JPH03103174A - 有用代謝産物の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は植物組織培養法を使った有用代謝産物の生産に
於で、特定の培地を使用して該代謝産物を細胞外へ放出
させながら連続的に生産する方法に関する。

（従来の技術） 植物細胞を用いての有用物質生産では、植物細胞の増殖
速度が非常に遅い（微生物細胞の数十分の一）というこ
と、組織培養系では親植物の持っていた代謝産物の生産
能が低下したり消失してしまうこと、さらに代謝産物の
多くが細胞内に蓄積されるために高濃度大量生産ができ
ないということなどの問題がある。

これらの問題のうち、代謝産物の生産能の低下や消失と
いう問題を解決するための千段として、器官培養法や毛
状根培養法を利用することによって、ある程度生産性を
向上させられることが報告されてきた。しかしながら、
こうした培養方法よりも、増殖速度が非常に遅い植物組
織や培養細胞を使った物質生産において、最も直接的で
効果的な生産方法は、有用代謝産物の生産・蓄積を細胞
の山という限られた空間で行わせるのではなく、産生さ
れた代謝産物を積極的に細胞外へ放出させることによっ
て空間的な制限や生産物阻害による制限を取り除くこと
が可能な生産方法である。

植物の組織や培養細胞は、多くの場合、代謝産物を細胞
内に蓄積し、人為的に膜の透過性を変えるなどの特別な
処理を施すことなしに、代謝産物を細胞外へ放出する例
は非常に少ない。従って、現状では、有用代謝産物を回
収するために、組織や培養細胞を破壊して代謝産物を回
収する工程が必須となる。この工程は代謝産物の生産速
度という面からみて、組織や細胞を反復利用することが
できないために、増殖速度の遅い植物細胞では、特に大
きな欠点になる。

こうした背景から、植物細胞の膜透過性を変化させるこ
とによって、細胞内蓄積有用代謝産物を細胞外へ放出さ
せ、しかも、細胞の生在活性には損傷を与えない方法の
確立が望まれてきており、挿々の研究が報告されてきて
いる。

これまでに、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）など
の有機溶剤で細胞を処理する方法［Ａｎａｌ．　Ｂｉｏ
ｃｈｃｍ．　１１６．４６２（１９８１）．　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒａｐ．　３，２６２−２６５　（１９
８４）および特開昭６３−２２６２７８コ。Ｔｒｉ　ｔ
ｏｎ−ＸＩＯＯなどの界面活性剤で細胞を処理する方法
［Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ．　２７，　５６１（１９８８）特開昭６３−１
２９９８２］、高いイオン強度をもった培地で細胞を処
理する方法［Ｂｉｏｔｃｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏａｎｇ．
　２７．　８９０−８９２　（１９８５）］、細胞に電
気パルスを与える方法［ＰＩａｎｔ　Ｃａｌｌ　Ｒｅｐ
．　７．１８６−１８８（１９８８）］，エリシタ−（
Ｅｌｉｃｉｔｏｒ）を培地に添加する方法［Ｐｈｙｔｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６．４０１−４０５（１９８７
）］　、有機酸を培地に添加する方法［Ａｎａｌ．　Ｂ
ｌｏｃｈｅｍ．　１１８．　４６２（１９８１）、特開
昭６３−２２６２７８］、抗生物質を培地に添加する方
法［Ａｎａｌ　．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｌｉＢ．　４６２
（１９８１）コ、エチレングリコール、ジエチレングリ
コール、トリエチレングリコール等の低分子量多価アル
コールで処理する方法（特開昭８３−２２６２７８）な
どで細胞を処理する方法が検討されている。しかしなが
ら、上記の方法のうち、低分子量多価アルコールを添加
する方法を追試したところ、細胞に対する毒性が強すぎ
るために、細胞がほとんど増殖しなかったばかりか、代
謝産物を細胞外へ放出させるという目的をも遂げられな
かった（実施例１参照）。このように、対象とする細胞
の種類や目的代謝産物の違いによる代謝産物放出効果の
変動、さらに細胞の生存活性へのダメージの大きさの点
で、まだ多くの問題があり、いずれの方法も実用段階に
は至っていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、」二記課題、すなわち細胞の生存活性には悪
影響を与えずに、植物細胞の膜透過性を変化させること
によって、細胞内蓄積有用代謝産物を細胞外へ放出させ
る方法の確立を目的とするものである。

（課題を解決するための手段） 上記課題は、植物の組織あるいは培養細胞を高分子量の
ポリエチレングリコールを含Ｈする培地を用いて培養し
、細胞の生在活性に悪影響をｂえることなく、該組織あ
るいは該培養細胞の生産する有用代謝産物を組織外へ連
続的に放出させながら生産することを特徴とする６用代
謝産物の生産方法により解決される。

すなわち、本発明者らは、動植物細胞の細胞融合剤とし
て、また動物細胞の培養における無血浴培地め成分とし
て用いられている高分子量のポリエチレングリコール（
Ｐ　Ｅ　Ｇ）が植物細胞の生在活外にあまり悪影響を与
えることなく膜の透過ｔ／ＩＥを変化させ、細胞内の物
質を細胞外へ放出させる効果があると考えた。

そこで高分子量のポリエチレングリコールを培地に添加
した条件で植物の組織や培養細胞を培益することによっ
て、上記目的が達成できることを知り、この知見に基づ
いて本発明を完成するに至った。

（作用） すなわち、本発叩は、 （１）数平均分子量が２００以」二である高分子量のポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）を倉−６する培地中で
植物の組織、あるいは培養細胞を培養する培養方法、 （２）」―記培地を使用して培養することによって、細
胞の増殖に悪影響を与えることなく、組織や細胞内に蓄
積されている有用代謝産物や、細胞外へ分泌されている
代謝産物の分泌量を通常の分泌量よりも顕著に増大せし
める培養方法、 からなることを特徴とする有用代謝産物の生産方法を提
供するものである。

以下、本発四を詳細に説叩する。

本発明が適用される有用代謝産物産生植物として具体的
には、アルカロイドの生産に川いられる植物として、ニ
チニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　　ｒｏｓｅ益
）ウオレン（Ｃｏｐｔｉｓ　　ｊａｐｏｎｉｃａ）イン
ドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆ１ａ　　ｓｅｒｐｅｎｔｉ
ｎａ）　、キハダ（Ｐｈｅｌ　Ｉｏｄｅｎｄｒｏｎ　　
ａｍｕｒｃｎｓｅ）　、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
　ｔａｂａｃｕｍ）など、色素の生産に用いられる植物
としてコウシンダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ　　ｓａｔ
ｌｖｕｓ＞、アカネ（Ｒｕｂｉａａｒｇｙｉ）　、ツル
ムラサキ（Ｂａｓｅｌｌａ　　ｒｕｂｕｒａ）　、クチ
ナシ（Ｃａｒｄｅｎｉａ　　ｊａｓｍｉｎｏｉｄｃｓ）
、ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ　　ｃｒｙｔｈ
ｏｒｒｈｉｚｏｎ）、ブドウ（Ｖｉｔ１ｓ　　ｖｉｎｉ
ｆ’ｃｒａ）　、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　　ｔ
ｉｎｅｔｏｒｉｕｓ）、サフラン（Ｃｒｏｓｕｓ　　ｓ
ａｔｉｖｕｓ）、ダイオウ（Ｒｈｅｕｍｐａｌｍａｔｕ
ｍ）など、サポニンの生産に用いられる植物として、オ
タネニンジン（Ｐａｎａｘ　　ｇｉｎｓｅｎｇ）、トチ
バニンジン（Ｐａｎａｘ　　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ミシ
マサイコ（１３ｕｐｌｃｕｒｕｍ　　ｓｃｏｒｚｏｎｅ
ｒａｃｆｏｌｉｕｍ）、キキョウ（　１）＋ａｔｙｃｏ
ｄｏｎ　　ｇｒａｄｉｆｌｏｒｕｍ）、ヤマノイモ（Ｄ
ｉｏｓｃｏｒｃａｊａｐａｎｉｃａ）など、何用精油成
分の生産に用いられる植物として、ハッカ（Ｍｅｎｔｈ
ａ　　ａｒｖｅｎｓｉｓ）、シソ（Ｐａｒ１１１ａ　　
ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）　、さらに有用酵素の生産に用
いられる植物として、西洋ワサビ（Ｃｏｃｈｌｃａｒｉ
ａ　　ａｒｍｏｒａｅ１ａ）、パパイア（Ｃａｒｉｅａ
　　ｐａｐａ■）、ニチニチソウなどを挙げることがで
きる。

本発明では上記植物の組織および培養細胞を培養するに
あたっては、長梢のポリエチレングリコール群から選ば
れる任意の分子量のもののうち、少なくとも１挿の含有
する液体培養が用いられる。

本允明に関わるポリエチレングリコールとして、具体的
には、数平均分子量が２００以一ｌ二、好ましくは４０
０以上の長鎖のポリエチレグコリールである。

本発明では、該ポリエチレングリコールの培地中に於け
る濃度としては、通常、０．０１〜３０％（Ｗ／Ｖ）、
奸まし＜（；！０．１〜２０％（Ｗ／Ｖ）　の範囲であ
る。ポリエチレングリコールの濃度が０．０１％（ν／
Ｖ）未満では、有用代謝産物を誦胞外へ放出させる効果
が得にくく、また該濃度を３０％（１／／Ｖ）を越える
と、細胞の生在活性はほとんど影響を受けないが、培地
の粘度が上昇するため、培養液への酸素供給などにおい
て操作上の困難を生じることがあるので、通常、ポリエ
チレングリコールの濃度は前記濃度範囲にあることが望
ましい。

本発明で使用される液体培地は上記のポリエチレングリ
コールを、有用代謝産物の放出効果を得るための必須成
分として含有する、植物組織培養に一般的に用いられて
いる戊分を含む培地である。

」二記の植物組織培養に一般的に用いられている培地と
しては、ムラシゲースクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
−Ｓｋｏｏｇ培地、以下ｒＭＳ培地」という）、リンス
マイヤー−スクーグ培地（Ｌｉ　ｎｓｍｃｉｃｒ−Ｓｋ
ｏｏｇ培地、以下ｒＬＳＪ培地という）、ホワイト培地
（Ｗｈｉｔｅ培地）、ガムボルグ培地（Ｇａｍｂｏｒｇ
培地）、ニッチ培地（Ｎｉｔｃｈ培地）、ニッチーニッ
チ培地（Ｎｉ　ｔｃｈ−Ｎｉｔｃｈ培地）、コーレンバ
ッハーシュミット培地（Ｋｏｈｌｃｎｎｂａｃｈ−Ｓｃ
ｈｍ１ｄｔ培地）などの培地を使用することができる。

なお、植物ホルモンは植物の組織や培養細胞の培養に適
した柿類のものを必要な濃度だけ、適宜添加することが
できる。

本発明で使用できる上記培地は液体培地である。

本発明の培養方法は、上記培地を調製し、そこへ植物の
組織および培養細胞を接挿することによって培養を開始
する。細胞は培養開始直後より、有用代謝産物を細胞外
へ放出するようになるが、植物の種の違いや代謝産物の
柿類の違いによって生産される時期が異なる。従って、
目的代謝産物の生産様式に合った時期に培地のみを口収
し、残った組織や細胞は新たに上記の新鮮な培地を添加
することによって、まったく同様に、細胞の生在活性を
維持しながら細胞内蓄積代謝産物を細胞外へ放出させる
培養方法を繰り返し行うことができる。

（実施例） 以下、実施例を上げて本発叩をさらに詳細に説叩する。

実施例Ｉ ＭＳ培地にシュークロース　３０ｇ／．Ｑ，植物ホルモ
ンとして２．４−Ｄ　（２．４−ジクロロフエノキシ酢
酸）　０．　　５ｍｇ／．Ｑ　，カイネチン０，１＋ｎ
ｇ／Ｄを添加した培地を調製し、そこへエチレングコリ
ール（Ｅ　Ｇ’）を１．０、２．５、５．０、１０．０
％、ジエチレングリコール（Ｄ　Ｅ　Ｃ）を１．０、２
．５、５．０％、トリエチレングリコール（Ｔ　Ｅ　Ｇ
）を１．０、２．５、５．０％、さらに、種々の分子鎖
長を持つポリエチレングコリール、すなちわＰＥＧ２０
０　（平均分子量２００）を１．０、２．５、５．０％
、ＰＥＧ４００　（平均分子量４００）を１．０、２．
５、５．０％、ＰＥＧ６００　（平均分子量６００）を
１．０、２．５、５．０％、ＰＥＧ３００００　（平均
分Ｔ−量３０　０　０　０）を５．０％それぞれ添加し
た培地を調製し、ニチニチソウの懸濁培養細胞を培地５
０ｍｌに対して５ｍｌ接挿して培養を行い、培養開始後
１３０ロの細胞外ベルオキシダーゼ活性と細胞収量の比
較を行った。その結果を、第１図に示す。

酵素の活性は、過酸化水素とＡＢＴＳ　（２．２−アジ
ノービス［３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸コア
ンモニウム塩）とを基質としてＡＢＴＳがベルオキシダ
ーゼによって酸化されることによる発色を吸光度計を用
いて７Ｉｌリ定した。その結果を第２図に示す。

第１〜２図の結果から明らかなように、ＥＧ、ＤＥＣ，
そしてＴＥＧを添加した場合には、細胞外ベルオキシダ
ーゼ活性の増大効果がほとんど見られなかったばかりで
なく、細胞増殖に与える阻害効果も顕著であった。一方
、ポリエチレングリコールを添加した場合では、分子量
が大きくなればなるほど、細胞外のべルオキシダーゼ活
性が増大し、さらに、細胞増殖に与える影響も、消失す
ることが明らかとなった。また、平均分子量が２００か
ら３０，０００のポリエチレングリコールまで非常に広
い分子量の範囲で酵素活性を増大させる効果がみられた
。

実施例２ ＭＳ培地にシュークロース３０ｇ／Ｄ，植物ホルモンと
して２．４−Ｄ　（２．４−ジクロロフエノキシ酢酸）
を１０−８Ｍ／Ｎを添加した培地、および上記培地に平
均分子量６００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０
０）を５％（Ｗ／’Ｖ）添加した培地、平均分子量３，
３５０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０）を
５％添加した培地、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ
）５％を添加した培地をそれぞれ調製し、培地５０ｍｌ
に対してハナタバコの懸濁培養細胞を５ｍｌして培養を
行った。

細胞の収量を測定したところ、第３図の結果が得られれ
た。同図から明らかなように、ＤＭＳＯを添加した場合
には、細胞の生存活性が強く匝書され、全く細胞の増殖
がみられなかったが、ポリエチレングリコールを添加し
た場合には増殖附害は全く見られなかった。

実施例３ ＭＳ培地にシュークロース３０ｇ／ｇ，植物ホルモンと
して２．４−Ｄ　（２．４−ジクロロフエノキシ酢酸）
０．５ｍｇ／Ｎ　，カイネチン０．１ｍｇ／Ｄを添加し
た培地（増殖用培地）を詞製し、培地５　０　ｍｌに対
してニチニチソウの懸濁培養細胞を５ｍｌ接種して前培
養を行った。

前培養した細胞懸濁液を遠心分離し、新軒な上記培地で
洗浄後、同組成の培地平均分子量６００、６０００およ
び３００００のポリエチレングコリール（ＰＥＧ６００
、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ３０　０　０　０）をそれぞ
れ５％（Ｗ／Ｖ　）を添加した培地、およびポリエチレ
ングリコールを添加していない培地に再度懸濁した。こ
れらの細胞懸Ｑｉ夜を４時間振盪培養したのちに遠心分
離し、細胞を除いた培地のべルオキシダーゼの活性を測
定した。

その結果を第１表に示す。

第１表の結果から明らかなように、検討の桔果、いずれ
の分子量のポリエチレングコリールを添加した場合でも
無添加の場合に比べて顕著な酵素活性の増大がみられた
。

第１表 添加物 ペルオキシダーゼ活性 （Ｘ　１　０’　　Ｕ／ｍｌ） な　　し　　　　　　　　　　　　　　　　　０．　　
００５８５％　ｌ）ＥＧ８００　　　　　　　　　０．
　　Ｏ　１　５　３５％　ＰＥＧ６０００　　　　　　
　　０．　　０３３６５％　Ｉ）ＥＧ３００００　　　
　　　　　０．　　０４４６分離し、細胞を除いた培地
のべルオキシダーゼの活性を測定した。その粘果を第２
表に示す。

第２表の結果から明らかなように、いずれの濃度の場合
でも、無添加の場合の酵素活性と比較して、高い活性が
得られた。

条 第２表 件 ペルオキシダーゼ活性 （Ｘ　１　０’　　Ｕ／ｍｌ） 実施例４ 実施例１と同様の増殖用培地を調製し、前培養した細胞
懸濁液を遠心分離し、新鮮な上記培地で洗浄後、同組成
の培地に平均分子量３０，０００のポリエチレングリコ
ール（ＰＥ０３００００）を０．５、１．０、５．０、
１　０．　０％（Ｗ／Ｖ）　ソれぞれ添加した培地、お
よびポリエチレングコルールを添加していない培地に再
度懸濁した。これらの細胞懸濁液を１２時間振盪培養し
たのち遠心無添 ０．５％ １．０％ ５．０％ １０．０％ 加 ＰＥＧ３００００ ＰＥＧ３００００ ＰＥＧ３００００ ＰＥＧ３００００ ７９２ ４２６ ５４７ ２４７ ２９８ 実施例５ 実施例１と同じ組成の増殖用培地に平゛均分子量３０，
０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ３　０　０　
０　０）を添加した培地を調製し、ニチニチソウの懸濁
培養細胞を培地５０ｍｌに対して５ｍｌ接種して培養を
行い、培養開始後１３日目までのべルオキシダーゼの活
性を測定した。同様にＰＥＧ３００００無添加のものに
ついて測定した。その結果は第４図のとおりである。

第４図の結果から明らかなように、ポリエチレングコリ
ールを添加した場合は添加していない場合に比べて顕著
な酵素活性の増大がみられた。また、培地中のタンパク
質量も増大していることがわかった。さらに細胞収量を
比較したところ、第３表の粘果が得られたが、ポリエチ
レングリコールの添加による増殖阻害はまったく見られ
なかった。

５｛５ ３ 表 培 養 条件 細胞収量 （ｇ／ρｄｒ．　ｗｔ．） ５％　Ｉ）ＥＣ３００００　　　　　　　　　　　９．
　　６８無添加　　　　９．９０ 実施例６ アントシアニン系赤色色素を産生ずるコウシンダイコン
の培養細胞を０．５ｇ（湿重量）づつ秤りとり、５％の
平均分子量６００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６
００）　、平均分子量６，０００のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ６０００）、平均分子ｆｉｔ３０．０００
のポリエチレングリコール（ＰＥＧ３００００）をそれ
ぞれ添加したリン酸緩衝液に接種して２５℃で振盪した
。振盪開始２０時間後に培地中に放出された赤色色素量
を、５１０ｎｍの吸光度を測定することによって比較し
たところ、第４表の結果が得られた。

第４表の結果から明らかなようにポリエチレングコリー
ル処理によって培地中に放出される赤色色素の量が増大
した。

第４表 処理条件 培地の吸光度（５ＬＯｎｍ） ５％　Ｉ）ＥＧ６００　　　　　　　　　　０．　１４
６５％　１）じＧ６０００　　　　　　　　　０．　　
１６７５％　１）ピＧ３００００　　　　　　　　０．
　　１９４未処理　　　０．　０５７ （発明の効果） 本発明方法であるポリエチレングリコールによる有用代
謝産物の細胞外放出方法は、これまでに報告されている
種々の方法に比べ、細胞に与える損傷がほとんどないた
め、予め植物の組織や細胞を培養してから処理するとい
った複雑な操作を伴うことなく、培養開始時からポリエ
チレングリコールを添加して、細胞中に蓄積されたａ用
代謝産物を連続的に放出生産することが可能になる。

本発明方法によれば、代謝産物が細胞内に蓄積すること
による生産物附害がなくなるため、有用物質を従来より
も高濃度で生産することができ、また、細胞を破砕して
代謝産物を分離する操作の必要がなくなるので培養操作
の単純化を図ることができる。さらに、組織や細胞の繰
り返し利用が可能になるため、生産コストの低減化がで
きる。

言い換えれば、これまでに含量が少なく、生産コス１・
の面で工業化を断念されていたものでも王業化が可能に
なると考えられ、植物組織培養による有用物質生産に対
して大きく寄与することができる。

【図面の簡単な説明】

第１園は各種添加物が細胞外ベルオキシダーゼ活性に与
える影響を示すグラフ、第２図は谷秤添加物が細胞収量
に与える影響を示すグラフ、第３図は細胞増殖に対する
各種添加物の阻害効果を示すグラフであり、また第４図
は高分子量ポリエチレングリコールの添加が細胞外ベル
オキシダーゼ生産に与える促進効果を示すグラフである
。 第２図 畑胞ｈ）＜童｛９／Ｌチ謙珪） 〜　　−　　Ａ　　ひ　　の　　Ｎ　　の　　ω　　０
　　吻　　〜特許出廓人 日本触媒化学工業株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物の組織あるいは培養細胞を高分子量のポリエ
   チレングリコールを含有する培地を用いて培養し、細胞
   の生存活性に悪影響を与えることなく、該組織あるいは
   該培養細胞の生産する有用代謝産物を組織外へ連続的に
   放出させながら生産することを特徴とする有用代謝産物
   の生産方法。
2. （２）培地に添加するポリエチレングリコールの数平均
   分子量が２００以上の高分子量のものである請求項１に
   記載の生産方法。