JPH03101698A - 新規ポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、ある種の細菌（特にダラム陰性菌）を殺すこ
とができるという点で殺菌活性を有する新規ポリペプチ
ドに関する。また、本発明は細菌増殖を阻止するための
薬剤組成物および方法に関する。

［従来の技術１ 小腸は重要な内分泌器官であり、多くの生理活性ペグチ
ドが最初にブタ組織から単離された（Ｍｕｔｔ，Ｖ．，
　Ｃｈｅｍｉｃａ　Ｓｃｒｉｐｔａ　２６Ｂ．　１９１
−２０７　（１９８６）参照）。正常なＷ１康状態にお
いて、小腸の上部は細菌をほとんど含まない。十二指腸
より下がると、細菌の濃度は次第に増え、大腸では最高
１０１１細菌／ｇ糞便に達する。このような大量の細菌
が繊細な宿主器官と共存し得るということは注目に値す
る。セクロビン（　ｃｅｃｒｏｐｉｎ）と呼ばれる小型
の塩基性ペググードは昆虫の免疫において重要な役割を
演じており（Ｂｏｍａｎ，Ｈ．Ｇ．　＆　｝Ｉｕｌｔｍ
ａｒｋ，Ｄ．，　Ｄ．＾ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．　４１．　１０３−１２６　（１９８７）参照）
、また、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）と呼ばれる構
造的に無開係のペプチドはカエルの皮膚を感染から保護
している（Ｚａｓｌｏｆｆ．Ｍ．，　Ｐｒｏｃ．ＮａＬ
Ｉ．＾ｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ．　８４．　５４４９−
５４５３　（１９８７）参照）。別のグループの抗菌ペ
プチドであるデフェンシン（　ｄｅｆｅｎｓ　ｉｎ）は
初めに晴乳類の顆粒球（Ｓｅｌｓｔｅｄｔ，Ｍ．Ｅ．，
Ｓｚｋｌａｒｅｋ，Ｄ．　＆　Ｌｅｈｒｅｒ．Ｒ．Ｉ．
，　Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．　４５＋１５０−１５
４　（１９８４）　参照）および好中球（　Ｓｅ　ｌｓ
Ｌｅｄｔ．Ｍ．Ｅ．，　Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｍ．，　Ｄｅ
Ｌａｎｇｅ．Ｒ．Ｊ．，　Ｈａｒｗｉｇ．Ｓ．Ｓ，＆　
Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
　２６０．　４５７９−４５８４　（１９８５）参照）
から単離され、最近になって昆虫からも単離された（Ｍ
ａｔｓｕｙａｍａＪ，　＆　Ｎａｔｏｒｉ，Ｓ．，　Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６３．　１７１１２−１７
１１６　（１９８ｇ）；　Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．　ｅＬ
　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．ＮａＬＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
　ＵＳＡ　８６．　２６２−２６６　（１９８９）参照
）。さらに、ウシ好中球は別の小型塩基性ペプチドのヂ
《クテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ）を含むことが判
明した（Ｒｏｍｅｏ，Ｄ．，　Ｓｋｅｒｌａｖａｊ，Ｂ
．，Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ．ｌＪ　＆　Ｇｅｎｎａｒｏ，
Ｒ．．　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６３＋９５７３
−９５７５　（１９８８）参照）。デ７エンシンもバク
テネシンも１個以上のジスルフィド橘を含むが、セクロ
ピンとマガイニンはシステインを含まない。

「発明が解決しようとする課題１ 本発明の目的は、細菌増殖（特に、ダラム陰性菌の増殖
）を阻止することができる新規な殺菌性ポリペブチドを
提供することである。本明細書中において、“阻ＩＥ“
なる用語は細菌を殺すことを含めるものとする。

本発明の他の目的は、活性成分として前記ポリペプチド
を含む組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、動物（特に、ヒトを含む啼
乳類）における細菌増殖を阻止するための治療方法を提
供することである。

［課題を解決するための千段１ １１１記目的および以下の説明から明らかな他の目的の
ために、本発明は次のアミノ酸配列：Ｈ，Ｎ−Ｓｅｒ−
Ｔｒｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ−１．ｙｓ−Ａｒｇ−１　　１ｅ−ＳｅｒＧ
ｌｕ−Ｃ；Ｉｙ−Ｉ　　Ｉｅ−Ａｌａ−１　　１ｅＡｌ
ａ−Ｉ　　Ｉｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＰｒｏ−Ａｒ
ｇ−ＣＯＯＨ を有するポリペプチドを提供し、また本発明は２．３の
保存的アミノ酸置換およびＣ末端アミドのような機能誘
導体を包含する。アミド形態はより良い抗生物質である
（実施例３参照）。

本発明ポリペプチドおよびその機能誘導体はすべて治療
上有用であり、特に抗菌剤として使用される。従って、
それらは細菌（特に、ダラム陰性菌）の増殖を阻止する
ことができ、様々な治療目的のために利用される。これ
については以下の特定実施例で詳しく説明することにす
る。

本発明による活性ポリペプチドはヒトまたは動物の治療
用あるいは予防用の医薬として使用するために製剤化さ
れる。活性製剤は通常経口的に、直腸に、または注射に
より投与され、活性或分および製剤学的に許容しうる担
体（固体、半固体または液体でありうる）を含有する薬
学的製剤または組成物の形で、あるいは経口的に投与す
る場合はカプセル内に封入した形で投与される。薬学的
製剤の例としては、錠剤、点滴剤、溶液剤および坐剤を
挙げることができる。一般に、活性戊分は薬学的製剤の
少量部、例えば重量基準で製剤の約０．１〜５０％を占
める。

経口投与用の投薬単位形態の薬剤組成物を調製するため
に、本発明ポリペプチドは固体、粉末または他の担休、
例えば乳糖、シヨ糖、ソルビトール、マンニトール、デ
ングン（例．ジャガイモデンブン、トウモロコシデング
ン）、ミロペクチン、セルロース誘導体、またはゼラチ
ンと混合することができ、さらに滑沢剤（例．ステアリ
ン酸マグネシウムまたはカルシウム）、またはポリエチ
レングリコールワックスを含むことができ、錠剤や糖衣
錠の本体に圧縮或形される。

数層の担体または希釈剤で被包することにより、徐放性
錠剤を製造することができる。

経口投与用または注射用の液体製剤はエリキシル剤、シ
ロップ剤または懸濁剤の形態に調製され、例えば溶液剤
は０．１〜２０重景％の活性物質、糖、エタノール、水
、グリセロール、プロピレングリコール、および任意に
他の慣用添加剤を含むことができる。

活性成分の投与量は広範囲にわたって変化し、疾患の重
症度、患者の年令および体重のような諸要因に左右され
、個々に調節することができる。

本発明はまた、動物における細菌増類を阻止しうる量の
前記ポリペプチドまたはその機能誘導体を投与すること
から成る、動物（例えば、ヒトを含む嘘乳類）の治療方
法を提供する。

本発明は以下の特定実施例によりさらに詳しく説明され
るであろう。しかしながら、これらの実施例は本発明の
範囲を制限するものとして解釈されるべきでなく、本発
明は添付の特許請求の範囲によって制限される。

熱安定性腸ペプチドの濃縮物は、本質的に他の文献［Ｍ
ｕｔｔ，Ｖ．，＾ｒｋｉｖ　Ｋｅｍｉ　１５．　６９−
７４　（１９５９）；Ｍｕｔｌ，Ｖ．，　Ｇｕｔ　１７
ｏｒｍｏｎｅｓ　（ｅｄ．　　ＢＩｏｏｍ．Ｓ．Ｒ．）
＋　　ｐ−２１−２７＋　　（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　　
Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，　　Ｅｄｉｎｂｕｒｇ．　　
１９７８］に記載されるようにしてブタ小腸から調製し
た。

ｏｎ単に説明すると、最上メートルの腸を沸騰水中に８
±１分間浸漬し、その後氷上で冷却して凍結した。凍結
材料を細か〈刻み、０．５Ｍ酢酸を用いて０−＋５゜Ｃ
で１２時間抽出し、この混合物を吸引濾過（懸濁液１リ
ットルあたり“ＩｌｙｆｌｏＳｕｐｅｒ−Ｃｅｌ″３０
ｇを使用）に付した。ペグチドは濾液からアルギン酸に
吸着させ、ペブチド吸着アルギン酸は順次０．００５Ｍ
　ＨＣ＋、９５％エタノール（脂肪を除くため）、再度
０．００５ＭＨＣＩで洗った。０．２Ｍ水冷ＨＣＩを用
いてペプチドを溶出し、溶出液のｐＨを酢酸ナトリウム
で３．５士０．１に調節した。その後溶出液にＮａＣ　
ｌを飽和させてペプチドを沈澱させ、沈澱物を吸引濾過
により回収した。この沈澱物の重さ（湿潤重量）は沸騰
させた腸組織の約１０００分の１であった。

この濃縮物は室温で水に溶解してｌＯｗ／ｖ％溶液とし
た。この溶液に２倍容量の９５％エタノールを加え、そ
の（見掛け）ｌ）ＴＩ（ガラスｔｌＥ緬で測定）をＮ　
ａ　Ｏ　Ｈで７．５±０．１に調節した（ＩＭ　ＮａＯ
ＩＩ　：　Ｅ　ｔＯＴＴ　　ｌ　：　２）　，沈澱物が
形戊され、濾過により除いた。透明溶液に１容量の９５
％エタノール（−２０°Ｃに予め冷却したもの）を加え
、懸濁液をこの温度に２４時間保ち、その後ｍ過した。

ベプチドは濾液から水溶液中に回収し、この溶液にＮａ
Ｃｌを飽和させてｐｌｒ３．５±Ｏ．ｌで沈澱させた。

吸引濾過により回収した沈澱物は、その調製のために使
用した濃縮物の約１０％の重さであった。それを０．２
ＭＡＣＯＨに溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５　ａ
ｌ粒子によるクロマトグラ７イーにかけ、０．２Ｍ　Ａ
ｃＯＨで溶出した。このクロマトグラフィーからのペプ
チド含有溶出液の第二半量（容量で）にＮａＣ　Ｉを飽
和させ、沈澱物を吸引濾過により回収した。その重さは
このクロマトグラ７イーに利用したペプチド沈澱物の約
４０％であった。それを水に溶解し、この溶液のｐＨを
４±０．１に調節し、ＮａＣ　ｌでベグチドを再沈澱さ
せ、沈澱物を吸引濾過により回収した（再沈澱ｎＩＩと
後の物質の重さには有意な差がなかった）。この再沈澱
物質をメタノール（５０ｍｌ／ｇ）で抽出し、Ｍ　ｅ　
Ｏ　Ｈ不溶性画分を吸引濾過により集め、７イルター上
でエーテルにより洗った。エーテルを真空蒸発させた。

乾燥物質の重さはＭ　ｅ　Ｏ　Ｈ抽出に利用したべグチ
ド沈澱物の約ｌ５％であった。

実施例２ 濃縮物の精製 精製のための出発物質として、実施例１から得られた濃
縮物を使用した。濃縮物（１．５ｇ）はギ酸アンモニウ
ム（ｐＨ６．４）８０ｍｌに溶解し、バッチ方式により
　ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　３　０　ｍ　ｌで処
理した。

段階１　：　ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂに
よるクロマトグラフィー（５　６ｍ　ｌカラム、０．１
Ｍギ酸アンモニウムｐＨ６．４で平衡化した） 初めに０．１Ｍギ酸アンモニウム（約２１００ｍｌ）を
用いて低吸光度になるまで溶離を実施し、次に０．１−
０．８５ＭＷＦ酸アンモニウムｐＨ５、２　（３００＋
３００ｍｌ）を用いて勾配溶離を行った。活性は０．３
８Ｍで最大値を有する積分ピクとして溶離された；比活
性３０−４０単位／μｇｎ　　（１単位はセクロビンＡ
ｌｎｇの活性と定義される。） 段階２：　Ｓ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏ
ｗによるクロマトグラ７｛　　　（２６ｍｌカラム、０
．３０Ｍ酢酸アンモニウムｐＩＴ５．２で平衡化した）
段階ｌからのピークを１．３＠に希釈して約０．３Ｍと
なし、カラムに加えた。初めに０．３Ｍ酢酸アンモニウ
１，　（約２３０ｍｌ）を用いて溶離を実施し、その後
０．３０−０．５０Ｍ酢酸アンモニウムｐＴ１５．２　
（３００＋３００ｍｌ）を用いて勾配溶離を行った。活
性はＵＶ物質ピークが０．４０Ｍで溶離された後で失わ
れた。

ピーク物質は凍結乾燥した；比活性２００−４００単位
／μｇ０ 段階３　：　ＰｅｐＲＰＣによるＦＰＬＣ　（Ｃ２／Ｃ
Ｉ８カラム）段階２からのピークを水中の０．ｌ％ＴＦ
Ａに溶解した。この物質を０．ｌ％ＴＦＡで平衡化した
カラムに加えた。初めに０．ｌ％ＴＦＡを用いてＡ！＋
４が基底線に下がるまで溶離を実施し、その後複雑な勾
配溶離を行った二〇一５分０−２９％ＣＩＩ，ＣＮ，５
−／１５分２９−４８％Ｃｌｌ，ＣＮ、４５−５０分４
８−１００％ＣＩ．ＣＮ０多くのＵＶビークが観察され
たが、活性は３３％ＣＨ，ＣＮで溶離された２−３試験
管中に回収した。比活性は少なくとも７００単位／μｇ
であると概算された。

段階４　：　ＰｅｐＲＰＣ　ＦＰＬＣでの再クロマトグ
ラフィ／μｇ０ 段階４から得られた精製ペプチドはアミノ酸配列決定と
質量スペクトル分析に付した。上に示したアミノ酸配列
が確認された。

実施例３ 実施例２で得られたポリペプチドはいろいろな細菌に対
する抗菌活性について試験した。活性はマイクロモル／
リットル（μＭ）で致死濃度として表される。これらの
実験の結果を以下の表１に示す。

段階３からのピークを水で２倍に希釈し、同一カラムに
加えた。初めに０．１％ＴＦＡを用いてＡ　２１４が基
底線に下がるまで溶離を実施し、その後複雑な勾配溶離
を行った二〇一５分０−２９％ＣＨｓＣＮ，　５　　６
　５分２９−３８％ＣＨ３ＣＮ．６５−７０分３８−１
００％Ｃ　Ｈ，Ｃ　Ｎ．通常、活性を有する１つのピー
クが３３％ＣＨ，ＣＮで溶離される；比活性約７００−
１２００単位Ｌ セクロピンＰ１の２種類の合戊体に関する致死濃度とし
ての抗菌活性 ＰＩ−Ｎｉｌ．　　　ＰＩ−０１１ 生物および菌株 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＫＩ２，
　０２１ ８５３／６７，　０１４９，　Ｋ８８ Ｂｄ２２２１／７５，　０８．　Ｋ８８ｎｄ４４６２／
８４，　０１０１．　Ｋ９９Ｒｄ４４６６／８４，　０
６４．κ９９ネズミチフス菌、Ｔ．Ｔ２ （Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
アンネトバクター・カルコアセチクス、＾ｃｌｌ（＾ｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ
）プロテウス・ブルガリス、Ｐｖｌｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）緑膿菌、ＯＴ９
７ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）巨
大菌、Ｂｍｌｌ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａＬｅｒｉｕｎ＋）化膿連
鎖球菌 （ＳＬｒｅｐＬｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）黄
色ブドウ球菌、ＣＯｅａｎ　１ （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）０、
２ ５．７ ５．９ １．８ １９ 〉４９０ ０．５ １２ Ｉ３ ５．３ ４４ 〉５２０ 大腸菌の最後の４ｆ！Ｊ類の株はＯｌｏｆ　Ｓ６ｄｅｒ
ｌｉｎｄ，ＳＶＡ，　Ｕｐｐｓａｌａから入手し、それ
らは子ブタに対し病原性がある臨床単離物である。Ｏお
よびＫ抗原の型は株番号の後に示してある。致死濃度は
薄層アガロース平板での細菌の増殖を阻止するセクロビ
ンの最低濃度である（１１ｕＩＬｍａｒｋ，Ｄ．　ｅＬ
　ａｌ．，ＥＭ［３０　Ｊ．，　２．　５７１−５７６
　（１９８３）参照）。

代謹人弁理士秋沢正災光 他　１　名

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有するポリペプチドおよびそれらの機能誘導体。
2. （２）誘導体化されていない形態の、請求項１記載のポ
   リペプチド。
3. （３）アミドの形態の、請求項１記載のポリペプチド。
4. （４）治療に使用するための、請求項１〜３のいずれか
   １項記載のポリペプチド。
5. （５）抗菌剤として使用するための、請求項４記載のポ
   リペプチド。
6. （６）活性成分としての、抗菌有効量の請求項１〜３の
   いずれか１項記載のポリペプチドを、製剤学的に許容し
   うる担体または希釈剤と共に含有して成る薬剤組成物。
7. （７）前記担体または希釈剤は経口、筋肉内、静脈内、
   または皮下投与のために許容できる、請求項６記載の薬
   剤組成物。
8. （８）細菌増殖阻止量の請求項１〜３のいずれか１項記
   載のポリペプチド、もしくは請求項６または７記載の組
   成物を投与することから成る、ヒトを含む哺乳類のよう
   な動物における細菌増殖の阻止方法。
9. （９）腸管内使用のために、除放性投薬形態の請求項６
   または７記載の組成物を経口投与することから成る、請
   求項８記載の方法。
10. （１０）注射投薬形態の請求項６または７記載の組成物
    を注射により投与することから成る、請求項８記載の方
    法。