JPH0289015A - 顕微試料の画像処理方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ｇ徽試料の画像処理方法及び装置に関し、よ
り詳しくは、顕微試料を観測して得な画像情報をコンピ
ュータにより処理して修正された位相分布（屈折率分布
）の画像を得ることができる顕微試料の画像処理方法及
び装置に関する。

（従来の技術とその問題点） 顕微試料のうち、生物試料や生体組腑は無色透明に近く
、すなわち、吸収が余りなく、屈折率のみが場所により
異なるものが多い。このような試料を観測するためには
、従来から染色法がよく用いられてきた。これは、組織
によって染まり方に違いがでることを利用して、組織を
可視化することによって、その吸収率の分布を測定する
方法である。しかし、染色という処理は、生物を殺して
しまうため、生きたままでの観測には適さない。

一方、無染色で生物試料を観測するための手法としては
、試料の持つ屈折率分布（透過光の位相分布）を測定す
る方法が、従来からいろいろ考案されている。ところが
、多くの手法は、１）吸収分布がなく（分布があっても
無視できる程度、すなわち弱吸収近似）、かつ２）位相
分布の変化量が少ないこと（弱位相近似）を仮定してい
る。ツェルニケの位相差法は、この２つの仮定が成り立
つ条件下においてのみ位相差を近似的に光強度分布に変
換することにより位相分布を定量することができる。し
かしながら、この条件から外れた場合、得られる強度分
布は正しい位相分布を表わさない。

（発明の目的・問題点を解決するための手段）そこで、
本発明は、顕微試料において弱吸収近似及び弱位相近似
を用いることなくその正しい位相分布を知ることができ
る新規な手法を提供することを目的とする。

このため、本発明に係る手法は、新規に導出した下記の
式（１）、（ＩＩ’）に基づき、ｕｉ＝Ｌｈ　　Ｍ＋α
石・ｅｘｐｌｊ　ｔ　ｌ　　　−（１）ｕｏ”ｕｗ　　
ｕ＋α’ｉ’ｅｘｐｌ　　ｊε）　・・・（ＩＩ）ここ
に、 Ｕイ： Ｕ　： ｕ８： ｕｏ： 試料の複素振幅透過率、 ｕｓの平均値、 位相差顕微鏡におけるブライト・コントラスト像に係る
複素振幅、 位相差ｇ微鏡におけるダーク・コントラスト像に係る複
素振幅、 α：位相差顕微鏡の位相板の振幅透過率（０くα＜１）
、 ε　：位相差顕微鏡の位相板の位相シフト量（Ｏくε）
、 ｊ　：虚数単位であり、上記Ｕ。１ｕＨｕｏｌεの変数
は２次元の直交座標（ｘ、ｙ）である。

位相差顕微鏡により得られるブライト・コントラスト像
またはダーク・コントラスト像の少なくともいずれか一
方の画像情報に、通常の顕Ｖ＆鏡（試料物体を透過照明
で観察する透過型生物顕微鏡など）により得られる吸収
画像情報を適用して、コンピュータにより所定の演算を
行うことによって、前記位相差に係る画像情報（位相分
布の情報と吸収分布の情報の両者が含まれている）から
吸収分布の情報を取り除いた位相分布の情報のみを分離
して得るものである。

試料における位相の変化量が小さい場合には、１つの位
相差画像情報と１つの吸収画像情報の２枚の画像を用い
ることにより、真の位相分布を求めることができる。し
かし、位相の変化量が大きい場合や、測定雑音の影響を
軽減するためには、異なる２種以上の位相差画像をもち
い、合計３枚以上の画像を用いることによって、より精
度の高い真の位相分布を求めることができる。

以下に、本手法の原理的背景とともに実施例を示し、本
発明を具体的に説明する。

（本発明の原理） はじめに、位相差法の結像原理を説明するために、−例
として、ツェルニケ型の位相差顕微鏡の基本構造をｆｊ
ｒ１１図に示す。

ツェルニケ型の位相差顕微鏡では、ケーラー照明系（１
）の光源面（２）の光軸（３）上に点光源（４）を設け
（コヒーレント照明）、対物レンズ（今）の瞳面（６）
の光軸上に零次回折光に位相シフトを与えるための位相
板（７）が設けられる。第１図の系では、左側から順に
、光源面（２）（μ軸）、第ルンズ（１１）、試料面（
８）（Ｘ輪）、対物レンズである第２レンズ（１２）、
瞳面（６）（μ軸）、接眼レンズである１３レンズ（１
３）、結像面（９）（Ｘ軸）が距離「で並ンテイル。ｆ
　ハ第１．第２．第３　レンズ（１１）、（１２）。

いる。

試料物体（１０）の複素振幅透過率と複素屈折率との関
係について考える。以下、簡単のためすべて１次元で説
明する。

物体の複素振幅透過率をｔ（×）とする。シ（×）は各
、克Ｘでの複素屈折率をＩｎ（Ｘ）、空気の複素屈折率
ｎ０を１としたとき、 ｔ（ｘ）＝ｅｘｐｉ−ｊｎ（ｘ）ｌ／ｅｘｐｔ−ｊｎｏ
ｌ＝ｅｘｐ（ｊ（ｉ　　ｎ（ｘ）））　　　　　　・・
・（１）と表される。ＴＩ（Ｘ）を、実数部（位相部）
と虚数部（吸収部）に分け、 ［１（ｘ）＝　ｎ（ｘ）−ｊｋ（ｘ）　　　　　　・・
・（２）とすると、ｔ（×）は、 ｔ（ｘ）＝ｅｘｐｌ−ｋ（ｘ）ｌ　・ｅｘｐ（ｊ（１−
ｎ（ｘ））１＝ｅｘｐｌ　　ｋ（ｘ））　・ｅｘｐｔｊ
φ（ｘ）ｌ　　・・（３）となる、ここで、φ（×）が
物体の位相分布である。

対象となる光学系は前述した系（ｍ１図）であり、軸上
に点光源と位相板を持つタイプの位相差光学系とする。

軸上点光源を仮定しているので、点光源（４）の光源面
（２）での複素振幅Ｕｓ（μ）は、（４）式のようにデ
ルタ関数で表わされる。

Ｕｓ（μ）＝δ（μ）　　　　　　　　　・・・（４）
この光が伝播して、試料面（８）に達するとその複素振
幅Ｕ０（Ｘ）は、（４）式の逆７−リエ変換で与えられ
、 ｕｏ（ｘ）＝′ｆ−”［Ｕ　ｓ（ｉｔ　）］＝１　　　
　　　　　　　　　　・・・（５）となる、ここで、ヒ
【・１は７−リエ変換の操作を表わす、この光が物体を
通過すると、通過直後の光の複素振幅ｕ０°（Ｘ）は、 ｕ’（ｘ）＝ｕｏ（ｘ）・ｔ（ｘ） ＝ｔ（ｘ）　　　　　　　　　　　　・・・（６）とな
る。瞳面（６）における複素振幅Ｕｐ（μ）は、（６）
式を７−リエ変換して、 Ｕｐ（μ）＝ア［ｕＯ’（Ｘ）］ ＝Ｔ（μ）　　　　　　　　　　・・・（７）となる、
ただし、Ｔ（μ）はｔ（ｘ）の７−リエ変換である、ブ
ライト・コントラストの位相差光学系では、ここで瞳面
にある位相板（７）によって、原点を通る光だけがその
位相をπ／２遅らされ、かつ光強度が落とされる。すな
わち、位相板の振幅透過率をα（０＜αく１）とすると
、位相板通過直後の光波の複素振幅Ｕｐ’（μ）は、 Ｕｌ）’（μ）＝Ｔ（／’）　　Ｔ（０）＋ｊｆｆＴ（
０）　　・＝（８）となる、結像面（９）における光波
の複素振幅ＵＳ（Ｘ）は、（８）式を再び逆７−リエ変
換して、Ｕ書（ｘ）＝ｃ？−”［ＬＩｐ’（μ）］”ｔ
（ｘ）　　ｔ＋ｊαＬ　　　　　　　・・・（９）とな
る。

また、ダーク・コントラストの位相差光学系では、瞳面
にある位相板によって、原点を通る光だけがその位相を
π／２進まされる。すなわち、ダーク・コントラストの
位相差光学系の結像面で得られる複素振幅ｕｏ（ｘ）は
、 ｕｏ（ｘ）＝　ｔ（ｘ）　　ｔ　　ｊ　Ｑ　ｔ　　　　
　　　・・・（１０）となる、ただし、ｔはｔ（ｘ）の
平均値であり、次式で表される複素数である。

ｔ　＝　ｆ　ｔ（に）ｄに　　　　　　　　　　・・・
（１１）よって、結像面で観測される光の強度分布Ｉ　
（ｘ）は、ブライト・コントラストの場合（Ｉｓ（ｘ）
）、ＩＢ（ｘ）＝ｕｇ（ｘ）ｕ＠’（ｘ） ＝（ｔ（に）−１）２＋（α１）２　　　　・・・（１
２）となる。ダーク・コントラストの場合（Ｉｏ（に）
）では、 Ｉ　ｏ（ｘ）＝　ｕｏ（ｘ）ｕｓ”（ｘ）＝（ｔ（ｘ）
　　Ｔ）’　　（αｔ）２−（１３）となる。

ここで、この式の意味をグラフを用いることにより、Ｗ
Ｊ単に説明してみる。

複素振幅透過率ｔ（×）を複素平面上でベクトル表示す
ると、第２図のようになる。この表示法では、矢印の長
さが吸収率を表し、軸とのなす角が位相を表わしている
。純吸収物体（吸収分布のみをもち、位相遅れ量は空間
的に全ての点について一定値をとるもの）の場合、同図
（ａ）に示すように、各、αＸに対応する複素振幅透過
率を示すベクトルの先端は、原点を通る１つの半直線上
にのみ存在しく太線の部分）、吸収が小さいところが太
線の上部、吸収の大きいところが太線の下部にに対応す
る。また、純位相物体（位相分布のみをもち、吸収率は
全ての点について一定値をとるもの）の場合は、同図（
ｂ）に示すように各、αＸに対応する複素振幅透過率を
示すベクトルの先端は、原点を中心とする円弧上にのみ
存在しく太線の部分）、位相が遅れているところが実Ｍ
Ｒｅの右側、位相が進んでいるところが実軸Ｒｅの左側
に対応する。より一般の物体（吸収・位相物体）の複素
振幅３１１過率ｔ（ｘ）は、例えば同図（ｅ）のように
表示でき、各点Ｘに対応する複素振幅透過率を示すベク
トルの先端は、斜線部に存在する。

この表示法を用いて、（９）式、（１０）式を書き表わ
してみる。いま、ある試料の複素振幅透過率ｔ（ｘ）の
存在域が第３図の斜線の部分であるとする。

ブライト・フントラストの場合、（９）式が示すように
、結像面での複素振幅ＵＳ（に）はｔ（ｘ）からＬ（ｘ
）の平均ベクトルであるｔを引き、ｊａｔベクトルを加
えたものである。ただし、ｊａＬベクトルはαｔベクト
ルを右回りに９０°回転させたベクトルである。この結
果、各々の、くにこの操作を加えると斜線の部分で表わ
されている試料の複素振幅透過率ｔ（ｘ）は網線の部分
に写像され、これがブライト・コントラストの位相差光
学系の結像面で得られる複素振幅分布Ｕ・（Ｘ）を表わ
すことになる。

ダーク・コントラストの場合には、（１０）式が示すよ
うに、ベクトルｔ（ｘ）からベクトルＴを引きベクトル
ｊｆｆｊを引いたものとなる（ｆ５４図）。

ここで、このベクトル演算を座標演算にに置き換えて考
えてみる。第３図のブライト・コントラストの場合、ベ
クトルｔ（ｘ）がらベクトルτを引きベクトルｊｆｆｊ
を加えるという操作は、座標原点をｔ−ｊａｔだけ動か
す操作！ｍ５図（ａ）と同等である。

同じく、ダーク・コントラストの場合は、同図（ｂ）の
座標変換として考えることができる。

さて、実際に位相差像として観察されるのは、（１２）
式で示されるとおり、複素振幅ＵＳ（Ｘ）の絶対値の２
乗であり、第５図（、）のｕｌＩの長さ１ｕ８１が求ま
る。

ブライト・コントラストの位相差光学系で得られる画像
の光強度を、ｔｊＳａ図を用いて考察する。

前述したように、同図の斜線の部分で表されている物体
の振幅透過率の内、位相の進んでいる部分が実軸Ｒｅの
右側、遅れている部分が左側に対応する。斜線の部分が
網線の部分に写像されると、位相の進んでいる部分は、
ｕ！Ｊ線の部分の右側となる。従って、ＵＳ（Ｘ）の絶
対値が大きくなり、位相差像では、明るく表される１位
相の遅れている部分は、網線の部分の左側となり、Ｕ＠
（Ｘ）の絶対値が小さくなって、位相差像では、暗く表
わされる。

すなわち、位相差光学系で得られる画像の強度分布は、
近似的に、試料物体の位相分布φ（Ｘ）を表している。

しかし、厳密には、吸収の全くない物体であっても、位
相分布をそのまま表わしてはいない。

前述したように、位相差光学系によって得られる複素振
幅は物体通過直後の複素振幅を座標変換したものと考え
ることがきる。そこで、ここではこれらの複素振幅の絶
対値が、試料物体を透過照明で観察する通常の顕微鏡（
透過型生物顕微鏡）、及び位相差顕微鏡により測定でき
る点に注目して、位相分布を弱吸収・弱位相近似を用い
ずに求める本発明の方法についてより具体的に説明する
。

本手法で用いる情報は次の３つの画像の強度情報である
。３つとは、１）通常の顕微鏡で観察できる画像（以後
、吸収像という）、２）位相差顕微鏡で得られるブライ
ト・フントラスト像（以後、ブライト像という）、及び
３）ダーク・フントラスト像（以後、ダーク像という）
である。

透過型生物顕微鏡では、試料面と結像面は完全に結像関
係になっており、試料通過直後の複素振幅はそのまま結
像面に再現される。結像面における複素振幅ｕＪｘ）は
、 ｕｌｌ（ｘ）＝ｔ（ｘ）　　　　　　　　　　　　・１
１４）となり、試料の複素振幅透過率と同じになる。観
測できる結像面の各点の強度ＩＮ（Ｘ）は、それに対応
する点の複素振幅Ｕ。（×）の絶対値の２＊ｌ　ｕ、（
ｘ）ｌ　’であり、各点の強度の平方根を計算すること
により、対応する複素振幅の絶対値を求めることができ
る。

ｔ（ｘ）Ｉ　＝　ｌ　Ｃ１−（Ｘ）ｌ　＝、／Ｔ；ｌ；
７；Ｔ　　　　　−（１５）一方、ブライト・コントラ
ストの位相差顕ｖｌｔｔａにおい″Ｃ１観察面において
得られる複素振幅ＵＳ（Ｘ）は、（１２）式及び（１４
）式より、 ｕｎ（ｘ）＝ｕ、、（ｘ）−石十ｊａ石　　　　　　　
・・・（１６）となる。ただし、石はＵ、の平均値であ
り、τ＝ｔ　＝　ｆ　ｕＨ（ｘ）　ｄｘ　　　　　　　
−（１７）である。

ダーク・フントラストの位相差像の複素振幅ＵＯ（Ｘ）
は、同梯にして、 ｕＪｘ）＝ｕＨ（ｘ）　　’Ｈ−ｊｆｆｕ　　　　　　
　−（１８）となる。ただし、以上の考察では、試料面
から結像面への伝播に対応する位相の遅れは無視して考
えている。

以上のように、１ｕＪｘ月、　ｌ　ｕｓ（ｘ）Ｉ　Ｉ　
ｌ　ｕ＊（ｘ）Ｉが求められるので、最後に、（１１）
式、（１））式で示される物体の複素振幅透過率の平均
値τ（＝ｉ）がわかれば物体の複素振幅透過率を求める
ことができ、位相分布φ（×）が求まる。

計算を簡単にするために、この３つの複素振幅の関係を
整理してみる。Ｕ、と、ｕＩＩと、Ｄａの関係を示した
のがｆ５６図（ａ）である。これはｆｊＳ５図（、）に
おいて、ｔ（ｘ）をＵ。（ｘ）に書き換えたものと同じ
である。ここで、いま求めたい量は位相の相対量である
から原点を中心として回転移動しても同等である。そこ
で、簡単のためにｉベクトルが軸に重なるように回転移
動してみると、同図（ｂ）のようになる、実際に測定で
きるのはそれぞれのベクトルの長さである。ダーク像に
関しては、同図（ｃ）のようになる、さて、１００図（
ｂ）において、原点を中心とする半径１ｕ、＋の円とｕ
−３０石の点を中心とする半径ＩＵε１の円の交点と、
原点を結ぶ直線が釉となす角φを求めれば、×における
位相が求まることが分かる。

第７図に、角度φの求め方を図示する。同図から明らか
なように、半径ｌｕ、Ｉの円と、半径１ｕ８１の円の交
点は２点存在する１位相の変化が余り大きくないような
試料においては、この２つの交点のうち実軸Ｒｅに近い
方の角度が求めるφであると見なせる。これは、得られ
た位相差像がコントラストの反転現象を起こしていない
という仮定の下で成り立つ。実軸Ｒｅに近い方の交点を
各画素毎に求めることによって全体の位相分布が求まる
。

ｔ５７図より、位相角φは、 φ＝ｓｉｎ−’　（１１／２（１＋　０２）石ｕ、１・
［α（（１＋α２）石２＋ｕｈ’−ｕｓ２１となる。

画像内に位相の変化が大きい部分を含む場合、その部分
において位相差像がコントラストの反転を起こし得る。

・このとき、求めるべき点Ｐが必ず実軸Ｒｅに近い方の
交点であるとは限らない。そこで、２つの交点のうちど
ちらが求めるべき点Ｐであるかを決める必要がある。こ
の場合、吸収像、ブライト像、ダーク像の３つの画像を
用いる。第８図は、第７図にダーク像の振幅ＵＯを加え
たものである。ベクトルｕＬｌの起点は、実軸Ｒｅに対
してベクトルＵ−の起点と対称の位置にある。いま、各
画素においてベクトルの長さ１ｕｌＩｌ、　ｌｕθ１．
１ｕｏｌは吸収像、プライト像、ダーク像から、それぞ
れの強度の平方根として求まる。＊た、ＵＳの起点は原
点で、ＵＳ及びＵＯの起点は、石＝ｆｕＨｄｘを知るこ
とにより求まる。結局、Ｕ、＝ｔ（Ｘ）のベクトルは、
これら半径１ｕ７１．１ｕ＠１．１ｕ０１の円の交点を
求めることにより一意的に決まる。すなわち、試料通過
直後の複素振幅が求まり、試料の位相分布が求まる。

以上をまとめると、通常の顕微鏡によって得られる吸収
像の強度の平方根（複素振幅の絶対値）をｌｕｉ＋ｌ、
位相差顕微鏡によって得られるブライト・コントラスト
像の強度の平方根（複素振幅の絶対値）を＋Ｕ、＋、ダ
ーク・コントラスト像の強度の平方根（複素振幅の絶対
値）を１ｕｏｌとし、複素振幅Ｕ。

の平均値を石とするとき、物体通過直後の光波の複素振
幅を示すベクトルは、原点Ｏを中心とする半径１ｕ、Ｉ
の円と、プライト像に対する原点である点１３（−ａ石
、Ｍ）を中心とする半径１ｕ６１の円と、ダーク像に対
する原点である点Ｄ（０石１石）を中心とする半径１ｕ
、１の円の３つの円の交点Ｐと原点０を結ぶベクトル（
ＬＩＭ）である（第８図参照）。ただし、αは位相板の
振幅透過率であり、既知量である。

このベクトルＵ。が釉となす角φを求めることによりそ
の点Ｘでの相対位相１が求まる。この計算を２次元平面
の各点（ｘ＋ｙ）について行えば修正・回復された位相
分布が求まる。

本手法を用いることによって改善されるもう１つの点は
、位相板の位相シフト量がπ／２以外の値であってもよ
い点である。従来の位相差顕微鏡の結像埋＠（近似法）
では、位相板の位相シフト量は正確にπ／２でなくては
ならなかった。そのため、測定できる光の波長は通常１
つに限定されていた。しかし、本手法においては位相シ
フト量が分かっているならばπ／２である必要はない。

なぜならば、位相シフト量がε（ε＞０）である場合に
は、（１６）式、（１８）式は、 ｕ＠（ｘ）＝ｕ、（ｘ）−ｕ＋α石・ｅｘｐ　ｌ　ｊε
）　　・・・（２０）ｕｏ（ｘ）＝　ｕ、（ｘ）−石＋
ａ石−ｅｘｐ［ｊεｌ　　・（２１）と、置き換えるこ
とにより対処できる。これは、図示するとｆ：ｔＳ９図
（ａ）および（ｂ）のようになる。そこで１．Ｔｌｌ＋
定する全ての波長における位相板の位相シフト量を予め
測定しておくことにより、単一の位相差対物レンズ（位
相板を組み込んだユニットとしてのレンツ：系）を用い
て、多波長の屈折率と吸収率の測定ができる。

コンピュータに取り込んだ画像データには、ディテクタ
や処理系（カメラ、量子化誤差）の雑音が含まれている
。そのため、先はど述べた３つの円は、１つの点では交
わらず、３つの円のお互いの交、αが合計６つ存在する
。しかし、雑音の分散が信号のコントラストに比べて小
さいときは、この内の３点は比較的近傍に存在しており
、技術の実際上、簡単化して、接近している３、αの中
心を点Ｐとして求めるのが実用的である。

雑音の影響を軽減するためには、位相分布の推定に使用
する禁報量を増やすことが考えられる。

すなわち、より多くの画像を用いることにする。

位相差光学系に使用している位相板の透３ＰＪ率や位相
シフト量を変えることにより、得られた位相差像と吸収
像の複素振幅間の関係をいろいろな状態にすることが可
能である。これは、１８図の点Ｂ。

Ｄの位置を複素平面内でいろいろに変えることに相当す
る。これらの点（Ｂ、Ｄ等）と点Ｐまでの距離が雑音を
含む量として全て測定できる。例えば、この距離を半径
とした円を描き、いま措いたいろいろな円に近い点を求
めると最も適した点Ｐを求めることができる０以上のよ
うにして雑音の影響を大幅に軽減することができる。

以下には、本手法を用いて実際の試料の位相分布を求め
るために構築した装置システム、画像処理の実際、及び
これを用いて得た結果について説明する。

（実施例） 本手法を実現するために構築した装置システムをｆｊＳ
１０図にブロック図で示す。顕微鏡（３１）は、ニコン
社製の生物顕微鏡０ＰＴＩＰＨＯＴを用いた。その対物
レンズ系の３種を切り替える、あるいはボー２ンレツト
対物レンズを利用することにより、通常の吸収像、ブラ
イト像、ダーク像の３枚の画像を得ることができる。こ
の顕ｍｌ！（３１）のＣマウントにＣＣＤカメラ（３２
）、例えばＮＥＣ製ＣＣＤカメラＴｌ−２３Ａ（２５万
画素）を取り付けた。ＣＣＤカメラ（３２）から出力さ
れるＴＶ信号は、画像取り込み装ｆＨ（３３）、例えば
シバツク社製画像取り込み装置Ｖ　Ｍ　０１　Ｂ　１　
（５１２Ｘ５１２画素、２５６階調）内で、Ａ／Ｄ変換
された後、メモリにディノタル量として記憶され、ＤＭ
Ａを介してフンピユータ（３４）、例えばＤＥＣ社製ス
ーパー・マイクロコンピュータＭｉｃｒｏＶ　Ａ　Ｘ　
Ｕに転送される。ＭｉｃｒｏＶ　Ａ　Ｘ　ｎ　（３４）
内で、真の位相分布を求める画像処理の演算を行なう、
演算結果は再びＤＭＡを介して７レームグラバと称され
る画像取り込み装置（３３）、ＶＭＯＩ　Ｂ　１に送ら
れ、デイスプレィモニタ（３５）に表示される。画像の
取り込み、データの転送、及び結果の表示はすべてコン
ピュータ（３４）、Ｍ　１ｃｒｏＶ　Ａ　Ｘ　Ｕにより
制御される。この制御の指令は、端末（３６）から入力
する。なお、コンピュータ（３４）は、一般市販のパー
ソナルコンピュータであってもよい、また、位相差顕微
鏡の位相板の位相シフト量はε＝π／２とした。

コンビエータ（３４）内で行う画像処理の流れを第１１
図に示す。演算等の具体的な詳細は、本手法の原理的な
説明のところで示されている。第１２図は複素振幅の推
定処理ステップ（４０）の−具体例を示している。

本手法を実際の顕微試料に適用した結果を示す。

試料は、アオミドロである。゛この試料の３枚の観測像
と、本発明の手法によって求められた位相分布を第１３
図に写真で示す。（ａ）が通常の吸収像、（ｃ）がブラ
イト像、（ｄ）がダーク像であり、各々１２８Ｘ１２８
画素の情報としてコンピュータに取り込んだ、この測定
に用いた対物レンズの倍率は４０倍であり、この画像は
実際には３０Ｘ３０μｍの広さとなる。（ｂ）は、（ａ
）、（ｃ）、（ｄ）から求められた位相分布である。こ
こで、明るい部分は位相の遅れを、逆に暗い部分は位相
の進みを表している。

（ｃ）、（ｄ）と、（ｂ）の比較から、（ｃ）、（ｄ）
の位相差像はかなり吸収分布の影響を受けていたことが
分かる。待に中心部に存在している核や、その上下にあ
る螺旋状の葉緑体の所々に存在する強い吸収の影響のた
め、ブライト像ではこれらに対応する部分が明るくなっ
ており、核や螺旋部にかなりの濃淡が見られる。（ｂ）
の結果ではこれらの部分は一様に明るい。すなわち、こ
の部分は周りに比べ位相が遅れている。その位相遅れ量
は螺旋部のどの部分もほぼ同程度になっている。この結
果これらの部分はその他の部分とはっきり区別できる。

ト像、（ｄ）はダーク像であり、（ｂ）が本発明の手法
により求めた真の位相分布の画像である。

（発明の効果） 本発明は、顕微試料の空間的屈折率の変化や吸収率の変
化、すなわち位相分布と吸収分布を、通常の顕微鏡及び
位相差顕ｉｅｔを用いて観測した画像情報から求める新
たな手法である。この手法によれば、従来から問題であ
った位相差像における吸収分布の影響を取り除くことが
できる。また、従来の位相差法のように弱位相近似を用
いていないため、大きな位相変化をも定量測定すること
が可能である。

本手法では、位相変化量が少ない場合は基本的に２枚の
画像を用いることにより真の位相分布を求めることがで
きる。位相変化量が大きい場合や、測定雑音の影響を軽
減するためには３枚以上の画像を用いて、精度の高い真
の位相分布を求めることができる。すなわち、位相差顕
微鏡における位相板の位相シフト量や透過率をいろいろ
な値にした対物レンズ系を用いれば耐雑音性を大幅に改
善することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はツェルニケ型の位相差顕微鏡の光学系の説明図
である。 第２図（ａ）、（ｔ＋）、（ｃ）のそれぞれは複素振幅
透過率のベクトル表示の説明図である。 第３図はプライト・コントラストの場合における複素振
幅の写像の説明図である。 第４図はグーク・コントラストの場合における複素振幅
の写像の説明図である。 第５図（ａ）、（ｂ）のそれぞれはベクトル演算と座標
変換の関係を示す説明図である。 ｒＢａ図（ａ）、　（ｂ）、　（ｃ）のそれぞれは回転
移動による簡略化を説明するための図である。 １７図は角度φの求め方を図解した説明図である。 第８図は１７図にさらにグーク像の情報を加えて角度φ
の求め方を図角了した説明図である。 第９図（ａ）、（＋３）のそれぞれは位相板の位相シフ
ト量とその座標変換の関係を示す説明図である。 第１０図は本発明の一実施例に係る装置システムのブロ
ック図である。 第１１図は本発明の一実施例に係る画像処理の概要を示
す７０−チャートである。 第１２図は複素振幅の推定処理ステップの一例を詳しく
示したフローチャートである。 第１３図は試料がアオミドロの場合における生物の形態
に係る図面に代わる写真である。 ＰｔＩＪ１４図は第１３図中における配列の対応関係を
示した説明図である。 第１５図は試料がミドリムシの場合における生物の形態
に係る図面に代わる写真である。 第１６図はｆｆ＄１５図中における配列の対応関係を示
した説明図である。 ７・・・位相板、１０・・・試料、１２・・・対物レン
ズ、１３・・・接眼レンズ、３１・・・顕微鏡、３２・
・・ＣＣＤカメラ、３３・・・画像取り込み装置（７レ
ームグラバ）、３４・・・フンピユータ、３５・・・デ
イスプレィモニター、３６・・・制御端末。 （ａ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料物体を透過照明で観察する顕微鏡により試料
   を観測してその吸収画像情報を記憶し、位相差顕微鏡に
   より前記試料を観測してその位相差画像情報を記憶し、 記憶された前記吸収画像情報と前記位相差側像情報とを
   データとして、下記第（ I ）式または第（II）式の少
   なくともいずれか一方の式に基づく演算により、観測さ
   れた前記位相差画像情報に固有に含まれる吸収分布の情
   報をこの位相差画像情報から分離し、 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（II） ここに、 ｕ＿Ｎ：試料の複素振幅透過率、 ＠ｕ＠：ｕ＿Ｎの平均値、 ｕ＿Ｂ：位相差顕微鏡におけるブライト・コントラスト
   像に係る複素振幅、 ｕ＿Ｄ：位相差顕微鏡におけるダーク・コントラスト像
   に係る複素振幅、 α：位相差顕微鏡の位相板の振幅透過率（０＜α＜１）
   、 ε：位相差顕微鏡の位相板の位相シフト量（０＜ε）、 ｊ：虚数単位、 そして、前記演算により得た結果の画像情報をモニタに
   表示する顕微試料の画像処理方法。
2. （２）前記位相差顕微鏡に用いる位相板の位相シフト量
   εがπ／２とは異なる任意の値である、特許請求の範囲
   第（１）項記載の顕微試料の画像処理方法。
3. （３）前記位相差顕微鏡に用いる位相板の位相シフト量
   εがπ／２である、特許請求の範囲第（１）項記載の顕
   微試料の画像処理方法。
4. （４）顕微試料の吸収分布のみを観測する第１の手段と
   、 前記顕微試料の位相差の分布を近似的に明暗の差の分布
   にかえて観測する第２の手段と、前記第１の手段により
   得られた吸収画像情報と前記第２の手段により得られた
   位相差画像情報とを記憶する手段と、 前記記憶手段に記憶された吸収画像情報と位相差画像情
   報に基づいて、観測された位相差画像情報に固有に含ま
   れる吸収分布の情報をこの位相差画像情報から分離して
   真の位相差分布の情報を演算する手段と、 前記演算手段により得られた演算結果の情報を記憶する
   手段と、 この記憶手段に記憶された演算結果の情報を画像として
   表示する手段と、 所定の入力に基づいて前記の各手段をそれぞれに又は相
   互に制御する手段とを備えた顕微試料の画像処理装置。
5. （５）前記の演算手段には、下記第（ I ）式または第
   （II）式の少なくともいずれか一方の式に基づく演算に
   より、観測された前記位相差画像情報に固有に含まれる
   吸収分布の情報をこの位相差画像情報から分離するため
   の処理手段を含む、特許請求の範囲第（４）項記載の顕
   微試料の画像処理装置。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（II） ここに、 ｕ＿Ｎ：試料の複素振幅透過率、 ＠ｕ＠：ｕ＿Ｍの平均値、 ｕ＿Ｂ：位相差顕微鏡におけるブライト・コントラスト
   像に係る複素振幅、 ｕ＿Ｄ：位相差顕微鏡におけるダーク・コントラスト像
   に係る複素振幅、 α：位相差顕微鏡の位相板の振幅透過率（０＜α＜１）
   、 ε：位相差顕微鏡の位相板の位相シフト量（０＜ε）、 ｊ：虚数単位。