JPH02500401A - 脾臓の活性を刺激する新規な蛋白質分解錯体の製造方法ならびにその畜産への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 膵臓の活性を刺激する新規な蛋白質分解錯体の製造方法ならびにその畜産への応 用 本出願人は、フランス国特許第２，０３４，５５９号において、ストレプトマイ セス　フラジア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ）がら蛋白質分解 錯体を製造する方法ならびにこの錯体の特に畜産への応用を開示した。

上記特許に記載の発明は一般的に好ましいものであるが、実験の結果、この発明 を実施して得られた結果は必ずしも規則性がなく、また不充分な点もあるため、 この錯体の使用は制限されたものであった。

そこで、本出願は、より明瞭な組成を有する新規な錯体の製造方法と、この新規 な錯体を用いて規則的に畜産上の改良をする条件を定めることができる方法を提 供する。

さらに、本出願はこの方法により得られる新規な蛋白質分解錯体を提供するもの である。

イギリス国特許第１．１３３．５７９号において、ジオツギは、ストレプトマイ セス　フラジアにより、Ｉａ、Ｉｂ、　ＩＩ、■、■で表される少なくとも５つ のプロテアーゼと、２つのペプチダーゼの製造が可能であることを記載している 。本出願人はさらに、ストレプトマイセス　フラジアから、はぼ同じ一般的特性 をもち、上記ジオツギ特許に記載されたものと同じタイプの酵素を製造した。本 出願では、混乱を避けるため、上記ジオツギ特許に記載されたものと同じローマ 数字でこれらの酵素を示すことにする。

ｎ、ｍ、ｒｖタイプのプロテアーゼだけで構成されている錯体は、上記当初の特 許に記載したように、腸の粘液粘度を適度に低下させ、一般に畜産学上好ましい 結果をもたらすが、規則的でなくまたは不充分である。本出願人は、これらの錯 体の中で、タイプ■のプロテアーゼを豊富に含む錯体のみがタイプ■または■の プロテアーゼに比較して畜産学上の効果を規則的に大きく向上させるということ を確認した。

さらに、本出願人は、前記５つのタイプのプロテアーゼと２つのタイプのペプチ ダーゼから成る複合錯体は、腸の粘液粘度を過度に低下させ、膜に対して強過ぎ るため、畜産に応用することはできないということも確認した。

以上のような理由で、本出願人は、タイプ■、■、■のプロテアーゼのみで構成 され且つタイプＨのプロテアーゼを最も多く含む錯体の製造方法を開発した。

製造方法 本発明の錯体は下記の条件下で製造される：発酵 例えば、アメリカン　タイプ　カルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、略称：ＡＴＣＣ）に第１０． ７４５号で登録されている代表的なワクスマン（ＷＡＫＳＭＡＮ）３５３５株等 のストレプトマイセス　フラジア株を用いる。この株は、蛋白質分解活性の低い 自然突然変異体を除去するための寒天培養基上での公知の解離方法により定期的 に再生させることができる。また、この株は、蛋白質分解活性を高めるため、公 知の誘発突然変異により改良することもできる。

この株は先ず撹拌されたフラスコ中で前培養され、次に、中間発酵型中で培養し 、その後、工業的発酵型中に接種される。この製造用培養培地は以下のような組 成にすることができる： ・大豆粉末・・・・・・・１５ｇ／１２・グルコース・・・・・・３０ｇ／ｌ ・リン酸カリ・・−・・・Ｉｇ／７７ ・炭酸カルシウム・・・−１０ｇ／Ｒ 滅菌後のｐ）ｌは約７．０であり、発酵温度は２８℃に維持し、滅菌空気は毎分 培養基の体積１に対し０．３の割合で供給する。

培地のｐＨは最初７．０であるが、次第に低下し始め発酵１０時間後には６．５ に達した。それから急速に増加し、発酵２０時間後には７．５に達し、その後は ゆっくりと増加し最終的に８．２に達した。

例えば、３Ｎ塩酸溶液等の酸性溶液を自動的に添加することによりｐＨを７．５ 〜７．０の間に維持することが非常に重要であることが確認された。すなわち、 このような酸性溶液にすることによって、 −菌糸体の分裂および培地中での二次代謝物、ＩａおよびＩｂタイプのプロテア ーゼ、ペプチダーゼの発生を防ぐことができ、従って、これらの二次代謝物およ び酵素を細胞内に留めておくことができる。

−生に細胞外酵素である■、■、■タイプのプロテアーゼ製造量を増加させるこ とができる。

−特に、■タイプのプロテアーゼの製造量を大幅に増加させることが可能となる 。

発酵時間は７２〜９６時間で、培地の最終滴定量は約１５．０００アンソン単位 ／献であり、これはフランス国特許第２．０３４．５５９号に記載されている滴 定ｆｉ３，０００アンソン単位／７！をはるかに上回っている。アンソン単位（ 略称：　Ａ、　Ｕ、　）とは、変性ヘモグロビンの存在下において、ｐＨ７，５ 、温度２５℃の条件下で１０分間培養され、チロシン１ｍｇ当量を培地から放出 した酵素の量を指し、これは、トリクロロ酢酸に対して非沈殿性の濾液上につい ての２８０％ｍにおける分光光度吸収により測定される。

抽出 この菌糸体は、清澄濾過により培養基から分離される。

錯体は、公知の酵素分離方法（一連の沈殿操作、カラム通過）により抽出するの ではなく、新しい方法である限外濾過により抽出する。

最大効率をもたらす限外濾過膜（メンブレン）についテ検討した。その結果、分 子量３０．０００に対応するカット閾値を有する膜は、５０％以上の錯体を流出 させてしまうので適切ではなく、また分子量１．０００に対応するカット閾値を 有する膜も低分子量の二次代謝物から錯体を分離することが不可能であるため適 していないことがわかった。最終的に、２．０００〜１２、０００の範囲にある 分子量に対応するカット閾値を有する膜が適していることが明らかにされた。例 えば、商品名Ｐ、　Ｔ、Ｇ。

Ｃ１でミリボール（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）社より市販され、分子量１０．０００ に対応するカット閾値を有するポリスルホン膜を用いることができる。

得られた濃縮物をアトミゼーションにより処理した。

最終的に、滴定量が少なくとも２．０ＯＯＡ、　Ｕ、　／　ｍｇの透明ベージュ 色の粉末状の錯体が得られた。尚、アトミゼーションの前または後に選択的に添 加された例えば過乾燥スターチ等の不活性支持体は考慮に入れていない。

蛋白質分解活性の全効率は約７０％であり、この値は一連の沈殿操作またはカラ ムを通して工業レベルで得られるものより高い。

！洩 ストレプトマイセス　フラジア株から所望の蛋白質分解錯体を得るためには、無 機または有機酸溶液の添加により培地のＰＨを７．５〜７．０に維持し、清澄剤 の存在下で濾過し、次いで２．０００〜１２．０００の分子量に対応するカット 閾値を有する膜上で限外濾過した後に、さらにアトミゼーションにより蛋白質分 解錯体の抽出を行うことが望ましい。

さらには、ストレプトマイセス　フラジア株として、ＡＴＣＣに第１０．７４５ 号で登録されている代表的な株ワクスマン（ＷＡＫＳＭＡＮ）　３５３５を用い 、３Ｎ塩酸溶液により培地のＰＨを７．５〜７．０＋、：維持しながら、限外濾 過膜としてミリポール（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）社より市販されている商品名Ｐ、 　Ｔ、　Ｇ、　Ｃ，のポリスルポンをベースとした膜を用いるのが好ましい。

本発明による新規な錯体の特徴 一タイブＩａ、Ｉｂのプロテアーゼおよびペプチダーゼを除くタイプ■、■、■ のプロテアーゼが存在する（酵素電気泳動による測定） 一蛋白質分解活性全体の４０％以上を占めるタイプ■のプロテアーゼが最も多く 含まれ、タイプ■または■のプロテアーゼはそれぞれ活性全体の３０％以下であ る。

上記の新規な錯体を成すプロテアーゼの特徴−タイプ■のプロテアーゼ： 平均分子量約１８．０００．等電点的９．０．　ｐＨ８，０テ０）Ｎ気泳動によ る陰極への移動速度は比較的低い一タイプ■のプロテアーゼ二 分子量約１４．０００゜等電点的９．０．　ｐＨ８，０での電気泳動による陰極 への移動速度は中程度 一タイブ■のプロテアーゼ： 分子量約１６．５００゜等電点的９．０゜ｐｔ＋ｇ、ｏでの電気泳動による陰極 への移動速度は比較的高い 畜産学への応用 本発明の錯体を畜産学へ応用する場合には、次のように実施すれば最良の結果が 得られる。

未処理蛋白質含有率の高い餌の使用 錯体には、脂肪形成よりも蛋白質形成を優先する傾向があり、これにより動物の 成長を刺激することが分かっている。

例えば、錯体による処理を施した子牛や豚の肉は筋肉が多く、脂肪が少ないので 高級肉に分類されることがある。しかし、このような改良も規則的にはできなか った。

従って、錯体が蛋白質同化作用を刺激するという上記のような傾向は、用いた餌 が未処理蛋白質を多量に含んでいる場合においてのみ完全に達成されるものと推 測される。

蛋白質同化作用の有効な刺激を規則的に達成するために守るべき条件の１つは、 未処理蛋白質含有率の高い、すなわち全窒素化物質（略称：　Ｔ、　Ｎ、　Ｍ、 　）含有率の高い餌を用いることであることが実験により確認された。

例えば、このＴ、　Ｎ、　Ｍ、含有率は以下の値でなければならない：若鶏の初 期育成用の餌の場合　≧２３％子牛または子羊の噴孔用の餌の場合　≧２２％子 豚の離乳用の餌の場合　２２０％ 妊娠および授乳期間中の雌豚用の単一の餌の場合　２１６％このような餌の使用 は、以下に示す理由で、一般に実用には適していない。

−Ｔ、　Ｎ、　Ｍ、含有率の高い餌を動物が完全に同化できるとは限らず、未消 化の蛋白質は、蛋白質分解菌の過剰な発生による腸内植物相の不均衡、さらに下 痢の回数増加を引き起こす。本発明による錯体は、動物がＴ、　Ｎ、　Ｍ、含有 率の高い餌を充分に同化することを可能にするので、この錯体を使用することに より、上記の問題は解消される。

−Ｔ、Ｎ、Ｍ、含有率の高い餌は、通常の餌より高価であり゛、これに錯体を加 えればさらに値段は高くなる。しかし、錯体は通常の量より低いエネルギレベル の餌の使用を可能にすることから、上記の費用の増加分を相殺することができる 。

いずれにせよ、得られた畜産上の結果が大幅に向上するので全体的経済収支は非 常に有利である。

妊娠、授乳（または哺乳）および離乳期の動物用餌への使用本発明の特定の錯体 は、膵臓の外分泌活性を刺激することが観察された。これは、フランス国特許第 ２．０３４．５９９号に無い新しい発見である。この刺激は、特にねずみを使っ た実験で、膵臓管から放出される全酵素の膵臓白濃度の大幅な増加により認める ことができる。尚、このときの増加率は、アミラーゼが５０％、トリブシノゲン およびキモトリフロシノゲンが７０％、リパーゼが８０％に達した。

従って、本発明の特定の錯体は、新規で予想外の特性をもつ新しい物質と考える ことができる。膵臓の外分泌活性への刺激により、この錯体は特に、膵臓に欠陥 があるとき（妊娠した雌の場合）、例外的な生産作業（雌が大量授乳する場合） あるいは特別な適応作業（離乳期にある若い哺乳動物の場合）を施す必要がある ときに効果的であろう。

以下に示す具体例は、上記の仮定を裏付けている：（ａ）　妊娠末期にある雌の 膵臓は、子宮体積の大幅な増加により全ての消化器管が圧迫されるので、欠陥が ある場合が多い。このような雌に与える餌に錯体を添加することにより良好な膵 臓の機能が確保され、新生児の誕生時における体重も増加する。例えば、妊娠ま たは授乳期にある雌豚用のＴ、　Ｎ、　Ｍ、含有率が１６％の単一の餌に、餌１ ｇ当り１２ＯＡ、ｔｌ、の割合で錯体を添加することにより、新生児の誕生時に おける体重は１２．８ｋｇから１５ｋｇすなわち１７％（１，２５ｋｇの子豚１ ０．２匹から１．４ｋｇの子豚１０．７匹）に増加した。

（ｂ）多数の子に授乳する雌の毎日の餌の消費は急速に増加するはずであり、妊 娠末期から授乳８日目の間に２．５倍に増加する（雌ねずみについては１８ｇか ら４５ｇへ、また雌ウサギについては１４０ｇから３５０ｇへ、雌豚については ２．４ｋｇから６ｋｇに増加する）ことになる。従って、このような授乳期にあ る雌の膵臓はかなりの補足処置を施す必要があり、特にこのような状態において 錯体の作用はより重要になってくる。

例えば、妊娠または授乳期にある雌豚用のＴ、　Ｎ、　Ｍ、含有率１７％の単− 餌に、餌１ｇ当たり１２０Ａ、１１．の割合で錯体を添加することにより、離乳 ２１日目の子豚の体重が４３ｋｇから５４ｋｇすなわち２５％＜４．７ｋｇの子 豚９．１匹から５．７ｋｇの子豚？、４匹）に増加した。

同様の条件下であるが、離乳２１日目ではなく２８日目の子豚を測定した別の実 験でも、子豚の体重は２５％増加した。

すなわち、２１日目で４１ｋｇから５２ｋｇ　（４，８ｋｇの子豚８．５匹から ５．４ｋｇの子豚９．４匹）の増加であり、２８日目では５５ｋｇから６９ｋｇ 　（６，５ｋｇの子豚８．５匹から７，１ｋｇの子豚９．７匹）の増加であった 。

上記のような子豚の体重増加と同時に、雌豚の状態を良好に維持するのに必要な 餌の消費量が減少した。すなわち１年間の合計で約１０％＜１．１００ｋｇから １．０００ｋｇへ）の減少であった。

（Ｃ）　離乳期において、若い哺乳動物は母乳から混合餌の消費に移行しなけれ ばならないため、膵臓はこの大きな変化に対して速やかに適応する必要がある。

そこで、錯体をこれらの混合餌に添加することにより、この適応を容易に行わせ ることができる。

例えば、Ｔ、　Ｎ、　Ｍ、含有率が２３％の豚の離乳用の餌５〜１０ｋｇに、餌 １ｇ当たり１２ＯＡ、　Ｕ、の割合で錯体を添加することにより、毎日の平均体 重増加が１８８ｇから２１６ｇにすなわち１５％増加し、消費係数が１．８３か ら１．５９にすなわち１５％減少した。

子豚の場合よりも、若いウサギや反別類（子やぎ、子羊、子牛）において錯体の 作用をさらに大きくすることができる。これらの動物の場合には、錯体を用いる と、毎日の平均体重の増分を４０％（子ウサギは離乳期間５週間後の週において ３３ｇから４７ｇに、また子牛は離乳期間２ケ月後の月において５２３ｇから７ ９７ｇに）増加させることができる。

使用可能な限界量の指定 大きな向上を規則的にもたらすためには、錯体は比較的狭い範囲の割合、すなわ ち、餌１ｇ当たり４０〜１６０Ａ、Ｕ、の範囲内で用いるべきであることがわか った。

授乳期の雌豚に餌を与える場合には、餌１ｇ当たり１２０Ａ、　１１゜の割合で 錯体を用いると離乳期間２１日目の子豚の体重は２５％増加する。これが、２０ ＯＡ、　Ｕ、　／　ｇの割合であると、体重の増加率は４％（４７ｋｇから４９ ｋｇ、すなわち、５．６ｋｇの子豚８．４匹から６．０ｋｇの子豚８．２匹）増 加にすぎない。

子豚に餌を与える場合、錯体の使用量は１２０　Ａ、　Ｕ、　／　ｇであり、畜 産学上の向上率は１５％である。この使用量が２０ＯＡ、　１１゜７ｇであると 、畜産上の向上率は不規則となり、３週間にわたる実験の後、最高１５％に達す るが、５週間後皆無となる。

国際調査報告 にＯＪ葛Ｔ○ミＩＮＴ五でＩＡτｒＯＮＡＬ　Ｓ三λＲＣＨ北ＰＯＲτＯＮ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ストレプトマイセスフラジア株から培養により蛋白質分解錯体を製造する 方法において、無機または有機酸の溶液の添加により培地のｐＨを７．５〜７． ０に維持し、清澄剤の存在下で濾過し、次いで２，０００〜１２，０００の分子 量に対応するカット閾値を有する膜上で限外濾過した後、さらにアトミゼーショ ンにより上記蛋白質分解錯体の抽出を行うことを特徴とする方法。
2. （２）上記ストレプトマイセスフラジア株が、ＡＴＣＣに第１０，７４５号で寄 託されているワクスマン（ＷＡＫＳＭＡＮ）株３５３５であることを特徴とする 請求項１記載の方法。
3. （３）３Ｎ塩酸溶液を添加することにより上記培地のｐＨを調節することを特徴 とする請求項１記載の方法。
4. （４）上記限外濾過膜がミリポール（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）社より市販されてい る、商品名Ｐ．Ｔ．Ｇ．Ｃ．のポリスルホン膜であることを特徴とする請求項１ 記載の方法。
5. （５）請求項１記載のストレプトマイセスフラジアから得られる蛋白質分解錯体 。
6. （６）少なくとも２，０００アンソン単位／ｍｇの滴定量を有することを特徴と する請求項５記載の蛋白質分解錯体。
7. （７）タイプＩａ、Ｉｂのプロテアーゼおよびペプチダーゼを除くタイプＩＩ、 ＩＩＩ、ＩＶのプロテアーゼから成り、タイプＩＩのプロテアーゼが蛋白質分解 活性全体の４０％以上を与え、タイプＩＩＩまたはＩＶのプロテアーゼが、それ ぞれ蛋白質分解活性全体の３０％以下を与えることを特徴とする請求項５または ６記載の蛋白質分解錯体。
8. （８）動物の餌を改良するための請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質分 解錯体の応用。
9. （９）請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質分解錯体の量が、餌１ｇ当た り４０〜１６０アンソン単位の蛋白質分解活性に対応することを特徴とする動物 用の混合餌。
10. （１０）請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質分解錯体の量が、餌１ｇ当 たり４０〜１６０アンソン単位の蛋白質分解活性に対応することを特徴とする若 い哺乳動物用の混合餌。
11. （１１）請求項５〜７のいずれか一項に記載の蛋白質分解錯体の量が、餌１ｇ当 たり４０〜１６０アンソン単位の蛋白質分解活性に対応することを特徴とする妊 娠または授乳期にある雌用の混合餌。
12. （１２）Ｔ．Ｎ．Ｍ．含有率が少なくとも１６％以上であり、請求項５〜７のい ずれか一項に記載の蛋白質分解錯体の量が、餌１ｇ当たり４０〜１６０アンソン 単位の蛋白質分解活性に対応することを特徴とする妊娠または授乳期にある雌ウ サギまたは雌豚用の混合餌。
13. （１３）Ｔ．Ｎ．Ｍ．含有率が少なくとも２０％以上であり、請求項５〜７のい ずれか一項に記載の蛋白質分解錯体の量が、餌１ｇ当たり４０〜１６０アンソン 単位の蛋白質分解活性に対応することを特徴とする離乳期または離乳後の子豚用 の混合餌。