JPH02503796A - 単クローン性抗体を用いて炎症部位における組織傷害を軽減する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 単クローン性抗体を用いて炎症部位 における組織傷害を軽減する方法 １徂圀！ 本発明は白血球接着−促進分子に特有の単クローン性抗体を生体内に投与するこ とによって炎症白血球活性によって媒介された（ｍｅｄｉａｔｅａ）組織傷害を 軽減する新規な方法に関する。特に、人体の組織または他の部分における傷害に 住する炎症信号に対する白血球の炎症応答の実質的減少は大または動物源の顆粒 球および単核食細胞によって表現された表面決定基に結合し、これにより特に組 織傷害に貢献するが、しかし心筋梗塞経験に制限されないある接着−依存白血球 機能（ａｄｈｅｓｉｏｎ　−ｄｅｐｅｎｓｅｎｔｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｆｕｎｃ ｔｉｏｎｓ）を特に抑制する選択単クローン性抗体を生体内に投与することによ って達成する。

ｌ米■茨盪 大または動物の循環系における末梢血液は主として赤血球細胞（ｒｅｄ　ｂｌｏ ｏｄ　ｃｅｌｌｓ）、すなわち、赤血球および白血球細胞（ｗｈｉｔｅ　ｂｌｏ ｏｄ　ｃｅｌｌｓ）　、すなわち白血球を含んでいる。白血球の機能の変化およ びその臨床適切さは科学界によって大きい興味を与えている。白血球の科は好中 球、単球、好酸球、好塩基球およびリンパ球を含んでいる。リンパ球は多数のサ ブセットを有するＴ−リンパ球およびＢ−リンパ球を含んでいる。好中球、好酸 球および好塩基球はその細胞質顆粒含有物のために顆粒球として知られている。

好中球、卓球、好酸球および好塩基球は、人免疫系における主機能が細菌、微生 物および他のタイプの異質材料を食菌または摂取するために、食細胞として知ら れている。これらの細胞は大または動物の骨髄における共通の前駆細胞から作ら れ、および末梢血液に循環し、最後に感染の制御に必要とする場合には組織に侵 入するか、または任意のタイプの炎症反応に関係することは知られている。しか しながら、これらの各食細胞は異なる機能を有し、かつ関係するが、しかし別々 の系としてふるまう。

好中球は人および動物の末梢血液におけるもっとも共通の白血球である。１マイ クロリツトルの標準の人の全血液は平均５×１０３個の白血球を含んでおり、そ の３０７５個が好中球、１５０個が好酸球、２５個が好塩基球、２５０個が単球 、および１５００個がリンパ球である。

任意のタイプの感染または炎症に対する顆粒球または単核食細胞の応答において 、これらの細胞を先づある細菌生成物、補体成分および他のフラクションのよう な科学−誘引物質フアクタ−（ｃｈｅｍｏ　−ａｔｔｒａｃｔａｎｔ　ｆａｃｔ ｏｒｓ）に対応する適当な領域に移動するように活性化する。この誘引プロセス は「走化性」と称されている。一度、炎症または感染の領域においでは顆粒球お よび単核食細胞をそのターゲットにしっかりと付着させる必要がある。この目的 のために、これらの細胞は補体、ＦｃＳおよびフィブロネクチン　レセプターの ようなこの相互作用を促進する多くの特殊な細胞表面レセプター糖タンパク質を 保有している。

細胞表面レセプター糖タンパク質の極めて重要な科は白血球細胞接着分子（ＬＥ ｔｌ−ＣＡＰＩ）科（ＣＤ１．１／ＣＤ１８）である。この科は２個の各サブユ ニットを存する少なくとも３個の細胞表面タイバク質を含んでいる。この科は９ ４　、０００ダルトン分子量の共通ベータサブユニットであることが明らかで、 かつ異なるアルファサブユニットを有している。この科の知られているメンバー はＬＦＡ−１（ＣＤ　Ｉｌａ／ＣＤ１８）　、Ｍｏ　１．　（ＣＤ　ｌｌｂ／Ｃ Ｄ１Ｂ）　、およびＰ２Ｓ５．９４（ＣＤ　ｌｌｃ／ＣＤ１８）と称され、これ らはそれぞれ１８０，０００．１５５．０００および１５０．０００ダルトン分 子量のアルファ　サブユニットを有している。これらの各細胞表面タンパク質は 、特に単クローン性抗体を用いて同定されている。表面糖タンパク質のこの科の 生物学的に重要なことは、白血球が抗原のこの科において発生学的に不足する人 の病気の同定を介して確認されでいることである。（アーナウトＭ、Ａ、、ダン アＮ、、ビットＪ１．およびトッドＲ，Ｆ、ｍ氏「２個の太白血球表面膜糖タン パク質（門０１およびＬＦＡ−］）の欠失Ｊ　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、、４４：　２ ６６４〜２６７０（１９８５））　、疾病は再発の重い細菌感染、および食作用 、プラスチックに広がる好中球Ｐ白血球凝集、および走化性のような接着−依存 機能における欠失によって特徴づけられる。

ＰＩＯＩ糖タンパク賞は、この特別の構造が１Ｃ３ｂ、補体の第３成分のフラグ メントと称する補体の成分を結合する収容力を有することが知られていることか ら、特に興味がある（アーナウト？’１．Ａ、、　　トッドＲ，Ｆ、　Ｉ［Ｉ　 、ダ７ｔＮ、、　　、ｌ　−ｙ／　）−Ｊ、：＞ユｏ−，；ｚ、７７ｓ、Ｆ、。

およびコルチンＨ，Ｒ，氏「補体Ｃ３または１ｇＧ〜被覆粒子のおよび単球−顆 粒球膜糖タンパク質（Ｍｏｌ）に対する単クローン性抗体によって結合する１ｃ ３ｂの食作用の抑制Ｊ　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、、７２：１７１〜１７９ （１，９８３））、また、Ｍｏｌ　ｔＨタンパク賞はすべての接着−依存食細胞 機能において極めて重要である。異なる単クローン抗体はＭＯｌ　１！’タンパ ク質の機能を抑制することが知られている。

Ｍｏｌは顆粒球、単核食細胞およびヌル細胞に存在する細胞表面誠タンパク質で ある　（トッドＲ，Ｆ、　ＩＩＩ　、ナドレーＬ、？１．およシュロースマンＳ 、Ｆ、氏「人単球における抗原Ｊ　Ｊａｕｒｎａｌ　ｏｆ臆駐胚ｂ」よ１２６　 ：　１４３５〜１４４２（１９８１）、人において、この分子は１５５．０００ および９４，０００ダルトンの２個の非共有結合的に結合したタンパク質からな るＣトンドＲ，Ｆ、ＩＩｌ、ファン　アゲソーベンＡ１．シュロースマンＳ、Ｆ 、およびターポルスト００氏「人単球における分化性抗体、ＭｏｌおよびＭｏ２ の構造分析Ｊ　ｈ紅」憇虹１：３２９〜３３９（１９８２））。

この複合体は他の顆粒球、内皮、および不活性基質を含む種々の表面に対し細胞 接着が媒介されることは知られている。これらの分子における遺伝欠失は抗菌性 炎症応答を媒介するのに対して顆粒球の不能のために再発細菌感染を生ずる。こ れらの分子において欠乏するタンパク質は、基質、走化性、およびオブソニン作 用した粒子の食作用に対して減少したまたは存在しない凝集接着によって生体内 で調べた場合、高められた白血球計数（いわゆる「白血球増多症」）および食細 胞活性における機能欠陥によって特徴づけられる。可溶性の炎症メジエータ（ｉ ｎｆｉａｍｍａｔｏｒｙ　ｍｅｄｉａｔｒｓ）による顆粒球および単球の活性化 はこれらの分子の表現を増大する（トッドＲ，Ｆ、　ＩＩＩ　、アーナウトＭ、 Ａ、）ロジンＲ，Ｅ、、　クララレイＣ，Ａ、、　　ビータスＷ、Ａ、およびバ ビオールＢ１本氏ｒＭｏｌ　（Ｍｏｌａ　；以前の、ｐｌｌｌｌｌ）好中球接着 で結合した表面糟タンパク質の亜細胞局在化Ｊ　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌｎｖｅｓｔ、 、　７４　：　１２８０〜１２９０　（１９８４）；アーナウト本Ａ、ｌ　ハキ ムＲ，Ｐ１．．　　）ッドＲ，Ｆ、、ダナＮ、およびコルチンＨ，Ｒ，ｒ血液透 析の顆粒球減少における接着−促進表面糟タンパク質の高められた表現Ｊ　Ｎｅ ｗ　Ｅｎ　］、Ｊ、Ｍｅｄ。

３１２　：　４５７〜４６２　（１９８５））　、　Ｍｏｌ　￥１Ｍタンパク質 る対する単クローン性抗体は生体内で好中球凝集を効果的に抑制し、および食作 用を防止する。好中球−媒介節傷害（急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）のラット 肺モデルにおいて、アンチ−Ｍｏｌ単クワクローン性抗体性化好中球により生じ た肺の内皮傷害を有意に抑制する（イスマイル６．１七ルガノロスＨ，Ｌ、、　 　）ラドＲ，Ｆ、　Ｉ［ｌ　、およびポックサーＬ、Ａ、氏　「アンチ−Ｍｏｌ 単クワクローン性抗体り予備埋置した活性化ヒト好中球による分離潅流ラット肺 における肺傷害の予防Ｊ　Ｂｌｏｏｄ、６９　：　１１６７〜１１７４（１９８ ７））　。

白血球の炎症応答は侵される微生物の根絶に極めて重大であるから、証拠の実質 的に、かつ確実な肉体は、これらの細胞を病理学的結果を誘因することにより発 生する可溶性炎症ファクターによって生体内で活性化する場合に、種々の器官お よび組織に傷害を与えることを示している（ハルランＪ、Ｍ、氏「白血球内皮相 互作用Ｊ　Ｂｌｏｏｄ、　６５　：　５１３〜５２５（１９８５））。活性化好 中球および単核食細胞を毒性酸化代謝産物およびプロテアーゼの順次釈放による 脈管内皮細胞への接着および拡散は、成人の呼吸窮迫症候群（ＡＩ？ＤＳ　；　 ショック肺症候群）、糸球体腎炎、および心臓、腸、および中枢神経系のような 虚血性組織の再潅流後に生する炎症傷害のような疾病に観察される器官傷害に影 響する白血球の炎症応答に傷つきやすいことは、多くの研究の結果によって確め られている。これらの研究は、犬を好中球特異抗血清と顆粒球を循環して消耗す る場合〔ロムソンＪ、Ｌ、氏はか「犬における好中球消耗による虚血心筋傷害の 程度の減少Ｊ　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ。

６７　：　１０１６〜１０２３（１９８３）　）　、または窒素が局所心筋虚血 および再潅流の誘導前に刺激する場合〔ムランに、Ｍ、氏ほか「麻酔をかけした 犬の急性心筋梗塞における白血球の役割Ｊ　Ｊ、Ｒｈａｒｔａａｃａｌ。

ｈムユ肚ｒ、　２２８　：　５１０〜５２２（１９８４）　）　、心筋梗塞の程 度が標準の循環好中球計数を有する犬と比べて有意に小さいことを証明している 。多くの他の研究は、また好中球活性化を抑制する物質が心筋梗塞の程度を低下 することを示している（ロムソンＪ。

Ｌ１氏はか「実験的心筋梗塞における■−インジウムＷＩ皇付けした小板および 白血球の蓄積におけるイブプロフェンの効果」Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、　６６ 　：　１００２〜１０１１（１９８２）　；　　ベトナール４９氏はか「麻酔を かけた犬の虚血心筋層のナファザトローム（Ｎａｆａｚａｔｒｏｍ）・誘導救済 が好中球機能の抑制を介して媒介されるＪ　Ｃ１ｒｃ、Ｒｅｓ、＋５７　：　１ ３１〜１４１（１９８５））。

接着−依存機能を抑制する能力を示すが、しかし１Ｃ３ｂの結合に影響しない１ 種の単クローン性抗体はＭＹ９０４として知られている（ダナＮ、ステイルトＢ 、グリフインＪ、Ｄ、　）ラドＲ，Ｆ、　Ｉ［ｌ　、タレムプナーＭ、Ｓおよび アーナウ）Ｍ、Ａ、氏「単クローン性抗体で確認した食細胞！Ｉｉ！タンパク質 における２つの官能性ドメイン」Ｊ、Ｌｍ＋ａｕｎｏ１．Ｉ３７　；　３２５９ 〜３２６３（１９８６））　、それ故、単りローン性抗体肘９０４の好中球への 結合は好中球を炎症または感染領域にし　移動するのを特に抑制する。更に、こ のＭＹ９０４の特異な結合はかかる領域に達する活性好中球の接着および拡散を 抑制し、次いで顆粒球により釈放される毒性物質の心身に有害な効果を遮断する 。

本発明の方法は生体内での傷害を軽減するＭＹ９０４単クローツクローン性抗体 利点を利用することである。ＭＹ９０４単クローツクローン性抗体に炎症白血球 により媒介された急性炎症応答の設定において、例えば心筋血液流れを虚血心筋 層に変換する前に受けるや、性冠状動脈血栓に投与する。末梢血液または組織に おける食細胞集団に影響を与える府９０４抗体のこの潅流は、侵された組織内に 炎症部位に移動するこれらの炎症細胞の能力を抑制または減少し、更に、例えば かかる領域における好中球の接着を抑制して接着細胞により釈放された毒性物質 の潜在的な有害作用を抑制または減少する。例えば、この処理は心筋血液流れを 復帰させた後、心筋梗塞の領域における組織傷害を実質的に減少することを確か めた。

！型車皿玉 本発明の方法は炎症食細胞白血球により組織傷害を軽減することであるが、しか し心筋梗塞の程度の減少に制限するものでない。単クローン性抗体ＭＹ９０４は 生体内に、血栓性薬また外科の作用によって心筋血液流れ（急性心臓血栓症によ りさえぎられた）を回復する前に、心筋梗塞を受けた場合に活性化食細胞白血球 による潜在的に有害な炎症応答の過程で予想してまたは早期に投与する。ＭＹ９ ０４単クローツクローン性抗体流後は、付随する組織傷害による心筋虚血の領域 における炎症部位に組織傷害を通常誘発する顆粒球および単核食細胞のある機能 を抑制する作用をする。再潅流心筋傷害にＭＹ９０４単クローツクローン性抗体 る場合、虚血心筋症の再潅流前に生体内に投与した場合に、有意な割合で予想し た梗塞の程度を減少する作用を示す。

１里坐呈皇星翌貝 第１Ａ図は本発明の方法の実施において得た平均の動脈血圧（？ＩＡＰ）データ を示すグラフであり；第１Ｂ図は本発明の方法の実施において得た心臓速度（Ｈ Ｒ）データを示すグラフであり； 第１Ｃ図は本発明の方法の実施において得た左回旋血液流れ（ＬＣＸ）データを 示すグラフであり；第１Ｄ図は本発明の方法の実施において得た拍数・圧の積（ ｒａ　ｔｅｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＲＦＰ）データを示すグラフ であり；第２図は心筋梗塞の形成における本発明における効果の結果を表わすデ ータを示すグラフであり； 第３図は梗塞程度を心電図のＳＴ上セグメント範囲に対して示す試験結果の結果 を示すグラフであり；および第４図は心筋梗塞プロセス中の循環好中球計数を示 すグラフ本発明の方法に用いる単クローン抗体は上述するＭＹ９０４によって同 定した。コーオラーおよびミルスティン氏によりＮａ　ｔｕｒｅ２５６　：　４ ９５〜４９７（１９７５）に記載された標準手順によって大慢性顆粒球白血病（ ＣＧＬ）細胞で免疫したネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）肺臓細胞の融合から展開した。

免疫処理に用いた顆粒球白血病細胞は診断評価の１部としてＣＧＬの新しい診断 患者から得た。血液は、フィコルーハイバク（Ｆｉｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ ）密度勾配沈降法による顆粒球および赤血球から分離した静脈穿刺および単核細 胞によって得た、１．０７７ｇ／ｃｃ、単核細胞フラクシヨンは未熟な顆粒球お よび芽細胞を含んでい１こ。これらの細胞を低温保存し、マウスを１０ＸＩＯ’ の解凍単核細胞で４週間にわたって週間間隔で腹腔内注射して免疫した。融合前 ３日目に、１０　Ｘ　１０”の同様に処理したＣＧＬ単核細胞をマウスの尾静脈 に静脈内注射した。融合のために、肺臓を除去し、次いで単細胞懸濁物を肺細胞 から作った。

次いで肺細胞をＮ５−１プラズマ細胞腫細胞系と肺細胞８対Ｎ５−１１の割合で 血清を含まない媒質に混合した。細胞をペレントに遠心処理し、０．５−の３０ ％ポリエチレングリコールに２５℃で８分間にわたって懸濁させ、次いで細胞を １回、血清を含まない媒質中で洗浄し、細胞を微量措定プレートに分布する前に ＨＡＴ媒質に希釈した。

免疫細胞集団と反応するハイブリドーマ　クローンを生ずる単クローン性抗体を 注入後１４日目に蛍光抗体スクリーニングによって選定した。単クローン性抗体 ？１Ｙ９０４を、ＣＧＬ細胞とまたは標準人顆粒球、単球、および大きい粒状リ ンパ球のフラクションと反応した抗体として同定した。単クローン性抗体ＭＹ９ ０４は１０人の試験患者の１０の顆粒球の９０％以上と反応した。単クローン性 抗体ＭＹ９０４はＴ−リンパ球二またはＢ−リンパ球とは反応しない。単クロー ン性抗体は表面標識付した標準人顆粒球からの２種のサブユニット；　１５５． ０００ダルトンおよび９４，０００ダルトンを含む糟タンパク質を免疫沈澱する （ブナＮ５氏はか「単クローン性抗体で同定した食細胞膜塘タンパク質Ｍｏｌに おける２つの官能ドメインＪ　Ｊ、］ｍｍｕｎｏ＋、、　１３７　：　３２５９ 〜３２６３　（１９８６）　）。

単りローン性抗体肘９０４の反応性分布状態およびこの単クローン性抗体で同定 した抗原の分子量は、抗原がＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（咄。

１」）糖タンパク質であることを示す。更に、機能の研究では、単クローン性抗 体ＭＹ９０４が１Ｃ３ｂ結合を抑制しないが、しかし接着−依存プロセス、プラ スチックに広ける顆粒球および走化性の効力を有する抑制因子であることを示し ている（ブナＮ１氏はか「単クローン性抗体で同定した食細胞膜糖タンパク質に おける２つの官能ドメインＪ　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ］、　１３７　：　３ ２５９〜３２６３（１９８６））。他のアンチ−Ｍｏｌ単クコクローン性抗体べ て、抗体ＭＹ９０４は接着−依存機能だけを抑制するが、しかし１Ｃ３ｂを結合 しないことは類のないことである。試験した他の抗体は単クローン性抗体４４． ９０３．　９４．１７．　ＯＨＭ　１０およびＬｅｕ　−１５を含んでいた（ブ ナＮ、ほか１ｂｉｄ、）。

それ故、単クローン性抗体？１Ｙ９０４は？！０１顆粒球−単球表面糖タンパク 質と同一であり、更に顆粒球−単球活性の接着−依存プロセスに含んでいる糖タ ンパク質におけるエピトープに特に結合する。

ＭＹ９０４単クローツクローン性抗体ことのできる雑種細胞系（ｈｙｂｒｉｄ　 ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）の１例はアメリカン　タイプ　力ルチュアコレクシジン（ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（Ａ 、Ｔ、Ｃ，Ｃ，）に寄託し、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　ＨＢ９５１０と指定され ている。

人、犬およず霊長類は一般にＭｏｌ　ｔｉクンバク質を有することが、生体内研 究によって知られている（レトビンＮ、Ｌ、、　　）ラドＲ，Ｆ、　Ｉ［ｌ、バ レイＬ、Ｓ、およびグリフインＪ、Ｄ氏「霊長類顆粒球上における骨髄表面抗原 の保存Ｊ　Ｂｌｏｏｄ、　６１　：　４０８〜４１０　（１９８３））。

更に、犬における白血球糟タンパク質欠失症候群が人において確められたかかる 症候群に類領していることが研究報告されている（ギガーｕ、、ボックサーＬ、 Ａ、、　シンプソンＰ、Ａ、、ルシヘシイＢ、Ｒ，、およびトンドＲ，Ｆ、　Ｉ ｎ氏「循環細菌感染による犬における白血球表面糟タンパクｉｉＭｏｌ、　ＬＦ Ａ−１およびＬｅｕ　Ｍ５の欠失、動物モデルＪ　Ｂｌｏｏｄ、　６９　：　１ ６２２〜１．６３０（１９８７））　、単クローン性抗体ＭＹ９０４が大およ大 白血球のアルファ　サブユニッ）　（ＣＤ１１ｂ）に結合することは示されてい る。また、ＭＹ９０４単クローツクローン性抗体好中球は結合することは、ホル ボール　エステルＰＭＡで刺激した場合に好中球凝集が生体内で効果的に抑制す る（ギガー氏はか」艮）。特定の単クローン性抗体を生体内で、食細胞媒介炎症 応答から、例えば心筋層の順次再潅流が独特で、かつ予期されていない場合の、 心筋傷害の付随軽減による減少心筋虚血傷害から苦しむ生存人または動物に投与 することが考察されている。

心筋再潅流傷害を軽減するＭＹ９０４抗体の投与の例において、先ず２３匹の生 体大のグループを作った。動物を麻酔し、これらの心臓を第５番目の肋間間隔の 左開胸を介して露出した。左回旋冠状動脈を、血液流れの連続記録のために目盛 付き！磁流れプローブを用いて調べた。血圧を記録するために、カテーテルを大 動脈に挿入しおよび単クローン抗体注入および血液採集のために、左頚静脈に挿 入した。標準肢藁内１１心電図を連続的に記録した。

局所心筋虚血を、回旋動脈を９０分間にわたって閉塞し、次いで欠陥の狭窄また は狭い部分に存在する心筋層を再潅流することによって起こした。この処理は出 血梗塞形成の進行を防ぎ、かつ再潅流誘導心室原線維形成の起るのを減少した。

心筋層を６時間にわたって再潅流した後、心臓を電気的に原綿維形成し刺激した 。梗塞程度を梗塞危険における心筋層の領域の百分率として、または全左心室の 百分率として評価した。ロムソン氏はか「意識ある犬の冠状動脈血栓症および心 筋虚血における経口イブプロティン投与の有効作用」ムハ肛Ｌ」皿」狂エユ肛肚 ユ２１５　：　２７１（１９８０）に記載されている、生体外の二重潅流組織科 学染色技術を用いた。カニユーレ装入回旋は２０ｍＭりん酸カリウムで緩衝した １、５％トリフェニルテトラゾリウム　クロリド（ＴＰＴ）溶液（ｐ）１７．４ ）で潅流し、同時に大動脈に導入したエバンブリュー染料（Ｅｖａｎ＋　ｂｌｕ ｅ　ｄｙｅ）によって冠状循環の他の部分を潅流した。両溶液は脈管分布を１０ ０ｍＨｇの一定圧下３７°Ｃの温度で５分間にわたって与えた。次いで、心臓を ５または６ＣＩ！厚の横断面に切断し、梗塞程度を面積測定的に調べた。梗塞程 度を正確に測定するこの方法はＴＰＴと心筋デヒドロゲナーゼ酵素との組織科学 反応によって定めるようにして非生存心筋組織から生存組織を区別する。

上述する動物の処理完了によって、２グループの犬について試験した。第１グル ープＮｏ１ｌには５％人血清アルブミン、単クローン性抗体についての賦形薬を 与えて「対照」グループとした。第２グループＮｏ、　９には製薬等級の単クロ ーン性抗体ＭＹ９０４１■／ｋｇを静脈内注入し、１０分間で局所心筋虚血を誘 導した（冠面液流れの再開始前４５分）。ＭＹ９０４抗体の大白血球のＭｏｌ抗 原への結合の検出を監視した。単クローン性抗体ＭＹ９０４はフロリダ州ヒアレ アのＣｏｕｌｔｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｃｏｕｌｔ ｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから調達した。

ＭＹ９０４抗体を犬に注射した後、約０．８５または１２０分間して、４−アリ コートの静脈血液を試験動物から採集し、ＥＤＴＡ含有試験管に入れ、５００ｇ で５分間にわたって遠心処理した。血漿をペレットから分離し、残りの単クロー ン性抗体の後の分析に用いた。細胞ペレットを塩化アンモニウム溶解によって赤 血球を消耗させ、残りの白血球を免疫蛍光染色により先夜アンチーＭｏｌ抗体の 存在を分析した。１〜２Ｘ１０６白血球を緩衝液だけでまたは飽和濃度のネズミ のアンチ−１’ｌｏｌ抗体を含む緩衝液で温置した。次いで細胞を洗浄し、飽和 濃度のフルオレセイン−抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ　アンチ−マウス免 疫グロブリンを含有する緩衝液中で、更に３０分間４°Ｃで温置した。アンチ− Ｍｏｌの生体内投与によりまたは付加アンチ−Ｍｏｌ抗体に生体内さらしく江ν １ｔｒｏ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ）後に、大好中球および単球に結合する抗体を、こ れらの骨髄性細胞について選択ゲート（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｇａｔｉｎｇ）後 フロー型血球計算法（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒいにより、フロリダ州　ヒア レアのＣｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるエピクス＠　（ ＥＰＩＣＳ）Ｃフロー型血球計算法を用いて対数前角対対数直角光散乱により測 定するようにして評価した。測定当り５０００の細胞の蛍光強さを単クローン性 抗体結合の定量測定として用いた。

処理大の血漿または血清中に過剰のアンチ−Ｍｏｌ抗体を生成するのに十分なＦ ＩＹ９０４アンチ−Ｆｌｏｌ単クローり性抗体の投与を説明するために血漿（Ｅ ＤＴＡ−抗凝固化血液）または血清のサンプルを分析した。これは、Ｉ　ＸＩＯ ６Ｍｏｌ−陽性試験セル、カルシウム　イオン透過担体Ａ２３１８７−刺戟大好 中球、を人血漿または血清（′／２．　％、　１／８．１／１６　ｍ釈）を含ｔ ；　緩＆　液中Ｔ：　４°Ｃで３０分間培養した間接螢光抗体分析により評価さ れた。次いで、細胞を飽和濃度のフルオレスセイン抱合ヤギ　アンチ　マウス免 疫グロブリンを含有する緩衝液中で更に３０分間４°Ｃで洗浄した。試験細胞に 結合した単クローン性抗体をここで述べるようなフロー型血球計算法によりエピ クス＠（ＥＰＩＣ５＠）計器を用いて定量した。

心筋組織中の好中球蓄積を測定するため心筋の５０〜２００■のサンプルを中央 梗塞領域、危険領域内の非梗塞組織、梗塞領域と危険域の間の心内膜ないし心外 膜境界帯域から、また正常な非梗塞および非染色（ｕｎｓｔａｉｎｅｄ　）心筋 がら取り出した。組織サンプルを均質化し、−ブラドレー、ピー、オー、　　（ Ｂｒａｄｌｅｙ。

ｐ、ｏ、　　）　ら％　Ｍｅａｓｕｒｅ＋ｎｅｎｔ　ｏｆ　ｃｕｔａｎｅｓｕｓ 　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　　：Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍ、、　７８　： 　２０６〜２０９　（１９８２）記載のミエロペルオキシダーゼ含量を検定した 。梗塞後の心筋組織のミエロペルオキシダーゼ含量は、ベトナー、エム（Ｂｅｄ ｎａｒ、　Ｍ、）ら、Ｃ１ｒｃ、Ｒｅｓ。

５７　：　１３１〜１４１　（１９８５）　；マラン・ケイ・エム（ＦＩｕ］１ ａｎｅ＋　Ｋ、Ｍ、　）ら、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ、　１４　　：　１５７〜１６７　（１９４６）に記載するように好中球浸 潤の組織学的証拠との関係を示した。心筋内の梗塞および好中球蓄積の組織学的 評価を得るために、各心臓からのヘマトキシリンおよびエオシンで染色した代表 的な組織学的部分を、特定の処理を知らない独立の有資格調査員により評価した 。データを評価した。

単離された好中球凝集上の単クローン性抗体の影響を評価するために未処理大の 静脈血液からフィコルーハイパ７の勾配技術により好中球を単離した。赤血球の 緩衝塩化アンモニウムで溶解し、１０’／ｄの濃度にバンク（）ｔａｎｋ）の平 衡塩溶液中に再懸濁した。凝集は、血小板凝集プロフィラー（ｐｒｏｆｉｌｅｒ ）　、米国ペンシルベニア州、ホージャム（Ｈｏｒｓｈａｍ　）　ＢＩＯ／ＤＡ ＴＡ　　コーポレーション社、モデルＰＡＰ−３により評価した。好中球のサン プルは、ＭＹ９０４および陰性対照抗体とともに予備培養され次いで１２５■／ ｄ　ＰＭＡにより活性化された。

全データを、Ｐ＜０．０５の価が有意と考えられる対応対照群と比較した。

前記のように、局所虚血および再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　）後に起こる アンチ−Ｍｏｌ単クコクローン性抗体筋梗塞の程度に及ぼす影響を評価する研究 において２３匹の犬で始めた。これら２３匹の犬の中で１６匹は梗塞程度の最終 分析に含まれた。３匹の犬は心電図変化で測った虚血の他覚的徴候を発生しなか ったので除かれ、４匹は、３匹が未処理で１匹がアンチ−Ｍｏｌ抗体で処理され たが、心室細動により除かれた。

平均動脈血液（ＭＡＰ　）　、心拍数（ＨＲ）　、左回旋（ＬＣＸ　）　、血液 流れおよび拍数・厚の積（ＲＰＰ　　；　ＭＡＰＸＨＲ／１００）を、抗体がこ れらのパラメータに何らかの影響を及ぼすかどうかを見るために実験中一定間隔 で測定した。蓄えられたデータを第１Ａ、　ＩＢ。

ＩＣおよびＩＤ図にそれぞれ示す。二つの処理群は、実験中ベースラインおよび 各時点において同様な？ｌＡＰ、　ＨＲ，ＲＰＰおよびＬＣＸ血液流れを有した 。したがって抗体の保護効果は、ＬＣχ血液原液流測った心筋血液供給またはＲ ＰＰ若しくはＨＲもしくはＭＡＰで測った心筋酸素要求の変化に帰すことができ なかった。

梗塞の程度は、第２図のデータから分かるようにアンチ＝Ｍ０１抗体の投与によ り対照に比べて４６％だけ減った。同様に、梗塞の程度は、これを全左心室の百 分率で表した場合、単クローン性抗体処理によって著しく小さかった。虚血性に された左心室の百分率、すなわち危険領域／左心室は、処理群の間で同様であっ た。梗塞程度を心電図に上の訂セグメント上昇の程度の関数として表す場合、第 ３図のデータから分かるように異なる回帰線を画く各処理群において良好な関係 が存在する。これらのデータは、ＳＴ上セグメント昇で測った、所定のか酷度の 心筋虚血に対して起った梗塞の程度が単クローン性抗体処理群に比べて対照群で 大きいことを示す。したがって、心筋梗塞の程度は、虚血のか酷度と関係なく単 クローン性抗体処理により減少する。

免疫フルオレセンス分析により、すべての２０の実験の被験者がアンチ−Ｍｏ　 Ｉ　　ＭＹ９０４単クロー単性ローン性抗体出しうる抗原エピトープを示した。

アンチ−Ｍｏｌ単クコクローン性抗体けた９匹の犬において、抗体投与後の各時 点で（すなわち、抗体投与後４０．７５および４０５分）、血清または血漿は、 血清または血漿処理Ｍｏｌ陽性試験細胞の免疫フルオレセンス染色により検定さ れるように残留アンチ−？Ｉ０１抗体を含んでいた。これは、１■／　ｋｇの注 入で生体内に抗体過剰を起こすのに十分であることを示した。結合抗体の検出可 能な飽和以下（ｓｕｂｓａｔｕｒａｔｉｎｇ　）の量が９匹の犬の中でわずか６ 匹の白血球で見いだされ、これは、フルオレスセイン複合ヤギ　アンチ−・マウ ス免疫グロブリン試薬とともに培養することによる検定前に膜からの抗体解離を 反映するのであろう。

第４図のデータは、好中球計数が対照群で見られるように心筋梗塞の経過中、通 常増加することを示す。しかし、二つの群を比較した場合、循環好中球計数のこ の早い増加をアンチ−Ｍ。

１抗体による処理が押さえる。これらのデータは、血液中の過剰の抗体および白 血球に結合した抗体の測定とともに抗体処理群からの好中球が循環から除かれて いかないことを確かめる。

抗体による白血球処理に関する一つの大きな問題は、抗体が細胞表面に結合する ために抗体が迅速に除かれうろことである。

これらのデータは、この抗体による処理が循環好中球の数の激しい低下を起こさ せなりことを示す。

追加研究において、５匹の犬の第３群を同じ仕方で陰性対照ネズ°ミＩｇＧ　Ｉ 単りローン性抗体、すなわち大白血球と反応しない抗体で処理した。我々は、細 潅流後の梗塞の程度がＨ３Ａ稀釈剤を受ける他の対照群により示される程度から あまり異ならないことを確かめた。

我りの方法から得られたデータは、単クローン性抗体、ＭＹ９０４による好中球 付着の防止は白血球付着に不利に向かい、促進分子Ｍｏｌは心筋梗塞のよく特徴 ずけられた動物モデルにおいて再潅流障害を低減することができる。この発明の 方法により得られるデータは、アンチ−Ｍｏｌ単クロりン性抗体ＭＹ９０４の投 与が心筋梗塞の程度を軽減することができるが、虚血の苛酷さを低下することに よってはできないことを示す。虚血期間はすべての例で９０分であったので、Ｍ Ｙ９０４抗体による保護の機構は、虚血心筋の好中球媒介損傷の低下を伴う好中 球付着への影響の結果であろう。したがって、心筋梗塞の程度の二つの大きな決 定要素は、苛酷さを虚血期間であると考えられる。

この発明の例の方法の実施から蓄積したデータから単クローン性抗体？’１Ｙ９ ０４の被験者への局所心筋虚血の４５分内投与が虚血の苛酷さと無関係に梗塞程 度を大いに軽減することが分かる。

更に、データは、局所心筋虚血の発生後アンチ−Ｍｏｌ単クロりン性抗体肘９０ ４による白血球付着の禁止が梗塞程度により測られる低下した心筋再潅流損傷を 与えることを示す。結果である梗塞の危険領域の百分率として示される心筋梗塞 の程度は、ＭＹ９０４単クロー単性ローン性抗体処理対照に比べて４６％だけ低 下されるや この発明の例の方法を用いる冠状血栓事故を経験する人の治療に対し、医学的経 験は、胸に苦痛または不安を経験した患者は通常その後３０〜６０分内に緊急ベ ースで病院に運ばれることを示す。患者は迅速に検査され急性の心筋虚血の発生 と冠状動脈閉塞の位置を記録し治療を定める。このような治療はゑ、性の冠状閉 塞を起こした血餅を溶解する血栓溶解剤（例えばストレプトキナーゼ又は組織プ ラスミノゲン活性剤（ＴＰＡ　）　）注入療法でありうる。他の治療は性質が外 科的で循環系にバルーンカテーテルを挿入し閉塞を除くため血餅領域に向ける。

治療のどの仕方においても、虚血心筋の再潅流（すなわち冠状動脈血液流れの回 復）に至る中間の直前に、ある量のＭＹ９０４単クロー単性ローン性抗体静脈内 に注射する。１回または多数回の静脈内薬量を炎症性応答を適度に弱めるように 投与することができる。

その後、ＭＹ９０４単クロー単性ローン性抗体のように虚血事象の苛酷さに関係 なく組織損傷（梗塞程度）を軽減する作用をする。

？ＩＹ９０４単クローン性り体注入は、望ましくない好中球作用を禁止すること により心筋再潅流損傷を軽減する作用をする。

この発明の例の方法を実施する際含まれる方法段階は、特許請求の範囲に記載す るこの発明の範囲と精神から外れることなく種々変更を加えることができる。

ＬＣＸ　友Ｗ！、　すれ　輻ｌ／ＭＩＮＩ　　　　　　ＭＡＰ　（ｍｒｎＨｇ＋ ＦＩＧ、　　２ ＦＩＧ、　　３ ＦＩＧ、　４ 補正書の写しく翻訳文）提出書く特許法第１８４条の８）平成元年１２月１１日 特許庁長官　　吉　　１）　文　　毅　殿１、特許出願の表示 ＰＣＴ／Ｌ７Ｓ　８８１０１９２８ ２、発明の名称 単クローン性抗体を用いて炎症部位における組織傷害を軽減する方法 ３、特許出願人 名称　　ザ　ユニバージティー　オブ　ミシガン（外１名） ４、代　理　人 １９８９年　６月１３日 ６、添付書類の目録。

請求の範囲 １、（補正後）食細胞−媒介炎症状態にある人体または動物体の任意の部分にお ける炎症部位に生じた組織傷害を軽減するために大または動物宿主を処理する方 法において、顆粒球および他の食細胞の表面に表現されたＭｏｌ抗原のＣＤＩＩ ／ＣＤ１８糖タンパク質のＣＤｌｌｂ部分にのみを特に結合する単クローン性抗 体を生体内投与して前記傷害に貢献する免疫学的炎症応答機能を反映する前記細 胞のＣＤＩＩ／ＣＤ１Ｂ接着依存細胞相互作用を抑制することを特徴とする大ま たは動物宿主の処理方法。

２、（補正後）前記単クローン性抗体を、アメリカン　タイプ力ルチュア　コレ クションに寄託しＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，寄託Ｎ（ＬＨＢ９５１０で指定されたハ イブリッド細胞系の主特性を有する細胞系からハイブリドーマ技術により生成し たＭＹ９０４単クロー単性ローン性抗体定する請求項１記載の方法。

３、（補正後）炎症状態にある人体の炎症部位に生ずる組織傷害を軽減するため に人宿主を処理する方法において、好中球の表面に表現されたＭｏｌ抗原のＣＤ １１ｂ、　１５５．０００ダルトン分子量ペプチドに表現されたエピトープのみ に特に結合するある量のネズミ単りローン性抗体を炎症状態前のまたは炎症状態 中に人体に注入し、前記傷害に貢献する免疫学的応答機能を反映する好中球のＣ ＤＩＩ／ＣＤ１８接着依存細胞間反応を抑制することを特徴とする大宿主の処理 方法。

４、（補正後）前記単クローン性抗体を、アメリカン　タイプカルチニア　コレ クションに寄託しＡ、　Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託ＮαＨＢ９５１０で指定されたハイブ リッド細胞系の主特性を有する細胞系からハイブリドーマ技術により生成したＭ Ｙ９０４単クローツクローン性抗体定する請求項３記載の方法。

５、（補正後）炎症部位における心筋血液流れを回復させるのに薬物的にまたは 外科的に治療する急性冠状血栓症にかかっている患者の心筋炎症傷害を軽減する 方法において、少なくとも前記血液流れ回復前に好中球のＭｏ１表面抗原のＣＤ １．１／ＣＤ］８糖タンパク質のＣＤｌｌｂ部分に表現されたエピトープのみを 特に結合するある量のネズミ単りローン性抗体を静脈内に供給し、これにより免 疫学的応答機能を反映する前記部位における好中球の接着−依存細胞相互作用を 抑制し、これにより前記部位における好中球の有害作用を低下させることを特徴 とする心筋炎症傷害の軽減方法。

６、（補正後）前記単クローン性抗体を、アメリカン　タイプカルテニア　コレ クションに寄託しＡ、　Ｔ、　Ｃ１Ｃ，寄託Ｎｏ、ＨＢ　９５１０で指定された ハイブリッド細胞系の主特性を有する細胞系からハイブリドーマ技術により生成 したＭＹ９０４単クローツクローン性抗体定する請求項５記載の方法。

７、（補正後）食細胞−媒介炎症状態にある人体または動物体の任意の部分にお ける炎症部位に生じた組織傷害を軽減するために大または動物宿主を処理する方 法において、顆粒球または他の食細胞の表面に表現されたＭｏｌ抗原のＣＤＩＩ ／ＣＤ１８糖タンパク質のＣＤ１］、ｂ部分に表現されたエピトープに特に結合 する細胞系Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，ｋ　ＨＢ９５１０により生じたＭＹ９０４ネズ ミ単クロー単性ローン性抗体異性を有する単クローン性抗体を生体内に投与し、 前記傷害に貢献し、かつ１Ｃ３ｂの結合に干渉しない免疫学的炎症応答機能を反 映する前言己細胞のＣ０ＩＩ／ＣＤ１８接着依存細胞相互作用を抑制することを 特徴とする大または動物宿主の処理方法。

８、（補正後）前記単クローン性抗体が細胞の表面に表現されたＭｏｌ　糖タン パク質のＣＤ１１ｂ、　１５５．０００ダルトン分子量ペプチド分子におけるエ ピトープに結合する請求項７記載の方法。

９、（補正後）前記炎症部位が体部分の脈管内皮細胞界面または亜細胞マ）　Ｉ Ｊソックス位置する請求項７記載の方法。

１０、（補正後）　前記炎症部位が体部分の内皮組織にある請求項７記載の方法 。

１１、（補正後）前記炎症部位が体部分の接合にある請求項７記載の方法。

１２、（補正後）前記炎症部位が心筋梗塞状態から発生する請求項７記載の方法 。

１３、（補正後）単りＯ−ン性抗体を前記炎症状態前の選定時間にまたは状態中 に静脈内投与する請求項７記載の方法。

１４、（補正後）前記単クローン性抗体が好中球のＭｏｌ糖タンパク質を結合す る請求項７記載の方法。

１５、（補正後）炎症状態にある人体の炎症部位に生ずる組織傷害を軽減するた めに大宿主を処理する方法において、好中球の表面に表現されたＭｏｌ抗原のＣ Ｄ１１ｂ、　１５５．０００ダルトン分子量ペプチドに表現されたエピトープに 特に結合するバイブリド−７細胞系Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、　）ＩＢ９５１ ０から生じたＭＹ９０４のある量の結合特異性を有するネズミ単りローン性抗体 を炎症状態前のまたは炎症状態中に人体に注入し、前記傷害に貢献し、かつ１Ｃ ３ｂの結合に干渉しない免疫学的応答機能を反映する好中球のＣＤＩＩ／ＣＤ１ ８接着依存細胞間反応を抑制することを特徴とする大宿主の処理方法。

１６、　０’ｌｒ正後）炎症部位における心筋血液流れを回復させるのに薬物的 にまたは外科的に治療する急性冠状血栓症にかかっている患者の心筋炎症傷害を 軽減する方法において、少なくとも前記血液流れ回復前に好中球のＭｏ１表面抗 原のＣＤＩＩ／ＣＤ１８糖タンパク質のＣＤ１．１ｂ部分に表現されたエピトー プを特に結合する細胞系Ａ、　Ｔ、　Ｃ０Ｃ，Ｎ（Ｌ　ＨＢ９５１０で生じたＭ Ｙ９０４ネズミ単クロー単性ローン性抗体性を有するある量のネズミ単りローン 性抗体を静脈内に供給し、これにより免疫学的応答機能を反映する前記部位にお ける好中球の接着−依存細胞相互作用を抑制し、これにより前記部位における好 中球の有害作用を低下させ、かつ１Ｃ３ｂの結合において抗体結合ターゲット好 中球に干渉しないことを特徴とする心筋炎症傷害の軽減方法。

１７　　　（！ｉｌ＋Ｉ　Ｖｂ　） 国際調査報告 １°゛９′″Ｊ１ｍｅａｌａｅｍｔａ＋−Ｎ″’ＰＣτ１０Ｓ８Ｂ１０ユリＰ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．食細胞−媒介炎症状態にある人体または動物体の任意の部分における炎症部 位に生じた組織傷害を軽減する方法において、顆粒球および他の食細胞の表面に 表現されたＭｏ１抗原に結合する単クローン性抗体を生体内投与して前記傷害に 貢献する上記細胞の特異的免疫学的炎症応答機能を抑制することを特徴とする組 織傷害の軽減方法。
2. ２．前記細胞の接着・依存機能を前記単クローン性抗体結合によって抑制する請 求項１記載の方法。
3. ３．前記単クローン性抗体をＭＹ９０４として同定する請求項２記載の方法。
4. ４．前記単クローン性抗体を細胞の表面に表現されたＭｏ１糖タンパク質のＣＤ １１ｂ，１５５，０００ダルトン分子量ペプチド分子におけるエピトープに結合 する請求項１記載の方法。
5. ５．前記炎症部位が体部分の脈管内皮細胞界面または亜細胞マトリックスに位置 する請求項２記載の方法。
6. ６．前記炎症部位が体部分の内皮組織にある請求項２記載の方法。
7. ７．前記炎症部位が体部分の接合にある請求項２記載の方法。
8. ８．前記炎症部位が心筋梗塞状態から発生する請求項２記載の方法。
9. ９．単クローン性抗体を前記炎症状態前の選定時間にまたは状態中に静脈内投与 する請求項２記載の方法。
10. １０．前記単クローン性抗体はｉＣ３ｂの結合に影響を受けない請求項２記載の 方法。
11. １１．前記単クローン性抗体が好中球のＭｏ１糖タンパク質を梗塞する請求項１ ０記載の方法。
12. １２．人体における炎症部位に生ずる組織傷害を軽減する方法において、免疫学 的炎症応答を通常示す食細胞白血球細胞のＭｏ１表面抗原のエピトープに結合す るように選定したある量の単クローン性抗体を、炎症状態前にまたは状態中に人 体に注入し、および前記炎症状態に応答する免疫学的接着−依存機能を抑制する ことを特徴とする組織傷害の軽減方法。
13. １３．前記単クローン性抗体をＭＹ９０４として同定する請求項１２記載の方法 。
14. １４．前記単クローン性抗体が好中球のＭｏ１糖タンパク質を梗塞し、かつｉＣ ３ｂの結合に影響しない請求項１２記載の方法。
15. １５．炎症部位における心筋血液流れを回復させるのに薬物的にまたは外科的に 治療する急性冠状血栓症にかかっている患者の心筋炎症傷害を軽減する方法にお いて、少なくとも血液流れ回復前に好中球のＭｏ１表面抗原を結合するある量の 単一クローン性抗体を静脈内に供給し、これにより前記部位における好中球の接 着−依存機能を抑制し、かつ前記部位における好中球の有害作用を低下させるこ とを特徴とする心筋炎症傷害の軽減方法。
16. １６．前記単クローン性抗体がＭＹ９０４単クローン性抗体である請求項１５記 載の方法。
17. １７．前記炎症部位が人および動物の好中球に表現されたＭｏ１糖タンパク質（ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）のＣＤ１１ｂ，１５５，０００ダルトン　ポリペプチド におけるエピトープに結合する請求項１５記載の方法。