JPH02504391A - 腫瘍壊死因子による感染の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍壊死因子による感染の治療 本発明は、感染性疾患の予防又は治療における腫瘍壊死因子の使用に関する。

微生物感染は、種々の免疫変性剤により阻害され得ることはこれまで長く知られ ている。これらの物質は、次のように分類され得る：１）微生物性質の粗免疫刺 激剤〔例は、マイコバクテリウム　ポリス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏ ｒｉｓ）株ＢＣＧ及びコリネバクテリウム　パルピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）の殺されたワクチンである〕　；及び２）細菌超厚 の化学的に定義された免疫アジユバント（例は、リポ多糖類である）。

つい最近、種々の合成免疫変性薬剤が抗ウイルス効果を有することが示された。

これらのうち最っとも有望なＩｎｏｓｉｐｌｅｘは、ヒトで試験され、そして種 々のウィルス感染（Ａ型肝炎、再Ｒ性ｊｌ純ヘルペス、帯状ヘルペス、インフル エンザ、ライノウィルス原因の通常のカゼ）に対して効果的であることが請求の 範囲に記載される。しかしながら、その応答は常に予測できるとは限られず、そ して個々の患者で異なるように思える。

サイトメガロウィルス（ＣＭν）は、ＡＩＤＳ患者において最っとも重要なウィ ルスの好都合な感染の１つである。その感染はしばしば、重く且つ時々致命的な 疾患、たとえば脈絡網膜炎、肝炎、肺炎、食道炎及び播種性疾患を導ひくことが できる。

事実、ＣＭＶ感染は、ウィルスがＡＩＤＳを特徴とする免疫抑制に関与している のではないかと思われるＡＩＤＳ症候群にひじょＤｅｆｅｎｓｅ　Ｍｅｃｈａｎ ｉｓｍｓ、第５巻、１９８５を参照のこと。これまで、知られている効果的な治 療は存在しない。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はまず、マウス中で増殖する場合、化学的に形質転換さ れた腫瘍細胞の壊死を引き起こす内毒素誘（１９８４）３１２　：　　７２４〜 ７２９及び５ｈｉｒａｉなど、、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）（１９８５） ３１３：　　８０３〜８０６．　Ｗａｎｇなど、、　　Ｓｃ　１ｅｎｃｅ　（１ ９８５）　、　　２２８　：１４９〜１５４を参照のこと。

ウサギＴＮＦのクローニングは、１９８５年６月２６日に公開されたＥＰ　１４ ６．０２６（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、、　 Ｌｔｄ、）及び１９８５年７月１７日に公開されたＥＰ　１４８．３１１（Ａｓ ａｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｋｏｇｙ。

Ｋａｂｕｓｈｉｋｉ）に開示される。１５１及び１５５個のアミノ酸（天然形よ りも２〜６個少ない）を有するヒトＴＮＦのクローニングは、１９８５年９月２ ５日に公開されたＥＰ　１５５．５４９（ＤａｉｎｉｐｐｏｎＰｈａｒｒｎａｃ ｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｌｔｄ、）に開示され、そして１５５個のアミノ酸 を有するヒ）ＴＮＦは、１９８５年１０月１６日に公開されたＥＰ　１５８．２ ８６（Ａｓａｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｋｏｇｙｏ　Ｋａｂｕｓｈｉｋｉ　Ｋａｉｓｈ ａ）及び１９８５年１１月２０日に公開されたＧＢ　２．１５８．８２９Ａに開 示される。成熟Ｔ　Ｎ　Ｆ　（１５７個のアミノ酸）のクローニング及びその種 々の変性形（ムティン）は、１９８６年１月１５日に公開されたＥＰ　１６８． ２１４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及び１９８７年６月３０日発行されたアメリカ特 許第４、６７７、０６３（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に開示され、 そしテコれらの開示を引用により本明細書に組込む。

ＴＮＦは、細胞がウィルス攻撃の前、ＴＮＦによりインビトロで前処理される場 合、種々の感染されやすい細胞においてウィルス感染をイン　ビトロで阻害する ものとして、並：６５９〜６６６　（１９８６）により報告されている。

従って、本発明は、哺乳類宿主における感染の予防又は治療のための方法に向け られ、そして該方法は、宿主の感染の前又は後で、宿主に、晴乳類種からの腫瘍 壊死因子（ＴＮＦ）の有効量を投与することを含んで成り、ここでＴＮＦの量は 、宿主の少なくとも５０％保護を達成するのに十分な量である。

好ましい態様において、治療はウィルス感染のための予防法である。

本明細書で使用される場合、用語“組換え体”とは、一般的にＴＮＦをコードす る遺伝子が既知の組換えＤＮＡ技法によりクローン化される組換えＤＮＡ技法に より生成されるＴＮＦを言及する。たとえば、鋳型としてヒトＴＮＦ　ｃＤＮＡ を用いることによって、ヒ）ＴＮＦ　ｃＤＮＡに対して相補性を示す遺伝子が、 適切なりＮＡベクター、たとえば細菌プラスミド、好ましくはＥ、コリプラスミ ド中に導入され、組換えプラスミドが得られ、そしてそのプラスミドが、適切な 宿主を形質転換するために使用される。遺伝子は、組換ＴＮＦタンパク質を産生 するために宿主に発現される。この目的のために適切な組換えフラスミトノ例は 、ｐＢＲ３２２，ｐｃＲｌ、　ｐＭＢ９及びｐｓｃｌを包含する。形質転換され た宿主は、真核又は原核生物、好ましくは原核生物宿主である。

本明細書に使用される場合、用語“医薬的に許容される”とは、活性成分の生物 学的活性の有効性を妨害せず、そしてそれが投与される宿主に対して毒性でない キャリヤー媒体を言及する。

本明細書で使用される場合、用語“予防又は治療”とは、感染前又は後のいづれ かでのＴＮＦの宿主への投与を言及する。ＴＮＦが感染体への暴露の前に投与さ れる場合、この処理は予防であり（すなわち、それは感染に対して宿主を保護す る）、そして感染後に投与される場合、その処理は治療である（すなわち、それ は存在する感染体と戦う）。たぶん、れるであろう。

本明細書で使用される場合、用語“感染”とは、ある種の感染性疾患、たとえば 細菌、菌類、ウィルス、原生動物又は寄生体により引き起こされる疾患を言及す る。細菌感染の例は、Ｐ、アウルギノサ、（Ｐ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、Ｅ 、　　ニアす破傷風１マイコバクテリウム種、連鎖法菌株、ジフテリア及びサル モネラを包含する。菌類感染の例は、クリプトココシス（ｃｒｙｐｔｏ−ｃｏｃ ｃｏｓｉｓ）　、ヒストプラスモシス（ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）及びカ ンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種による他の感染体を包含する。ウィルス感染の例は 、Ａ型肝炎、再発性単純ヘルペス、ＡＤＩＳ、帯状ヘルペス、インフルエンザ、 サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）　及びライノウィルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ）を包含する。好ましくは、感染体は、ウィルス、より好ましくは単純ヘルペス 又はＣＭＶであり、又は感染体は細菌、より好ましくはダラム陰性細菌及び最っ とも好ましくは、Ｐ、アウルギノサ及びＥ、コリである。

本発明の方法は、哺乳類宿主、好ましくはヒト宿主に、を動量のＴＮＦを投与す ることを含んで成る。その投与は、適切な技法、好ましくは非経口投与により生 じる。非経口投与の例は、静脈内、動脈内、筋肉内及び腹腔内投与を包含し、そ して静脈内投与が好ましい。

投与量規制は、ＴＮＦが予防目的又は治療目的のいづれのために投与されるか、 感染のタイプ、患者及び患者の病歴に依存するであろう。その量は、少なくとも ５０％、好ましくは少なくとも７０％の保護レベルを達成するために有効である べきであり；この最少レベルの有効性を達成しない用量は使用され得ない。投与 は、数日間にわたって、１回の投与又は数回の投与であり、そして単一の投与が 好ましい。本発明の目的のためには、少なくとも５０％の保護レベルとは、処理 された宿主の少なくとも５０％が、感染に対する改良、改良された生存割合、よ り急速な回復又は症状の改良又は排除を示す（但しこれだけには限定されない） ことを意味する。ＴＮＦの好ましい投与量は、投与量たりＴＮＦ約０．４〜２． ０４である。

非経口投与のためには、ＴＮＦは一般的に、本質的に非毒性及び非治療又は非予 防性である医薬的に許容できるキャリヤー媒体中における注入できる単位投与量 形（溶液、懸濁液、エマルジョン）で配合されるであろう。そのようなビークル の例は、生理食塩水、リンガ−溶液、デキストロース溶液、マンニトール、及び 正常な血清アルブミンを包含する。非水性ビークル、たとえば固定油及び二チル オレエートもまた、使用され得る。キャリヤー媒体は、少量の添加物、たとえば 等強性及び化学的安定性、を高める物質、たとえば緩衝液及び保存剤を含むこと ができる。ＴＮＦは典型的には、約０．１ｒｎｇ／ｒＩＬｅ〜１００ｍｇ／ｍｆ 、好ましくは０．２〜１ｍｇ／ｍｌの濃度でそのようなキャリヤー中に配合され るであろう。

上記のように、本発明で使用されるＴＮＦは、組織培養物から又は組換え技法に より、及びいづれかの哺乳類源、たとえばマウス、ラット、ウサギ、サル、ブタ 及びヒトから得られる。好ましくはＴＮＦは、ヒト源に由来し、そしてより好ま しくは、ヒト組換えＴＮＦである。

組換えヒトＴＮＦは、　Ｐｅｎｎ　ｉｃａなど、、　　Ｎａｔｕｒｅ、　３１２ 　：　７２４〜？２９（１９８４）　　；　Ｙａｍａｄａなど、、　　Ｊ、Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏ］ｏｇｙ（１９８５）３　：１４１〜１５３　　；　ｖｌａｎｇ など、、　　５ｃｉｅｎｃｅ＜１９８５）、　　２２８：　　１４９〜１５４； １９８５年９月２９日に公開されたＥＰ　１５５．５４９　；　１９８５年１０ 月１６日に公開されたＥＰ　１５Ｂ、　２８６　；　１９８６年１月１５日に公 開されたＥＰ　１６８．２１４　；及び１９８６年４月１日に公開されたＰＣＴ 　ｔｌｓ８５１０１９２１に記載されているようにして得られる。組換えウサギ ＴＮＦは、１９８５年６月２６日に公開されたＥＰ　１４６．０２６及び１９８ ５年７月１７日に公開されたＥＰ　１４８，３１１に記載されるようにして得ら れる。好ましくは、ＴＮＦは、Ｎ−末端を欠失された、好ましくは初めの８個の アミノ酸残基が、１９８７年６月３０日に発行されたアメリカ特許第４．６７７ 、０６３号に記載される方法を用いて欠失されているヒ）ＴＮＦであり、又はＴ ＮＦは、１９８５年２月７日に出願されたアメリカ継続出願第６９８．９３９号 及びアメリカ特許第４．５１８．５８４号、前記（ＩＬ−２のためにではあるが 、ＴＮＦにも適用できる）に記載されるシスティン欠失のムティンである。

本発明の種々の観点はさらに、次の例により説明されるが、但し、これは本発明 を限定するものではない。たとえば、％保護率のためにこの例で使用される試験 は、％生存割合であり、これは、宿主における保護の程度を決定するために使用 され得る多くの試験のたった１つである。これらの例において、固体のためのす べての部は、重量によってであり、そして液体及び気体のためのすべての百分率 は、特にことわらないかぎり体積によってであり、そしてすべての温度は℃で与 えられる。

例１−グラム陰性感染の処理のためにＩＬ−２及びＴＮＦの使用ＮＦ 初めの８個のアミノ酸がＮ−末端から欠失されているヒトＴＮＦのムティンを、 アメリカ特許第４．６７７、０６３号に記載されるようにして調製した。手短に 言えば、ＴＮＦは、）ＩＬ−６０細胞から誘発され、そして精製され、そして配 列決定された。

次に、ヒトＴＮＦをコードするイントロンを持たない配列を、富化されたｍＲＮ Ａを生成し、ｃ［ｌＮＡライブラリーを構成し、プローブを選択し、そして配列 を回収するために前記ライブラリーをプローブすることにより調製した。次に、 ＡＴＧ出発コドンを、特定部位の突然変異誘発により、成熟タンパク質のＮ−末 端バリンをコードするＧＴＣ配列のすぐ前に導入した。

クローンを選択し、そして鎖を発現ベクターに連結し、ムティンの原生動物発現 を得た。次に、そのムティンを、配合緩衝液中に懸濁した。

ＩＬ−２の調製 この例に使用される組換えｌ　Ｌ−２は、ｄｅｓ−ａｌａ＋　ＩＬ−２ａｅｒ＋ ｚｓであった。このＩＬ−２のアミノ酸配列は、それが生来の分子の初めのアラ ニンを欠き、そして位置１２５でのシスティンがセリンに変えられている点で、 生来のヒ）ＩＬ−２のアミノ酸配列と異なる。このＩＬ−２を産生ずるＥ、コリ のサンプルは、１９８３年９月２６日、寄託番号３９．４５２として、Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　　１２３０１　 Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ、　ＵＳＡにＣ ｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより寄託されており、そしてこれはブタペ スト条約の規定下で寄託番号３９．６２６を、１９８４年３月６日に得た。

ＩＬ−２を、アメリカ特許第４．６０４．３７７号の本文及び第１図に記載して いるようにして処理し、そして精製しくこの開示は引用により本明細書に組込む ）、但し、酸化は、０−ヨードソベンゾエートよりもむしろアメリカ特許第４． ５７２．７９８号に記載されるような塩化銅を用いて行なわれた。）Ｌ−２がク ロマトグラフィ一段階から回収される場合、それは凍結乾燥され、モして１Ｌ− ２を還元状態に保持するための還元剤（ＤＴＴ）及びそれを溶液中に保持するた めの溶解剤を含む中性の水性緩衝液中に再懸濁された。クロマトグラフィ一段階 の後、組換えＩＬ−２の純度は、少なくとも約９５％であり、モしてＩＬ−２は 、リムルスアメーバ様細胞アッセイにより決定される場合、約０、０２ｎｇ／ｙ ｎｌ！以下の内毒素を含んだ。

精製されたＩＬ−２は、０．３■／ｒｎ１の濃度で配合され、そして５０■／ｄ のマンニトートを含む。

細菌 ５ａｉｎｔ　Ｍａｒｙ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ 、　ＣＡに入院する菌血症患者からのタイプ０２臨床単離体、Ｅ、コｌＪｓＭ１ Ｂを、３７℃で脳−心臓注入ブイヨン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ｄｅｔｒｏｉｔ。

Ｍｌ）中で一晩、培養し、６０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により収穫し、 標準のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、２０％グリセロールを含む脳−心臓 注入ブイヨン中に再懸濁し、アリコートし、そして−７０℃で貯蔵した。細菌の 生存率を、トリプチカーゼーダイズ寒天プレート上で１０倍の連続した希釈度で プレートシ、そして３７℃で２４時間のインキュベーションの後、コロニー形成 単位（ｃｆｕ）を計数することによって決定した。

力価を、貯蔵細菌の（ｊｕ／ｍｆの平均数として表わした。細菌は、室温でＰＢ Ｓ中に、新しく融解されたバイアルを希釈することによって注入のために調製さ れた。

実験 １５のグループにランダムに分配された生後６〜８週の雌ＣＤＩ？ウス＜Ｃｈａ ｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｗｉｌｍｉ ｎｇｔｏｎ。

Ｆ１投与量当たり１０．０００単位の上記組換えＩＬ−２の一回の投与又はＴＮ Ｆ　（０，０ＩＪｌで）の−回の投与、続＜　ＩＬ−２（１０，０００単位で） の−回の投与のいづれかにより腹腔内注射した。この注射の後、４時間で、マウ スに、マウス当たりＬＤ、。。（６Ｘ１０’ｃｆｕ）の前記Ｅ、コリ５Ｍ１８に より腹腔内注射した。ＬＤ＋。。は、グループ内のマウスのすべてを殺すために 必要な細菌の最少数を表わす。第１表における結果は、７日後の死亡率を示す。

ＴＮＦ及びＩＬ−２７６（Ｐ　１／４０．０１）食塩水　　　　　　　　　　０ マウスは、毎日観察され、そして死亡率は、４〜７日間、記録された。

括弧により上記表に示される％生存率の統計学的有意性は、標準のワンーテイル 　フィシャー　イグザクト試験（ｏｎｅ−ｔａ　ｉ　１ｅｄＦｉｓｈｅｒ　Ｅｘ ａｃｔ　ｔｅｓｔ）を用いてすべての実験のために計算され載される。

この結果は、Ｉ　Ｌ−２及びＴＮＦの組合せが、細菌感染と戦う上で付加的効果 よりもむしろ相乗効果を有することを示す。

例２−単純ヘルペスウイルスを処理するためにＴＮＦの使用異系交配されたＣＤ Ｉマウスに、例１に記載されるＴＮＦを２．０／ｇ／ｋｇで腹腔内投与した。２ 回の投与が、マウス当たすＩ　Ｘ　１０’ｐｆｕで、単純ヘルペスウィルスによ る感染攻撃の１日前及び４時間前に行なわれた。その結果は、ＴＮＦにより処理 されたマウスが、食塩水により処理された対照動物よりも有意高い生存率を示し た（Ｐ１／４０．０５）ことを示した。従って、ＴＮＦはウィルス感染の治療に おいて、単独で又は他のリホホカインと組合して使用され得る。

要約すれば、本発明は、ＴＮＦを含む感染体を攻撃する効果的な治療及び予防組 成物を供給する。

分子及び臨床生物学、薬理学及び関連する分野において熟練した人々にとっては 明らかである、本発明を実施するための上記態様の変法は、次の請求の範囲内で 意図される。

国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類宿主における感染の予防又は治療処置のための方法であって、宿主の 感染の前又は後で、哺乳種からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の有効量（ここで、Ｔ ＮＦの量は、宿主の少なくとも５０％保護率を達成するための有意な量である） を宿主に投与することを含んで成る方法。
2. ２．前記ＴＮＦがヒト源からである請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記ＴＮＦが組換え体であり、そして前記処置が予防的である請求の範囲第 ２項記載の方法。
4. ４．前記ＴＮＦが微生物から生成される請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記ＴＮＦがＮ−末端欠失ＴＮＦムテインである請求の範囲第４項記載の方 法。
6. ６．前記ＴＮＦムテインが−８ムテインである請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記ＴＮＦの量が、宿主の少なくとも７０％保護率を達成するための有意な 量である請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記宿主がヒトである請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記感染が細菌性又はウイルス性感染である請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．前記細菌性感染がグラム陰性感染である請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．前記ウイルス感染が単純ヘルペスウイルス又はサイトメガロウイルス感染 である請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．前記ＴＮＦが、投与する前、医薬的に許容されるキャリヤー媒体と共に混 合される請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．前記ＴＮＦの投与量が、１回の投与においてｋｇ体重当たり約０．４〜２ ．０μｇである請求の範囲第１項記載の方法。