JPH03127979A

JPH03127979A - 核酸ハイブリッドの呈色反応装置及び方法

Info

Publication number: JPH03127979A
Application number: JP26763889A
Authority: JP
Inventors: Kinya Kato; 欽也加藤; Nobuko Yamamoto; 伸子山本; Harumi Iwashita; 岩下　晴美; Masanori Sakuranaga; 桜永　昌徳
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1989-10-13
Publication date: 1991-05-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は非放射性プローブと一本鎖ＤＮＡ間に形成され
た核酸ハイブリッドを可視化し検出するための装置及び
方法に関する。

さらに具体的には、非放射性プローブを用いたハイブリ
ダイゼーション反応後ニトロセルロースフィルター上の
標識物質を検出するための諸反応の工程を、マイコン等
により温度、時間等が制御された系を用いて、反応過程
の最適条件を自動的にかつ正確に行なうだめの装置及び
方法を提供するものである。

〔従来の技術〕

核酸の中から特定の配列をもつＤＮＡフラグメントを検
出する代表的な方法としてハイブリダイゼーション反応
があげられる。この方法の概要は、分離したＤＮＡフラ
グメントをアルカリ処理等によって一本鎖ＤＮＡとし、
これを固定相としてのニトロセルロースメンブレン等へ
移したあと、何らかの標識した特定のＤＮＡ或は、ＲＮ
Ａプローブを含む溶液で処理することによりハイブリッ
ドを形成させ、未反応のプローブを洗浄除去後ハイブリ
ッドを形成したＤＮＡフラグメントを検出する。

これらの方法は、これまでクローニングの際に所望の形
質転換体クローンをスクリーニングするために利用され
てきたが（コロニーハイブリダイゼーション、プラーク
ハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーショ
ン１．スポットハイブリダイゼーション）、サザンハイ
プリダイゼーション及びスポットハイブリダイゼーショ
ンの技術は最近遺伝子診断等、医療分野でも注目を集め
ている。

また、プローブの標識には、通常、放射性同位元素が用
いられてきた。しかしながら、これらの放射性化合物は
高価なうえその取り扱い及び貯蔵の不便さという欠点を
有する。

このため最近ビオチン試薬を初めとする各種の非放射性
物質による核酸の標識が開発されてきている。そしてク
ローニング等に利用されているだけでなく、遺伝子診断
にも応用され、既に感染及び遺伝疾患の診断用のＤＮＡ
プローブも開発され市販化されるに至っている。

非放射性プローブを用いたハイブリダイゼーション反応
の要点は、ニックトランスレーション等の方法により、
例えばビオチン等で標識したＤＮＡプローブを用い、ニ
トロセルロースフィルター上に固定した検出対象の一本
鎖ＤＮＡフラグメントとハイブリッドを形成させ、−末
鎖ＤＮＡのついていない部分をウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）等でブロックしたあとビオチンと特異的に結合す
るアビジンを先ず反応させ、次にビオチン化アルカリフ
ォスファターゼ等をアビジンと反応させ、この反応量を
呈色反応等によって求め、特定のＤＮＡフラグメントを
検出する方法である。

この方法はビオチン誘導体を用いた方法（例えば特開昭
５９−１４８７９８、同６３−１５２９９９）、或はア
ルカリフォスファターゼのかわりに　−ガラクトシダー
ゼ複合体（特開昭６ｌ−２１９４００）を利用した場合
にもほぼ同様の工程で検出される。

さらにビオチン誘導体以外の系、例えばジニトロフェニ
ル誘導体（特開昭５９−２０４２００）、アセチルアミ
ノフルオレイン誘導体（特開昭５８−５０２１６５、同
６Ｏ−２３１６９３）等ＤＮＡを標識するための非放射
性物質が各種開発されているが、いずれの場合もそれぞ
れの標識物質とその抗体を結合させ次にこれらの抗体と
反応し、かつ呈色反応等で特定基質に対する活性が検出
できうるような二次抗体を用いて顕現操作を行なってい
る点で、可視化に至る諸反応はビオチンの場合と基本的
には同じである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記可視化に至るまでの諸反応は当初実験室において手
作業により行なわれた。この手作業による方法は多数繰
り返される液体取り扱い工程及び制御された温度におけ
るインキュベーションを含むものである。これらの反応
過程は多大な時間と繁雑な取り扱いを要する。

特に、本反応では少量で高価な反応溶液群（Ａ）を用い
る過程と大量で比較的安価な反応溶液群（Ｂ）を用いる
過程が混在しており、例えば（Ｂ）なる溶液群に装置仕
様を合せると高価な反応溶液を多大に消費してしまい、
また（Ａ）なる溶液群に装置仕様を合わせると（Ａ）な
る溶液の反応が十分進まず、誤まった結果が生じる危険
性がある。

従って本発明ではハイブリダイゼーション反応以後、ビ
オチン等を発色反応で検出するまでの工程を両溶液を効
率的に用い、より速くしかも誤差なく再現性のある結果
を得ることが目的である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、かかる問題点を解決するために、呈色反応の
自動化を鋭意検討した結果達成されたものである。すな
わち、呈色反応の自動化装置を提供することが一点であ
る。

本発明の装置は、支持膜上に固定された標識物質の酵素
による呈色反応を逐次的に行なうものである。その構成
は以下のようである。サンプル膜を槽内に装着する手段
；複数容器に、該標識物質と特異的に結合する酵素溶液
、該酵素と選択的に結合する第二の酵素溶液、染料溶液
、呈色停止液及び洗浄液を分別貯蔵する手段；これら複
数種の反応液を選別し、かつ槽内への反応液流入量を制
御する給送手段；槽内反応液の加熱手段及び温度検知手
段を備えた槽内溶液温度制御手段；槽内溶液を撹拌ある
いは振とうする手段；槽内反応液の排送および再使用を
選別する手段；槽内反応液を一旦保持し再び反応液とし
て用いる手段；槽内反応の排送手段；槽内の制御温度、
給送反応液種及び流入量と給排送のタイミングの信号を
利用者により設定する手段；を有することを特徴とする
ものである。

第１図は、本発明の装置の概念をブロック図として示し
たものである。この図において、１−１は呈色反応を行
なう反応槽であり、反応液の給送系１−２と排送系１−
３が接続している。給送系１−２は複数の反応液の貯蔵
容器系１−６から反応槽１−１へ溶液を給送する。槽内
へ流入した溶液は反応槽に付随した温度制御系１−４と
撹拌または振とう手段１−５により制御される。１−８
は一度反応に用いた溶液を再び反応に用いる再供給系で
ある。さらに、１−２．　１−３．　１−４．　１−５
はＣＰＵおよびコントローラによってパラメータ及び０
Ｎ１０ＦＦの制御を受け、このときのパラメータ及びタ
イミングは利用者によって設定される。

本発明の装置は、操作のための電力供給源、及び利用者
の制御を可能とするキーボードを含むことは言うまでも
なく、利用者の入力信号を確認するためにデイスプレィ
を設けてもよい。

本発明の装置に使用され呈色反応に供されるサンプルと
しては、酵素反応により呈色させうる標識物質と結合し
た物質（リガンド）が支持膜上の特定の場所に固定され
てかつリガンドと特異的に結合する物質（リセプター）
を介して該支持膜上に保持させたようなものをあげるこ
とができる。

しかし、単に支持膜上に標識物質が固定されているサン
プルで良いことは言うまでもない。より具体的に例をも
って説明すると、従来技術で述べられたように、ニトロ
セルロース膜に固定した一本鎖ＤＮＡフラグメントと、
ビオチンを組み込んだオリゴヌクレオチドプローブとの
ハイブリダイゼーションによって調整されたものをあげ
ることができる。このようなサンプルは、特に遺伝子診
断において、ＤＮＡプローブを使用したスポットハイブ
リダイゼーションあるいはサザンハイプリダイゼーショ
ンによって特定の塩基配列を検索する際に準備されるも
のにほかならない。

本発明のもう一点は、上記の装置によって所望の呈色反
応を連続して、均一に達成することができることを見出
したことによる。

すなわち、酵素反応により呈色させうる標識物質と結合
した物質（リガンド）が支持膜上の特定の場所に固定さ
れてかつリガンドと特異的に結合する物質（リセプター
）を介して該支持膜上に保持させたサンプルの１枚ある
いは複数枚を呈色反応させる方法である。この方法は、
一槽からなる反応槽において該標識物質と特異的に結合
する酵素溶液、該酵素と選択的に結合する第二の酵素溶
液、染料溶液、呈色停止液及び複数種の洗浄液に逐次的
に浸漬して呈色反応させる工程であって、利用者が設定
した信号に従って、槽内へ給送する反応液の選択及び順
番と総流量及び反応時間間隔と反応温度を制御する装置
によって、該逐次反応を自動的に達威し呈色せしめる、
ことを特徴とする呈色反応の方法である。

本発明の方法が適用される例は、前述したように、ニト
ロセルロース膜に固定した一本鎖ＤＮＡフラグメントと
、ビオチンを組み込んだオリゴヌクレオチドプローブと
のハイブリダイゼーションによって調整されたものをあ
げることができる。

また、従来技術で述べたように、標識物質としては、ビ
オチン以外にも、ビオチン誘導体、ジニトロフェニル誘
導体、アセチルアミノフルオレイン誘導体などから選ぶ
ことも可能である。

〔実施例１〕以下に、本発明の実施例を添付の図面を参照しながら説
明する。

先ず、第２図を参照して本発明の基本構成を説明する。

図中２−１〜２−８の容器には各種反応液が入っている
。標準的には、２−１の容器に２ＸＳＳＣ１０，１％Ｓ
ＤＳが、２−２の容器にはｏ、２ｘＳＳＣ１０゜１％Ｓ
ＤＳが、２−３の容器にはＢｕｆｆｅｒｌ　（０，ＩＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　（ｐＨ７，５）　１０．１５Ｍ　
ＮａＣ１）なる溶液が、２−４の容器にはＢｕｆｆｅｒ
２　（０，１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，５）
１０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ！１５０ｍＭＭｇＣｌ！２・
６Ｈ２０）なる溶液が、２−５の容器にはＢｕｆｆｅｒ
ｌに対する３％ＢＳＡ溶液が、２−６の容器にはＢ　ｕ
　ｆ　ｆ　ｅ　ｒ　１　１　ｍ　ｌに対して１μｆの割
合で５ＡＡＰを溶かした溶液が、２−７の容器にはＢｕ
ｆｆｅｒ２１０ｍＩ！に対してＮＢＴ　　４４　μｉ、
ＢＣＩＰ　　３２　μｉの割合で溶かした溶液が、さら
に２−８の容器には２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ’　（
ｐＨ７，５）　１０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液が必要量封
入されている。各々の反応はサプライポンプ１７によっ
て反応槽２−２５におくられるが、その液量とタイミン
グは例えば中央処理装置（ＣＰＵ）２−２１からの指令
に応じたコントローラ２−２０によって決められる。こ
の指令に従ってサプライポンプ２−１７と電磁弁２−９
〜２−１６．２−２９が連動して働き所望のタイミング
で所望の溶液を必要量反応槽２−２５に送り込む。２−
２４は反応槽のドレインポンプで反応槽２−２５の溶液
を吸引する吸引ポンプからなる。この吸引のタイミング
は上記溶液の送り込み同様ＣＰＵ２−２１．コントロー
ラ２−２０で制御される。２−２８は反応溶液を再使用
するか廃棄するかの選別を行なう電磁弁である。

２−２７は、再使用する反応溶液を一旦保持しておく貯
蔵容器である。サプライポンプ２−１７、ドレインポン
プ２−２４の吸引量をそれぞれ制御することで、各々の
反応液が反応槽にとどまる時間、流量を自由に制御でき
る。即ち、サプライポンプ、ドレインポンプを所望のタ
イミングで稼動させ反応槽内の反応溶液と２−２７の貯
蔵容器内の再使用を行なう反応溶液を循環させることで
、反応溶液の容量を増し良好な呈色反応を促進すること
ができる。これらの制御方法はＣＰＵ２−２１に依らず
ロジックコントローラを用いてもよい。２−１８は撹拌
器であるが反応槽内における液の混和、均一化を促す役
割を担っていればいかなる形態のものでも良い。撹拌の
開始、停止はＣＰＵ２−２１からの信号で行なわれる。

２−２５の反応槽は密閉容器であり反応は十分遮光され
た状態で行なわれる。反応槽内の溶液の液温を測定する
温度センサー２−１９及び反応槽内の溶液を加熱するた
めのヒーター２−２３が設けられている。ヒーターは温
度センサーからの信号に従ってＯＮ、ＯＦＦを行なうこ
とによりＣＰ、Ｕ　２−２１１コントローラ２−２０で
制御されている。２−２６は発色を行なうフィルターを
保持するフィルター固定器具で一度に多数枚処理できな
おかつフィルター同志が接触しないようメツシュでフィ
ルターをはさみフィルターの積層を可能にしたものであ
る。

第３図に本実施例におけるＣＰＵ２−２１のシークエン
スを示した。

第４図は反応槽に振とう器を設けた実施例である。

振とうはフィルター固定器を振とうする方法、反応槽自
体を振とうする方法など反応槽内における溶液の混和、
均一化を促進し、洗浄及び諸反応を促す役割を担ってい
ればいかなる形態のものでも良い。振とうの開始、停止
はＣＰＵ２−２１からの信号で行なわれる。第５図に本
実施例におけるＣＰＵ２２１のシーフェンスを示した。

次に、さらに具体的な実施例を第２図、第３図に基づい
て説明する。

この装置による発色の程度を確認するために確実に発色
する系を用いて実験を行なった。まず、宿主ＪＭ１０９
にプラスミドｐＵｃ１９及びプラスミドｐＢＲ３２２の
各々を、常法に従ってトランスフォーメーション（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｌｌ、両コロニ
ーが同数（２５コロニー）混在するプレートを作製した
。

このプレートから、常法に従ってコロニーをニトロセル
ロースフィルターに移しとり、アルカリ等で変性させて
一本鎖ＤＮＡをフィルター上に固定した。次にニックト
ランスレーション（Ｍ　ｏ　Ｉ　ｅ　ｃ　ｕ　ｌ　ａ　
ｒＣｌｏｎｉｎｇ）等の常法に従ってビオチン標識プロ
ーブ（ｐＵｃ１９のマロチプルクローニングサイトの塩
基配列と相補的な配列を有する）を作製し、コロニーハ
イブリダイゼーションを行なった。

上記のフィルター１０枚をフィルター固定器２−２６に
装着し、反応槽２−２５（容ｆｉ１５０ｍｊ７）内にお
さめた。

次に、表１に従って反応を行なった。表１は、第３図に
示す手順に従って各ステップの電磁弁の開閉、反応液総
量、反応温度、反応時間の設定値をまとめたものである
。また、容器２−１〜２−８は第２図の番号に対応し、
溶液の組成は表１の通りである。

以上の事柄に従って反応を行なったところ、５０個中２
５個の同程度の発色が得られた。これら２５個は、プレ
ート上のｐＵｃ１９／ＪＭ１０９のコロニの場所に全て
対応するものであった。また、反応槽内のフィルターの
位置、フィルター上のコロニの位置に関係なく全て均一
な発色であり良好な結果が得られた。

〔実施例２〕実施例１で作製したｐＵｃ１９／ＪＭ１０９及びｐＢＲ
３２２／ＪＭ１０９のコロニーから常法に従って二本鎖
ＤＮＡを抽出した。この二本鎖ＤＮＡ溶液をアルカリ等
で変性させて一本鎖ＤＮＡとした後、ニトロセルロース
フィルターに１０ケ所ずつこの溶液をスポットして、−
末鎖ＤＮＡをフィルター上に固定した。

次に、実施例１で作製したビオチン標識プローブ（ｐＵ
ｃ１９のマルチプルクローニングサイトの塩基配列と相
補的な配列を有する）と、スポットハイブリダイゼーシ
ョンを行ない実施例１と同様に反応を行なったところ、
ｐＵｃ１９／ＪＭ１０９のコロニーから抽出したＤＮＡ
を含む１０ケ所のスポットが高い再現性で色むらなく同
程度に発色し良好な結果を得た。

〔実施例３〕実施例１で作製したｐＵｃ１９／ＪＭ１０９のコロニか
ら常法に従って、二本鎖ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ
溶液を、Ｅｃｏ　　Ｒ１とＳｃａ　　Ｉの二種類の酵素
で同時に切断しく１７８１ｂｐ、９０５ｂｐ）、０．８
％アガロースゲル電気泳動（定電流５０　ｍ　Ａで９０
分間）を行なった。泳動後、常法に従ってサザンブロツ
テイングを行ない、−末鎖ＤＮＡをニトロセルロースフ
ィルターに固定した。

次に実施例１で作製したビオチン標識プローブ（ｐＵＣ
１９のマルチプルクローニングサイトの塩基配列と相補
的な配列を有する）と、サザンハイブリダイゼーション
を行ない、実施例１，２と同様に反応を行なったところ
マルチプルクローニングサイトを含む１７８１ｂｐの断
片の発色が得られた。

尚、コロニーハイブリダイゼーション、スポットハイブ
リダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションを行
なった三種類のフィルターを混在させて、フィルター固
定器２−２６に装着し反応槽２−２５におさめて同様に
反応を行なったところ、いずれのフィルターにおいても
良好な発色が得られた。

〔発明の効果〕

本発明による装置を用いてハイブリダイゼーション以後
の洗い及び発色反応を行なったところ、従来専任のオペ
レータが一日余を要していた作業が人手を全く介するこ
となく良好な呈色反応が得られた。この結果イ）労働力が大幅に軽減された。

口）夜間作業が可能になり実験時間が短縮された。

ハ）人的誤差が押えられ呈色反応が均一に進み、同時に
高い再現性が得られた。

二）わずかな反応溶液で、効率よく反応が行なえるよう
になった。

などの効果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による装置の構成を示すブロック図であ
る。第２図はさらに具体的な実施例の構成図、第３図は第２
図の制御部（ＣＰＵ／コントローラ）の動作の一実施例
を示すフローチャートである。第４図は他の具体的な実施例の構成図、第５図は第４図
の制御部（ＣＰＵ／コントローラ）の動作の一実施例を
示すフローチャートである。図中符号、１−１・・・反応槽１−２・・・給送系１−３・・・排送系１−４・・・温度制御系１−５・・・撹拌／振とう系１−６・・・貯蔵系１−７・・・ＣＰＵ／コントローラ２−１〜２−８・・・反応液貯蔵容器２−９〜２−１６・・・電磁弁２−１７・・・サプライポンプ２−１８・・・撹拌器２−１９・・・温度センサー２−２０・・・コントローラ２−２１・・・ＣＰＵ２−２２・・・ヒータ２−２３・・・フィルター２−２４・・・ドレインポンプ２−２５・・・反応槽２−２６・・・フィルター固定器を表わす。東５図イの ■ ドレインポンプを所定時間稼動し、反応種から吸引、廃棄を行うドレインポンプを所定時間稼動し。反応槽から吸引、廃棄を行う ↓ サプライポンプを所定時間稼働し、反応槽にＢｕｆｆｅ
ｒ＋を容器２−３から導入する電磁弁２−１０を閉じる ↓ 撹拌器ＯＮ ↓ 所定時間　待機 ↓ 撹拌器ＯＦＦ ↓ ドレインポンプを所定時間稼働し、 ↓ サプライポンプを所定時間稼働し、反応槽にＢＳＡ溶液
を容器２−５から導入する ↓ 電磁弁２−１３を閉じる ↓ 攪拌器ＯＮ ↓ 所望１度への温度維持回路ＯＮ ↓ 所定時間　待機 ↓ 所望温度への温度維持回路ＯＦＦ ↓ 撹拌器ＯＦＦ ↓ ドレインポンプを所定時間稼働し、 ↓ サプライポンプを所定時間稼働し、反応槽に５Ａ−ＡＰ
溶液を容器２−６から導入する電磁弁２−１４を閉じる ↓ 撹拌器ＯＮ ↓ 所定時間　待機撹拌器ＯＦＦドレインポンプを所定時間稼働し、ドレインポンプを所定時間稼動し、反応槽から吸引、廃棄を行うサプライポンプを所定時間稼働し、反応槽にＢｕｆｆａ
ｒ２溶液を容器２−４から導入する電磁弁２−９を閉じ
る撹拌器ＯＮ所定時間　待機撹拌器ＯＦＦドレインポンプを所定時間稼働し、 ↓ サプライポンプを所定時間稼働し、反応槽にＮＥＴ　−
ＢＣＩＰ溶液を容器２−７から導入する電磁弁２−１５
を閉じる撹拌器ＯＮ ↓ 所定時間　待機Ｔｔｉｓ待機反応種から吸引、＊＊を行う ↓ ＮＤ殆５図＋のドレインポンプを所定時間稼動し、反応槽から吸引、廃棄を行う茶５図４，７，３ドレインポンプを所定時間稼動し、反応槽から吸引、廃棄を行うサプライポンプを所定時間稼働し、反応槽にＢｕｆｆｏ
ｒ＋を容器２−３から導入する電磁弁２−１０を閉じる振とう器ＯＮ所定時間　待機振とう器ＯＦＦドレインポンプを所定時間稼働し、反応槽から吸引、Ｗｉ！を行う ↓ サプライポンプを所定時間稼働し、反応槽にＢＳＡ溶液
を容器２−５から導入する ↓ 電磁弁２−１３を閉じる ↓ 振とう器ＯＮ ↓ 所望温度への温度維持回路ＯＮ ↓ 所定時間　待機 ↓ 所望温度への温度維持回路ＯＦＦ ↓ 振とう器ＯＦＦ ↓ ドレインポンプを所定時間稼働し、反応槽から吸引、ｌｉＮを行うサプライポンプを所定時間稼働し、反応槽に５Ａ−ＡＰ
溶液を容器２−６から導入する電磁弁２−１４を閉じる振とう器ＯＮ所定時間　待機振とう器ＯＦＦドレインポンプを所定時間稼働し、反応槽から吸引、廃棄を行う ↓　　つづくドレインポンプを所定時間稼動し、反応槽から吸引、廃棄を行う ↓ サプライポンプを所定時間！働し、反応槽にＢｕｆｆｏ
ｒ２溶液を容器２−４から導入する↓ 電磁弁２−９を閉じる ↓ 振とう器ＯＮ ↓ 所定時間　待機振とう器ＯＦＦドレインポンプを所定時間稼働し、 ↓ サプライポンプを所定時間稼働し、反応槽にＮＥＴ　−
ＢＣＩＰ溶液を容器２−７から導入する↓ 電磁弁２−１５を閉じる振とう器ＯＮ ↓ 所定時間　待機 ↓ 振とう器ＯＦＦ ↓ ドレインポンプを所定時間稼働し、反応槽から吸引、廃棄を行う電磁弁２−１６を開くサプライポンプを所定時間稼働し、５Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　・ＥＤＴＡ溶液を容器２−８かシミ
磁弁２−１６を閉じる振とう器ＯＮ所定時間　待機振とう器ＯＦＦドレインポンプを所定時Ｍ稼働反応槽から吸引、廃棄を行う ↓ ＮＤ芝応檀にう導入するし、

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一槽からなる反応槽で呈色させる装置であって、酵素反応により呈色させうる標識物質を支持膜上に保持
させたサンプルを装着する手段；複数容器に、該標識物
質と特異的に結合する酵素溶液、該酵素と選択的に結合
する第二の酵素溶液、染料溶液、呈色停止液及び複数種
の洗浄液（以下これらを反応液と総称する）を分別貯蔵
する手段；複数種の該反応液を選別し、かつ槽内への反
応液流入量を制御する給送手段；槽内反応液の加熱手段
及び温度検知手段を備えた温度制御手段；槽内溶液を撹
拌あるいは振とうする手段；槽内反応液の排送および再
使用を選別する手段；槽内反応液を一旦保持し再び反応
液として用いる手段；槽内反応液の排送手段；槽内の制
御温度、給送反応液種及び流入量と給排送のタイミング
の信号を利用者により設定する手段；を有することを特徴とする呈色反応自動化装置。
（２）酵素反応により呈色させうる標識物質と結合した
物質（以下リガンドと称す）が支持膜上の特定の場所に
固定されてかつリガンドと特異的に結合する物質（以下
リセプターと称す）を介して該支持膜上に保持させたサ
ンプルの１枚あるいは複数枚を、一槽からなる反応槽内
で、該標識物質と特異的に結合する酵素溶液、該酵素と
選択的に結合する第二の酵素溶液、染料溶液、呈色停止
液及び複数種の洗浄液に逐選的に浸漬して呈色反応させ
る工程において、利用者が設定した信号に従って、該槽内へ給送する反応
液の種と総流量及び槽内維持継続時間間隔と槽内温度を
制御する装置によって、逐次反応を達成する、ことを特徴とする呈色反応の方法。
（３）標識物質を結合した該物質が特定の塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項
２記載の方法。
（４）該オリゴヌクレオチドを該膜上の特定の場所に保
持する方法が該オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補性
を有し該膜上に固定された一本鎖ＤＮＡフラグメントと
のハイブリダイゼーシヨンによることを特徴とする請求
項２及び３記載の方法。
（５）該標識物質がビオチン、ビオチン誘導体、ジニト
ロフェニル誘導体、アセチルアミノフルオレイン誘導体
から選ばれた一つであることを特徴とする請求項２記載
の方法。