JPH02500717A - 新規蛋白質甘味料の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規蛋白質甘味料の製造 技術分野 本発明は組換技術による新規の蛋白質甘味料の製造に関するものモネリンは、西 部アフリカに産出するジオスフレフィルム・コミニシイという植物の果実である “不思議な成果（Ｓ　ｅｒｅｎｄｉｐｉｔｙ　ｂｅｒｒｉｅｓ）”の樹液に存在 している大変甘味な物質である。この物質は均一物質に精製され、炭水化物がま ったく含有されていない、分子量１、ｌＸ１０’の塩基性蛋白質であると明らか にされた。

モネリンは熱帯植物にみられる物質に由来するいくつかの甘味料または調味料な どのうちでその特性が最もよく知られた物質で、大きさが殆ど似ている二つのサ ブユニットが非共有結合で結合されている。この二つのサブユニットは相互に同 一でなく、モネリンの味を出す能力は二つのサブユニットと一つの単一メルカプ タン基によるものでこれを遮断すると甘味を失う。

植物原料から天然生成物を抽出するものの不確実性および費用のため、蛋白質甘 味料を生産するための他の経路が実質的な関心を引いている。組換技術は多様な 種類の蛋白質を合成する機会を提供した。しかし、組換技術を使用する場合、遺 伝子を製造するための戦略を開発し、蛋白質が宿主細胞に成功的に発現されたか を立証しなければならず、生理活性を示す物質を分離することが必要である。

大部分の場合、実質的に有用な生成物生産の成功の不確実性を増大する天然に存 在する配列を修正するのが必要または望ましい。

関連文献：モリスら、　ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２ ４８巻５３４〜５３９頁（１９７３年）にモネリンの特性が説明されており、そ の他、カガン、サイエンス、１８１巻３２〜３５頁（１９７３年）、ウロダワー およびホジソン、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシーズ・ニーニスエイ、７２巻３９８〜３９９頁（１９７５年）、ボ アクおよびリー、バイオチミカ・工・バイオフィン力・アクタ、４２７巻１５３ 〜１７０頁（１９７６年）、ハドソンおよびピーマン、バイオケミカル・アンド ・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、７１巻２１２〜２２０ 頁（１９７６年）、ジルゲンソン、バイオチミカ・工・バイオフィン力・アクタ 、４４６巻２５５〜２６１頁（１９７６年）およびファン・デル・ウェルおよび ロエブ、フエブス・レターズ、２９巻１８１〜＋８３頁（１９７３年）にもモネ リンの特性について説明されている。米合衆国特許第３，９９８．７９８号には 天然モネリンの製造方法が説明されている。

発明の概要 本発明では、甘味を出す能力を有した新規の蛋白質を発現するため、新規のＤＮ Ａ読み取り可能枠とその読み取り可能枠を使用してなる構築物および発現システ ムが提供され、上記蛋白質はモネリンのアミノ酸配列の大半を使用する。上記蛋 白質は二つのサブユニットを有するモネリンとは異なり一つの分子であり、単一 配列として規定する。

本発明では、新規の蛋白質甘味料とその製造方法及び製造方法に利用される中間 体、特に核酸中間体が提供される。上記甘味料は天然モネリンをモデルとしたも ので、モネリンの独立し１ニニつのサブユニットが一つの連続配列として共に連 結されている。二つのサブユニットはそれら間の連結部位に隣接したアミノ酸を 修正するか又は配列を延長して成る短い連結体を挿入することによりその端と端 とが連結され得る。

本発明のアミノ酸配列はその大部分がモネリンサブユニットのアミノ酸配列とし て、一般にモネリン配列と少なくとも約８０％以上の相同性を、より一般にはモ ネリン配列と少なくとも約９０％以上の相同性を有する。アミノ酸配列は挿入や 削除又は置換により変化され得るが、挿入及び削除する場合には一般におよそ９ 個のアミノ酸を超過せず、より一般にはおよそ６個のアミノ酸を超過せず、置換 は保存的あるいは非保存的であり、次の表にて同列にあるアミノ酸などを保存的 置換として示す。

大部分の場合、極性アミノ酸は非極性アミノ酸に置換され得ず、脂肪族アミノ酸 は芳香族アミノ酸に置換さメー得ない。

アミノ酸 脂肪族 非極性 極性 中性 Ｓ、Ｔ、Ｃ，Ｍ、Ｎ、Ｑ 荷電性 塩基性 に、Ｒ，Ｈ 酸性 り、Ｅ 芳香族 Ｆ、Ｗ、Ｙ 大部分の場合、保存的置換が望ましく、サブユニットＨの４１及び４２位置のシ スティン及びメチオニンは存続させる。（標題構成物とは異なるモネリンと関連 したアミノ酸の番号付けとして、天然モネリンのサブユニットの番号付けに基づ いたものである。）本発明の蛋白質はＮ−末端としてサブユニット■又はサブユ ニットＩのうち、いずれを有してもよく、特にサブユニット■を有するのが良い 。本構成物によると、生成物はＮ−末端メチオニンを有することもあり、あるい は有しないこともある。二つのサブユニットは、一般に１０個以下、より一般に ８個以下の短い連結体を利用して連結するか、あるいは直接連結、望ましくは連 結部位のアミノ酸などを修正して直接連結することができる。連結体を形成する ための連結部位のアミノ酸などは極性連結のため提供され、サブユニット末端に 存在するアミノ酸のうち、少なくとも５０数％以上、一般には少なくとも７５数 ％以上が極性になるようにし、さらに便宜的には少なくとも２５数％以上、一般 には５０数％を自然状態に置く。

この様なアミノ酸などはサブユニット■のループの１つから出ることができる。

連結に関して、連結部位はサブユニットの天然配列のうち１０個以下、一般には ６個以下のアミノ酸を連結体として含む。サブユニット■のＣ−末端をサブユニ ットＩのＮ−末端と連結する場合、連結部位はサブユニット■のｒ　Ｉｅ（４６ ）とサブユニットＩのＧ　ｌｙ（６）に存在し、若し介在アミノ酸があれば連結 体としてこれらを含める。

Ｎ−末端がサブユニットＨに存在する時、連結部位の野生型アミノ酸のうち、一 つ以上を除去又は置換でき、一般におよそ１０個以下のアミノ酸を除去又は置換 させ、より一般にはおよそ６個以下のアミノ酸を除去又は置換させる。一般に、 除去ま１こは置換されたアミノ酸のうち７５％以下がサブユニット中の一つと結 合させるようにする。

望ましい連結体としては次の様な配列を含む。

ＸＸＸＸＸＸＸ　Ｘ ここにて、一つのアミノ酸だけは存在する必要があり、各アミノ酸などは次の様 に定義されろところであり、ａａ’はＡ、Ｄ、Ｅ、に、ＲまたはＹであり、ａａ ”はＹ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｒ，ＴまたはＳであり、ａａ３はＮ、Ｑ、Ｓ、Ｔ 、Ｄ、Ｅ、ＲまたはＹであり、ａａ’はＦ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｋまたは Ｒであり、ａａ５Ｄ、Ｅ、に、Ｒ，ＬまたはＴであり、ａａ＠はり、Ｅ、Ｖ、１ ．Ｌ、ＫまたはＲであり、ａａ’はＧ、Ａ、Ｖ、Ｉ　、Ｌ、ＫまたはＲであり、 ａａ”はＫまたはＲであり、 Ｘは０又は１であり、少なくとも一つのＸはｌである。

望ましい組成は次の通りである。

ａａ’はＹまたはＥであり、 ａａ”はり、Ｅ、ＹまたはＫであり、 ａａ３はＮ、Ｔ、ＡまたはＹであり、 ａａ’はＲ，Ｓ、ＫまたはＥであり、 ａａ’はＥ、ＤまたはＴであり、 ａａ＠はに、ＤまたはＲであり、 ａａ’はＧ、Ｉまにはしであり、 ａａ”はＫまｆこはＲである。

配列が最初の二つのアミノ酸としてＹ及びＥを有する場合、０ないし４個のχが ０の値を有することができ、最初の二つのアミノ酸としてその他のアミノ酸を有 する場合、０ないし５個のＸとｙが０の値を有することが出来る。即ち、上記チ ェーンは一般に３ないし８個、より一般には４ないし８個のアミノ酸を有する。

特に、連結部位がＹ−Ｅ−Ｎ−Ｅ−Ｒ−Ｅ−１−にの場合、フェニルアラニンが 除去される。

他の連結体として、Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−１−に、Ｙ−に−Ｔ−Ｒ−Ｅ−Ｄ −１−に、Ｙ−Ｅ−Ｒ−Ｅ−１−に、Ｙ−Ｅ−Ｎ−１−に、Ｙ−Ｅ−Ｉ−に、Ｙ −Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に−Ｌ−ＫＳＹ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に−Ｌ％Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に 、Ｙ−Ｓ−Ｄ−に、Ｅ−Ｄ−Ｙ−に−Ｔ−Ｒ−Ｇ−Ｒ及びＥ−Ｄ−Ｙ−Ｔ−Ｒが 含まれる。

一般に、チェーン内にＹ、Ｅ、Ｄ、Ｋ又はＲのうち少なくとも一つ以上が存在す るようにし、望ましくはＥ、Ｄ、Ｋ又はＲのうち少なくとも一つ以上が存在する 様にする。連結体のため望ましいアミノ酸はＹ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、に、Ｒ， Ｎま１＝はＱであり、連結体のアミノ酸のうち５０％以上を上記アミノ酸グルー プのうちから選択する様にする。

変換、挿入、削除および置換の総数は一般に１２個、より一般には１０個のアミ ノ酸を超過しない様にする。この時、置換を先に数え、次いで削除または挿入を 数えてその総数を数えることにする。

標題組成物は組換技術により製造できる。発現のためには遺伝子が提供されなけ ればならず、サブユニットｌおよびＨの配列は天然原料よりゲノムＤＮＡまたは ｃＤＮＡから得られる。これとは異なる方法として、望ましい二重鎖を得るため に共に結さつされる単一鎖などを製造するための戦略が開発され得る。その結果 により結さっされた二重鎖のＤＮＡが適当な読み取り可能枠を有することを確実 にするためには、配列などをヘテロ二本鎖にすることを最小化する様に設計する 。実施例にて使用された戦略が特に望ましい。

一旦、二重鎖の配列を設計した後、多様な単一鎖の断片を合成し、通常の技術で 共に結さつする。その後、コード部分を利用して発現カセットを製造する。発現 カセットは、読み取り可能枠での転写方向に沿って５゛−末端に転写および翻訳 開始調節部分を、転写方向に沿って読み取り可能枠の３°−末端に転写および翻 訳終了部分を含める。

最近、大変多様な遺伝子などの転写および翻訳調節部分を含む多くのベクターが ある。この様なベクターの開始および終了部分はポリリンカーにより分離されて おり、読み取り可能枠はそれらの転写および翻訳調節下に存在するため開始部分 と終了部分との間に挿入されている。ベクターは特定な発現宿主によっては商業 的に入手可可能な切片から製造され得る。大部分の場合、ベクターは低いかある いは高い複製数をもち、一般には１０００以下の複製数を有する複製システムを 含むが、場合によってはランチウェイベクターを使用しても構わない。これとは 異なる方法として、過剰遺伝子を利用する代わり、ベクターと宿主ゲノムとの間 の相同性を与え、統合の機会を増加させることが出来る。統合させる場合には、 発現カセットと前後に増幅遺伝子（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ｇｅｎｅ）が提供さ れ得る。増幅遺伝子としてはジヒドロフオレートリダクターゼ、メタロチオネイ ン又はチミジンキナーゼなどが含まれる。この様な遺伝子は発現宿主から発現さ れるため適当な転写および翻訳調節部分を伴う。原核生物を利用する場合、ポリ シストロン性メツセージが利用され得、また増幅遺伝子のような甘味料遺伝子は 同じ転写および翻訳調節部分により調節され得る。

一般に、ベクターには標題蛋白質が発現された時、発現カセットを含むそれらの 宿主細胞のうちから選別できる様にマーカーを含める。マーカーとしては生物前 耐性、特に抗生物質または重金属などに対する耐性、基本有機栄養を提供する栄 養要求性宿主に対する相保性およびウィルス感染に対する抵抗性などが含まれ得 る。一つ以上のがマーカー存在でき、特に一つのマーカー（表示物）を構成物に 挿入して利用し、特定能力の消滅として発現カセットの存在いかんを確認するこ とが出来る。

転写開始部分として使用され得るものとしては、ｔｒｐ、　Ｉａｃ、　ｇａｌ。

ｈｉｓなどの遺伝子と関連したもの、λ■、λＰＲ、Ｐ　４プロモーターの様な ウィルスプロモーター、又はａｄｈ　−１、ａｄｈ−２、ｍａｔ、　ｇａｌ、１ ）ｇｋ、　ｐＹｋｓ　ｐｈｏ５、ｍＡ、　ｇａｐｄｈ、　ａｎｙ、　ｄｂｆｒな どの遺伝子と関連した物などの様な酵母ブロモターなどがある。連結ブロモタ一 部分にはｔａｃ、　ａｄｈ　−２／ｇａｐｄｈ、　ｇａｌ／ｇａｐｄｈＳｅｙｅ ／ｇａ＋転写開始部分の様なものが使用され得る。米合衆国特許第４，４１８． １４９号、第４゜３０４．８６３号、第４，３５０．７６４号、第４．３６３， ８７７号および第４．３６６．２４６号に例示されている。

転写の程度を増加するため、エンハンサ−の様な特別な配列が利用され得、多様 なエンハンサ−が宿主範囲内の多様な遺伝子と関連する文献に提示されている。

また他の配列として、蛋白質の分泌および製造のためのシグナルリーダーがある 。多数のシグナルリーダーなどが多くの文献に説明されており、広範囲の蛋白質 に有効であることが示されている。従って、一つのシグナルリーダーが効果的で ない場合には、他の利用できるシグナルリーダーなどを試験することができる。

シグナル配列の例として米合衆国特許第４．３３６，３３６号、第４．３３８． ３９７号および第４，５４６，０８２号などがある。

若し、シグナル配列を含有させるならば、シグナル配列を甘味料のコード読み取 り可能枠の５′−末端に連結してメチオニンコドンを提供する様にし、読み取り 可能枠をメチオニンと共に適当な読み取り段階に位置する様にする。従って、前 駆蛋白質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ進行しつつ、シグナル配列、製造シグナル 及び蛋白質甘味料を包含する様になり、前駆蛋白質が分泌される時、シグナル配 列と製造シグナルは酵素作用により除去される。多くの製造シグナルが知られて いるが、これらは宿主と分泌及びシグナル配列を除去する製造の為に使用された 酵素作用システムを基礎とする。

本発明では多様な宿主が使用され、原核生物と真核生物の両方とも可能である。

一般的な宿主としてエシェリヒア・コリ、バシラス・サチリス、バシラス・リシ ェニフォルミス、サツカロミセス・セレビジア、クリュイベロミセス・ラクチス 、ニューロスポラ・クラサ、ストレプトマイセス及びアスペルギリス・ニゲルな どを例として上げられ、各属の構成種などが使用され得る。大部分の場合、微生 物発現宿主として、特に原核生物が使用される。

発現カセットだけを有するか、又は発現カセットをベクターや他の構成物の一部 分として有する発現宿主を形質転換させるためその宿主の特性により多様な技術 が使用され得る。発現カセットの導入は結さつ、形質転換、形質変換、形質導入 及び融合などにより遂行され得る。本来の宿主細胞または原形質体、特に再生産 された原形質体などは外因性ＤＮＡの導入のため、使用され得る。

一応、宿主が形質転換されると、選択培地にて培養してマーカーまたは関連発現 カセットを有するそれらの宿主を選別することが出来る。抗生物質耐性を利用す る時、栄養素は抗生物質耐性遺伝子不在下である程度の抗生物質細胞毒性を包含 し得る。栄養テ求佇相保の場合、栄養培地は必要な代謝物質が足りＴ；い様にす る。生成物が細胞質に生産され存続すると、細胞の成長に十分に時間が立つｆコ 後に細胞を融解し、従来の精製方法により目的とする蛋白質を得る。

この様な精製方法などとしては液体−液体抽出、ＨＰＬＣ、クロマトグラフィー 、電気泳動などがある。その次、生成物はゲル除去、クロマトグラフィーなどに よりさらに精製され得る。

その結果として生成物は甘味料として多様な方法にて利用され得、缶詰製品や炭 酸飲料に添加して利用されたりコーヒーまたは茶などの様な多様な飲料水に添加 するための粉末または液体として利用され得、料理、チューインガム、クリーム 歯磨き、口濯ぎ薬、歯衛生剤、薬剤、ハムやソーセージなどの肉類製品、インス タントスープ、ヨーグルト、デザート、穀物、動物幅などに利用され得る。

本発明の目的物である蛋白質甘味料は液体または粉末として使用できる。液体の 場合には安定剤、緩衝溶液、殺菌またはプロテアーゼ抑制剤などの様な他の添加 物が結合され得る。水溶液媒体には甘味料が一般に０．１ないし９０重量％の組 成で存在する様にする。

粉末の場合、従来の食品増量物である多様な賦形剤が添加され得る。

一方、甘味料を独立生成物として提供するよりは、発現カセットを植物で利用出 来るように製造することができる。特に、発現カセットを植物の構成物または調 節性転写開始部分機能を利用し、果物、野菜、メロンなどの生成物の甘味を増加 することができる。

多様な構成物が文献に説明されており、植物で構成物または調節性転写開始部分 を利用する多様な遺伝子の発現を論議している。転写開始部分としてオクトパイ ン、マンノパイン、ツバリンなどのような多様なオパイン開始部分がある。その 他、カウリフラワーモザイクウィルス３５Ｓブロモターの様な植物性ウィルスの 転写開始部分を使用することもできる。他の転写開始部分、特に誘導可能な部分 、より特別には細胞分化と関連した部分としてはりブロース−１゜３−ビフォス フェートカルボキシラーゼの小さいサブユニットまたは大きいサブユニット転写 開始部分、果物特異性プロモーター、熱シヨツクプロモーターなどが含まれる。

次の実施例は実例を提示したものであり、本発明の範囲を制限するものではない 。

実施例 １、オリゴヌクレオティドの合成と精製次のオリゴマーをアプライド・バイオシ ステム３８０ＢＤＮＡ合成機を利用して合成した。

５′→３゛ Ｕ　１　：　ＴＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＡＴＡＴＴＧＧ ＡＣＣＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣ（４６量体）ｔＪ　２：ＴＴＧＧＧＴＡＡＧ ＴＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡ丁ＴＧＧＴＣＡＡＴＡＴ 　（４５量体）Ｕ３：ＧＧＴＡＧＡＴＴＧＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴ ＴＡＧＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧ　（４５量体）Ｕ４：ＡＣＴＡＴＴＴ ＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＧＧＴＡＣＧＡＡＴＡＣＣ ＡＡ　（４５量体）Ｕ　５：ＴＴＧＴＡＴＧＴ丁ＴＡＣＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡ ＧＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＣＴ　（４５量体）Ｕ６：ＧへへＧ ＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＧＧＴＡＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＣＡ ＡＣＧＧＴ　（４５量体）Ｕ７：ＣＣ’ＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＴＡ Ｇ　（２１量体）Ｌｌ：ＣＧＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＣＡ　（２１ 量体）Ｌ２：ＣＧＴＣＡＡＣＡＧＣＧＡＡＣＴＴＡＣＣＣＡＡＧＴＴＴＴＧＡＧ ＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＡＡＴＡＴ　（４５量体）Ｌ３：ＣＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡ ＧＴＣＡＡＴＣＴＡＣＣＡＴＡＴＴＧＡＣＣＡＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴ　（ ４５ｉ欺体）Ｌ４：ＣＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＴＴＣＴ ＴＣＡＴＡＣＡＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＡ　（４５１体）Ｌ　５：ＴＧＴＣＡＧＡ ＡＧＣＧＴｌへＡＣＡＴＡＣＡＡＴＴＧＧＴＡＴ丁ＣＧＴＡＣＣＣＣＴＴＡＡＴ Ｔ丁　（４５１１体）Ｌ６：丁ＡＣＣＧＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＡ ＧＡＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＣＴ　（４５量体）Ｌ　７　：ＴＣ ＧＡＣＴＡＴＴＡＴＧＧτＧＧＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＴＴＧＡ、１．ＴＣ ＴＣＡＡＣＡＡＣＴτＴＣ（４Ｒｆｉ体）上記オリゴマーなどはウレア−ポリア クリルアミドゲル電気泳動で分離し、セパツク　ＣＩ８コラム（ファツトマン） を通して精製しに０ モネリンサブユニットおよび連結体に該当する遺伝子によりコード化されたアミ ノ酸配列と結さつ戦略は次の様である。

〈結さつ戦略〉 Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｔｈｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　 ＧｌｙＰｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐ ｈｅ　ＡｌａＶａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｇｌ ｙ　Ｇｉｎ　ＴｙｒＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ 　Ｖａｌ　Ｔｈｅ　Ａｒｇサブユニット■ Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌａ　 ＡｓｎＬｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅＵＰｈｅＡｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｉｃｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ 　Ｌｙｓ　ＴｈｒＡｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｎｄｅ　Ｉ　Ｓａｌ　Ｉ ＵＩ　Ｕ２　Ｕ３　Ｕ４　Ｕ５　Ｕ６　Ｕ７ＬＩ　Ｌ２　Ｌ３　Ｌ４　Ｌ５　Ｌ ６　Ｌ７２゜オリゴマーのアニーリングと結さっ及び融合されたモネリン遺伝子 の分離 各オリゴマーなどを３７℃にて４５分間３０μｇの５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、 ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＭｇＣ１，、ｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、５ユ ニツトのＴ４ボリニュクレオティッドキナーゼを含有する反応混合物のうちから 燐酸化しｆ二。　各反応混合物を一緒に集め、フェノール／クロロホルムで抽出 し、エタノールで沈澱させた後、高速真空下で乾燥した。乾燥したパレットを５ μＣの蒸留水に溶解し、７μｇの結さっ緩衝溶液（０，２Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ７゜５．０．ＩＭ　ＭｇＣ１ｔ、０．１Ｍ　ＤＴＴ）を添加した。上記溶液を ９５℃の水槽に置き、−晩中徐々に室温にまで冷した。上記混合物に７ｔｔＱの １０ｍＭ　Ａ’ＴＰ、４０ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼにニュー・イングラ ンド・バイオラブズ・インコーホレイテッド）及び２μｇの水を添加した。

上記反応混合物を室温にて１０分間置き、フェノール／クロロホルムで抽出し、 沈澱し、乾燥し、８５μｇの水に再溶解した。結さつされたオリゴマー混合物を 制限酵素Ｎｄｅｌと５ａｌＩにニュー・イングランド・バイオラブズ・インコー ホレイテッド）で処理した。

２９０塩基対の断片を７％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させて分離し、 バンドを電気溶出させた後、エルテップ−Ｄ　コラム（ニス・アンド・ニス・コ ーポレイション）を利用して精製した。

３、分子クロニング 融合された合成モネリン遺伝子クロニングするため、Ｍ１３ｍｐ１９ＲＰを利用 した。まず、Ｍ　Ｉ　３ｍｐｌ　９　ＲＰをＸｂａ　Ｉ／Ｓａｌ　Ｉ（二ニー・ イングランド・バイオラブズ・インコーホレイテッド）で切断した。大きい断片 を分離し、上記の方法により精製した。

次の様な合成Ｘｂａ　Ｉ／Ｎｂｅ　Ｉを合成し、Ｘｂａ　Ｉ　Ｎｄｅ　１ ５’−ＣＴＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＧＡＴＴＴ ＴＣＧＡＴＣＡ−３’　（４０量体）３°　−ＴＴＴＧＡＣＧＴＴＡＣＡＡＣＴ ＴＡＴＴＴＧＣＧＡＣＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＡＴ−５°　（３８量体）アダプ ターを上記にて説明した様に精製した。Ｎｄｅ　Ｉ／Ｓａｌ　Ｉで切断され、ア ニーリングされ融合された合成モネリンの断片を１０ｔｔ（ｌの２０ｍＭ　トリ ス−ＨＣｌ、　Ｉ）Ｈ７，５、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、２０ ０ユニツトのＴ４　ＤＮＡ　リガーゼ（、ニュー−イングランド・バイオラブズ ・インコーホレイテッド）のうち、ｘｂａｌ／５ａｌＩ−処理されたＭｌ　Ｓｍ ａ１９　ＭＯＮ　Ｉ　ＲＦおよびＸｂａ　Ｉ／Ｎｄｅ　Ｉアダプターと共に組み 合わせ、４℃にて一晩中放置しておき、Ｍ　Ｉ　３ｍ１）１９　ＭＯＮ　−Ｉ　 ＲＦを得た。

形質転換は５７１Ｏの結さっ混合物を２００μρのエシェリヒア・コリＪ　ＭＩ 　０１適合細胞に添加し遂行され（メッシング、メソッズ・イン・エンザイモロ ジー、１０１巻２０−７８頁（１９８３年））、ジデオキシＤＮＡシーフェンシ ングおよびＭｌ　Ｓｍａ１９　ＭＯＮ　−ＩＲＦの製造はメッンングメソッズ・ イン・エンザイモロジー（１９８３年）およびサンガーら、　プロシーディング ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ニーニス エイ、７４巻５４６３−５４６’７頁（１９８５年）に説明された通りに実施し た。

４、発現ベクターの構築 合成融合モネリンのＩ）ＮＡ（２９３ｂｐ）をＭ　１　Ｓｍａ１９　ＭＯＮ−Ｉ ＲＦから分離し精製”した。ｔｒｐＯ，Ｐ（ファルマシア・インコーホレイテッ ド：Ｃａｔ、　３２７−４９３０−０１）を含むベクターｐＤＲ７２０をＳｍａ 　Ｉ／Ｐｖｕ　Ｉ［で切断し、鈍端結さっさせてｐｔｒｐ３２２を製造した。ｐ ｔｒｐ３２２をＨｐａ　Ｉ／Ｓａｌ　Ｉで切断し、２　、５　ｉｔｂｐの大きい 断片を分離し得ｆ二。

次のような合成Ｈｐａ　Ｔ／Ｎｄｅ　ｌ　アダプターをアプライド・バイオシス テム３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機を利用して合成した。

Ｈｐａ　Ｔ　Ｎｄｅ　１ ５°　−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡｉへＧＧＧ丁Ａ ＡＴＡＣＡ−３’　（３６量体）３°−ＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴ ＧＣＡＴＴＴ丁ＴＣＣＣＡＴＴＡＴＧＴＡＴ−５’　（３８量体）上記の合成融 合モネリン（２９３ｂｐ）とＨｐａ　１／Ｓａｌ　Ｉ−処理されたｐｔｒｐ３２ ２ベクター及びＨｐａ　Ｉ／Ｎｄｅ　Ｉ　合成アダプターを１０ｔｔＱの２０ｍ Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣＩｓ、１０ｍＭＤＴＴ、２ ００ユニツトのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（−ニー・イングランド・バイオラプズ・ インコーホレイテッド）存在下で１４℃にて一晩中結さつ反応させ、ｐｔｒｐ３ ２２　ＨＭＯＮ　−１を得た。

この様なプラスミドでエシェリヒア・コリ　ｗ３１１０（ＡＴＣ０２７３２５） を形質転換させること及び両組合わせられたクローンの選別は上記のように実施 した。

５、合成融合モネリン遺伝子発現の確認遺伝子発現の研究のため、Ｗ３１１０に 挿入されているｐｔｒｐ３２２ＨＭＯＮ−１５０μＣをルリア　ブロスで一晩中 培養し、０．４％カサミノ酸と１０μ９／吋ビタミンＢ１及び４０μ９／ｘＱア ンピシリンを含有するＭ９培地５杼に接種させ、温度が調節される振温保温器内 で３７℃にてＯＤｓｓｏｎｍの値が０．５となるまで培養し几。その後、０　、 １　ｍ９のインドレアクリン酸を上記の反応混合物に５０μ９ＩＲＱの濃度とな るように添加し、引き続き上記の混合物を約８時間放置しに。培養された細胞を ベックマン　Ｊ６の遠心分離機により２５００ｒｐｍで５分間ベレット化した。

ラエムリ蛋白質試料緩衝溶液を細胞ペレットに添加し、９５℃で５分間加熱した 後、ＤＮＡを１５％ラエムリ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで３００にて２゜ ５時間電気泳動させた（ラエムリ、ネイチャー、２２７巻６８０−６８５頁（１ ９７０年））。ゲルをコーマシ・ブルー・ブリリアント染料で染色して生成物が 正確な分子量を有するかを確認した。発現された生成物を分離して甘味を有する かをも確認した。

上記の順序によって修正されたＤＮＡ配列が製造されるところ、連結部位のアミ ノ酸などは多数である。次の配列などはサブユニット■のイソルイシン（アミノ 酸　４６）（ボークおよびり−、スブラ、番号付け）をサブユニット■のグリシ ン（アミノ酸　６）に連結する配列を指定する。

２、Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−１−に ３、Ｙ−に−Ｔ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−１−に ４、Ｙ−Ｅ−Ｒ−Ｅ−１−に ５、Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｉ−に ６、Ｙ−Ｅ−１−に ７、Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に−Ｌ−に ８、Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に−Ｌ ９、Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−に １０、　Ｙ−Ｓ−Ｄ−に １１、Ｂ−Ｄ−Ｙ−に−Ｔ−Ｒ−Ｇ−Ｒ１２、Ｅ−Ｄ−Ｙ−に−Ｔ−Ｒ 使用されたコドンは３で指定したコドンを除いては、ＭＯＮ−１構成で指定した ものと同様であり、Ｓ、セレビジア該当酵素によって選ばれたコドンが使用され た。この様な配列はＡＡＧ、ＡＣＴ。

ＡＧＡである。

モネリン配列を基礎とする新規の蛋白質甘味料が多様な方法を利用し、安定した 単一鎖の蛋白質で生産できるという事実は上記の結果から証明される。生成物を 、天然原料から分離せずに、微生物宿主を利用して効果的尚かつ経済的に製造で き、安定した、さらに均等の供給が可能な甘味料を得られるようになった。また 、甘味を出す特性には影響を及ぼさずに、アミノ酸の構造に変化を与えられ、化 学的、物理的な安定性、貯蔵期間、成形及び精製の容易、甘味の増加など、様々 な便宜を提供できる。

本明細書に言及されたすべての刊行物と特許明細書は本発明が属する分野で熟練 者たちの技術水準の指標である。すべての刊行物と特許出願物は、個々の刊行物 と特許出願物が本明細書の一部として含まれているのと同様に、本明細書の説明 の一部をなすものである。

上記の発明か明確な理解を目的として実例と実施例の方式で詳細に説明されてい るが、添付されて請求範囲内でいかなる変化と修正も可能なことは明白であろう 。

国際調査報告 ＋−７−−−＋ｎ−ａｉＡ、カニ（ｇ＠＊　４ｍ、　？　ｃ＝／ＫＲａｓ／Ｃｏ ｏｌ　０

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．一つのペプチド・リンケージを通じて互いに共有結合されたモネリンのサブ ユニットなどのアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸 配列から成るポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列。
2. ２．上記ポリペプチドはＮ−末端としてサブユニットＩＩを有し、Ｃ−末端とし てサブユニットＩを有するものであることを特徴とする、請求項Ｉ記載のＤＮＡ 配列。
3. ３．上記ポリペプチド配列に存在するモネリン野性型配列ＩＩｅ（４６）とＧＩ ｙ（６）との間の介在配列は総１０個以下のアミノ酸から構成され、置換・削除 または挿入により修正されたものであることを特徴とする、請求項２記載のＤＮ Ａ配列。
4. ４．上記の介在配列は次の構造式で示される配列であることを特徴とする、請求 項４記載のＤＮＡ配列。 ａａ１Ｘ−ａａ２Ｘ−ａａ３Ｘ−ａａ４Ｘ−ａａ５Ｘ−ａａ６Ｘ−ａａ７Ｘ−ａ ａ８Ｘここにおいて、ａａ１はＤまたはＥであり、ａａ２はＫ、Ｒ、ＮまたはＱ であり、 ａａ３はＤ、Ｅ、ＳまたはＴであり、 ａａ４はＦ、ＷまたはＹであり、 ａａ５はＫまたはＷであり、 ａａ６はＤまたはＥである。 ｘは０または１であり、少なくとも一つのｘは１である。
5. ５．上記の介在配列はＹ−Ｅ−Ｎ−Ｅ−Ｒ−Ｅ−Ｉ−Ｋ、Ｙ一Ｅ−Ｎ−Ｒ−Ｅ− Ｄ−Ｉ−Ｋ、Ｙ−Ｋ−Ｔ−Ｒ−Ｅ−Ｄ−Ｉ−Ｋ、Ｙ−Ｅ−Ｒ−Ｅ−Ｉ−Ｋ、Ｙ− Ｅ−Ｎ−Ｉ−Ｋ、Ｙ−Ｅ−Ｉ−Ｋ、Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−Ｋ−Ｌ−Ｋ、Ｙ−Ａ− Ｓ−Ｄ−Ｋ−Ｌ、Ｙ−Ａ−Ｓ−Ｄ−Ｋ、Ｙ−Ｓ−Ｄ−Ｋ、Ｅ−Ｄ−Ｙ−Ｋ−Ｔ− Ｒ−Ｇ−ＲまたはＥ−Ｄ−Ｙ−Ｔ−Ｒであることを特徴とする、請求項４記載の ＤＮＡ配列。
6. ６．転写方向に沿って、転写及び翻訳開始調節部分と、第１項ないし５項に一致 するＤＮＡ配列としてその５′−末端にメチオニンを有するＤＮＡ配列及び、翻 訳および転写終了部分から成っており、上記調節部分が微生物宿主で機能し得る 発現カセット。
7. ７．転写方向に沿って、転写及び翻訳開始調節部分と、第１項ないし５項による ＤＮＡ配列としてその５′−末端にメチオニンを有するＤＮＡ配列及び、翻訳及 び転写終了部分から成っており、上記調節部分が徴生物宿主で機能し得る発現カ セットを含有する微生物宿主。
8. ８．モネリンの二つのサブユニットと８０％以上の相同性を有する蛋白質甘味料 を製造する方法において、上記の甘味料は単一鎖で構成されており、上記方法は 、転写方向に沿って転写及び翻訳開始調節部分と、第１項ないし５項に一致する ＤＮＡ配列としてその５′一末端にメチオニンを有するＤＮＡ配列及び、翻訳及 び転写終了部分から成っており、上記調節部分が微生物宿主で機能する発現カセ ットを含有する徴生物宿主を適当な栄養素中で培養することにより上記ＤＮＡ配 列を発現させて上記の蛋白質甘味料を産生させた後、上記の蛋白質甘味料を分離 することを特徴とする蛋白質甘味料の製造方法。