遺伝子配列があります】
2. （２）下記の塩基配列またはその相補鎖を有することを
   特徴とする請求項１の標識オリゴヌクレオチドプローブ
   。 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｎは、Ａ、ＧまたはＣ、Ｘは、ＡまたはＧ、Ｙ
   は、ＣまたはＧ、Ｚは、ＡまたはＣである）
3. （３）下記の塩基配列を有することを特徴とする請求項
   ２の標識オリゴヌクレオチドプローブ。 【遺伝子配列があります】
4. （４）酵素、ラジオアイソトープ、および化学ルミネッ
   センス発光体により標識されたことを特徴とする請求項
   １〜３のいずれかの項に記載の標識オリゴヌクレオチド
   プローブ。
5. （５）請求項１〜４のいずれかの項に記載の標識オリゴ
   ヌクレオチドプローブを含む遺伝子診断キット。