JPH02500082A - 遺伝子操作された生物による生物粘着物質前駆体タンパク質類似体の生産 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子操作された生物による生物粘着物質前駆体タンパク質類似体の生産 ｌユニ１１ １豆二豆１ この発明は、湿潤環境下において物質を結合するために採用することができる生 物粘着物質の生産に関する。典型的には、この発明の生物粘着物質は、海洋性粘 着物質（ｍａｒｉｎｅ　ａｄｈｅｓｉｖｅｓ）　、生物医療的粘着物質、又は歯 科粘着物質として用いられる。この発明はまた、化学的又は酵素的処理によって 生物粘着物質に転化することができる。生物粘着前駆体の微生物による生産に関 する。 １景　休゛の簡単な脱臼 粘着物質の性質は一般的に、それらが用いられる特定の環境の要求に応じるよう に変化することができなければならない、理想的には、粘着物質は硬化（ｃｕｒ ｅ）されることができ、その接着性及び粘着性を使用条件下において維持できる べきである。硬化は、化学的又は酵素的手段によって粘着物質の物理的性質を変 化させることである。ここに記載する操作によって生産される生物粘着物質の場 合には、硬化は、触媒的及び／又は化学的試薬による、隣接する硬化していない 粘着物質分子間の架橋により起こり易い、硬化はまた、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔ ｅｌ　との粘着的架橋をも包含する。 乾燥条件下で優れた粘着性を発揮する多くの粘着物質は、湿潤環境下ではその粘 着力を太き（減じ又は完全に喪失する。さらに、従来技術の粘着物質は、湿ｆＩ ｌ環境下では硬化することができない、従って、海洋で用いられる粘着物質や医 療又は歯科的分野で用いられる粘着物質のような、粘着物質を開発することは特 に困難であった。 海生ムラサキガイ及び他の定着性態を椎動物は、それによってそれら自身が水中 の目的物に固定される粘着物質を分泌する能力を有する０例えば、ミチラス（■ ｔｉｌｕｓ）　ｔ：に属するムラサキガイ、例えばミチラス・エデュリス（虹田 ｊｅ　ｄ　ｕ　１　ｉ　ｓ　ｌ及びミチラス・カリフォルニアヌス（肛出三ｃａ Ｈｆｏｒｎｉａｎｕｓ）は、足から粘着物質を沈着し、この粘着物質は硬化され 、基体に永久的に付着する。ミチラス・エデュリスにより被着される粘着物質の 主成分は約１３０．０００ダルトンの水酸化タンパク質であることが同定されて いる（ウェイト・Ｊ、Ｈ，Ｊ。 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５８：２９１１−２９１５　（１９８３）　、こ の物質は湿潤環境下で用いられる優れた粘着物質を与えるかもしれないが、商業 的にムラサキガイから未硬化の粘着物質を単離することは現実的ではない、なぜ なら、１　ｋｇの粘着物質を抽出することは５百万ないし１子方個のムラサキガ イな必要とする、労力のかかる工程であるからである。 ミチラス・エデュリスの生物粘着タンパク質の生、化学的分析の結果、それはリ ジン（１００残基中２０）及び水酸化アミノ７１（１００残基中６０）に冨むこ とが示された（ウェイト、Ｊ、　Ｈ，上掲）、水酸化残基の少なくとも一部は、 翻訳後にチロシン又はプロリンがそれぞれ水酸化されることによって形成される ３、４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）及びヒドロキシプロリンで ある。 翻訳後の水酸化、特にチロシン残基の水酸化はタンパク質の粘着性を規定する上 で重要であると信じられている（ウェイト、Ｊ、　Ｈ，、Ｉｎ　Ｍｏ１ｌｕｓｃ ａ、　ｖｏｌ、　１．　ｐｐ、　４６７−５０４　ｆ１９８３）：　ビジ、Ａ９ ．ら、　Ｉｎｄ、　Ｅｎｇ、　Ｃｈｅｗ、　Ｐｒｏｄ。 Ｒｅｓ、　Ｄｅｗ、、　２１：　３０９−３６９　ｆ１９８２１及びウェイタ、 Ｗ、　Ｃ，。 「粘着物質の粘着及び製剤Ｊ　Ａｐｐｌｉｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈ 、　Ｌｔｄ、英国・パーキング、（１９８２）。 米国特許第４．５８５．５８５号は、単離されたムラサキガイ粘着タンパク質の 酵素的消化によって生産されたデカペプチド単位を化学的に結合することによっ て生物粘着ポリマーを調製する方法を記載している。この特許の開示に従うと、 生物粘着クンバク質は先ず、ウェイトとクンザーによって、サイエンス、２１２ ：　１０３８１１９８１１に記載されたクンバク質精製方法を用いてミチラス属 に属するムラサキガイのフェノール腺から単離される。単離される分子量１２０ ．０００ないし１４０．０００ダルトンの生物粘着物質は先ずコラゲナーゼで処 理され、その分子量が約１０．０００ダルトンに減少する。処理されたクンバク 質は次にトリプシンで消化され、消化されたタンパク質はゲルろ過透析にかけら れて以下の式で示されるデカペプチドが単離される。 ＮＨ！−Ａｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−３ｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｙｒ／Ｄｏｐ ａ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−３ｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｙｒ／Ｄｏｐａ−Ｌ ｙｓ−ＣＯＯＨこのようにして生産されたデカペプチドは、次に、クルクルアル デヒド、オリゴペプチド、アミノ酸又は他の二官能性結合基のような化学的結合 基を用いることによって重合され、このようなデカペプチド単位を約１０００含 む生物粘着物質が生産される。 米国特許第４．５８５．５８５号の方法ではさらに、ムラサキガイからの生物粘 着タンパク質の単離が要求され、これは、上述したように商業規模で行なうのに 実際的ではない、さらに、労力のかかる精製操作に加え、この方法では酵素的消 化、デカペプチド断片の単離及び断片の生物粘着ポリマーへの化学的再構築工程 がさらに必要である。この困難な方法は商業規模の生産には適さない、さらに、 本出願人の出願にかかる。　１９８６年１１月２４日に出願された米国特許出願 筒９３３．９４５号は、ミチラス・エデュリスからのムラサキガイ粘着物質中に は、クレームされた配列の他に、有意な配列が存在することを示している。記載 された繰り返しデカペプチドは明瞭に存在するけれども、ミチラス・エデュリス からの粘着タンパク質はこのデカペプチドだけではな（、他の関連繰り返しペプ チド配列をも含むことが知られている（ウェイト、Ｊ、　Ｈ，ら、Ｂｉｏ　Ｃｈ ｅｗ、　２４：　５０１０−５０１４　ｆ１９８５）及び米国特許出願筒９３３ ．９４５号）、全ての種々の繰り返しペプチド配列は高濃度のＤＯＰＡ及びヒド ロキシプロリンにより特徴づけられる。 従って、ムラサキガイ足生物粘着物質に伴う湿潤環境下での優れた性質を有する 生物粘着物質の効率的生産手段及び方法が存在する必要性が持続している。 さらに、ムラサキガイ足生物粘着物質に伴う湿潤環境下での優れた性質を有する 生物粘着物質を、大量のムラサキガイを処理する必要なく生産する手段及び方法 が存在する必要性が持続している。 ｌユニ嵐１ この発明は、組換えＤＮＡ技術を用い、海生熱を推動物によって生産される非水 酸化ポリフェノール性粘着タンパク質に類似した生物粘着物質前駆体タンパク質 の生産に関する。この発明は、生物粘着物質前駆体タンパク質類似体をコードす るＤＮＡ配列、該配列を含むベクター、該ベクターにより形質転換された宿主、 生物粘着物質前駆体タンパク質、水酸化生物粘着タンパク質並びに前駆体クンバ ク質を生産する方法、水酸化タンパク質を生産する方法、粘着物質を生産する方 法及び粘着物質を使用する方法を包含する。 この発明の方法により生産される生物粘着物質前駆体タンパク質は、約２０％な いし４０％のプロリン残基と、約１０％ないし４０％のりジン残基と、約１０％ ないし４０％のチロシン残基と、０％ないし約４０％の、プロリイン、リジン及 びチロシン以外のアミノ酸を含む、約５０ないし約１５００のアミノ酸残基配列 を含む、好ましくは、この発明の生物粘着物質前駆体タンパク質は繰り返しポリ ペプチド配列を含む１個々のポリペプチドは約２０％ないし４０％のプロリン残 基と、１０％〜４０％のりジン残基と、１０〜４０％のチロシン残基と、０〜４ ０％の他のアミノ酸残基を含む、任意的に、ポリペプチド結合基が全体にわたっ て分散している。 この発明の方法により生産されるタンパク質は生物粘着物質前駆体として用いる ことができる。タンパク質の粘着性はチロシン残基の少なくとも一部を化学的又 は酵素的手段によって３．４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）に水 酸化により転化し、また、任意的に、プロリン残基の少なくとも一部を３−又は ４−ヒドロキシプロリンに水酸化により転化することによって高められる。１つ の実施例では、水酸化生物粘着物質前駆体は、ムラサキガイ、ミチラス・エデュ リスのフェノール腺から単離された粘着タンパク質（ウェイト、Ｊ、　Ｈ，、Ｊ 、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｗ、、　２５８：　２９１１−２９１５　（１９８３１に類似している。 生物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、所望のタンパク質をコードする化学的 に合成された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡｌを含む複製可能な発現ベクターを、大 腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓ。 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌ　、枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｕｓｌ、アスパラギル ス・ニガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒｌ　、ビー・バストルス（Ｒ６ｐａｓｔｏｒｕｓ ）のような適当な宿主に挿入し、宿主内の合成二本鎖ＤＮＡ配列を発現させてタ ンパク質を生産させることにより生産される。この発明の生物粘着物質前駆体タ ンパク質をコードする合成二本鎖ＤＮＡ配列は、用いられる特定の宿主内で発現 を最適化し、遺伝情報の適切な複製を与えるように選択される。 生物粘着物質前駆体タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、宿主プロモー ターにおいて開始される転写を容易にするために、その５゛末端を宿主クンバク 質のＮ末端部分をコードする配列に結合することができる。このような場合には 、発現されたタンパク質は生物粘着物質前駆体タンパク質と宿主タンパク質断片 との融合物を構成する。宿主タンパク質断片は、サツカロミセス・セレビシアエ のような宿主の場合には、細胞膜を介して外界に発現物質を分泌することを容易 にするシグナルペプチドを包含することができる。なお、シグナルペプチドは分 泌後切断される。生物粘着物質前駆体タンパク質をコードする配列と宿主タンパ ク質断片をコードする配列との間に、化学的又は酵素的方法によって切断される アミノ酸配列をコードする二本鎖ＤＮＡ配列を挿入することにより、生物粘着物 質前駆体タンパク質を宿主タンパク質断片から分離するための手段が与えられる 。 ２１日とｌ！」ｄｌ酉 第１図は、　ＯＬ／Ｐ、プロモーターを含み、茸Ｂ−キモシン融合クンバク質を コードする、大腸菌プラスミドｐＧＸ２２８７　（７）遺伝子地図、 第２図は生物粘着物質前駆体タンパク質類似体をコードする繰り返しＤＮＡ配列 の組み立てを示すフローチャート、 第３図は、ハイブリッドＧＡＬＩ／ＭＦ−ａ　１プロモーターと、　ＰＨ０５シ グナルコ一ド配列と、ＧＡＰＩＩＨ転写ターミネークーと、選択マーカーと、複 製開始点を含む、サツカロミセス・セレビシアエ及び大腸菌のためのプラスミド ＹｐＧＸ２６５ＧＡＬ４　（７）遺伝子地図、第４図は、トリプトファンシンセ ターゼオペロンの迫Ｂ及びｍＡ領領域ｔａｅプロモーターを含む大腸菌プラスミ ドｐＧＸ２２１３の遺伝子地図、 第５図は、サツカロミセス・セレビシアエー大腸菌シャトルベクターＹｐＧＸｌ の遺伝子地図、第６図は、フオスフォグリセレートキナーゼ遺伝子の一部を含む サツカロミセス・セレビシアエブラスミドＹｐＧＸ６０の遺伝子地図、 第７図は、生物粘着物質前駆体タンパク質類似体を大腸菌プラスミドｐＧＸ２２ ８７に挿入してトリブリッドｆｔｒｉｂｒｉｄｌ融合タンパク質をコードする配 列を生成させるための方法を示す図、 第８図は、１０の繰り返しデカペプチドをコードする、ｐＧＸ２３６５のトリブ リッド遺伝子の一部のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図、 第９図は、ｐＧＸ２３６５によってコードされる生物粘着物質前駆体タンパク質 類似体の、シアノーゲンブロミド切断後のアミノ酸配列を示す図、 第１０図は大腸菌中で産生された数種の生物粘着物質前駆体タンパク質類似体の ウェスタンプロット分析の結果を示す図、 第１１図は、サツカロミセス・セレビシアエＭＦ−α１プロモーターを含む、Ｍ １３系ベクターであるＭＧＸ４３６ノ遺伝子地図、 第１２図は、サツカロミセス・セレビシアエ中で産生された数種の生物粘着物質 前駆体タンパク質類似体の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果 を示す図、 第１３図は、ミチラス・エデュリスの生物粘着物質前駆体タンパク質をコードす るｃＤＮＡクローン１４−１と同定された遺伝子のＤＮＡ配列及び翻訳されたア ミノ酸配列を示す図、 第１４図は、ミチラス・エデュリスの生物粘着物質前駆体タンパク質をコードす るｃＤＮＡクローン５２と同定された遺伝子のＤＮＡ配列及び翻訳されたアミノ 酸配列を示す図、 第１５図は、ミチラス・エデュリスの生物粘着物質前駆体タンパク質をコードす るｃＤＮＡクローン５５と同定された遺伝子のＤＮＡ配列及び翻訳されたアミノ 酸配列を示す図、 第１６図は、ミチラス・エデュリスの生物粘着物質前駆体タンパク質をコードす るｃＤＮＡクローン５６と同定された遺伝子のＤＮＡ配列及び翻訳されたアミノ 酸配列を示す図、 第１７図は、実施例７のプラスミドｐＧＸ２３８５の生物粘着物質前駆体タンパ ク質類似体遺伝子のＤＮＡ配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列を示 す図、第１８図は、実施例７のプラスミドｐＧＸ２３８６の生物粘着物質前駆体 タンパク質類似体遺伝子のＤＮＡ配列及びそれによってコードされるアミノ酸配 列を示す図、第１９図は、実施例７のプラスミドｐＧＸ２３９３の生物粘着物質 前駆体タンパク質類似体遺伝子のＤＮＡ配列及びそれによってコードされるアミ ノ酸配列を示す図である。 及！目と７５１８　ｆｔ　’１朋 この発明の方法によって生産される生物粘着物質前駆体タンパク質は繰返しポリ ペプチド、好ましくは繰返しデカペプチド又はヘキサペプチドに配置された、約 ５０ないし約１５００、好ましくは約６００ないし約９００アミノ酸残基を有す る。このタンパク質、そして好ましくはそれぞれのポリペプチドは、約２０％な いし約４０％のプロリン残基を有する。現在の化学文献によると、プロリン残基 は生物粘着物質に可撓性を与え、分子を非球状に変える。このため、生物粘着物 質は基体の表面に適合し、他の粘着物質分子と相互作用する。このタンパク質、 そして好ましくは個々のポリペプチドはまた。約１０％ないし約４０％のりジン 残基を有する。リジン残基は生物粘着物質を塩基性に変え、それによって、一般 的に薄い酸性の生物材料の膜で覆われた、水面下の表面に結合することを助ける 。リジン残基はまた、硬化工程も提供する。このタンパク質及び好ましくは個々 のポリペプチドはまた。約１０％ないし約４０％のチロシン残基を有する。フェ ノール性のチロシン残基は、生物粘着物質に水素結合能力を与える。さらに、プ ロリン及びチロシン残基の両方は水酸化のための部位を与える。チロシンに水酸 基を与えてＤＯＰＡを提供することは、水分子を基体の表面から強力に排除する ことを可能にするものと信じられる。プロリン、リジン及びチロシン残基に加え 、このタンパク質、好ましくは個々のポリペプチドは約Ｏ％ないし約４０％の他 のアミノ酸残基を含む、好ましくは、これらの残基は、もし存在するならば、例 えばアラニンのような非反応性脂肪族側鎖を有するもの並びにセリン及びスレオ ニンのような水酸基含有アミノ酸である。これらの残基は好ましくは、それぞれ のポリペプチド配列に約４個を超える数存在することがないように分散される。 好ましくないアミノ酸は酸性アミノ酸、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸 及びシスティンのようなアミノ酸である。 生物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、タンパク質をコードする合成二本鎖Ｄ ＮＡを、コードされたタンパク質の適当な宿主細胞内での発現を司ることができ る調節配列と機能的に連結するように、複製可能な発現ベクターに挿入すること により生産することができる。このような宿主細胞、例えば大腸菌やサツカロミ セス・セレビシアエはこの発現ベクターで形質転換し、生育することができ、タ ンパク質が発現する環境下に置かれる。 この発明の目的にとって、「組換え体クンバク質」という語は、複製可能な組換 え発現ベクターで形質転換された宿主によって生産されるタンパク質を意味する ・生物粘着物質前駆体クンバク質をコードする二本鎖ＤＮＡ配列は、公知のＤＮ Ａ合成方法のいずれによっても調製することができる。二本鎖ＤＮＡ配列を合成 するため１つの適当な方法はフォスファイト固相法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　 Ｌｅｔｔｅｒｓ、　２１ニア１９−７２２　（１９８０））である。 この二本鎖ＤＮＡは、それが繰返し構造を有する天然の粘着タンパク質の類似体 であるタンパク質をコードするという事実によって特徴づけられる。「類似体」 という語は、厳密なアミノ酸配列が天然のタンパク質とは異なるが、繰返し構造 を有する、翻訳前に修飾される天然の粘着タンパク質に一般的なポリペプチド繰 返し単位を包含することを意図する。「生物粘着物質前駆体タンパク質類似体」 という語は、翻訳後の水酸化に先立つ天然のタンパク質粘着物質中に見出される のと同じか又は類似した繰返しポリペプチド単位を含む、遺伝子操作された微生 物中で産生されるタンパク質を意図する。特定のポリペプチド類似体及びこれら の類似体をコードするＤＮＡ配列は第８図、第１７図、第１８図及び第１９図に 示されている。 以下の記載は、ミチラス・エデュラスクンバク質の生物粘着物質前駆体タンパク 質類似体について詳細に行なうが、本発明は、繰返しポリペプチド構造を有する 全てのあらゆる天然のタンパク質粘着物質を包含する０例えば、ここに記載する 技術は、海生無を推動物からの他のタンパク質粘着物質のための類似体前駆体及 び水酸化誘導体を開発するのに有用である。さらに、当業者によって理解される ように、本発明はまた、生物粘着物質前駆体タンパク質類自体誘導体をも包含す る。「生物粘着物質前駆体タンパク質類似体誘導体」という語は、生物粘着物質 前駆体タンパク質類似体とは１又は２以上のアミノ酸が異なるが、それでもその 基本的な性質を維持しているポリペプチドを意味する。 単一のデカペプチドの繰返しを含む生物粘着物質前駆体タンパク質類似体をコー ドする二本鎖ＤＮＡ配列を合成し、クローニングし５発現する２つの基本的な方 法を検討した。実施例１及び２に記載した第１の方法は、以下の工程を含む。 （ａ）１つのデカペプチド繰返しをコードするオリゴヌクレオチドを合成する。 Ｔｂ）オリゴヌクレオチドを連結してデカペプチド連結体をコードする配列を構 築する。 （Ｃ）大腸菌クローニングベクター中で該連結体コード配列をクローニングする 。この場合、好ましくはクローニングされたオリゴヌクレオチドをベクターに挿 入することを容易にする特に設計されたリンカ−を用いる。 （ｄ）最長のクローニングされた配列を大腸菌及びサツカロミセス・セレビシア エ発現ベクターに移してこれらの微生物宿主中で配列が融合タンパク質として発 現されるようにする。 この方法は、ポリペプチド（ａｌａ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｐｒｏ −ｐｒｏ−ｔｈｒ−ｔｙｒ−１ｙｓ）、ｌ（ただし、Ｎはこのデカペプチド配列 の直接的繰返しの数を示す）を構築するのに用いた。このデカペプチドはミチラ ス・エデュリスのポリフェノール性粘着タンパク質の成分であり、天然タンパク 質のトリプシン消化物中に同定されている（米国特許第４．５８５．５８５号） 、この方法はまた、他のポリペプチドの繰返しをコードする合成りＮＡ配列を構 築するためにも用いることができる。 発明者らは、例えばｌＯコドンの繰返しを２０個含む、クローニングされた結合 体コード配列は、大腸菌中で不安定ではないかと予想した。大腸菌プラスミド中 での直接的ＤＮＡ繰返し数を限定するために、異なるコドンの組合わせを用いて ５つの異なるオリゴヌクレオチドを合成した。しかしながら、デカペプチドをコ ードする１つの特定のオリゴヌクレオチド（ＧＣＧ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＡＧＴＴ ＡＣＣＣＡ　ＣＣＧ　ＡＣＣＴＡＣＡＡＡ）は結合体コード配列で最も効率的な 構築物であり、得られた繰返しＤＮＡ配列は大腸菌中で安定であることがわかっ た。 サツカロミセス・セレビシアエ中でクローニングするために、実施例２に示した 配列を有し、酵母中で効率的に翻訳される遺伝子中に主として見出されるコドン な含む１つのオリゴヌクレオチドを合成した。 この方法により得られたクローンのＤＮＡ配列決定及び／又は制限酵素分析によ り、大腸国中では９個以下のデカペプチド繰返しをコードする断片が、サツカロ ミセス・セレビシアエ中では３個以下のデカペプチド繰返しを含む断片がクロー ニングされていたことがわかった。しかしながら、多くのクローンはＤＮＡ配列 中に、間違ったコドン、フレームシフト又はターミネーションコドンをもたらす エラーを含んでいることがわかった。 従って、均一な２０個のデカペプチド繰返し体をコードする配列を生成させる改 良された方法が開発された。 実施例４に示した第２の方法は以下の工程を含む。 （ａ）１つのデカペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成する。 （ｂｌ　オリゴヌクレオチドを連結してデカペプチド結合体コード配列を構築す る。 （Ｃ）オリゴヌクレオチドの挿入を容易にし、クローニングされる配列の末端に 固有の制限部位を与える特に設計された５゛及び３°　リンカ−を用いて大腸菌 発現ベクター中で結合体コード配列をクローニングする。 ｆｄ）クローニングされたデカペプチドコード配列繰返し体を、５゛末端及び３ °末端における固有の制限部位を用いて大腸菌発現ベクター中で拡張（ｅｘｐａ ｎｄｌ　する（繰返しデカペプチドコード配列はまた、サツカロミセス。 セレビシアエ中でタンパク質を生産するためにサツカロミセス・セレビシアエ発 現ベクター中に移すこともできる。 発現ベクターはプラスミド及びファージから選択することができるが、プラスミ ドが一般的に好ましい０発現を容易にするために、タンパク質をコードする合成 二本鎖ＤＮＡはその５°末端を、採用する特定の調節配列の制御下にある微生物 性タンパク質のＮ末端部分をコードする配列に結合することができる。サツカロ ミセス・セレビシアエ中で発現するために、生物粘着物質前駆体タンパク質類似 体をコードする配列の前の５°末端はまた、生物粘着タンパク質前駆体類似体の 分泌を可能にする、通常分泌されるタンパク質のためのシグナルペプチドをコー ドするものであることができる。 大腸菌中でのホモロガス組換えによって引き起こされる配列欠失の問題を少なく するために、ｒｅｃＡ大腸菌宿主ＧＸ３０１５を用いた０合成りＮＡは、ウシキ モシンの生産のために以前に開発された発現ベクター（本出願人による米国特許 出願筒６７１．９６７号に完全に記載し、米国イリノイ州ぺオリアＮＲＲＬに寄 託され、その寄託番号はＮＲＲＬ−Ｂ１５７８８１　（ＩＩ）誘導体（ｐＧＸ２ ２８７　、第１図参照）中で、トリブリッド融合遺伝子が生成されるように直接 的にクローニングした。遺伝子は、効率的な翻訳開始をプロモートする高発現迫 Ｂ遺伝子の５°領域を含み、合成生物粘着物質前駆体タンパク質類似体遺伝子が それに続き、さらにウシキモシンのカルボキシ末端の１５９アミノ酸をコードす る３°領域がそれに続（、シアノーゲンプロミドによる切断を用いてトリブリッ ド融合タンパク質から生物粘着物質前駆体タンパク質類似体を放出することがで きるように、生物粘着物質前駆体タンパク質領域の両末端にメチオニンコドンが 位置する。さらに、プラスミドは、ｍＲＮＡを安定化するための遺伝子の３°で ある合成」を配列と、トリプトファンを含まない培地が用いられた時にＧＸ３０ １５　デルタ江ｌＤ　１０２宿主中で効率的にプラスミドを安定化するｍＥＤ遺 伝子を含む、プロモーターは、ＧＸ３０１５宿土中の欠陥的ラムダライソーゲン （ｌｙｓｏｇｅｎｌによって生産される温度感受性ｃ１８５７リブレツサーによ って調節されるハイブリッドラムグＯＬ／ＰＬプロモーター（本出願人による米 国特許第５３４．９８２号に完全に記載）である、生物粘着物質前駆体タンパク 質類似体を発現するためのベクターの構築に関する他の事項は、ここに記載した 内容から当業者にとって明らかである。もっとも、一般的な規則として、生物粘 着物質前駆体タンパク質コード領域を、効率的なプロモーターの制御下にある他 の遺伝子とのフレームを合わせた融合物として挿入することが有利である。好ま しくは、融合物は、コードされた融合タンパク質が生物粘着物質前駆体タンパク 質領域の５°末端にメチオニン残基を含むようにコードされる０回収された生物 粘着物質類似体タンパク質は従って、周知の条件を用いてシアノーゲンプロミド で処理することによって余剰のアミノ酸を除去することができる。当業者に知ら れているように、シアノーゲンブロミドはメチオニン残基においてタンパク質を 切断する。生物粘着物質前駆体タンパク質自身の内部にはメチオニン残基が存在 しないので、このタンパク質は損なわれずに残る。 デカペプチドａｌａ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｔｈ ｒ−ｔｙｒ−１ｙｓの繰返しをコードするＤＮＡ配列を構築するために、デカペ プチド配列並びに固有の制限部位を与える５°及び３°　リンカ−配列をコード するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリン グにより大腸菌発現ベクターに連結して、３つのデカペプチドコード繰返しを含 むｐＧＸ２３４Ｂを作製した。 ５゛　リンカ−はＮｏｔＩ部位を、３°　リンカ−は−１部位を与える。　Ｎｏ ｔＩ消化及びＤＮＡポリメラーゼＩで一本鎖部分を充填することによって作製さ れたｐＧＸ２３４６デカペプチドコード配列の５°末端を、ｐＧＸ２３４６の一 ■処理により作製されたデカペプチドコード配列の平滑３°末端に連結した（第 ２図参照）、これにより、ｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌａをコードするリンカ−領域を 介したフレームが合致した（インフレーム）融合物が創製される。５°、３°及 び内部リンカ−の全ては、元のデカペプチド中に見出されるａｌａ、　ｔｈｒ、 　ｐｒｏ、　ｓｅｒのアミノ酸をコードするので、これにより翻訳産物の一般的 な性質が破壊されることはない、　ＮｏｔＩ及びＮａｅＩ部位は、これらがプラ スミド中で唯一の制限部位であり、従って、ライゲーションにより合成遺伝子の 長さを増す操作を単純化できるので採用した。 例えば、５つのデカペプチド繰返し体遺伝子（ｐＧＸ２３４８１を２つ結合して ｌＯの繰返し体遺伝子（ｐＧＸ２３５４１にする操作は、ｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌ ａリンカ−を用いて単にＮｏｔＩ／ＤＮＡポリメラーゼエで処理したｐＧＸ２３ ４８　ＤＮＡと、■がで消化しりｐＧＸ２３４８　ＤＮＡとを単に連結し、次イ テＰｖｕＩ　（ｐＧＸ２３４８の当遺伝子中の部位）で消化し、プラスミドの再 環化に適当な低ＤＮＡ濃度で再び連結することにより行なうことができる。　Ｎ ｏｔＩ／ＤＮＡポリメラーゼ■処理プラスミドＤＮＡを、ＮａｅＩで切断された プラスミドの他の試料に連結することによって繰返し単位数を増やす方法を採用 することにより、１５個の繰返し単位（ｐＧＸ２３５８）及び２０個の繰返し単 位（ｐＧＸ２３６５）をコードする合成遺伝子もまた構築された。プラスミドｐ ＧＸ２３４８　、　ｐＧＸ２３５４、ｐＧＸ２３５８及びｐＧＸ２３６５によっ てコードされる生物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、下記配列のＣ末端及び Ｎ末端に他のアミノ酸が結合したものである。 （（ａｌａ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−ｔｙ ｒ−１ｙｓ）　５−ｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌａ］　ｎ ミチラス・エデュリスのポリフェノール性粘着タンパク質中にはデカペプチドａ ｌａ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−ｔｈｒ−ｔｙｒ−１ ｙｓが何回も繰返されるが、このタンパク質の部分をコードするｃＤＮＡを調べ ることによって（米国特許出願第９３３．９４５号参照）、このタンパク質中に は多くの他の繰返しデカペプチド及びヘキサペプチド配列が存在し、これらの他 の配列がミチラス・エデュリスのポリフェノール性粘着タンパク質の主たるアミ ノ酸配列を構成しているかもしれないことがわかった０例えば、ｃＤＮＡクロー ン１４−１中では、１９個のデカペプチド及び１個のへキサペプチドがコードさ れている（第１３図）。 ウェイトによって観察されたデカペプチドはこの配列中にコードされているが１ 、他の多くのデカペプチドもまたコードされている。天然タンパク質配列のこの 異質性は、天然のポリフェノール性タンパク質に関連するが、あるデカペプチド 及びヘキサペプチドの頻度並びにタンパク質の分子量において異なる一部の生物 粘着物質前駆体タンパク質類似体を生産し得ることを示している。このことによ り、特定の用途に用いる新規な粘着タンパク質を特に設計することが可能になる かもしれない、従って、他の実施例では、数種の異なるデカペプチド及びヘキサ ペプチド配列並びに種々の分子量を有する生物粘着構築するために、上述の一般 的方法を用いた（実施例７参照）。 発現ベクターが生物粘着物質前駆体タンパク質類似体をコードする領域又はその 断片をコードする領域全体を担持することができるようにベクター構築を修飾す ることができることは明らかであろう、好ましくは、断片は断片は、生物粘着物 質前駆体タンパク質類似体に対応する少な（とも１００アミノ酸をコードするの に十分な配列を含む。 生物粘着物質前駆体タンパク質をコードする、挿入された二本鎖ＤＮＡを含む発 現ベクターが、公知のトランスフォーメーション技術によって宿主をトランスフ オームするために用いられる。この発明によって提供される発現ベクターは、あ らゆる適当な宿主微生物を、公知の方法を用いてトランスフオームしてトランス フォーマントを作製するのに用いられる。適当な宿主は、例えば、大腸菌並びに サルモネラ、クレブシラ。 アーウィニア［Ｅｒｗｉｎｉａｌ等の他の関連するグラム陰性微生物を包含する 。 他の実施例では、生物粘着物質前駆体タンパク質をコードする構築されたＤＮＡ 配列は、サツカロミセス・セレビシアエのような酵母中で機能する発現ベクター 中に挿入される。この型の典型的なベクターは、本出願人による、１９８６年１ ０月１４日に出願された、「複合酵母ベクター」という名称の米国特許第９１８ ．１４７号に開示されている。酵母中で生物粘着物質前駆体タンパク質を発現す るのに好ましい１つのベクターは、酵母シャトルベクターＹｐＧＸ２６５ＧＡＬ ４　（ＡＴＣＣ＃６７２３３１　（第３図）　であ６゜このベクターは、サツカ ロミセスにセレビシアエＧＡＬＬブロモークーとＭＰ−αｌ　（α因子）ブロモ −クーとから誘導されたハイブリッドプロモーターによって特徴づけられる。調 節遺伝子は、ＧＡＬＩ−ＭＰ−α１ハイブリツドプロモーターのポジティブレギ ュレーターであるＧＡＬ４タンパ’）　’Ｊｉ　ヲコ−Ｆ　ｔ　６　ＧＡＬ４遺 伝子を含む、　ＹｐＧＸ２６５ＧＡＬ４　ヘクター系中のクーミネーターは合成 りＮＡから誘導され、サツカロミセスにセレビシアエＧＡＰＤＨ転写ターミネー タ−に基づく０合成りＮＡから誘導されたシグナルコード配列はサツカロミセス ・セレビシアエＰＨ０５シグナルに基づく、コドンは、サツカロミセス・セレピ シアエ中で優先的に用いられるものから実質的に設計される。 ＹｐＧＸ２６５ＧＡＬ４ベクターは、サツカロミセス・セレビシアエ中でのプラ スミド選択のためのマーカーであるＬＥＵ２遺伝子を含む、これはまた、サツカ ロミセス・セレビシアエのためのプラスミド複製開始点を与える、サツカロミセ ス・セレビシアエ２ミクロンプラスミドから誘導されたＤＮＡを含む、このベク ターはさらに、ｐＪＢＤ２０７から誘導された大腸菌複製開始点及び、ｐＪＢ０ ２０７から誘導された、アンピシリン耐性である大腸菌選択マーカーによって特 徴づけられる。 典型的なベクター構築において、ＧＡＬＬ／ＭＦ−αｆハイブリッドプロモータ ー及びＰＨ０５シグナルコ一ド配列を含む酵母発現モジュールが、ＨｉｎｄＩＩ Ｉ及びＢａｍＨＩで消化することによって単一の制限断片として切り出され、こ の断片はＨｉ　ｎ　ｄ　［１及びＢａｍＨＩで消化された旧３ｍｐ９に連結され る。生物粘着物質前駆体タンパク質コード配列は、制限酵素消化によってｐＧＸ ２３６５のような大腸菌発現ベクターから切り出され、酵母シグナルと生物粘着 物質前駆体タンパク質コード配列との間でフレームが合致した融合が起きるよう に、酵母発現モジュールを担持するＭ１３ベクター中に位置付けられる。所望の 誘導コード配列の作製は、オリゴヌクレオチドリンカー及び／又はオリゴヌクレ オチドに誘導される突然変異の利用を包含する。酵母発現モジュール融合タンパ ク質コード配列は次いでＭ１３系ベクターから切り出され、酵母グリセロアルデ ヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ転写ターミネークーが融合タンパク 質コード領域の末端から下流に位置するように酵母発現ベクターＹｐＧＸ２６５ に挿入される。このベクターは酵母及び大腸菌の両方のための複製開始点及びプ ラスミドの維持のための選択マーカーを含む、最終段階で、酵母ＧＡＬ４遺伝子 が、Ｈｉｎｄｌｌ制限断片として発現ベクターに加えられる・ 酵母発現のための１つの典型的な構築方法を上述したが、一般的な教示の範囲内 で修飾及び変化を加えることができることは当業者に明らかである。上記したベ クターにおいて、発現ベクターは生物粘着物質前駆体タンパク質のコード領域の 全体又はその断片のコード領域をふくむことができる。 ＬＥＵ２構造遺伝子に突然変異を有するサツカロミセス属株（例えばＤＳ又はＡ Ｈ２２（ＡＴＣＣ＄１３８６２６））は、標準的方法によりこのプラスミドでト ランスフオームすることができる。得られる酵母菌株は適当な培地（０，７％酵 母窒素塩基、２％グルコース及び適当な栄養補填物を含むＹＮＢＤ）で生育して プラスミドを維持することができる。生物粘着物質前駆体クンバク質の生産のた めに、トランスフオームされた酵母菌株を適当な培地中で培養することができる 。適当な培地の１つは１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％グルコース及び１％ ガラクトースを含む。 トランスフォーマント微生物（大腸菌又は酵母）は、生育及び生物粘着物質前駆 体タンパク質類似体遺伝子の発現にとって適当な条件下で培養される。タンパク 質が発現した後、細胞の機械的又は化学的溶解のような公知の方法によりトラン スフォーマント細胞から回収される６タンパク質は、周知のクロマトグラフィー 操作を包含する、この分野において公知の方法により精製することができる。生 物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、均−又はほぼ均一になるまで精製するこ とが好ましい、融合タンパク質の場合には、回収したタンパク質はシアノーゲン ブロミド切断にかけて余剰のペプチド配列を除去することができる。 回収された生物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、水酸化によって生物粘着物 質に転化される。すなわち、海生生物の生体内で行なわれているように、チロシ ン残基の少なくとも一部を水酸化することが必要であろうし、また、任意的にプ ロリン残基の一部を水酸化することも必要であろう、水酸化により、チロシン残 基がＤＯＰＡ残基に転化され、任意的にプロリン残基がヒドロキシプロリン残基 に転化される。　ＤＯＰＡ水酸基は結合面において水を排除し、粘着物質の湿潤 下での優れた強さに寄与し、ＤＯＰＡ残基はキノンに酸化されて粘着物質を硬化 し、接着性を与える分子内架橋に関与する。 水酸化を行なうあらゆる適当な化学的又は酵素的手段を採用することができる。 もっとも、キノコのチロシナーゼ又はストレプトコッカス・アンチビオチヵスの チロシナーゼのような酵素を用いて酵素的に水酸化を行なうことが好ましい、こ れらの酵素を用いた酵素的水酸化方法は、Ｉｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　 ２２２：４０７−４１１　ｆ１９８４１並びにＭａｒｕｍｏ及びＷａｉｔｅ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　８５２：９８−１０３　（１ ９８６１に一般的に記載された方法により行なうことができる。好、ましくは、 少なくとも約１０％のチロシン残基が水酸化される。キノコのチロシナーゼは、 ＬＨ−セファデックス６０カラムに結合した後０．２Ｍ酢酸により溶離すること やメンブレンフィルターによるろ過によってクンバク質から分離することができ る。 上述の記載及び以下の実施例は、ミチラス・エデュラスの生物粘着物質前駆体タ ンパク質の類似体に基づいて記載されているが、この発明は、繰返し構造を有す るあらゆる全ての生物粘着物質前駆体タンパク質の類似体を包含することを意図 する。公知の方法を用いて生物粘着物質前駆体タンパク質を単離し配列決定を行 なうこと及び／又はこれらのタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離して配列決 定を行なうことができる。この発明の方法を用いることによって、当業者は適当 なりＮＡ配列を演鐸し、該配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、繰返 しポリペプチド配列をコードする合成遺伝子を構築し、繰返し配列を発現するこ とができる。このように、この発明は、繰返し構造を含むあらゆる全ての天然タ ンパク質粘着物質の生物粘着物質前駆体タンパク質類似体の微生物による生産を 可能にする。 この発明の方法によって生産された生物粘着物質は、従来と同様に使用すること ができ、所望ならば、接着剤において採用される従来の合成ポリマー接着剤、充 填剤、コアセルベート及び／又はアジュバントと混合することもできる。これら は湿潤環境下での働きが望まれる、例えば海で使用される接着剤、医療用接着剤 若しくは歯科用接着剤又は保護コーティングとして特に有用である。 生物粘着物質タンパク質は、後日接着剤を再構成するために凍結乾燥することが できる。これは他の接着物質を含む若しくは含まない適当な溶媒中での溶液の形 態で接着剤、シール剤又は接着剤プライマーとして用いることができる。生物粘 着物質のための適当な溶媒は、水、メタノール、プロパツール等のアルコールの 水溶液、アセトン、ＤＭＳＯ及びジメチルフォルムアミド等を包含する。１つの 実施例では、生物粘着タンパク質は溶液中に約１０ないし約５０％の濃度で存在 する。 生物粘着タンパク質の溶液はプライマーとして表面上に均一にコートすることが できる。ブライマーコーティングの硬化は、架橋によって通常の空気環境下で起 き、これは高濃度に用いた場合には茶色又は黄褐色に着色することによって示さ れる。エポキシ接着剤のような従来の接着剤がプライマーコート上に塗布され、 接着すべき表面どうしが付着される。 この発明の他の実施例では、他の粘着物質を含む溶液中に水酸化生物粘着タンパ ク質を含む接着剤組成物が提供される。この発明の生物粘着クンバク質と共に用 いられる接着剤の典型的なものとして炭水化物接着剤及びポリアクリレート、ポ リエポキシド、レゾール等のような合成樹脂接着剤を挙げることができる。採用 することができる公知の炭水化物接着剤は、キトサン、デンプン、ペクチン、グ ルカン、デキストラン等を包含する。 １つの好ましい炭水化物接着剤は、５ｋｕｊｉｎｓ、　Ｊ、Ｊ。 ら、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ｌ１１＋３５９　（１ ９６５１に記載された方法によってカニ又はエビの殻のキチンから精製されるキ トサンである。キトサンの遊離のアミノ基は酸化された生物粘着タンパク質のＤ ＯＰＡ誘導キノンと反応性を有し、２つのポリマー間に共有結合性の架橋を与え る。 適当な濃度のキトサンは高い粘度及び優れた接着強度を有する生物粘着タンパク 質混合物を与える。高い粘度は、接着剤が硬化する機会を与えられる前に拡散し てしまう水中下での使用にと手特に有用な性質である。 好ましい接着剤混合物は２％ないし３０％の水酸化生物粘着物質ポリマー及び１ ％ないし７％のキトサンを含み、残部は・溶媒である０組成物のｐｌは約５．５ から７．０である１組成物は、　ＤＯＰＡ−誘導キノンの生成及び架橋を触媒す るカテコールオキシダーゼ又はチロシナーゼを添加することによってｐ）１６． ０で硬化することができる。 この発明の他の実施例では、生物粘着タンパク質が粘着性のような他の物理的性 質を改善する他のタンパク質と混合された接着剤組成物が提供される。ムラサキ ガイ粘着クンバク質はその性質がコラーゲンと深く関連していることが見出され ており、従って、接着剤組成物にとりて好ましい組成物はコラーゲンである。好 ましい組成物は１０％ないし７０％の固形分を有する溶液である。この固形分の １％ないし５０％は生物粘着タンパク質で５０％ないし９９％はコラーゲンであ る。 この発明の生物粘着タンパク質は、例えば傷の治療における生物医療接着剤又は シール剤として特に有用である。生物粘着タンパク質は生物由来の材料であるの で、化学合成された接着剤と比較すると毒性の分解産物を生じる危険性がはるか に小さい、生物粘着クンバク質は、フィブリンと同様にして生物医療シール剤と して用いることができる（例えば、Ｒｅｄｌ、　Ａ、及びＳｃｈｌａｇ、　Ｃ， 。 Ｆａｃｉａｌ　Ｐｌａｓｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　２４：　３１５−３２１　（１ ９８５１参照）。 以下の実施例はここに記載したこの発明の実施をさらに例示することを意図した ものであって、この発明の範囲を限定することを意図するものではない。 オリゴＤＮＡの合成のために用いた方法は、アプライド・バイオシステムズ社に よって製造された自動化固相ＤＮＡ合成機を用いたメチルフォスファイト固相法 （Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、　Ｄ、及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、　Ｈ，。 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　１ｅｔｔｅｒｓ、　２１ニア１９−７２２　［１９８ ０］）である、４つの適当に保護された５−ジメトキシトリチル−２−デオキシ リボヌクレオシド−３°−フォスフォラミダイトのような出発物質、適当に保護 された５°−ジメトキシトリチル−２−デオキシリボヌクレオシドで誘導された シリカ及びコンドロールド多孔ガラス（（：ＰＧｌ　（Ａｄａｍｓ、　Ｓ、　Ｐ 、　。 Ｋａｖｋａ、　Ｋ、Ｓ、、　Ｗｙｋｅｓ、　Ｅ、　Ｊ、、　Ｈｏ１ｄｅｒ、　Ｓ 、　Ｂ、及びＧａ１ｌａｐｐｉ、Ｇ、Ｒ，、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅａｐ、Ｓａｃ 、、１０５：６６１−６６３［１９８３］１は市販のものである。 ＤＮＡ合成は３°末端から５°末端に進む０例えば、５’　ＧＣＧ　ＡＡＡ　Ｃ ＣＡ　ＡＧＴ　ＴＡＣＣＣＡ　ＣＣＧ　ＡＣＣＴＡＣＡＡＡ　３゜の一本鎖を合 成するためには、約１μｍａｌの保護された５°−ジメトキシトリチル−２°− デオキシアデノシンを合成カラムに装填し、自動化ＤＮＡ合成機に挿入する。結 合サイクルは、２％トリクロロ酢酸ジクロロメタン溶液で固体支持体をデトリチ レーションし、無水アセトニイトリルで洗浄し、同時に適当に保護された５−ジ メトキシトリチル−２°−デオキシリボヌクレオシド−３°−フォスフオラミデ ート（ｌ　Ｏｕ＋ｍｏｌｌアセトニトリル溶液と、テトラシル（３０μモル）ア セトニトリル溶液を加え、１分間インキュベートし、未反応の５°−水酸基を無 水酢酸及びテトラヒドロフラン中ジメチルアミノピリジンでキャッピングし、テ トラヒドロフラン、ルチジン及び水（２：１：２）の混合物中でヨウ素で酸化し 、最後に無水アセトニトリルで洗浄することから成る。結合サイクルは所望の長 さのＤＮＡが得られるまで繰返される。ＤＮＡは次に、ジオキサン／トリエチル アミン中チオフェノキシトで処理することによって部分に脱保護され、濃水酸化 アンモニウムによる数回（２〜４回）の短い処理（５〜１０分間）によって固体 支持体から遊離される。完全に脱保護されたＤＮＡは水酸化アンモニウム溶液を ６０〜６５℃で８〜１４時間加熱することによって得られる。 ＤＮＡは次いでイオン交換及び直線的プレバラティブポリアクリルアミドゲル電 気泳動によって精製される。精製されたＤＮＡはその５°末端を酵素的にリン酸 化され１次のライゲーションの前に特徴づけられる。 烹Ｊ■１１ 単一のデカペプチドの直接・繰゛しを　む生物　物「　タンパク　類似　をコー ドする　ケのム成　びクローニング並びに　腸　での Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ− Ｌｙｓの配列を有する個々の繰返しデカペプチド単位をコードする合成二本鎖Ｄ ＮＡは、コード鎖が以下の式で示される配列を有する配列から選択することがで きる。 ＧＣＮ　ＡＡＲＣＣＮ　（ＡＧＹ又はＴＣＮＩ　ＴＡＹ　ＣＣＮ　ＣＣＮ　ＡＣ Ｎ　ＴＡＹ　ＡＡＲただし、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＣはそれぞれグアニン、アデニン、 チミン及びシトシン塩基を含むデオキシリボヌクレオチドを示し、Ｒはグアニン 又はアデニンを含むデオキシリボヌクレオチドを含み、Ｙはシトシン又はチミン を含むデオキシリボヌクレオチドを含み、ＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す。 上記デカペプチドの繰返しを含むタンパク質の大腸菌中での発現′のために、生 物粘着物質前駆体タンパク質類似体をコードする二本鎖ＤＮＡ挿入物を調製する ために次の５つの二本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド配列を用いた。 これらのオリゴＤＮＡは、宿主による欠失又は組換えを導くおそれがある繰返し ＤＮＡ配列を最少化することに留意して選択された。５つのオリゴＤＮＡは、デ カペプチドの種々の繰返し物をコードする配列を作製するために、互いにランダ ムに連結した。 自動化ＤＮＡ合成機は、上記した１０種類の一本オリゴＤＮＡを合成するために 用いた。さらに、アニーリングにより二本鎖ＤＮＡ挿入物の５°末端のための、 以下の平滑末端リンカ−断片を形成することができる２種類の一本鎖オリゴＤＮ Ａも合成した。 最後に、アニーリングにより二本鎖ＤＮＡ挿入物の３°末端のための、以下の平 滑末端リンカ−断片を形成することができる２種類の一本鎖オリゴＤＮＡも合成 した。 朱印を付した一本鎖オリゴＤＮＡの５°末端は、ポリヌクレオチドキナーゼの存 在下でアデノシン三リン酸で処理することによりリン酸化したものを示す。 デカペプチドの繰返しを２０個含むクンバク質を作製するために、デカペプチド をコードする１０個のオリゴデオキシリボヌクレオチド（各１．６μｇ）及び４ つのリンカ−オリゴＤＮＡ　（各ａ、４ｕｇｌをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で アニーリングし、連結する。この連結反応により、平均的２０のデカペプチドコ ード断片を含み、ランダム順に連結され、５°及び３°　りオンカー断片に挟ま れた、異なる長さの平滑末端二本鎖ＤＮＡの群が生成される。このようにして合 成された二本鎖ＤＮＡは、５°　リンカ−によりコードされるＬｅｕ−Ｇｌｕ− Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｍｅｔ配列に先行され、３°　リンカ−の停止コドン（ＴＧＡ ）よりも上流のＧＣＧＡＡＡがその後に続く、一連の繰返しデカペプチドをコー ドする。ライゲーション反応からの合成二本鎖ＤＮＡは、マニアティスら、（Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。 １４：３７８７−３７９４　＋１９７５）ｌの方法に従って６％ポリアクリルア ミドゲル電気泳動にかけられる。２０デ力ペプチドコード配列に対応するバンド をゲルから切り出し、二本鎖ＤＮＡをゲルから電気溶出させる。２０デカペプチ ドよりも多い又は少ない繰返しを含むタンパク質を合成することを望む場合には 、ライゲーション混合物中のデカペプチドをコードするオリゴＤＮＡ断片とリン カ−断片との比率を調節し、所望の大きさの二本鎖ＤＮＡ断片をゲルから分離す る。 次いで合成二本鎖ＤＮＡをプラスミドｐＧＸ２２１３の単一のＨｐａＩ部位に挿 入する。第４図に基づいて説明すると、このプラスミドはｔａｃ　（ハイブリッ ドｔｒｐ／１ａｃｌプロモーターの制御下にあるトリプトファンシンセターゼオ ペロンのｔｒｐＢ及びｔｒｐＡ領域を含む、このプラスミドは大腸菌宿主（ＧＸ １６６８株）に挿入されてＡＴＣＣに寄託されており、その受託番号はＡＴＣＣ ３９３８８である。このプラスミド（ｌｕｇ）をＨｐａＩ　（１単位）で処理す ることによって切断する。切断はｔｒｐＢ領域内で起こり、ｔａｃブロモ−クー に連結されたｔｒｐＢ遺伝子の５°末端に１１２２塩基対を残す、直線化された プラスミドは平滑末端を有する。デカペプチドコード配列を含む二本鎖ＤＮＡ挿 入物（０，２μｇ）は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて直線化されたｐＧＸ２２１ ３に平滑末端連結される。 再環化したプラスミドは、大腸菌ＪＭ１０９株をトランスフオームするために用 いる。この宿主菌株は例えば、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社、ベセスグ・リサーチ ・ラボラトリーズ社及びニュー・イングランド・バイオラプス社等から市販され ている。これは、ｔａｃプロモーターからの発現を調節するｌａｃレブレッサー アを過剰生産する１ａｃｌ’遺伝子を含む、　ｔａｃブロモ−クーからの発現は 、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導するこ とができる。この宿主はまた、ｒｅｃＡ−であり、これは、二本鎖挿入物中のデ カペプチドコード配列の組換えの確率を減少させる。トランスフオームされた大 腸菌ＪＭ１０９細胞は、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に接種し、２４時間 培養する。得られたコロニーから調製されるプラスミドＤＮＡは、制限酵素分析 によりスクリーニングし、正しい方向に挿入された単一の二本鎖ＤＮＡを含むク ローンを単離する。単離されたり゛　ローンはｔｒｐＢ遺伝子産物の最初の３７ ４アミノ酸と、これに融合された合成二本鎖挿入物の５°末端リンカ−によって コードされる５つのアミノ酸（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｍｅｔｌと、 デカペプチド配列の２０の繰返しと、合成挿入物の３°末端のリンカ−の停止コ ドンの前の部分によってコードされるＡｌａ−Ｌｙｓを含む。 単一の二本鎖ＤＮ挿入物を正しい方向に含むトランスフォーマントをルリア肉汁 とアンピシリンを含む２リツトル培養フラスコに接種し、中期対数期（０Ｄ６０ ０・０．５）まで生育させる。　ＩＰＴＧ　（終濃度０．２５　ｍＭ　）を加え て発現を誘導する。８〜１６時間後、融合タンパク質が宿主細胞中で高濃度に発 現される。細胞を遠心により集め、超音波処理により崩壊し、融合タンパク質を 従来のタンパク質回収方法により回収する。融合タンパク質は、最初のデカペプ チド配列の直上流のメチオニン残基のカルボキシル側でタンパク質を切断するシ アノーゲンブロミドで処理し、それによって生物粘着物質前駆体タンパク質をｔ ｒｐＢ遺伝子産物のＮ末端断片及びリンカ−誘導ペプチド断片から分離する。生 物粘着物質前駆体タンパク質は次いで従来の方法により単離する。 見立里ユ 単一のデカペプチドの直妾・繰゛しを　む　物　物「駆体タンパク′類似体　コ ードする　列の＾成　びクローニング並びにサツカロミセス・セレビシアエ　で のエコ サツカロミセス・セレビシアエ中での発現のために、生物粘着物質前駆体タンパ ク質類似体をコードする二本鎖ＤＮＡ挿入物を調製するために、以下の二本オリ ゴＤＮＡ配列を用いる。 Ｇ（：ＴＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＣＡＣＣＡＡＣ（：ＴＡＣＡＡＧＧＧＴＡ ＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴ（：ＣＧＡＴＴＣ自動化ＤＮＡ合成機 を用いて以下のオリゴＤＮＡを合成した。 Ａ５°ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＴＡＣＣＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＣＴＡＣ ＡＡＧＢ　５°　ＣＴＴ　ＡＧＣＣＴＴ　ＧＴＡ　ＧＧＴ　丁ＧＧ　ＴＧＧ　Ｇ ＴＡ　ＡＧＡ　ＴＧＧＣ５°ＧＡＡ　ＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＤ５°ＣＴＴ　 ＡＧＣＣＡＴ　ＧＴＣＧＡＣＧＡＡ　ＴＴＣＥ　５’　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＴＡＡ 　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＦ５°ＧＧＡ　ＴＣＣＡＡＧ　ＣＴＴ　Ａオリゴデ オキシリボヌクレオチドＡ、Ｂ、ＤおよびＥは、ポリヌクレオチドキナーゼの存 在下でアデノシン三リン酸で処理することによって５°末端をリン酸化する。デ カペプチド繰返しを２０個含むタンパク質を作製するために、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼの存在下で、オリゴＤＮＡを４Ａ：４Ｂ：　ＩＣ：　ＩＤ：　ＩＥ：　ＩＦの 比率でアニーリングして、５°　リンカ−（Ｃ及びＤ）、３°　リンカ−（Ｅ及 びＦ）並びにサツカロミセス・セレビシアエ中での発現にとって好まれるコドン な含む、繰返しデカペプチドコード配列（Ａ及びＢ）を含む二本鎖ＤＮＡ挿入物 を作製する。５°　リンカ−はＥｃｏＲＩ及び５ａｌＩ切断部位を有する。３° 　リンカ−はＨｉｎｄ［［及びＢａｎＨＩ切断部位を有する。ライゲーション産 物をマニアナイスら（止揚）の方法に従って６％ポリアクリルアミドゲル電気泳 動にかける。デカペプチドコード配列の繰返しを約２０含む二本鎖ＤＮＡに対応 するバンドをゲルから切り出し、二本鎖ＤＮＡをゲルから電気溶出させる。 単離した二本鎖ＤＮＡ断片を５ａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化してギザギザの 末端を生成する。このようにして作製された二本鎖ＤＮＡ断片を、第５図に示す ＹｐＧＸｌに挿入する。　ＹｐＧＸｌは、テトラサイクリン耐性遺伝子の中に単 一の５ａｌＩ及びＨｉｎｄｎｌ制限部位を有する。プラスミド（２μｇ）を５ａ ｌＩ及びＨｉｎｄｍで消化し、得られた直線化プラスミドをＴ４ＤＮＡリガーゼ の存在下で二本鎖ＤＮＡ挿入物と連結する。再環化したプラスミドを用いて大腸 菌ＪＭ１０９株をトランスフオームし、トランスフォーマントを別々にアンピシ リン含有ＬＢ−寒天プレート上で生育し１次いでＬＢ＋アンピシリン及びＬＢ＋ テトラサイクリンプレート上に移す、　Ａｐ”Ｔｃ”コロニーからのプラスミド を制限酵素消化によって分析し、正しい方向に二本鎖ＤＮＡ挿入物を含むプラス ミドを同定する。 サツカロミセス・セレビシアエフオスフオグリＰレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロ モーター及び部分的構造遺伝子断片を第６図に示すようにプラスミドＹｐＧＸ６ ０から単離する。　ＹｐＧＸ６０を５ａｌＩで消化し、ＰＧＫブロモ−クーに対 応する断片と構造遺伝子の最初の２２９コドンに対応する２０００塩基対の断片 をゲル電気泳動によって単離する。デカペプチドの繰返しを２０個コードする合 成二本鎖ＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドｙｐｃ＋ｘｔを５ａｌＩで消化 する。プラスミドＹｐＧＸ６０から単離されたＰＧＫ断片を、２０デカペプチド コード挿入物を含有する直線化ＹｐＧＸ１とＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で連結 する。得られたプラスミドを用いてＤ８やＡＨ２２（ＡＴＣＣ＃３８６２６１の ようなサツカロミセス・セレビシアエ菌株をトランスフオームする。トランスフ ォーマントを、適当な栄養を補填したＹＮＢＤ固相培地上で培養し、免疫的にス クリーニングしてＰＧＫ−粘着融合タンパク質を産生しているコロニーを同定す る。単離されたトランスフォーマントは、ＹＮＢＤ＋トリプトファンを含む２リ ツトルフラスコ中に接種して３０℃で一夜培養する。細胞を遠心により回収し、 フレンチプレス中で破壊する。融合タンパク質を従来のタンパク質回収方法によ り回収する。融合タンパク質は、最初のデカペプチド配列の直上流のメチオニン 残基のカルボキシル側でタンパク質を切断するシアノーゲンブロミドで処理し、 それによって生物粘着物質前駆体タンパク質をＰＧＫのＮ末端断片及びリンカ− 誘導ペプチド断片から分離する。生物粘着物質前駆体タンパク質は次いで従来の 方法により単離する。 １五里旦 物　質前駆　タンパク　類似体に・する逸生ｎ生 メリーフィールド固相法により合成された。　Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ −Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓの配列を有する合成デカペ プチド（１，５ｍｇ）を、１．８　ｍｌのリン酸緩衝液中の２．ＯＢのウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）と結合した。１％グルタルアルデヒド（０，２ｍｌｌ　を 加え、溶液を２２℃で３０分間インキュベートした。水素化ホウ素ナトリウムを 終濃度０．５　Ｂ／ＩＩｌになるように加え、インキュベーションを２２℃で１ 時間続けた０次いで溶液をリン酸緩衝液に対して透析した。得られたタンパク質 のアミノ酸分析により、Ｂ５Ａｌモル当り３５モルのペプチドが結合しているこ とが示された。 フロイントの不完全アジュバント中の１００μｇのペプチド（ＢＳＡ結合）をウ サギに筋肉内注射した。フロイントの不完全アジュバントを用いたブースター皮 下注射をその後２週間間隔で行なった。この方法により、デカペプチド並びにム ラサキガイから単離されたミラチス・エデュラスの生物粘着物質前駆体タンパク 質又は微生物中で生産された類似体タンパク質に対して反応性を有する高タイタ ー抗体が得られた。 １土里Ａ 単一のデカペプチドの官　・繰返しを　も生物粘　物前駆　タンパク　類似体を コーじ−々」こ烈ｊと含」Ｌ及Ｕ’）ローニング並びに　腸　での　現 Ａ、　ｐＧＸ２３４６の構築 ウシキモシンの発現のためのベクター／宿主系の一部であるプラスミドｐＧＸ２ ２８７　ｆＮＲＲＬ−Ｂ１５７８８）　ヲ、生物粘着物質前駆体タンパク質類似 体コード配列のための大腸菌クローニング及び発現ベクターとして用いた。第７ 図は最初のクローニング実験の間に構築されたＤＮＡ断片の概略を示す０両端に ５゛及び３゛　リンカ−がついた１つのデカペプチドをコードする合成りＮＡを 、ｐＧＸ２２８７の単一のＣ１ａＩ及び５ｐｈＩ制限酵素部位の間でクローニン グした。このクローニングは、効率的に発現されるｔｒｐＢ遺伝子と、生物粘着 物質前駆体タンパク質類似体コード配列と、ウシキモシンの１５９個のカルボキ シ末端アミノ酸をコードする３７領域とを含む合成トリブリッド遺伝子が形成さ れるように行なった。このトリブリッド遺伝子は、５゛配列及びｔｒｐＢ部分が 効率的な転写及び翻訳開始を与え、キモシン配列が大腸菌中で不溶性の封入体（ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙｌを形成するので採用した。封入体の形成は、外 来クンバク質に安定性を与え、初期精製の便利な方法を与える。メチオニンコド ンが生物粘着物質前駆体タンパク質類似体コード配列の両側に存在し、従って、 生物粘着物質前駆体クンバク質はシアノーゲンブロミド処理によって融合タンパ ク質から容易に切りだすことができる。 第７図に示す合成りＮＡはアプライド・バイオシステムズ・ＤＮＡ合成機（〕〕 オスフォラミタイトケミストリー）を用いて７種類のオリゴヌクレオチドとして 合成した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の通りで１８７５　ＧＧＴＴＴＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴ　５’リンカ−１８７６ＣＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣ５°リ ンカ−１８７７ＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＣＧＧＴ　３°リン カ−ＧＧＧＴＡＡＧＡＣ １８９２ＧＣＧＡＡＡＣＣＧＴＣＴＴＡＣＣＣＡＣＣＧＡＣＣＴ　３°リンカ− １８９３ＡＣＡＡＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧ　３’リンカープレバラテ イブゲル電気泳動及び逆相クロマトグラフィーによる精製後、オリゴヌクレオチ ドを１デルタ２８０単位／■１の濃度で溶解した。オリゴヌクレオチド８１８７ ６、＃１８７７及び１１１１８９２は、それぞれ別々に、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼと、１ｍＭＡＴＰと、５０ｕｌのキナーゼ反応液に加えられた２０μｌ のオリゴヌクレオチド溶液を含む反応液中でリン酸化した。オリゴヌクレオチド ＃１５４５及びＪｔ１５４６は、最初に１：１の比率でプールすることを除き、 同様な方法で処理した。酵素反応後、溶液を煮沸して酵素を不活性化した。オリ ゴヌクレオチド８１８７５を等量の＃１８７６キナーゼ反応液に加え、ゆっくり と冷めさせて５゛　リンカ−を形成した。同様に、Ｈ８９２及び＃１８７７キナ ーゼ反応溶液を等量の、キナーゼを含まない１８９３と混合し、煮沸し、ゆっく りと冷めさせ、次いでＴ４ポリヌクレオチドリガーゼで１８０μｌの体積で１６ ℃で１１時間反応させて３°　リンカ−を構築した。 プラスミドｐＧＸ２２８７　Ｄ　ＮＡ　（５ｕ　ｇ　）を１８単位のＣ１ａｌで 消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿を行ない、０．０ ０１　Ｍ　ＥＤＴＡ含有０．０１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）中に ０．２５μｇＤＮＡ／μｌの濃度で溶解した。ｌＯμｌのＣ１ａＩ切断ｐＧＸ２ ２８７　Ｄ　Ｎ　Ａを、２５μｌの５°　リンカ−と、総体積４０μｌで、１６ ℃で１１時間連結した。連結後、ＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出し、エ タノール沈殿を行ない、次いで１ａＩの水に溶解した。ＤＮＡ溶液を、セントリ コン３０（アミコン９超遠心機を用いて濃縮し、次いで２ａＩの水で２回洗浄し 、５０００　ｒｐｍで１０分間遠心した。未結合リンカ−の多くが除去された、 洗浄及び濃縮されたＤＮＡを１、エタノール沈殿し、１０μｌの水に溶解した。 ′ライゲーション混合物を、１５０μｌの５ｐｈＩ制限酵素緩衝液中に希釈し、 　５ｐｈＩで消化した。１０μｇのｔＪ’ｌＮＡを加え、溶液をフェノール−ク ロロホルム抽出し１次いでエタノール沈殿した。ＤＮＡは最終的にＴ４リガーゼ 緩衝液で２００μｌに希釈し、１５℃で一夜連結した。連結体を用いて、標準的 な方法により大腸菌ＧＸ３０１５　（Ｆ−ｔｒｐＥＤ１０２　ｔｎａ２　ｒｅｃ Ａ　ｎａｄＡ　［ｃｈｌＤ−ｐｇｌ］［ラムダｃＩ８５７ＢａｍＨＩｌ　ｌ　を トランスフオームした。　ｒｅｃＡ及びｔｒｐＥＤ突然変異を有し、ラムダｃＩ ８５７リブレツサーを有する欠陥的゛　ラムダライソーゲンを有するいずれの大 腸菌も宿主として適当である。細胞は、　ＬＢ÷１００μｇ／ｍｌアンピシリン 、又は０．４％グルコース、０．４％酸加水分解カゼイン（カザミノ酸、ディフ コ社）及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む最少培地上で培養した。１つ の特徴づけられたトランスフォーマントは、３７℃に加熱すると、抗キモシン抗 体及び抗デカペプチド抗体（実施例３の方法により生産された）の両方と反応す ることがウェスタンプロット法（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｎ、、　１９８１． 　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１１２：１９５−２０３）により確認され たタンパク質を産生した。このトランスフォーマント中のプラスミドをｐＧＸ２ ３４６と命名した。これをＤＮＡ配列分析したところ、合成遺伝子は２つの内部 デカペプチドコード配列、合計３つのデカペプチドコード配列と５°及び３°　 リンカ−を含むことが示された（これらのデカペプチドの１つは３゛　リンカ− によってコードされる。第７図参照）。 Ｂ、生物　物質前駆体タンパク質類似体をコードする列の　きさを拡　すること によるＧＸ２３４８の　−ｐＧＸ２３４Ｂ中の３つのデカペプチドコード配列の 両端につく５゛及び３゛　リンカ−を、生物粘着物質前駆体タンパク質類似体コ ード配列の大きさをオリゴヌクレオチドをさらに連結することなく、単一の連結 操作で増大させることができるように、単一の制限部位を有するように設計した 。５７リンカーはＮｏｔＩ部位を、３゛　リンカ−はＮａｅＩ部位を有する。　 ｐＧＸ２３４６のＮｏｔＩ消化及びそれに続＜ＤＮＡポリメラーゼエでの処理に よって生成される３つのデカペプチドコード配列の５７末端を、別のｐＧＸ２３ ４６のＮａｅＩ消化によって生成される３つのデカペプチドコード配列の平滑３ ７末端に連結した（第２図参照）、コれにより、　ｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌａをコ ードするリンカ−領域を介してフレームが合致した融合物が形成される。 ５°、３°及び内部リンカ−の全ては、元のデカペプチドに用いられているアミ ノ酸ａｌａ、ｔｈｒ、　ｐｒｏ、ｓｅｒをコードするものであるので、翻訳産物 の一般的な性質を破壊することはない。 約０．５　ｕ　ｇ　ノｐＧＸ２３４６　Ｄ　Ｎ　Ａを２０ｕｌ（７）体積でＮｏ ｔＩで切断した。第２のｐＧＸ２３４６試料０．５μｇをＮａｅＩで切断した。 ＤＮＡ溶液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、２０μｌ の水に溶解した。 Ｎｏｔｌ消化したＤＮＡを、０．２５　ｍＭ　ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴ Ｐ、ｄＴＴＰを含有する１００μｌの７４ＤＮＡポリメラーゼ溶液と反応させて ＮｏｔＩ消化により生成した一本鎖末端を充填した。ＤＮＡを抽出し、沈殿し、 水に溶解した。 ＮｏｔＩ／Ｐｏ１ｌ処理ＤＮＡの約半分と、　ＮａｅＩ処理ＤＮＡの約半分とを Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ及び０．５　ｍＭ　ＡＴＰによって２０μｌの体 積中で２２℃で４．５時間連結した。連結反応液を１００μｌのＰｖｕＩ緩衝液 で希釈し６．２８単位のＰｖｕＩで１時間、３７℃で消化した。キャリアｔＲＮ Ａ（２０ＬＬｇ）を加え、反応液を抽出し、沈殿した。最後に、ＤＮＡを１５０ μｌの体積で１５℃で８時間連結して低ＤＮＡ濃度での環化を促進した。ライゲ ーション混合物でＧＸ３０１５細胞をトランスフオームした。 特徴づけられた１つのトランスフォーマントは、予想された６つの繰返しではな く、５つの生物粘着物質前駆体タンパク質類似体の繰返しをコードすることがＤ ＮＡ配列決定により示されたプラスミドを有していた。また、５°及び３°　リ ンカ−の結合から予想されるｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌａコード配列も存在しなかっ た。これは、おそらく、ホモロガス組換えによって１つのデカペプチドコード繰 返し及びリンカ−が欠失したものと思われる。この新規なプラスミドはｐＧＸ２ ３４８と命名した。　ｐＧＸ２３４８を含む細胞な０℃で培養し、次いで３７℃ にシフトさせると、予想されたように、抗デカペプチド抗体と反応する分子量２ ７，０００のタンパク質を産生した。 Ｃ０物　物　前駆　タンパク　類似　コード　ダのＬ立皇玉蓋」 ５つデカペプチドコード配列を有するプラスミドｐＧＸ２３４８を、ｐＧＸ２３ ４６について上述したのと全く同一の連結操作に付し、予想された構造を完全に 有するプラスミドｐＧＸ２３５４を含むトランスフォーマントを得た（第８図参 照）　、ｔｈｒ−ｐｒｏ−ａｌａ　トリペプチドコード配列によってそれぞれ５ つのデカペプチド繰返しをコードする２つの領域が存在していた。５°及び３° 　リンカ−をＮｏｔＩ及びＮａｅＩ部位において結合するとＮａｅＩ部位が再生 する。 従って、上記した方法によりさらに連結操作を行なうと、５つのデカペプチドコ ード繰返しの数が増えて大きさが増大する。すなわち、ｐＧＸ２３５４　ｆｌｏ デカペプチド繰返し）をｐＧＸ２３５８　ｆ１５デカペプチド繰返し）の構築に 用い、ｐＧＸ２３５８をｐＧＸ２３６５　（２０テカヘブチト繰返Ｌ）Ｃ７）ｍ 築！＝用いた。　ｐＧＸ２３５８及びｐＧｘ２３６５中の挿入物のＤＮＡ配列は 決定していないが、それらは内部ＮａｅＩ部位を有し、以下に述べるように、シ アノーゲンプロミド切断の前後で予想された分子量を有する免疫反応性タンパク 質を産生ずる。これらのデータは、予想される構造、すなわち、デカペプチドコ ード繰返しがトリペプチドコード配列によって分離された構造を有する合成遺伝 子と符合する。 ｐＧＸ２３４６　３　２４．７２９　４．００４ｐＧＸ２３４８　５　２６．９ ９６　６．２７０ｐＧＸ２３５４　１０　３２．９３１　１２．２０６ｐＧＸ２ ３５８　１５　３８．８５４　１８．１２８ｐＧＸ２３６５　２０　４４．８０ ３　２４．０７７第９図は、シアノーゲンブロミド切断後にプラスミドｐＧＸ２ ３６５を含む細胞によって産生された分子量２４．０７７の生物粘着物質前駆体 タンパク質類似体のアミノ酸配列を示す。 Ｄ、デカペプチド繰゛し　さの　大により減小する生物Ｔ躯体タンパク　、似　 蓄　の　析 ウェスタンプロットにおける免疫反応の強さく第１０図）及びコマシー染色した 総細胞タンパク質（データは示さず）に基づくと、プラスミドｐＧＸ２３４６及 びｐＧＸ２３４８を含む大腸菌細胞は総革溶性タンパク質の数パーセントの生物 粘着物質前駆体タンパク質を産生したが、デカペプチド繰返し数が１Ｏ１１５、 そして２０に増えるにしたがって、タンパク質の生産量が有意に減少する。すな わち、遺伝子発現レベルは、コードされるデカペプチド繰り返し単位の数に反比 例的に変化する。３ないし２０個の繰返しを含む一連のプラスミドｐＧＸ２３４ ６ないしｐＧｘ２３６５は１合成生物粘着物質前駆体タンパク質遺伝子の長さを 除けば同一に構築されている。従って。 発現レベルが低下することは、発現される遺伝子の大きさが増大することと直接 関連していると考えられる。 Ｅ、　物　物　「駆体タンパク′類似　を生産するための　腸　株の プラスミドｐＧＸ２２８７は、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼを有 し、また、トリプトファンを含まない培地において宿主ＧＸ３０１５染色体中で のｔｒｐＥＤ１０２欠失を補うｔｒｐＥＤ遺伝子を有する。大腸菌ＧＸ３０１５ のトランスフオームされた培養物は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び／又は トリプトファンを含まない培地中で生育させた。 上記セクションＣにおいて記載したプラスミドの１ツヲ含むＧｘ３０１５の単一 のコロニーを、０．４％カザミノ酸及び０．４％グルコースを添加した最少塩培 地（Ｍｉｌｌｅｒ。 Ｊ、Ｈ，、ｒ分子遺伝学における実験Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９７２．　ｐ、　４３２１上で生育した後、１０ ０μｇ／ａｌのアンピシリンを添加した５ｍｌのＬＢ培地に接種した。吸光度（ ＡＢＯ３）が１．０以上に達した後、０．４　ｍｌの培養物を、１００μｇ／ｍ ｌのアンピシリンを添加した５０＋ｓｌのＬＢ肉汁を含む２５０ｍ１の２つの振 盪フラスコのそれぞれに接種した。２つのフラスコを３０℃でインキュベートし 、２５０　ｒｐｍで６．５〜９時間振盪した。 発酵は８リツトルの以下の初期培地を用いて行なう。 （ＮＨ４１＊５０４３０　ｇ ＫＨ＊ＰＯ４−１５ｇ ＫＩＨＰＯ４−５ｇ ビオチン（９５％エタノール中０．５　ｍｇ／ａｌｌ　−１２ｍｌ水道水を加え て８リツトルにし、オートクレーブにかける。 オートクレーブにかけた後、以下の添加物を加えて初期培地を提供する。 ＣａＣ１ｔ・２Ｈ，０−１０％（ｖ／ｖ）滅菌溶液１０ｍ１グルコース　−５０ ％　（ｗ／ｖｌ滅菌溶液３６０ｍ１ニアシン　−０，５％　ｆｗ／ｖ）滅菌溶液 １８＋ｎｌ微量溶液１　−　９０ｍ１ 微量溶液２　−　１８ｍ＋１ 微量溶液３　−　１．８■ｌ 以下の発酵条件を維持する。 ｐＨ７，０（５Ｎ　ＮＨ，ＯＨ及びＩ　Ｎ　Ｈ，ＰＯ，により調整）スバージ速 度　１　ｖｖｍ 温度　３２℃ 撹拌速度　８００　ｒｐｍ 発現を誘導する前に細胞密度を増大させるために、栄養を含む肉汁補填物の系を 採用する。加える溶液は以下のようにして調製する。 脱イオン水中に１０００　ｇのグルコースを含む溶液（最終体積１７００　ａｌ ｌをオートクレーブにかける。オートクレーブ後、微量無機物温液を加える。 微量溶液１　−　５００＋ｎｌ 微量溶液２　−　１００ｍ１ 微量溶液３　−　１０＋ｎ１ ＣａＣ１ｉ・２Ｈｚ０　５０　ｍｌ 微Ｊｌ腋」２ 水　９００　酊１ 濃塩酸　１３．１　＋ｎ１ ＦｅＣ１ｉ’６ＨｚＯ５，４ｇ ＺｎＳＯ４４Ｈｉ０　１．４４　ｇ ＭｎＣ１ｇ’４８ｉＯ１，Ｏｇ ＣｕＳＯ−・５ＨＪ　Ｏ，２５ｇ ＧＯＣｌｔ・６ＨａＯＯ，２４ｇ Ｈ，ＢＯｍ　０．０６２　ｇ ｌｏｏｏ　ｍｌにして滅菌ろ過する。 裟ｌ呈亘ユ 水　９００ＩＩ１１ 塩酸　４４．８ｍｌ １ＨｔＯ４・７ＨｘＯ６１，６ｇ ｌｏｏｏ　ｍｌにして滅菌ろ過する。 匙１１豆ユ 水　１００ｈｌ Ｎａ＊Ｍｏ０ｎ・２ＨｔＯ２４，１ｇ 滅菌ろ過する。 添加溶液は肉汁に先ず１８０　ｍｌ加えておき、グルコ−゛ス濃度を１０　ｇ／ ｌに維持するのに必要に応じて添加する。 添加はＡＢＯ３が２０になるまで続け、この時点でハイブリッドラムダＯＬ／Ｐ ＊ブロモ−クーからトリブリッド生物粘着物質前駆体タンパク質遺伝子を発現す る誘導をかける。誘導は、温度を４２℃に１時間上げて、　ＧＸ３０１５染色体 中の欠陥的ラムダリソーゲンによって産生された温度感受性ラムダｃＩ８５７リ ブレツサータンパク質を不活性化することによフて行なわれる０発酵は３７℃で さらに６〜８時間行なう。 １胤ＰＩ　５ デカペプチド　Ａｌａ−Ｌ　５−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔ ｈｒ−Ｔ　ｒ−Ｌｓの繰返しを２０　む生物　物質前一体クンバク頚似　の　現 を改良するー プラスミドｐＧＸ２３６５を、大腸菌中での２０繰返しタンパク質の発現を増大 させる試みでさらに操作した。すなわち、発現レベルに及び細胞内溶解度に対す るキモシン配列の効果を調べるために、以下に示すようにｐＧＸ２３６５の新規 な誘導体を２つ作製した。 プラスミドｐＧＸ２３６５は、デカペプチド繰返しコード配列の末端に単一の５ ｐｈｌ部位と、キモシンコード配列の中に単一のＢａｎＩＩ部位と、キモシンコ ード配列の末端に単一のＢｃｌＩ部位とを有する。オリゴヌクレオチドを合成し 、アニールして以下に示すリンカ−を作製した。このリンカ−は、遺伝子からキ モシン配列を段階的に欠失させるために用いることができる。 リンカ−を先ずｐＧＸ２３６５のＢａｎｌＩ部位とＢｅ１１部位との間に挿入し てｐＧＸ２３７４を作製した。　ｐＧＸ２３７４から産生されたタンパク質は、 キモシンから誘導された６１のカルボキシ末端アミノ酸と４つのリンカ−アミノ 酸のみを含んでいた。欠失により、キモシン領域に元々存在した４つのシスティ ンの２つを包含する、９８個のカルボキシ末端キモシンアミノ酸が除去された。 　ｐＧＸ２３７４を５ｐｈｌで消化し、小さな５ｐｈｌ断片を除去し、再環化す ると、残ったキモシン配列が欠失し、デカペプチド繰返しの後にはリンカ−配列 によってコードされるカルボキシ末端アミノ酸ｎｅｔ−ｐｒｏ−ｇｌｙ−１ｅｕ のみが残った。このプラスミドはｐＧＸ２３７５　ト命名シタ。 ｐＧＸ２３７４及びｐＧＸ２３７５によって産生されるデカペプチド繰返しタン パク質の発現レベルと溶解度を、ウェスタンプロットにより調べて先に記載した 他の全てのプラスミドと比較した。結果を第１０図に示す。 浄書（内容に変更なし） 実施例６ 単一デカペプチドの反復配列を含む生物粘着物質前駆体類似タンパク質をコード する配列の、ビール酵母菌（Ｓ。 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）中での発現 実施例４のように構成した生物粘着物質前駆体類似り７／（り質を、第３図に示 した酵母の発現ベクターＹｐＧ２６５ＧＡＬ４　（ＡＴＣＣ＃６７２３３）に取 り込ませた。この酵母−Ｅ、ｃｏｌｉシャトルベクターは、酵母の２μｍの複製 起源およびｐＪＤＢ２０７からのＬＥＵ２−ｄ対立遺伝子を有するため、非常に 高いコピー数（ｌ細胞あたり１００〜２００コピー）でＳ　ａｃｃｈｒｏｍｙｅ ｅｓ中で複製した（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、、　Ｉｎ　Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎ５ ｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｓｓ　１６．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ、　Ｖａｎ　Ｗｅｔｔｅｎｓｔｅｉｎ。 Ｄ、ら編、　Ｍｕｏｋｓｇａａｒｄ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ｐｐ−３８３−３ ８９（１９８１）、転写の開始および調節は、ＧＡＬＬ−１０調節領域から上流 の活性化部位（ＵＡＳ）と結合したＭＦ−σ１転写開始部位（ＴＩＳ）で構成さ れたハイブリッドであるプロモーターによって決定された。転写開始が効率的に 生じるために、ＧＡＬ　ｌ　−１０ＵＡＳは、酵母ガラクトース遺伝子における 正のレグレータ−であるＧＡＬ４タンパク質に結合しなければならない。複数の ＧＡＬ　１−１０ＵＡＳ部位に結合するに十分なＧＡＬ４タンパク質を得るため に、ＧＡＬ４遺伝子も発現プラスミドに乗っている。さらに、プラスミドＹｐＧ Ｘ２６５ＧＡＬ４には、ＰＨ０５遺伝子由来のシグナルコード配列が含まれ浄書 （内容に変更なし） ている。転写を終止させるために、酵母のグリセロアルデヒド３−リン酸デヒド ロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）（）遺伝子に見られるターミネータ−に基づいて、合成 ターミネータ−を利用した。 ベクターＹｐＧＸ２６２ＧＡＬ４からの酵母発現モジュール（同時係属出願であ って、通常に譲渡された米国特許第９１６．１４７号に完全に記載）は、制限酵 素のＨｉｎｄＩ［［およびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで切り出され、Ｍ　ｌ　３　ｍ　ｐ 　９にクローニングされて、ＭＧＸ４３６を生じた（第１１図参照）。 Ｅ、ｃｏｌｉの調節配列を有する生物粘着物質前駆体類似タンパク質−キモトリ プシンバイブリド遺伝子は、βｍａＩおよびＢｃｌｌｆ！１ｌｌＥｆｔエンドヌ クレアーゼを用いてｐＧＸ２３６５　（実施例４参照）から切り出され、ＭＧＸ ４３６の酵母発現モジュール中のＥｃｏＲＶおよびＢａ　ｍ　Ｈ１部位で結合し 、ＭＧＸ４４１が生じた。直接類似体配列に先行する５つのｔｒｐＢコドンおよ びメチオニンフドン以外のＥ、ｃｏｌｉ配列は、以下のオリゴヌクレオチド配列 を用いたオリゴヌクレオチド規定突然変異によって欠失を生じた。 ５’　ＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＧＣＡＧＡＧＧＣＧＴＴＧＧＣＣＡＡＡＧ ＡＡＧにれによって、ベクターＭＧＸ４４８が生じた。 酵母の発現七ジュール−生物粘着物質前駆体類似タン浄書（内容に変更なし） バク質−キモトリプシン配列は、βｍａｌｔ；よびＸｈ。 ■制限酵素を用いてＭＧＸ　４４８ベクターから切り出し、酵母−Ｅ、ｃｏｌｉ シャトルベクターにトランスファーして、ＹｐＧＸ２７７が生じｔ；。続イテ、 ＧＡＬ４遺伝子を、ユニークＨｉｎｄＩ［［サイトでＨ１ｎｄＩ［［断片として ＹｐＧＸ２７７に加えると、ＹｐＧＸ２７７ＧＡＬ４が生シタ。 このプラスミドによってコードされた生物粘着物質前駆体類似タンパク質は、配 列、ＰＨＱ５シグナル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇａｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅ　ｔ−Ｍｅ　ｔ −Ａｌａ−Ａｌａ−［（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐ ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）ｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒａｌ　４−３ｅ　ｒ −Ｍｅ　ｔ−キモトリプシン（１５９のアミノ酸）を有する。 生物粘着物質前駆体類似タンパク質配列とＰＨ０５シグナル配列がメチオニンフ ドンによって分離するが、ｔｒｐＢコドンのない酵母発現ベクターを会合させる ために、ｐＧＸ２３６５をＣ１ａＩ８よびＢｃｌｌで消化し、生物粘着物質前駆 体類似タンパク質を含む断片を、ゲル精製した。さらに、配列が５’　ＡＴＣＡ ＡＴおよび５′ＣＧＡＴＴＴＧＡＴの２つのオリゴヌクレオチドを合成し、アニ ーリングした。ＮＧＸ４３６の２本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消 化し、大きなベクター断片をゲル精製した。 ２つの精製ＤＮＡ断片でおよびアニーリングオリゴヌクレオチドを連結し、Ｅ、 ｃｏｌｉを標準的なプロトコル浄書（内容に変更なし） を用いてトランスフオームした。を二だ１つのプラークに、ＢａｍＨＩおよびＩ ；ｃｏＲＶで消化して、ＤＮＡ断片を放出するＤＮＡが含まれていた。 制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ配列の解析によれば、リンカ−オリゴヌク レオチドは予想通り挿入されているが、予定の２０反復配列ではなく３０反復配 列のデカペプチド配列がベクターにコードされる組換えによって、生物粘着物質 前駆体類似タンパク質領域が伸長していることが分かつｔ；。生物粘着物質前駆 体類似タンパク質コード配列および酵母発現モジュールは、５′末端および３′ 末端のそれぞれでβｍａｌおよびＸｈｏｌを用いて、このＭ１３ベクターから切 り出され、酵母−Ｅ。 ｃｏｌｉシャトルベクターと連結され、ＹｐＧＸ２７５が生じた。統いて、ＧＡ Ｌ４遺伝子が、ユニークＨ４ｎｄｎ［サイトにＨｉｎｄｍ断片として付加され、 ＹｐＧＸ２７５ＧＡＬ　４が生じた。ＹｐＧＸ２７５ＧＡＬ４でコードされた生 物粘着物質前駆体類似タンパク質は、ＰＨ０５シグナル−Ａｓｐ−Ｉ　ｌｏ−Ｌ ｙｓ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−ＡＩａ−Ａｌａ−［（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ −Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）ｓＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌ 　ａ］　、−３ｅ　ｔ−Ｍｅ　ｔ−キモトリプシン（１５９アミノ酸）である。 ＹｐＧＸ２７７ＧＡＬ４中での生物粘着物質前駆体類似タンパク質コード配列の ３′末端からキモトリプシン配列を除去するために、酵母のプロモータ、シグナ ル配浄書（内容に変更なし） 列および生物粘着物質前駆体類似タンパク質配列は、プロモータの開始点でＨ１ ｎｄｌｌ＋サイト、およびキモトリプシン配列から生物粘着物質前駆体類似タン パク質配列を分１１１するβｐｈＩサイトを用いて、ＹｐＧＸ２７７ＧＡＬ４か ら切り出された。この断片は、βｐｈｒサイトがＢａｍＨＩサイトに隣接するよ うに、Ｍｌ　３ｍｐ　ｌ　８にクローン化した。酵母のプロモータシグナル配列 生物粘着物質前駆体類似タンパク質を含む断片は、プロモータ領域の開始点でＨ ｉｎｄｍサイト、およびＭｌ３からＢａｍＨＩサイトを用いて２本鎖Ｍ１３ベク ターから切り出された。続いて、この断片を、酵母−Ｅ、ｃｏｌｉシャトルベク ターによって連結し、ＧＡＬ４遺伝子をＭ　ｉ　ｎ　ｄｍ断片として添加したと ころ、発現ベクターＹｐＧＸ２７９ＧＡＬ４が生じた。これは、ＹｐＧＸ２６５ ＧＡＬ４に相当するが、ＰＨ０５シグナルコ一ド配列末端のＥｃｏＲＶサイトと ＧＡＰＤＨターミネータ−に先行するＢａｍＨＩサイトとの間に位置する生物粘 着物質前駆体類似タンパク質配列を有していた。同様の方法によって、キモトリ プシンコード領域は、ＹｐＧＸ２７５ＧＡＬ４カラ欠失シ、ＹｐＧＸ２８３ＧＡ Ｌ４が生じた。 ＰＨ０５シグナルと生物粘着物質前駆体類似タンパク質配列との間にｔｒｐＢ： ドンがなく、２ＣＩＥ復配列のデカペプチド配列をフードする発現ベクターを産 生ずるために、以下のような構成を行った。 ｙｐＣ，ｘ２７９を、酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩに浄書（内容に変更なし） よって消化し、２０デカペプチドの反復配列をコードする小さな断片をゲル精製 した。ＹｐＧＸ２７５は、Ｎ。 ｔＩおよびＢａｍＨＩによって消化し、酵母の発現モジュールおよび複製配列を 有する大きなベクター断片をゲル精製した。統いて、これら２つの断片を連結し 、Ｅ。 ｃｏｌｉをトランスフオームし、得られたベクターＹｐＧｘ２８４を単離した。 ＧＡＬ　４遺伝子を、Ｈ１ｎｄｌＩ［サイトとしてＹｐＧＸ２８４に加えた。Ｙ ｐＧＸ２８４ＧＡＬ４によってコードされる生物粘着物質前駆体類似タンパク質 は、ＰＨ０５シグナル−Ａｓ　ｐ　−１］　ｏ−Ｌｙ　ｓ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ａ ｌ５−３ｅｒ−［（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ −Ｔｈｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｙｓ）ｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｔ　ａ］　、−３ｅ　ｔ −Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＬｅＵである。 これらのＳ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株が予期した分子量の生物粘着物質前駆 体類似タンパク質を高レベルで産生ずるかを決定するために、発現ベクターでト ランスフオームした酵母株Ｄ８ＹｐＧＸ２２５ＧＡＬ４、ＹｐＧＸ２２７ＧＡＬ ４、ＹｐＧＸ２２９ＧＡＬ４、ＹｐＧＸ２８３ＧＡＬ４およびＹｐＧＸ２ｇ４Ｇ ＡＬ４を、最初にＹＮＢＤ個体培地（０，７％酵母窒素塩基、１０％グルコース 、２％寒天）上で成育させ、続いてＡ６００の初期値が０゜１となるようにＹＰ Ｄ　（１％酵母抽出物、２％ペプトン、浄書（内容に変更なし） ２％グルコース）１０ｍｌ中に接種し、２８℃で１７〜２４時間震盪しながら成 育させた。この細胞をＹＰＧａｌ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％ガラク トース）で収穫ならびに洗浄し、６〜２８時間誘導した。各培養物１ｍｌをＴｓ ｓｌＥ＋ｚｓ緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｘ　ｌ　２５ＥＤＴＡ％ｐＨ８ ，４）で、収穫および洗浄しｔ；。続いて、この細胞を収穫し、Ｔ□Ｅ　１２％ 緩衝液１００に再懸して、グラスビーズの存在下で渦動させることによって破壊 した。Ｔ□Ｅ　１２！緩衝液２００μｌを添加後、細胞溶解物をグラスビーズか ら除去し、細胞破砕物を微量遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）にて５分間でベレエ ット化した。不溶性ペレエットは、試料用緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、　ＩＪ、に 、　１９７０＋Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５）　２００μｌに再懸濁 し、５分間煮沸した。アリコート２５μｌを１０％ポリアクリルアミドゲル上で 調べ、クマシブルーで染色した。この解析結果（第１２図）によれば、適当な分 子量の生物粘着物質前駆体類似タジバク質は、この酵母株によって全細胞タンパ ク質の約５％のレベルで産生されることが示された。 発酵槽中で酵母株Ｄ８　（ＹｐＧＸ２８４ＧＡＬ４）を成育させる！こめに、細 胞を寒天プレートから以下の接種培地５０ｍ１に接種し、３０℃で２４〜３６時 間成育させた。光学濃度（ＡＢＯ３）４．０ないし６．０において、培養物５− ５−１Ｏを接種培地５００ｍ１に移し、３０℃にて２４〜３６時間成育させた。 ４．０〜６．０の光学濃度で、この培養物を、産生培地９．４Ｑが充填された浄 書（内容に変更なし） 発酵槽に移した。 接種培地： 酵母窒素塩基（Ｄｉｒｃｏ）　０　、６７　ｇ／　１グルコース　１００ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／ｌ Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ１０５ｇ／ｌ 産生培地： 酵母抽出物　１５ｇ／ｌ ベプトア　１５ｇ／ｌ ＊グルコース　２０ｇ／Ｉ ＫＨ，Ｐｏ、　５ｇ／Ｉ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ、・７Ｈ，０５ｇ／ｌ ＊ガラクトース　ｌｏｇ／ｌ イノシトール　０．ｌＯｇ／ｌ チアミン　０．００１ｇ／Ｉ Ｓａｇ４１３０　０．２５ｇ／ｌ ＊　オートクレーブ処理後に添加 細胞は、光学濃度が約５０〜５５に達する４０〜４５時間、産生培地中で増殖さ せｊ；。発酵茶件は、以下のようである。 浄書（内容に変更なし） 温度　３２℃ 通気　ｌＶＶＭ 撹拌　８００ＲＰＭ ｐＨ４，５±０．１ ｐＨ滴定剤　ｌＯ％Ｈ，Ｐｏ。 １０％ＮａＯＨ 続いて、細胞を遠心分離によって回収し、溶解緩衝液に再懸濁した。 実施例７ 数種の異なったデカペプチドおよびヘキサペプチドを含む生物粘着物質前駆体類 似タンパク質の、）：、ｃｏｌｉ中での合成、クローニングおよび発現 Ｍ、　ｅｄｕｌｉｓの生物粘着物質タンパクｃＤＮＡクローンに見られる様々な デカペプチドおよびヘキサペプチド列に基づくと（米国特許第９３３，９４５号 ）、ポリペプチド反復アミノ酸配列中で大きな多様性のある生物粘着物質前駆体 類似タンパク質をコードする合成遺伝子が構成されていた。 Ａ−ｐＧＸ２３８５およびＩ）ＧＸ２３８６（７）会合Ｍ、　ｅｄｕｌｉｓのポ リフェノールタンパク質に見られる、１つのへキサペプチドおよび４つの異なっ たデカペプチドをコードするように、以下のオリゴヌクレオチドを設計した（第 １３〜１６図における、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの塩基配列浄書（内容に変更なし） データに基づく）。このコドンは、高いレベルで発現される遺伝子中で酵母Ｓ　 、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによって優先的に使用されるものを基準に選択しＩ； 。 ヘキサペプチド オリゴ＃　Ａｒａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ２１９７　ＴＡＧ 　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＡＣＴ２１９６　ＣＧＡ　ＴＴＣＧＧＴ　 ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣデカペプチドＩ Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｓ２１９４　ＴＡＣＡＡＧ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＴＡＣＣＣ Ａ　ＣＣＡ　ＡＣＴ２１９５　ＧＧＴ　ＴＴＣＧＧＴ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＴ 　ＧＧＴ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣデカペプチド２ Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｓ２１９３　ＴＡＣＡＡＧ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＴＣＴＡＣＣＣＡ 　ＴＣＴ　ＡＣＴ２１９２　ＧＧＴ　ＴＴＣＴＡＡ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　 ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣデカペプチド３ ＋１ｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｓ２１９１　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＡＴＣＴＡＣＣＣＡ 　ＴＣＴ　ＡＣＴ２１９０　ＴＡＡ　ＴＴＣＧＧＴ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　 ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣデカペプチド４ Ａｒａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｌｙｓ２１８９　ＴＡＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＡＴＣＴＡＣＣＣＡ 　ＴＣＴ　ＡＣＴ２１８８　ＣＧＡ　ＴＴＣＧＧＴ　ＴＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　 ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣ浄書（内容に変更なし） これらのコード配列に加えて、ｐＧＸ２３４６のｔｒｐＢ遺伝子または関連ペプ チドとのフレーム内融合物ヲ産生ずるように、５′および３′　りンカーを設計 した。 これらリンカ−の配列は以下のようである。 オリゴ＃　Ｍｅｔ　Ａｒａ　Ａｒａ　Ａｒａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ２２０１　５’　 りンガー　ＣＧ　ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ２２００　ＴＡＣＣＧＣＣＧＧ 　ＣＧＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣＣｌａｌ　Ｎｏｔｌ Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ２１９８　３’リンガ−ＴＡ ＣＡＡＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＡＧＣＡＴＧ２１９９　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＴＣ Ａｓｐ７１８　５ｐｈｌ この５′　リンカ−にはＮｏｔＩ認識部位が含まれ、３′リンカ−にはＡｓｐ７ １８　認識部位が含まれている。 従って、プラスミドの第１バツチをＮｏｔＩで設計し、第２バツチをＡｓｐ７１ ８で設計した後、ＤＮＡポリメラーゼＩ処理によって５′末端の突き出し部分を 埋めると、これらＤＮＡが連結して、以下に示す新たな２結合遺伝子を創製する ことができる。 前駆体遺伝子 Ｍｅｔ　Ａｒａ　Ａｒａ　Ａｒａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＭｅｔＡＴＧ　Ｇ ＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　ＧＧＴ　ＡＣＣＡＧＣＡＴＣ浄書（内容に変更なし） ＴＡＣＣＧＣＣＧＧ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＴＣＧ　ＴＡＣＮｏｔ　Ｉ　’ 　Ａｓｐ７１ｇ ５゛　リンカ−生物粘着物質前駆体類似タンパク質配列２結合遺伝子 Ｍｅｔ　Ａｒａ　Ａｒａ　Ａｒａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒａ　Ａｒａ　Ｇｌｙ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＭｅｔＡＴＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＧＣ ＣＧＣＣＧＧＴ　ＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＡＣＣＧＣＣＧＧ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　Ｔ ＧＣＣＧＧ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＴＣＧ　ＴＡＣ５′　リンカ−連結Ｎｏ ｔｌ／Ａｓｐ７１８　３　’　リンカ−この工程は、遺伝子サイズの増大に伴っ て数回繰り返し、サイズを指数関数的な大きさにし、非常に大きな合成遺伝子を 作製することができる。制限酵素切断部位およびコドンは、フレーム内融合が起 き、リンカ−でコードしＩ；アミノ酸および結合配列の大部分が、天然の生物粘 着タンパク質のデカペプチドに通常見られるものとなるように、５′および３′ 　リンカ−内に選択した。唯一の例外は、結合配列へも引き入れる３′　リンカ −のグリシンコドンである。 これらオリゴヌクレオチドは、リン酸化学（ｐｈｏｓｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｃ ｈｅｍｉｓｒｔｒｙ）に基づいて、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍの自動 ＤＮＡ合成装置によって合成した。各オリゴヌクレオチドは、Ａ２６０が１．０ 単位／ｌ！１１ノ濃度テＨ２゜に溶解しＩ；。２２００および２１９９以外のす べてのオリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを浄書（内容に変 更なし） 用いてリン酸化した。この１．ＯＯＤ／＋ｏ；のオリゴヌクレオチド溶液２０μ ｌ（［１６６μｇ）を、容量６０μｌとして、３７℃で１．５時間キナーゼ処理 した。２分間煮沸し、続いて、相補対との混合（すなわち、２１９６と２１９７ ．２１９４と２１９５．２１９２と２１．９３．２１９０と２１９１．２１８８ と２１８９）によって反応させた。このリン酸化オリゴヌクレオチド２２０１は 等量の非リン酸化オリゴヌクレオチド２２００と混合して５′　リンカ−を作製 し、リン酸化オリゴヌクレオチド２１９８は等量の非リン酸化オリゴヌクレオチ ド２１９９と混合して３′　リンカ−を作製した。混合後、試料を沸騰するまで 加熱し、徐々に２０℃に冷却させ、統いて、氷上でアニーリングさせた。 容量１００／Ｉ１１中のｐＧＸ２２８７ＤＮＡ　（ＮＲＲＬ−Ｂ１５７８８）１ ０μｍを、ＣＩ　ａ　ｒ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　Ｉ　 Ｏ単位によって消化した。Ｃ１ａｌ断片ｐｃｘ２２８７１０μｇを、５′　リン カ−溶液３０μｍを用いて１５℃にて４，５時間容量４０μｌの反応で連結させ た。この連結溶液は、１ｍｌに希釈してから、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　フィ ルター（Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃａｒｐ−）によって５０μｌに濃縮した。 この希釈および再濃縮をさらに２回繰り返し、非連結リンカ−を除去した。この ＤＮＡは、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行って、Ｈ， ０４０μｌに溶解した。 ５′　リンカ−を用いて生物粘着物質前駆体類似タンパ浄書（内容に変更なし） り質とｐＧＸ２２８７に挿入する連結は、以下のように行った。約２．５μｇの 修飾ｐＧＸ２２８７ＤＮＡを、デカペプチドコードオリゴヌクレオチドの溶液（ ２１９４および２１９４．２１９２および２１９３．２１９０および２１’ｊｌ 、２１８８および２１８９）の各４μ１１およびヘキサペプチドコードオリゴヌ クレオチド溶液（２１９６および２１９７）２μｌを含む容量４０μｌの反応液 中で連結させた。３′　リンカ−オリゴヌクレオチド（２１９８および２１９９ ）を添加するために、２つの方法を取った。連結溶液（１〜３μｌ）に開始直後 から少量の３′　リンカ−を添加する方法、または１５分ないし１時間は３′　 リンカ−なしで連結反応を進行させる方法であった。続いて、３′　リンカ−を 過剰に（５〜１０μｌ）添加した。３′　リンカ−のｓｐｈ　！末端はリン酸化 されないので、その遺伝子へ３′　リンカ−を添加することによって、さらに大 きなサイズの末端が生じた。オリゴヌクレオチドの連結反応溶液は、５ｐｈＩ消 化緩衝液で１００または１５０μｌの容量に希釈し、５ｐｈＩによって切断した 。この消化断片をフェノール−クロロホルムで抽出してから、ｔＲＮＡ１０μｇ を含むエタノールで沈澱させた。最後に、５ｐｈＩ切断連結反応混合物の半分（ 最初のｐＧＸ２２８７の１．２５ｕｇ）を、１５０μｌの低濃度溶液中で環化さ せた。この最終連結溶液を用いてＥ。 こｏｌｉＧＸ３１０５をトランスフオームし、トリプトファン≠含有で、０．４ ％のグルコース、ｌμｇ／ｍｌの二浄書（内容に変更なし） クチン酸、１μｇ７ｍｌのビオチン、および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを 含有する、０．４％酸で加水分解したカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）添加の最小塩類 培地上に蒔いた。 その結果得られた。ｔｒｉ）＋ＡＪ）十のプラスミドを有するトランスフォーマ ントが増殖し、そのプラスミドを解析した。性質決定された２つのプラスミド（ ｐＧＸ２３８５８よびｐＧＸ２３８６）には、それぞれ、約２８０塩基対および ２００塩基対の生物粘着物質前駆体タンパク挿入片が含まれていｊ；。ｐＧＸ２ ３８５およびｐＧＸ２３８６のＤＮＡ塩基配列とタンパク質への翻訳は、それぞ れ第１７図および第１８図に示す。ｐＧＸ２３８５およびＩ）ＧＸ２３８６中の 合成遺伝子のＤＮＡ配列を調べたところ、上記の配列をコードするヘキサペプチ ドおよび４つのデカペプチドのうちの３つが含まれているこきが分かった。デカ ペプチド２（オリゴ２１Ｂ９８よび２１８８）のみは、これた２つの実施例では 示さない。 ｐＧＸ２２８５およびｐＧＸ２２８６を含むトランスフォーマントは、抗コモト リプシン抗体および実施例３の抗生物粘着物質前駆体類似タンパク質と反応する タンパク質を産生じた。 Ｂ、ｐＧＸ２３８５およびｐＧＸ２３８６中−’ｃ’ノ＝＋−ド配列の伸長 生物粘着物質前駆体類似タンパク質コード配列は、実施例４に記載の方法、また はそれ自体でデカペプチドを浄書（内割二変更なし） コードする結合配列が得られる方法によって、伸長することができる。後者の方 法によって、以下のオリゴヌクレオチドを合成したが、この両者には、上記の一 次遺伝子会合体に使用した３′　リンカ−および５°　リンカ−においてＡｓｐ ７１８およびＮｏｔＩ末端に相補的な１本鎖末端が含まれていた。 Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。 ＃２２２０　ＧＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＴＡＣＣＣ＃２２２１　Ａ　ＴＴ ＣＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＧＣＣＧＧリンカ−の設計は、２つの合成遺伝子への結合 後、このリンカ−から、第１の源遺伝子における最後のデカペプチドコード反復 配列と、第２の源遺伝子における最初のデカペプチドコード反復配列との間で、 以下に示すデカペプチドコード反復配列が生じた。 連結反復配列　連結反復配列 、、Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒ ａ　Ａｒａ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ、。 、、ＴＡＣＡＡＧ　ＧＧＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＴＡＣＣＣＧ　ＧＣＣＧ ＣＴ　ＴＡＣＡＡＣＣＣＡ　ＡＡＧ　ＣＣＡ、。 、、ＡＴＧ　ＴＴＣＣＣＡ　ＴＧＡ　ＴＴＣＡＧＡ　Ａ′Ｔｃ　ｃｃｃ　ＣＧＧ 　ＣＧＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣＧＧＴ　ＴＴＣＧＧＴ、　。 新たな連結Ｉミよってコードされた新規デカペプチドは、このｃＤＮＡに見られ るデカペプチド反復配列と同一の浄書（内容に変更なし） ものではないが、極めて関連しており、Ｍ、　ｅｄｕｌｉｓのポリフェノールタ ンパク質反復配列に通常見られるアミノ酸が含まれている（グリシンは例外）。 類似の方法を用いて、他の関連するリンカ−配列を設計することができる。 ｐＧＸ２３８５ＤＮＡＩ　ＯｕｇはＡ　ｓ　ｐ　７１８　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で、ｐＧＸ２３８６ＤＮＡｌＯμｇはＮ　ｏ　ｔ　Ｉ　 （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で、それぞれ容量１００μｌとし て消化した。これらＤＮＡは、フェノール−クロロホルムで抽出し、沈澱させ、 続いて、１０μｌの水に溶解した５Ａｓｐ７１８切断ｐＧＸ２３８５の半分は、 容量６０μｌにして、アニール化オリゴ２２２１および２２２０で連結した（２ ２２０は前以てＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した）。約１ ｎＨのリンカ−を添加した。連結後、非結合リンカ−は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　 ３０　（Ａｍｉｃｏｎ）濾過ユニット中でのＤＮＡの濃縮台よび洗浄によって除 去した。沈澱後、このＤＮＡは、容量２０μ！にして、ＮｏｔＩ切断ｐＧＸ２３ ８６ＤＮＡ５μｍ　（５μｇ）を用いて連結した。連結後、混合物は、１００μ ｍに希釈して、ＰｕｖＩで消化した。ＰｕｖＩ連結を行い、プラスミドの環形成 を促進させた。最終連結の混合物は、Ｇｘ３０１５細胞のトランスフォーメイシ 讐ンに使用した。１つのトランスフォーマントには、期待の構造を有するプラス ミドが含まれ、これをｐＧｘ浄書（内容に変更なし） ２３９３と命名Ｌ　タ。ｐ　ＧＸ　２３９３　（７）ＤＮＡ塩基配列を第１９図 に示す。 ｐＧＸ２３９３における、生物粘着物質前駆体類似タンパク質遺伝子は、この３ ′末端におけるユニークＡｓｐ７１８サイト、５′末端におけるユニークＮｏｔ Ｉサイト、およびＮｏｔＩサイトの上流３０１３塩基に位置するユニークＭ　Ｉ 　ｕ　Ｉサイトを利用することによって、大きさを倍加させた。ｐＧＸ２３９３ ＤＮＡは、Ｎｏｔ工およびＭ　１　ｕ　Ｉによって制限分解し、大きな断片（５ ゜２　ｋｂ）をゲル精製した。プラスミドＩ）ＧＸ２３９３ＤＮＡは、Ａｓｐ７ １８およびＭ　１　ｕ　Ｉによっても切断し、小さな断片（３，４ｋｂ）をゲル 精製した。この２つの断片は、前以てアニーリングしておいたオリゴマー２２２ ０および２２２１　（非リン酸化）と共に連結しｔ；。Ｅ。 ｃｏｌｉ　ＧＸ１２１０　（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５８００）は、連結混合物を用い てトランス７オームした。得られたプラスミドＹｐＧＸ２８ｇには、２８のデカ ペプチドおよび６つのへキサペプチドがコードされていなければならない。 この生物粘着物質前駆体類似タンパク質における、ざらＩ；２種類の結合も、同 じように、適当な大きなの断片のゲル精製、およびアニール化オリゴマーとの連 結によって実施した。これによって、５５のデカペプチドおよび１２のへキサペ プチドをシードすべきＹｐＧＸ２８９、および１１のデカペプチドおよび２４の へキサペプチド浄書（内容に変更なし） をコードすべきＹｐＧＸ２９０が生じた。これらＤＮＡ塩基配列の決定は行われ なかつＩ；が、ウェスタン法による試験では、実施例３の抗デカペプチド抗体と 反応するタンパク質の産生が認められた。これらタンパク質の分子量は、生物粘 着物質前駆体類似タンパク質セグ、メント中で、それぞれアミノ酸３０６個およ び６２２個を有するポリフェノール−キモトリプシン融合タンパク質で予期され るものであった。 実施例８ 数種の異なったデカペプチドおよびヘキサペプチドを含む生物粘着物質前駆体類 似タンパク質をコードする塩基配列の、酵母中での発現 実施例７において会合した生物粘着物質前駆体類似タンパク質コード配列を、Ｙ ｐＧＸ２６５ＧＡＬ４に存在する、酵母の発現モジュールに挿入するために、以 下のような方法を用いた。Ｍ１３ベクターのＭＧＸ４５１は、生物粘着物質前駆 体類似タンパク質コード配列、酵母プロモーター、およびＨｉｎｄＩ［［−５ｐ ｈＩ制限酵制限酵素口てＹｐＧＸ２７７ＧＡＬ４Ｐ　（実施例６）から（７）Ｐ Ｈ０５シグナルコ一ド配列をＨ１ｎｄｌｌ［およびＳｐｈ　Ｉ消化断片に挿入す ることによって会合した。ＭＧＸ４５１はＮｏｔＩおよびＳｐｈ　ｒで消化し、 大きな断片をゲル精製した。ＹｐＧＸ２８８　（実施例７参照）はＮｏｔｌおよ び５ｐｈＩで消化し、生物粘着物質前駆体類似タンパ浄書（内容に変更なし） り質コード配列を有する小さな断片をゲル精製した。２つの精製断片を連結して 、Ｅ、ｃｏｌｉをトランス７オームした。酵母発現モジュールに挿入された異種 の生物粘着物質前駆体類似タンパク質を有する、所望のトランス７オーマントを ＭＧＸ　４５６と命名した。ＭＧＸ４５６はＮｏｔＩおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで 消化し、小さなベクター断片をゲル精製した。ＹｐＧＸ２８４はＮｏｔＩおよび ＢａｍＨＩで消化し、大きなベクター断片をゲル精製した。続いて、これら２つ の断片を連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ中にトランスフオームした。得られた発現ベクタ ーは、ＹｐＧＸ２９１と命名した。そして、ＧＡＬ４遺伝子をＹｐＧＸ２９１の ユニークＨ１ｎｄＩＩ！サイトに加えｔ；ところ、ＹｐＧＸ２９１ＧＡＬ４を作 製した。 同じ方法で、プラスミドＹｐＧＸ２９０　（実施例７）からの生物粘着物質前駆 体類似タンパク質コード配列を酵母発現ベクターにトランスファーし、ＹｐＧＸ ２９７ＧＡＬ４を作製した。この遺伝的再構成の際に、生物粘着物質前駆体類似 タンパク質コード配列内で欠失が起き、１３８．０００ダルトンではなく１００ ，０００ダルトンのタンパク質をコードする配列が生じた。 酵母株Ｄ８は、ＹｐＧＸ２９１ＧＡＬ４ｊ；；よびｙｐｃＸ２９７ＧＡＬ４でト ランスフオームし、その翻訳産物を実施例６のように解析した。この解析によれ ば、株Ｄ８　（ＹｐＧＸ２９１ＧＡＬ４）　は、予想ｅおりの約３４゜００ダル トンの生物粘着物質前駆体類似タンパク質を産浄書（内容に変更なし） 生じミこのタンパク質は全酵母細胞タンパク質の１〜２％から成ることが分かっ た。株Ｄ８　（ＹｐＧＸ２９７ＧＡＬ４）によって産生された生物粘着物質前駆 体類似タンパク質のサイズは、Ｅ、ｃｏｌｉ中に存在するコード配列によって予 想されたものより小さく、ＹｐＧＸ２９０（１３８，０００ダルトン）には酵母 発現ベクターの再構成中に起きた欠失が反映していた。 実施例９ 生物粘着物質前駆体類似タンパク質の精製実施例４または７に記載したプラスミ ドの１つを含むＥ、　ｃｏｌｉ　ＧＸ３０１５細胞（３２ｇの湿式重量）を、２ ０ｍ１ａＴｒｉｓ−ＨＣＩ　２０ｍ１．２１１ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７゜５）、ｌ ＩＩＭフェニルメチルスルホニルクロリＦ、２５ｍＭヨード酢酸溶液に懸濁し、 フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ）への通過、および超音波処理によ って完全に破砕した。細胞破砕物、および生物粘着物質前駆体類似タンパク質を 含む封入体を、４℃にて３０分間２７．５００ｇでの遠心分離によってペレット 化した。このペレットを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ％　ＩＩＩＩＭＥＤＴＡ　 （＄）Ｈ７，５）中での懸濁および遠心によって徹底的に洗浄した。洗浄は、上 清が透明になるまで続けた。統いて、ペレットを、６Ｍグアニジン塩酸、５％β −メルカプトエタノール、２°５１１１Ｍヨード酢酸溶液１５ｍ１に溶解し、４ ℃にて３０分間３０．０００ｇで遠心分離した。その上清を０．２浄書（内容に 変更なし） ｍｘＥＤＴＡ％　ｌ　０ｍｇヨード酢酸溶液４Ｑに対して３回交換しながら透析 した結果、タンパク質の沈澱が生じた。 ０．５ｇのタンパク質を含む沈澱を、７０％蟻６４０ｍ１に溶解した。臭化シア ンを添加し、溶液を室温で１夜反応させた。これをロータリーエバポレーターに かけた後、残渣を水（残存の蟻酸からｐＨ４，０）２０ｍｌで抽出した。水溶性 分画のｐＨを、５Ｎ　ＫＯＨでｐＨ７゜０に調整した結果、いくらかの沈澱が生 じた。統いて、この上清を、５０ｍｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７，，５）で平 衡化したＣＭ−スルロースおよびＳ−セファロースのカラム（２，５Ｘ２６ｃｍ ）にかけた。カラムを１４時間５０１１１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７，５） で洗浄した後、生物粘着物質前駆体類似タンパク質を、塩の勾配（０〜０．５） 、または緩衝液のｐＨ変化によって溶出した。これらの分画は、２８０ｎｍでの 吸光度測定、およびクマシブルータンパク質染色ならびに特異抗体（実施例３） を用いたウェスタン法のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアッセ イした。生物粘着物質前駆体類似タンパク質を含む分画は、プールして、脱イオ ン水２Ｑに対して一夜で２回透析した。生じた懸濁液を凍結乾燥し、精製物質１ ｍｇを得た。必要に応じて、物質は、ｐＨ４，０の０．３Ｍ酢酸アンモニウムを 用、いＩニセファデックスＧ−７５カラムクロマトグラフイーによって更に精製 した。 精製タンパク質は、１０５℃の真空にて６Ｍの濃ＨＣ浄書（内容に変更なし） ｌ中で２４時間加水分解した。酸加水分解物中のアミノ酸は、Ｃ１８逆相ＨＰＬ Ｃカラム上で分離するＯ−７タルアルデヒド（ＯＰＡ）の誘導体として同定した （Ｆｌｅｕｒｙ、　Ｍ、Ｏ，およびＡｓｈｌｅｙ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、、　１３３：３３０−３３８（１９８３））。このアミノ酸組成は、アミノ 酸のサブ、セット（５ｕｂｓｅｔ）のみが生物粘着物質前駆体類似タンパク質に 存在するので、純度の確認に使用した。 実施例１０ 生物粘着物質前駆体類似タンパク質精製のｌ；めのスケールアップ法 １８０Ｑの発酵液から得られたＥ、ｃｏｌｉ細胞まｔ；は酵母細胞は、Ｗｅｓｔ ｐｈａｒｉａ遠心機で遠心分離し、生理食塩水で洗浄して、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａ ｕｌｉｎホモゲナイザーで破砕する前に、ｌ　ＯｍＭＥＤＴＡＳ　ｌ　、ＯｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）　、Ｉ　Ｏ＋ｎＭヨード酢酸 （ＩＡＡ）ｐＨ８，０に固体３０％として再懸濁した。 不溶性分画中に存在する生物粘着物質前駆体類似タンパク質を、Ｗｅｓｔｐｈａ ｒｉａ遠心機によって細胞破砕物とともに回収した。遠心分離しＩ；ペレットを 、ｐＨ２，２ないし２．５の酢酸または蟻酸中に固体２０％で再懸濁し、数時間 混合して、生物粘着物質前駆体類似タンパク質を可溶化した。この抽出物を遠心 分離または濾過して、固体を除去し、続いて透明な濾液をｓ　ｌ　Ｏｍ　Ｍ　Ｅ 　Ｄ　Ｔ　Ａ　ｓｌ　０ｍ１Ｍ　Ｉ　ＡＡｊ；よび１．ＯＩＯＭＰＭＳＦの存在 下、５Ｎ浄書（内容に変更なし） ＫＯＨを用いてｐＨ４，Ｏに調整した。 不純物は、濾過または遠心分離によって沈澱として除去した。次に、上溝中の生 物粘着物質前駆体類似タンパク質を、超遠心（分子量１０．０００の排除膜）に よって濃縮し、続いて凍結乾燥した。残渣（約５０〜１００ｇ）を７０％蟻酸１ ．２１２に溶解した後、臭化シアンを添加して、その溶液を室温で２４時間撹拌 した。続いて、反応混合物をロータリーエバポレーターで乾燥し、残渣をｐＨ８ ，０の６Ｍグアニジン塩酸５０５０−１Ｏ０中に溶解して、４℃にて２０分間３ ０．０００ｇで遠心分離した。その上清を、同一溶液で平衡化したセファクリル Ｓ−３０００のクロマトグラフィーにかけた。生物粘着物質前駆体類似タンパク 質を含む分画を集め、酢酸でｐＨ４，０に調整し、水に対して透析し、凍結乾燥 して、塩を含まない粉末として回収した。 実施例１１ 生物粘着物質前駆体類似タンパク質のヒドロキシル化チロシナーゼは、チロシン のヒドロキシル化およびＤＯＰＡの酸化を触媒することが知られている（ＣＩｔ ｏら。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２２２：４０７−４１１　（１９８４）　；　Ｍａｒｕｍ ｏおよびＷａ　ｉ　ｔｅ　。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、’　８９２：９８−１０３　 （１９８６））ので、マツシュルームのチロシナーゼは、Ｅ、ｃｏｌｉまたは酵 母産生の生物粘着物質前駆体類似タンパク質を酵素的に修飾することができる。 タンパク質２ｍｇ５２５μＭアス浄書（内容に変更なし） コルビン酸およびＯ−０５Ｍリン酸ナトリウムを含む混合物（ｐＨ５〜７．５） １ａ＋１に、マツシュルームのチロシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃｓｌｓ　Ｃ ｏ、　）を添加した。この混合物を室温で３時間反応させた。ヒドロキシル化工 程の動力学は、ＤＯＰＡおよびＤＯＰＡ誘導体キノンの呈色アッセイで記録した （　Ｗａｉｔｓ、　Ｊ、Ｈ，およびＭ、Ｌ、　Ｔａｎｚｅｒ、　Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、、　Ｉｌｌ：１３１−１３６　（１９８１））　、さらに、産物 は、上記のような酸加水分解後、アミノ酸分析にかけた（実施例９）。回収工程 の間に損失の補正を行った後、アミノ酸分析によれば、約４０％のチロシン残基 がり。 ＰＡに転化されたことが分かる。 ヒドロキシル化の後、溶液は、ｐＨを酢酸で４に調節し、５％酢酸１００容に対 して透析した。これら試料をロータリーエバポレーターにかけ、容積を減らした 。トリプシナーゼは、０．２Ｍ酢酸で溶出するＬＨセファデックス６０カラムの 使用、または膜濾過法（Ａｍ１ｃｏｎ　ｐＨ３０、排除分子量３０，０００）の 使用によって除去した。 ヒドロキシル化の後に行う別の精製法を以下に示す。 ＣＮＢｒ開裂後、ｐＨ７，０で得られた上溝（実施例９参照）を、アスコルビン 酸またはトロボロン（Ｋａｈｎ、　Ｖ。 およびＡ、　Ａｎｄｒａｖｉｓ　、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｒｙ、　２４：９ ０５”９０８　（１９８５））の存在下でｐＨ５ないし７に酸性化した。ヒドロ キシル化は、チロシナーゼの添加によって開始した。反応終了時、試料をＳＥ− セファデックスカラムで精製し浄書（内容に変更なし） た。ＤＯＰＡを含む分画をプールし、２．５％酢酸に対して透析して、凍結乾燥 した。ヒドロキシル化タンパク質の純度は、酸−尿素ポリアクリルアミドゲル電 気泳動（Ｐａｎｙｉｕｍ　Ｓ、およびＲ，Ｃｈａｌｋｌｅｙ、　Ａｒｃｈ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ。 ｐｈｙｓ、、　１３０：３３７−３４６　（１９６９））およびアミノ酸分析で 確定した。 さらに、ＤＯＰＡ含有生物粘着物質前駆体類似タンパク質は、接着剤としての製 品化に供される。 実施例１２ 金属またはプラスチックなどの表面は、しばしば酸による酸化、炎処理またはプ ラズマ衝撃といった前処理が施され、表面に「湿り」の性質を与えたり、接着剤 との反応性を改善させる。 微生物が産生じ、表面に塗布したヒドロキシル化生物粘着物質前駆体類似タンパ ク質は、従来の接着剤用の前処理剤または下塗り剤として使用が可能である。２ つのアルミニューム片を結合させるプライマー旭理として、生物粘着物質前駆体 類似タンパク質の使用例を以下に挙げる。 実施例１１で調製したヒドロキシル化生物粘着物質前駆体類似タンパク質を１０ ’−４００ｍｇ／ｍ１（１０〜４０％ｖ／ｖ）の濃度で脱気水（至適ｐＨ７，０ −８，０）に溶解した。溶液を窒素下で保ち、ＤＯＰＡ残基のキノンへの不完全 な酸化および接着プライマーの硬化を防止し浄書（内容に変更なし） Ｉ；。 生物粘着物質前駆体類似タンパク質溶液を、通常の空気雰囲気下で油の付着して いないアルミニューム表面に一様に噴霧または塗布する。次に、表面を低湿度雰 囲気下で乾燥させた。キノン酸化および化学的架橋を示す、褐色または黄褐色を 呈しｔ；。続いて、接着する下塗り表面を、エポキシ接着剤などの標準的物質を 用いて結合させる。 生物粘着物質前駆体類似タンパク質の硬化を促進し、プレヒドロキシル化段階（ 実施例１１参照）を省略する別の方法には、マツシュルームのチロシナーゼ（Ｉ ｔ’ｏら。 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２２２：４０７−４１１　（１９８４））または 連鎖球菌のチロシナーゼ（ＬｅｒｃｈおよびＥｔｔｌｉｎｇｅｒ、　Ｅｕｒ、　 Ｊ、　Ｂｉ。 ｃｈｅｍ、、　３１：４２７−４３７　（１９７２））を、使用直前（例えば、 噴霧器のノズル中で）に０　、０１　＝　ｌ　、　Ｏｍｇ／ｍｌの溶液濃度で学 ヒドロキシル化タンパク質（実施例１０）と混合する方法が挙げられる。これら の条件下で酵素は、チロシンから反応性キノン種への酸化作用をもたらす。 他のポリマーと混合した生物粘着物質前駆体類似タンパク質も、その他の接着剤 用プライマーとして使用することができる。 実施例１３ 生物粘着物質前駆体類似タンパク質の使用実施例１１で調製したヒドロキシル化 生物粘着物質前浄側内容に変更なし） 駆体類似タンパク質を、３０〜７００　ｍｇ／　ｍｌの濃度（３〜７０％固体） で、希酸でｐ）（６，０に調整した水（または、医用生理食塩水）へ溶解した。 表面への適用直前に、塩基溶液（約１１５０容）を添加して、ｉ）Ｈを８．０に 上げた。ムラサキガイの、カテコールオキシダーゼ（Ｗａｉｔｅ、　Ｊ、Ｈ，、 Ｊ、　Ｍａｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ａｓ５ｏｃ。 、　６５：３５９〜３７１　（１９５８））などの酵素も、適用直前に塩基溶液 の代わり、まＩ；はそれに加えて添加し、ＤＯＰＡ残基のキノンへの酸化を促進 して、より急速な硬化が可能となる。適用直前の混合は、例えば、フィブリンシ ーラントにおいて記載した（Ｒｅｄｌ、　Ｈ，およびＧ、　Ｓｃｈｌａｇ、　Ｆ ａｃｉａｌ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　２：３１５−３２１　（１９ ８５））ようなりｕｐｌｏｊｅｃｔ”シリンジのスプレーヘッドで生じることが ある。 マツシュルームのチロシナーゼ（Ｉｔｏら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。 ２２２：４０７〜４１１　（１９８４））まＩ；は連鎖球菌のチロシナーゼ（Ｌ ｅｒｃｈおよびＥｔｔｌｉｎｇｅｒ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　 ３１：４２７−４３７　（１９７２））も使用できる。チロシナーゼについて、 生物粘着物質前駆体類似タンパク質を前置てヒドロキシル化する必要はなく、実 施例１０で記載したヒドロキシル化の前処理なしで材料を使用することができる 。ＤＯＰＡ残基をキノンへ酸化し、硬化する（酵素の有無にかかわらず）ために 、生物粘着物質前駆体類似タンパク質には溶解厳素が存在しなければならない。 実施例１４ 浄書（内容に変更なし） 他のタンパク質ポリマーと生物粘着物質前駆体類似タンパク質の組成物 ムラサキガイのポリフェノール性タンパク質接着剤の性質を調節し、改善するた めに、他のポリマーとの混合物が使用される。生物粘着物質前駆体類似タンパク 質は、ムラサキガイのｂｙｓｓａｌ　ｔｈｒｅａｄ中のコラーゲンと自然に会合 する。コラーゲンは、フェノール性タンパク質組戊物の粘着強度を高める！こめ に使用できる天然ポリマーの１つである。酸溶性コラーゲン（Ｇａ１ｌｏｐ、　 Ｐ、Ｍ、およびＳ。 ５ａｉｆｔｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　ＶＴ：６３５−６４１ 　（１９６３））は、１０〜７０％（ｗ／ｖ）で希酸溶液に溶解する。コラーゲ ンは、全固体範囲がｌＯないし７０％であって、生物粘着物質前駆体類似タンパ ク質を含む固体の比が１％ないし５０％として、実施例１３に記載のような生物 粘着物質前駆体類似タンパク質混合物と混合することができる。 生物粘着物質前駆体類似タンパク質のパーセントが高いほど、低いパーセントの 生物粘着物質前駆体類似タンパク質のものより固体組成物の架橋強度が増す。ア ルカリ溶液を、使用直前、混合物の中和に使用することができる。これによって 、混合物のより急速な酸化および架橋（硬化）が可能となる。また、天然のｐＨ で、コラーゲンは結晶化し、添加した接着剤の強度を高くする。 さらに、生物粘着物質前駆体類似タンパク質は、コラーゲンの成塁シートを組み 合わせて使用される。この方法は、エポキシ組成物のセメントまたはグラファイ ト・フ浄書（内容（二変更なし） アイバー中の強化鋼の使用と類似している。市販のコラスタート（ｃｏｌｌａｓ ｔａｔ）　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｏｍｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎによって供給されるＨａｒｉｔｒｅｘ製品）などのコラーゲンシート、 または他の類似製品は、実施例１３に記載のように、活性化した生物粘着物質前 駆体類似タンパク質に噴霧もしくは浸せし、続いて結合表面に塗布する。 同様の方法で、他の型の不溶性または結晶性タンパク質シートを、接着タンパク 質の強化材として使用することができる。例えば、絹布もしくは羊毛のケラチン 繊維から得られる、可溶化および強化αケラドース（Ｊ、ＤｅＢｅｒｓａｇｂｅ 、　Ｃｕｒｒ、　Ｐｒｏｂｌ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、６：３４−８６　（１９ ７６））で形成されるシート、または精製フィブリノーゲン、トロンビンならび に第■因子から形成される重合フィブリンクロット（Ｒｅｄｌ、　Ｈ，８よびＧ 、　Ｓｃｈｌｏｇ、　Ｆａｃｉａｌ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　２： ３１５−３２１　（１９８５））が使用される。医療用に、フィブリンシートを 使用することによって、創傷治癒の促進に役立つ可能性がある（上記のＲｅｄ　 １およびＳｃｈ”ｇ）　６ 実施例１５ 炭水化物ポリマーと生物粘着物質前駆体類似タンパク質の組成物 キトサンを、１％酢酸に３０−１５０ｍｇ／ｍｌ　（３−１５％ｖ／ｖ）の濃度 まで溶解する。最終ｐＨが約６．０の浄書（内容に変更なし） キトサン溶液を、実施例１１のように調製したヒドロキシル化、生物粘着物質前 駆体類似タンパク質と混合する。 混合の際の濃度は、通常、生物粘着物質前駆体類似タンパク質が２ないし３０％ 、およびキトサンが２ないし７％とする。キトサンが溶解可能なｐＨ６，０で、 チロシナーゼの添加によって、反応性ＤＯＰＡ誘導キノロンおよび架橋の形成が 触媒される。適用前にｐＨが８．０へ上昇すると、場合により、望ましくない溶 液からキノロンの急速な沈澱が生じる。 浄書（内容に変更なし） ｔｒｐＤ　ＦＩＧ、　ｆ ＡＬ４ ＦＩＧ、３ 浄書（内容に変更なし） ＰＡＤ＝ポリフェノール性粘着性デカペプチドＦＩＧ、２ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ 浄書（内容に変更なし） Ｅ 二 呂 Ｒ６，８ ＲＧ、　９ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　１０ ＭＷＸｌｏ”３ ・１８．４ ・１４．３ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） 口めロ　ロｅ（ＯすＣロ的く　ロめく　ｏ防く〜為く　５＞く　Ｑ島く　ロ為く 　ロ島く　〜島くＪ（Ｊ（；（−（−一（ｕ−（ 浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体をコードするＤＮＡ配 列を含む組換えペクター。 ２．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はムラサキガイ中に見出されるタ ンパク質の類似体である請求項１記載の組換えペクター。 ３．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はミチラス属に属するムラサキガ イ中に見出されるタンパク質の類似体である請求項２記載の組換えペクター。 ４．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はミチラス・エデュリス中に見出 されるタンパク質の類似体である請求項３記載の組換えペクター。 ５．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、約５０ないし約１５００のア ミノ酸を含み、該アミノ酸の約２０％ないし約４０％がプロリン残基、約１０％ ないし約４０％がリジン残基、約１０％ないし約４０％がチロシン残基、約０％ ないし約４０％がプロリン、リジン及びチロシン以外のアミノ酸である請求項２ 記載の組換えペクター。 ６．前記ＤＮＡ配列は、以下の群から選ばれる１又は２以上の繰返しポリペプチ ドをコードする請求項２記載の組換えペクター。 ａ．【配列があります】 ｂ．【配列があります】 ｃ．【配列があります】ただし、 Ａ＝アラニン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、 Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニ ン、Ｖ＝バリン、Ｙ＝チロシン ７．生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体をコードするＤＮＡを 列を含む組換えペクターを含む宿主。 ８．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はムラサキガイ中に見出されるタ ンパク質の類似体である請求項７記載の宿主。 ９．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はミチラス属に属するムラサキガ イ中に見出されるタンパク質の類似体である請求項８記載の宿主。 １０．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はミチラス・エデュリス中に見 出されるタンパク質の類似体である請求項９記載の宿主。 １１．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、約５０ないし約１５００の アミノ酸を含み、該アミノ酸の約２０％ないし約４０％がプロリン残基、約１０ ％ないし約４０％がリジン残基、約１０％ないし約４０％がチロシン残基、約０ ％ないし約４０％がプロリン、リジン及びチロシン以外のアミノ酸である請求項 ８記載の宿主。 １２．前記ＤＮＡ配列は、以下の群から選ばれる１又は２以上の繰返しポリペプ チドをコードする請求項８記載の宿主。 【配列があります】 ただし、 Ａ＝アラニン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、 Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニ ン、Ｖ＝バリン、Ｙ＝チロシン １３．前記宿主は大腸菌、サッカロミセス・セレビシアエ、アスパラギルス・ニ ガー及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓからなる群より選ばれる請求項７記載の宿主。 １４．前記宿主は大腸菌である請求項１３記載の宿主。 １５．前記宿主はサッカロミセス・セレビシアエである請求項１３記載の宿主。 １５．生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体を含む組換えタンパ ク質。 １７．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はムラサキガイ中に見出される タンパク質の類似体である請求項１６記載の組換えタンパク質。 １８．前記生物粘着物質前躯体タンパク質類似体はミチラス属に属するムラサキ ガイ中に見出されるタンパク質の類似体である請求項１７記載の組換えタンパク 質。 １９．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はミチラス・エデュリス中に見 出されるタンパク質の類似体である請求項１８記載の組換えタンパク質。 ２０．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体は、約５０ないし約１５００の アミノ酸を含み、該アミノ酸の約２０％ないし約４０％がプロリン残基、約１０ ％ないし約４０％がリジン残基、約１０％ないし約４０％がチロシン残基、約０ ％ないし約４０％がプロリン、リジン及びチロシン以外のアミノ酸である請求項 １７記載の組換えタンパク質。 ２１．前記ＤＮＡ配列は、以下の群から選ばれる１又は２以上の繰返しポリペプ チドをコードする請求項１７記載の組換えタンパク質。 ａ．【配列があります】 ｂ．【配列があります】 ｃ．【配列があります】 ｄ．【配列があります】 ｅ．【配列があります】 ｆ．【配列があります】 ｇ．【配列があります】 ｈ．【配列があります】 ｉ．【配列があります】ただし、 Ａ＝アラニン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、 Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニ ン、Ｖ＝バリン、Ｙ＝チロシン ２２．水酸化された形態にある生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘 導体を含む生物粘着物質タンパク質類似体。 ２３．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はムラサキガイ中に見出される タンパク質の類似体である請求項２２記載の生物粘着物質タンパク質類似体。 ２４．前記生物粘着物質前躯体タンパク質類似体はミチラス属に属するムラサキ ガイ中に見出されるタンパク質の類似体である請求項２３記載の生物粘着物質タ ンパク質類似体。 ２５．前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体はミチラス・エデュリス中に見 出されるタンパク質の類似体である請求項２４記載の生物粘着物質タンパク質類 似体。 ２６．前記生物粘着物質前躯体タンパク質類似体は、約５０ないし約１５００の アミノ酸を含み、該アミノ酸の約２０％ないし約４０％がプロリン残基、約１０ ％ないし約４０％がリジン残基、約１０％ないし約４０％がチロシン残基、約０ ％ないし約４０％がプロリン、リジン及びチロシン以外のアミノ酸である請求項 ２２記載の生物粘着物質タンパク質類似体。 ２７．前記ＤＮＡ配列は、以下の群から選ばれる１又は２以上の繰返しポリペプ チドをコードする請求項２２記載の組換えペクター。 ａ′．【配列があります】 ｂ′．【配列があります】 ｃ′．【配列があります】 ｄ′．【配列があります】 ただし、 Ａ＝アラニン、Ｈ＝ヒスチジン、１＝イソロシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、 Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニ ン、Ｖ＝バリン、Ｙ＝チロシン ２８．チロシン残基の少なくとも一部が水酸化されている請求項２６又は２７記 載の生物粘着物質タンパク質類似体。 ２９．生物粘着物質タンパク質類似体及び適当な溶媒を含む接着剤組成物。 ３０．前記生物粘着物質タンパク質類似体は、生物粘着物質前駆体タンパク質類 似体から誘導される請求項２９記載の接着剤組成物。 ３１．（ａ）（ｉ）前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体を コードするＤＮＡ配列と、（ｉｉ）前記ＤＮＡ配列に機能的に結合されたプロモ ーター及び転写開始シグナルであって、前記宿主中で前記生物粘着物質前駆体タ ンバク質類似体の発現を行なうことができるもの とを台む組換えペクターでトランスフォームした宿主を培養する工程と、 （ｂ）生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体を発現する工程と、 （ｃ）前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体を回収する工程 とを含む、生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体の生産方法。 ３２．（ａ）（ｉｉ）前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体 をコードするＤＮＡ配列と、（ｉｉ）前記ＤＮＡ配列に機能的に結合されたプロ モーター及び転写開始シグナルであって、前記宿主中で前記生物粘着物質前駆体 タンパク質類似体の発現を行なうことができるもの とを含む組換えペクターでトランスフォームした宿主を培養する工程と、 （ｂ）生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体を発現する工程と、 （ｃ）前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体又はその誘導体を回収する工程 と、 （ｄ）前記生物粘着物質前駆体タンパク質類似体を水酸化する工程とを含む、生 物粘着物質タンパク質類似体の生産方法。 ３３．少なくとも１つの面に生物粘着物質タンパク質類似体を塗布し、該面と他 の面とを互いに接触させることから成る、２つの面の接着方法。