JPH0249586A - Novel thrombolytic agent and production thereof - Google Patents
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Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規プラスミノゲン活性化因子、該因子を産す
る細胞、該因子をコードするＤＮＡ配列及び該因子の製
造法に係わる。本発明による新規プラスミノゲン活性化
因子は、プラスミノゲンをフィブリン溶解活性を有する
プラスミンに変換する作用を有し、種々の血栓症の治療
薬として用いることができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a novel plasminogen activator, a cell producing the factor, a DNA sequence encoding the factor, and a method for producing the factor. The novel plasminogen activator according to the present invention has the effect of converting plasminogen into plasmin having fibrinolytic activity, and can be used as a therapeutic agent for various thromboses.
天然型ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（以下、ＴＰ
Ａと略記する）は、ヒト・メラノーマ細胞（Ｂｏｈｅｓ
ｍｅｌａｎｏｍａ）の分泌するＴＰＡについてよく研
究され、その５ＤＳ−ゲル電気泳動による推定分子量（
Ｍｒ）は６３にと６５にのものがあり、５２７のアミノ
酸残基を持つポリペプチドとされている（Ｐｅｎｎｉｃ
ａ、 Ｄ、 ら（１９８３年）「ネイチ＋ （Ｎａ
ｔｕｒｅ） Ｊ 、 ３０１巻、２１４頁〕。この分子
量約６３Ｋ、６５にのＴＰＡの他に、Ｍｒが５６Ｋ Ｃ
Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｌ、 Ｃ，と−ａｃｈｓｍａｎ
Ｊ、 Ｔ、 （１９８２年）「バイオキム・バイオフィ
シ・アクタ（Ｂｉｏｃｈ−４ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ）ｊ 、 ７０４巻、４５０頁〕、５４Ｋ （Ｓ
ｕｅｉｓｈｉ、 Ｋ、ら（１９８２年）「バイオキム・
バイオフィシ・アクタ（同上） Ｊ 、 ７．１７ ！
、 ３２７頁） 、 ５５ Ｋ （Ｙａｎｇ、 Ｎ、
Ｓ、 ら（１９８３年）「モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー（Ｍｏ−］、 Ｃｅ１１． Ｂ
ｉｏｌ、） Ｊ 、 ３巻、９８２頁〕等のプラスミ
ノゲン活性化因子の存在が知られているが、それらの構
造は何れも解析されていない。ヒト咽頭癌細胞Ｄｅｔｒ
ｏｉｔ−５６２から非つロキナーゼ型プラスミノゲン活
性化因子のｃＤＮＡがクローニングされ、大腸菌で発現
された（特開昭６１−１３９３８６）。Natural human tissue plasminogen activator (hereinafter referred to as TP)
A) are human melanoma cells (Bohes
TPA secreted by M. melanoma has been well studied, and its molecular weight estimated by 5DS-gel electrophoresis (
There are two types of Mr), 63 and 65, and it is said to be a polypeptide with 527 amino acid residues (Pennic
a, D, et al. (1983) “Naichi+ (Na
ture) J, vol. 301, p. 214]. In addition to TPA with a molecular weight of approximately 63K and 65, Mr is 56K C
G11bert, L, C, and -achsman
J, T. (1982) Bioch-4m, Biophys, A.
cta)j, vol. 704, p. 450], 54K (S
ueishi, K. et al. (1982) “Biokim.
Biophysia Acta (ibid.) J, 7.17!
, 327 pages), 55 K (Yang, N.
S. et al. (1983) “Molecular &
Cellular Biology (Mo-), Ce11.B
Although it is known that there are plasminogen activators such as plasminogen activators such as [B. Human pharyngeal cancer cell Detr
The cDNA of a non-cytokinase plasminogen activator was cloned from oit-562 and expressed in Escherichia coli (Japanese Patent Laid-Open No. 139386/1986).
このｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列は、メラ
ノーマ由来のＴＰＡと比べ、一部のアミノ酸残基の置換
とアミノ酸配列の欠失を有している。The amino acid sequence deduced from this cDNA sequence has some amino acid residue substitutions and amino acid sequence deletions compared to melanoma-derived TPA.
上述メラノーマ由来のＴＰＡのアミノ末端アミノ酸はＳ
ＥＰであるが、子宮組織由来のＴＰＡにはＶＡＬから始
まるＴＰＡが報告されており（Ｐ。The amino terminal amino acid of the melanoma-derived TPA mentioned above is S.
Although it is EP, it has been reported that TPA derived from uterine tissue starts from VAL (P.
ｈｌ、 Ｇ、 ら（１９８５年） ｒＰＥＢｓレタ
ー（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、） Ｊ 、 １６８巻、２９
頁〕、またアミン末端がＣＬＹであるＴＰＡも知られて
いる（Ｊｏｒｎｖａｌｌ、 Ｈ，ら（１９８３年）ｒＦ
ＢＢｓレター（同上）Ｊ 、 １５６巻、４７頁〕。以
上のように、ＴＰＡについてはアミン末端アミノ酸が異
なるいくつかの分子種が知られている。hl, G. et al. (1985) rPEBs Letter (FEBS Lett,) J, vol. 168, 29
Page], and TPA in which the amine terminus is CLY is also known (Jornvall, H, et al. (1983) rF
BBs Letter (ibid.) J, vol. 156, p. 47]. As mentioned above, several molecular species of TPA with different amine terminal amino acids are known.
ＴＰＡは現在、血栓症の治療に用いられている（Ｇｒｏ
ｓｓｂａｒｄ、 Ｅ、 Ｂ、 （１９８７年）「ファー
マシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）」、４巻、３７５頁〕。し
かし、ＴＰＡの最大の欠点はその血中からの急速なりリ
アランスである。TPA is currently used to treat thrombosis (Gro
ssbard, E. B. (1987) 'Pharmaceutical Research
Cal Research), Volume 4, Page 375]. However, the biggest drawback of TPA is its rapid release from the blood.
血流中に投与されたＴＰＡは、主に肝臓で代謝されると
推定され［Ｆｕｃｈｓ、 Ｈ，Ｅ、ら（１９８５年）「
ブランド（Ｂｌｏｏｄ）Ｊ 、 ６５巻、５３９頁〕、
その血中半減期は僅かに２分である（Ｃｏｌｌｅｎ、
Ｄ、ら（１９８５年）［サーキュレーション（Ｃｉｒｃ
ｕｒａｔｉｏｎ）Ｊ 、 ７２巻、３８４頁〕。従って
、血栓症の治療には大量のＴＰＡの投与が必要である。It is estimated that TPA administered into the bloodstream is mainly metabolized in the liver [Fuchs, H.E., et al. (1985).
Blood J, Volume 65, Page 539],
Its blood half-life is only 2 minutes (Collen,
D. et al. (1985) [Circ.
ration) J, vol. 72, p. 384]. Therefore, treatment of thrombosis requires administration of large amounts of TPA.
ＴＰＡのような蛋白の大量投与による血栓症治療は、極
めて高価な治療になるばかりでなく、抗原抗体反応によ
る副作用という懸念されるべき問題を含んでいる。Thrombosis treatment by administering large amounts of proteins such as TPA is not only an extremely expensive treatment, but also involves the worrying problem of side effects due to antigen-antibody reactions.
従って、ＴＰＡ分子の化学的修飾（ＷＯ８４１０１７８
６）、酵素的修飾（特開昭６２−２８２５８２）或いは
遺伝子工学的改変（特開昭６１−２４３０２４ 、特開
昭６２−１３０６９０ 、特開昭６２−２７２９７６、
特開昭６２−２６９６８８．特開昭６２−２８２５８２
）等により血中持続性の改良された、即ち血中半減期の
長いＴＰＡ誘導体作製の試みが行われている。Therefore, chemical modification of TPA molecules (WO8410178
6), enzymatic modification (JP 62-282582) or genetic engineering modification (JP 61-243024, JP 62-130690, JP 62-272976,
Japanese Patent Publication No. 62-269688. Japanese Patent Publication No. 62-282582
), etc., attempts have been made to produce TPA derivatives with improved persistence in blood, that is, with a long half-life in blood.
本発明は、血中半減期の長いグリコシル化された新規プ
ラスミノゲン活性化因子の発見に基づく。The present invention is based on the discovery of a novel glycosylated plasminogen activator with a long blood half-life.
本発明は該プラスミノゲン活性化因子を産生ずる動物培
養細胞の作製法、及び該動物培養細胞を利用した該プラ
スミノゲン活性化因子の製造方法を提供するものである
。The present invention provides a method for producing cultured animal cells that produce the plasminogen activator, and a method for producing the plasminogen activator using the cultured animal cells.
即ち、本発明の第１は、アミノ酸配列：Ｒ−５ＥＲＴＹ
ＲＧＬＮ ＡＳＰ Ｔ）ＩＲＡＲＧ
ＡＳＰ
ＡＲＧ
ＡＬＡ
ＣＹＳ
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ＡＳＮ
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ＡＲＧ
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ＰＲＯ
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ＰＲＯ
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ＰＲＯ
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ＣＹＳ
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ＡＳＮ
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ＬＮ
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ＲＰ
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ＹＲ
ＨＲ
５Ｎ
ＡＲＧ ＴＨＲＶＡＬ ＴＨＲＡＳＰ Ａ
ＳＮＭＥＴ ＬＥＵ ＣＹＳ ＡＬＡ
ＧＬＹ ＡＳＰＴＨＲＡＲＧ ＳＥＲＧＬＹ
ＧＬＹ ＰＲＯＧＬＮ ＡＬＡ Ａ
ＳＮ ＬＥＵ ＨＩＳ ＡＳＰＡＬＡ
ＣＹＳ ＧＬＮ ＧＬＹ ＡＳＰ
５ＥＲＧＬＹ ＧＬＹ ＰＲＯＬＥＵ Ｖ
ＡＬ ＣＹＳＬＥＵ ＡＳＮ ＡＳＰ
ＧＬＹ ＡＲＧ ＭＥＴＴＨＲＬＥＵ
ＶＡＬ ＧＬＹ ＩＬＥ ＩＬＥＳＥＲＴ
ＲＰ ＧＬＹ ＬＥＵ ＧＬＹ ＣＹ
ＳＧＬＹ ＧＬＮ ＬＹＳ ＡＳＰ
ＶＡＬ ＰＲＯＧＬＹ ＶＡＬ ＴＹＲＴ
ＨＲＬＹＳ ＶＡＬＴＨＲＡＳＮ ＴＹＲＬＥ
Ｕ ＡＳＰ ＴＲＰＩＬＥ ＡＲＧ
ＡＳＰ ＡＳＮ ＭＥＴ ＡＲＧＰＲＯ−
ＣＯＯＨ
（配列中、ＲはＮＨ，−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ＡＲＧ或いは
ＮＨ２であり、ＮＨ２−はアミノ末端を示し、−ＣＯＯ
Ｈはカルボキシ末端を示す）（以下、アミノ酸配列Ａと
記す）で示される配列を有するグリコシル化されたプラ
スミノゲン活性化因子を、本発明の第２は、ヒト組織プ
ラスミノゲン活性化因子をコードする染色体ＤＮＡ配列
に、動物培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモーター
領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有するＤＮＡによっ
て形質転換され、上記アミノ酸配列Ａで示される配列を
有するグリコシル化されたプラスミノゲン活性化因子を
生産する動物培養細胞を、本発明の第３は、ヒト組織プ
ラスミノゲン活性化因子をコードする染色体ＤＮＡ配列
に、動物培養細胞で機能する他の遺伝子のプロモーター
領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有するＤＮＡによっ
て形質転換された動物培養細胞を培養し、上記アミノ酸
配列Ａで示される配列を有するグリコシル化されたプラ
スミノゲン活性化因子を生成せしめ、これを採取するプ
ラスミノゲン活性化因子の製造方法を、
本発明の第４は、上記アミノ酸配列Ａで示される配列を
有するプラスミノゲン活性化因子をコードするｃ ＤＮ
Ａ配列を、
本発明の第５は、上記アミノ酸配列Ａで示される配列を
有するプラスミノゲン活性化因子をコードするｃＤＮＡ
配列を含む発現ベクターによって形質転換された動物培
養細胞を培養して、プラスミノゲン活性化因子を生成せ
しめ、これを採取するプラスミノゲン活性化因子の製造
方法をそれぞれ内容とするものである。That is, the first aspect of the present invention is the amino acid sequence: R-5ERTY
RGLN ASP T) IRARG ASP ARG ALA CYS SER PR○ PRO GLY TYR ARG CYS GLY HE CYS ASP GLY THR SER PRO ALA GLN GLY LU THR ALA TYR AS P LEU CYS ASP T Y R' CYS CYS SER CYS SER HIS GLY TRP THR GLY THR SER ASN LEU SER ALA GLY ARG SER VAL TYR SER LU TYR ALA SER ALA ASN CYS ILE TRP GLY TRP ALA GLY ILE ASN ASN CYS HE SER THR GLY HE TYR LEU SER SER TY, R SER SER ALA ASN GLN ARG ARG HIS PRO PRO CYS SER PRO ASN GLY ARG THR CYS MET LU TYR HR LU SER CYS ARG LEU ASN ASP TRP ALA LU ALA SER ASN GLY LU LEU ILE LEU TH R ALA GLY ARG ALA VAL LEU ASP THR TYR ARG HE I S ILE ARG HE LEU ILE CYS ILE ALA GLN CYS ASN CYS EtJ THR VAL CYS SER ILE ALA PRO HE SER LEU ILE LEU HE GLY GLN ALA HIS PRO PRO CYS TRP PRO GLY GLN CYS ASP TRP ALA PRO CYS SER SER GLN CYS ASN LEU ASN ASP TRP ASN LU SER EU PRO GLY ■ LE GLN CYS GLY GLY SER ALA LU VAL PRO GLY TYR GLY CYS ARG TYR CYS ARG GLN GLY ALA ALA HIS LU GLY CYS ALA ARG TYR SER LEU CYS ASP HIS ARG CYS SER GLN HE LEU SER ALA ARG ARG ILE TRP HIS HE PRO VAL TYR LU LU VAL ASP ASP LEU ARG SER CYS LEU THR GLY LA ER LA RO ER RO LE RG LU AL IS SP LE YS YS AL EU LN LU YR EU LU IS ER LN I S EU AL LU LU YS HR LA ER LA AL RO EU YS LY ER RG AL ER H ■ S IS LY AL LN YS LU YR ED SP LN RG RO RO LU YS RO EU RG RG EU EU RG RO YS YR HE EU ER LU T) (R LA SP EU IS HE YS EU YS EU HR HR LY HE LE SP SN LN ER ER AL SP RP ER LU YR LU YR HR 5N ARG THRVAL THRASP A
SNMET LEU CYS ALA
GLY ASPTHRARG SERGLY
GLY PROGLN ALA A
SN LEU HIS ASPALA
CYS GLN GLY ASP
5ERGLY GLY PROLEU V
AL CYSLEU ASN ASP
GLY ARG METTHRLEU
VAL GLY ILE ILESERT
RP GLY LEU GLY CY
SGLY GLN LYS ASP
VAL PROGLY VAL TYRT
HRLYS VALTHRASN TYRLE
U ASP TRPILE ARG
ASP ASN MET ARGPRO-
COOH (In the sequence, R is NH, -GLY-ALA-ARG or NH2, NH2- represents the amino terminal, -COO
The second aspect of the present invention is a chromosomal DNA encoding a human tissue plasminogen activator. A glycosylated plasminogen activator having the sequence represented by the above amino acid sequence A is transformed by a DNA having a DNA sequence connected to the sequence of the promoter region of another gene that functions in cultured animal cells. The third aspect of the present invention is to produce cultured animal cells using DNA having a DNA sequence in which a chromosomal DNA sequence encoding human tissue plasminogen activator is connected to a promoter region sequence of another gene that functions in cultured animal cells. The present invention provides a method for producing a plasminogen activator, which comprises culturing transformed cultured animal cells to produce a glycosylated plasminogen activator having the sequence represented by the above amino acid sequence A, and collecting the glycosylated plasminogen activator. 4 is a cDN encoding a plasminogen activator having the sequence shown in the amino acid sequence A above.
The fifth aspect of the present invention is a cDNA encoding a plasminogen activator having the sequence represented by the above amino acid sequence A.
Each content includes a method for producing a plasminogen activator, in which cultured animal cells transformed with an expression vector containing the sequence are cultured to produce a plasminogen activator, and the plasminogen activator is collected.
ＴＰＡの製造法として、本因子を生産する細胞株を培養
し、培養液から本因子を精製する方法がある（Ｒ４ｊｋ
ｅｎ、 Ｄ、 Ｃ，とＣｏ１１ｅｎ、 Ｄ、 （１９
８１年）「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、） Ｊ 、
２５６巻、 ７０３５頁〕。しかし、この方法は生産
細胞のＴＰＡ生産能に大きく依存し、大量生産が困難で
ある。ＴＰＡのＤＮＡ配列にＳＶ４０の初期プロモータ
ーを接続したＤＮＡ配列とジヒドロ葉酸還元酸素をコー
ドするＤＮＡ配列から成るプラスミドでＣＨＯ（チャイ
ニーズ・ハムスター・卵巣）細胞を形質転換し、更にメ
ソトレキセートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞を選
択することにより、ＴＰＡを著量産生する細胞が得られ
ている（特開昭５９４２３２１ ）。しかし、この生産
法に用いられたＤＮＡはｃＤＮＡであった。本発明者ら
は、イントロンを含むＴＰＡの染色体ＤＮＡ配列と動物
培養細胞で機能するプロモーター配列からなるＴＰＡ発
現ベクターを種々株化細胞に導入し、ＴＰＡを著量産生
する細胞が得られることを示した（特開昭６２−１４７
８３ ）。本発明者らが作製したイントロンを含むＴＰ
Ａの染色体ＤＮＡ配列を有するＴＰＡ発現ベクターのＣ
ＨＯ形質転換細胞は、ＳＤＳゲル電気泳動上でメラノー
マ細胞のつくるＴＰＡと殆ど区別できないＴＰＡを生産
した。しかし、驚くべきことに、ある割合の形質転換細
胞は、分子量が通常のＴＰＡと異なるプラスミノゲン活
性化因子を産生じていることが見出された。このプラス
ミノゲン活性化因子を精製し、そのアミノ酸配列を決定
することにより、本因子がいままでに見出されたことの
ない新規なプラスミノゲン活性化因子であることがわか
った。この新規なプラスミノゲン活性化因子を、以下、
ＰＡ（ＮＢ３１５）と呼ぶ。ＰＡ （ＮＢ ３１５）の
生産細胞からＰＡ （ＮＢ３１５）をコードするｃＤＮ
Ａをクローニングし、新たにＰＡ （ＮＢ ３１５）発
現ベクターを作製した。このベクターでＣＨＯ細胞を形
質転換した結果、ＰＡ （ＮＢ ３１５）を生産する形
質転換株が得られた。As a method for producing TPA, there is a method of culturing a cell line that produces this factor and purifying this factor from the culture solution (R4jk
en, D, C, and Co11en, D, (19
1981) “The Journal of Biological Chemistry (J, Biol, Chem,) J.
Volume 256, page 7035]. However, this method is highly dependent on the TPA production ability of the producing cells, making mass production difficult. CHO (Chinese hamster ovary) cells were transformed with a plasmid consisting of a DNA sequence in which the SV40 early promoter was connected to the TPA DNA sequence and a DNA sequence encoding dihydrofolate-reduced oxygen, and the gene was further transformed in a medium containing methotrexate. By selecting amplified cells, cells that produce a significant amount of TPA have been obtained (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5942321). However, the DNA used in this production method was cDNA. The present inventors introduced a TPA expression vector consisting of an intron-containing TPA chromosomal DNA sequence and a promoter sequence that functions in cultured animal cells into various established cell lines, and demonstrated that cells capable of producing significant amounts of TPA could be obtained. (Unexamined Japanese Patent Publication No. 62-147
83). TP containing an intron created by the present inventors
C of the TPA expression vector having the chromosomal DNA sequence of A
HO-transformed cells produced TPA that was almost indistinguishable from TPA produced by melanoma cells on SDS gel electrophoresis. However, it was surprisingly found that a certain proportion of transformed cells produced a plasminogen activator whose molecular weight was different from normal TPA. By purifying this plasminogen activator and determining its amino acid sequence, it was found that this factor is a novel plasminogen activator that has never been discovered before. This novel plasminogen activator is described below.
It is called PA (NB315). cDNA encoding PA (NB315) from PA (NB 315) producing cells
A was cloned to create a new PA (NB 315) expression vector. As a result of transforming CHO cells with this vector, a transformed strain producing PA (NB 315) was obtained.
一方、精製されたＰＡ （ＮＢ ３１５）をウサギに投
与し、その血中半減期が測定された。その結果ＰＡ （
ＮＢ ３１５）の血中半減期は、通常のＴＰＡに比べ極
めて長いことが証明された。On the other hand, purified PA (NB 315) was administered to rabbits, and its blood half-life was measured. As a result, PA (
The blood half-life of NB 315) was proven to be extremely long compared to regular TPA.
以下、本発明を更に詳細に説明する。The present invention will be explained in more detail below.
（１）ＴＰＡの染色体ＤＮＡ配列を有するＴＰＡ発現ベ
クター
イントロンを含むＴＰＡの染色体ＤＮＡ配列を有するＴ
ＰＡ発現ベクターは、特開昭６２−１４７８３或いは特
開昭６２−２５３３８３に記載の方法で作製することが
できる。ＴＰＡのアミノ酸配列をコードしている遺伝子
領域は、遺伝子のクローニングの結果、約１８Ｋｂ（キ
ロヘース）の長さを持つことが確認された。またＮｙら
は、その遺伝子が最低１４のエクソンと１３のイントロ
ンから構成されていることを示したＣＮｙら（１９８４
年）［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー （Ｐｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、 八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ＳＡ） ｊ 、 ８１巻、 ５２５５頁〕。ＴＰ
Ａをコードする染色体ＤＮＡ配列とは、第１図に示した
ＴＰＡの翻訳開始アミノ酸であるメチオニンコドンＡＴ
Ｇから終止コドンＴＧＡまでの配列を含むＤＮＡ配列を
示す。(1) TPA expression vector having the chromosomal DNA sequence of TPA T having the chromosomal DNA sequence of TPA including the intron
The PA expression vector can be produced by the method described in JP-A-62-14783 or JP-A-62-253383. As a result of gene cloning, the gene region encoding the amino acid sequence of TPA was confirmed to have a length of approximately 18 Kb (kiloheses). Furthermore, Ny et al. (1984) showed that the gene is composed of at least 14 exons and 13 introns.
2010) [Proceedings of the National Academy of Sciences Ninnisny (Pro
c, Natl, 8cad, Sci, U
SA) j, vol. 81, p. 5255]. T.P.
The chromosomal DNA sequence encoding A is the methionine codon AT, which is the translation initiation amino acid of TPA shown in Figure 1.
The DNA sequence including the sequence from G to the stop codon TGA is shown.
ＴＰＡをコードする染色体ＤＮＡは、ヒ）ＤＮＡからク
ローニングされる。ヒトＤＮＡは、例えばヒト白血球細
胞あるいはｍ織などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（Ｂｌｉ
ｎ、 Ｎ、ら（１９７６年）「ヌクレイツク・アシソズ
・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）
Ｊ３巻、 ２３０３頁〕により調製される。ＴＰＡ遺
伝子のクローニングに用いるベクターはＣｈａｒｏｎ
２８に代表されるλフアージベクター、ｐＢＲ３２２に
代表されるプラスミドヘクター等が利用できる。Chromosomal DNA encoding TPA is cloned from human DNA. Human DNA can be obtained using the method of B11n et al. (Bli
N, N. et al. (1976) Nucleic Acids Res.
J3, page 2303]. The vector used for cloning the TPA gene is Charon.
A λ phage vector represented by 28, a plasmid hector represented by pBR322, etc. can be used.
−例としてλファージをベクターとして用いる遺伝子操
作法を示す。ヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切断
後、λフアージベクターの置換可能領域の代わりに挿入
し、リコンビナントファージＤＮＡを作る。次にインビ
トロパッケージングの手法を用い、感染性のあるファー
ジ粒子を作製する。次に宿主大腸菌とともにプレートに
まき、組換え型ファージのプラークを形成させる（［！
ｎｑｕｉｓ−ｔ、 Ｌ、ら（１９７９年）［メソソズ・
イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙＮ ＋ ６８巻、２８１頁； Ｈｏｒ
ｎ、 Ｂ、 （１９７９年）［メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（同上）ｊ、６８巻、２９９頁〕。ＴＰＡを
コードするＤＮＡ断片を持つ組換え型ファージのプラー
クの検出には、ＴＰＡをコードするｃＤＮＡやＴＰＡ遺
伝子の一部のＤＮＡ配列を持つ合成りＮＡをプローブと
したプラークハイブリダイゼーションの手法（Ｗｏｏ、
Ｓ、 Ｌ、 Ｃ，（１９７９年）「メソソズ・イン・
エンザイモロジー（同上）Ｊ、６８巻、３８９頁； ５
ｚｏｓｔａｋ、 Ｊ、 Ｗ、ら（１９７９年）［メソソ
ズ・イン・エンザイモロジー（同上） ｊ 、 ６８巻
３４１９頁〕が利用できる。またＴＰＡの遺伝子を持つ
組換え型ファージは、プラークハイブリダイゼーション
によって選択されたプラークから回収し、宿主大腸菌と
共に培養することにより大量に調製できる。ＴＰＡ遺伝
子が複数のＤＮＡ断片にクローニングされた場合は、そ
れぞれの断片から完全なＴＰＡ遺伝子を再構成できる。- As an example, a genetic manipulation method using λ phage as a vector is shown. After cutting human high molecular DNA with an appropriate restriction enzyme, it is inserted in place of the replaceable region of the λ phage vector to create recombinant phage DNA. Next, in vitro packaging techniques are used to create infectious phage particles. Next, the recombinant phage is plated with host E. coli to form plaques ([!
nquis-t, L. et al. (1979) [Methods.
Methods in Enzymology
zymologyN + vol. 68, p. 281; Hor
n, B. (1979) [Methods in Enzymology (ibid.), vol. 68, p. 299]. To detect plaques of recombinant phage containing DNA fragments encoding TPA, plaque hybridization techniques (Woo,
S, L, C. (1979) 'Methods in...
Enzymology (ibid.) J, vol. 68, p. 389; 5
Zostak, J, W, et al. (1979) [Methods in Enzymology (ibid.) J, Vol. 68, p. 3419] is available. Furthermore, recombinant phages carrying the TPA gene can be prepared in large quantities by recovering them from plaques selected by plaque hybridization and culturing them with host Escherichia coli. If the TPA gene is cloned into multiple DNA fragments, the complete TPA gene can be reconstructed from each fragment.
本発明者らは、動物培養細胞内で機能する他の遺伝子、
即ちＴＰＡ遺伝子以外のプロモーター領域の配列をＴＰ
Ａ染色体ＤＮＡ配列の５゛側に接続した発現ベクターを
作製し、細胞に導入することによりＴＰＡの産生細胞を
作製することができた。それと同時にＰＡ （ＮＢ ３
１５）の生産細胞を得ることができた。この場合、ＴＰ
Ａ或いはＰＡ（ＮＢ３１５）のｍＲＮＡ合成は、接続し
たプロモーター領域の制御下に置かれ、例えば接続した
プロモーター領域が構成的な蛋白の遺伝子のプロモータ
ー領域であれば、細胞内でＴＰＡ或いはＰＡ （ＮＢ
３１５）のｍＲＮＡは常時合成され、従って細胞はＴＰ
Ａ或いはＰＡ （ＮＢ ３１５）の構成的生産細胞にな
る。もし接続するプロモーター領域が誘導蛋白のもので
あれば、形質転換細胞はＴＰＡ或いはＰＡ （ＮＢ３１
５）を誘導蛋白として生産する。動物培養細胞で機能す
るプロモーターの一つとして、ＳＶ４０の初期プロモー
ターが知られている。このプロモーターは５Ｖ４０ＤＮ
ＡのＨ４ｎｄＩ［１−ＰｖｕｌＩフラグメント、約３４
ｏｂｐ （ベースペアー）に含まれている。またこのＤ
ＮＡフラグメントは、逆向きにＳＶ４０の後期遺伝子プ
ロモーターとしての活性を有している。機能するプロモ
ーター領域とは、ｍＲＮＡの合成開始点は含むが、その
プロモーターが調節している蛋白の最初のアミノ酸であ
るメチオニンのコドンは含まないプロモーター領域の配
列を指す。We discovered that other genes that function in cultured animal cells,
That is, the sequence of the promoter region other than the TPA gene is
By creating an expression vector connected to the 5' side of the A chromosome DNA sequence and introducing it into cells, TPA-producing cells could be created. At the same time, PA (NB 3
15) production cells could be obtained. In this case, T.P.
mRNA synthesis of A or PA (NB315) is under the control of the connected promoter region. For example, if the connected promoter region is the promoter region of a constitutive protein gene, TPA or PA (NB315) is synthesized intracellularly.
315) mRNA is constantly synthesized, and therefore cells have TP.
It becomes a constitutive producer of A or PA (NB 315). If the connecting promoter region is that of an inducible protein, the transformed cells will have TPA or PA (NB31
5) is produced as an induced protein. The SV40 early promoter is known as one of the promoters that functions in cultured animal cells. This promoter is 5V40DN
H4ndI[1-PvulI fragment of A, approximately 34
Included in obp (base pair). This D again
The NA fragment has activity as a late gene promoter of SV40 in the reverse orientation. A functional promoter region refers to a sequence of a promoter region that includes a starting point for mRNA synthesis but does not include a codon for methionine, which is the first amino acid of the protein that the promoter regulates.
ＴＰＡ発現ベクターを導入し、安定に発現する細胞のみ
を選択的に増殖させるには、そのＴＰＡ発現発現ツクタ
ー択マーカー遺伝子を同−ＤＮＡ配列上に持っているこ
とが望ましい。動物細胞での選択マーカー遺伝子として
は、Ｅｃｏｇｐｔ （Ｍｕｌｌｉｇ−ａｎ、 Ｒ，Ｃ，
ら（１９８０年）［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｊ
、 ２０９巻、 １４２２頁） 、 ｎｅｏ （Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎ、 Ｐ、 Ｊ。In order to introduce a TPA expression vector and selectively proliferate only cells that stably express it, it is desirable to have the TPA expression vector selectable marker gene on the same DNA sequence. As a selectable marker gene in animal cells, Ecogpt (Mullig-an, R,C,
(1980) [Science J
, vol. 209, p. 1422), neo (So
uthern, P, J.
ら（１９８２年）「ジャーナル・オブ・モレキュラー・
アンド・アプライド・ジェネティクス（、Ｊ、 Ｍｏ＋
。(1982) Journal of Molecular
and Applied Genetics (, J, Mo+
.
＾ｐｐ１． Ｇｅｎｅｔ、） ｊ 、 １巻、３２７
頁） 、ｄｈｆｒ （Ｗｉｇｌ−ｅｒ、 Ｍ、ら（１
９８０年）［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー（同上
）Ｊ 、 ７７巻、３２７頁〕等の遺伝子が用いられる
。^pp1. Genet, ) j, vol. 1, 327
page), dhfr (Wiggler, M. et al. (1
(980) [Proceedings of the National Academy of Sciences Ninnisny (ibid.) J, vol. 77, p. 327] and the like are used.
以上のような観点から、プロモーター領域の配列とＴＰ
Ａ染色体ＤＮＡ配列の接続したＤＮＡ（ＴＰＡ発現ベク
ター）の作製を後記実施例に示した。From the above points of view, the promoter region sequence and TP
The preparation of a DNA (TPA expression vector) in which A chromosome DNA sequences are connected is shown in Examples below.
（２）発現ベクターの動物培養細胞への導入とＰＡ（Ｎ
Ｂ３１５）生産細胞の選択
動物培養細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェ
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ、 Ｍ、ら（１９７７年）「セル（Ｃｅｌ−１
） Ｊ 、 １１巻、２２３頁〕、マイクロインジェク
ション法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、 Ｈ，Ｆ、 ら（１９８
０年）「プロシーディング・オプ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー（同上）」
７７巻、 ５３９９頁〕、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デ
キストラン法或いは細胞融合法（Ｓｃｈｏｆｆｎｅｒ、
Ｗ、 ら（１９８０年）［プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー
ニスニー（同上） Ｊ 、 ７７巻、 ２１６３頁〕等
が知られている。(2) Introduction of expression vector into cultured animal cells and PA(N
B315) Selection of production cells As a method for introducing DNA into cultured animal cells, although there are differences in transfection efficiency, the calcium phosphate method (Wi
gler, M. et al. (1977) “Cel-1
) J, vol. 11, p. 223], microinjection method (Anderson, H, F, et al. (198
Year 0) “Proceedings of the National Academy of Sciences (same as above)”
77, p. 5399], liposome method, DEAE-dextran method, or cell fusion method (Schoffner,
W. et al. (1980) [Proceedings of
The National Academy of Sciences Ninnisny (ibid.) J, vol. 77, p. 2163], etc. are known.
遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は宿主染色体
ＤＮＡに安定に組み込まれることがある。When a gene is introduced into a cell, the introduced gene may be stably integrated into the host chromosomal DNA.
遺伝子が組み込まれる染色体上の位置は一見でたらめで
あり、また組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則であ
る。ＴＰＡ発現ベクター（＝ＰＡ（ＮＢ３１５）発現ヘ
クター〕を細胞に導入後、選択マーカー遺伝子によって
獲得した形質により形質転換株を得ることができる。得
られた形質転換細胞がＰＡ （ＮＢ ３１５）を生産す
るか否かは、各々の形質転換細胞の培養液に含まれるプ
ラスミノゲン活性化因子のザイモグラフィー（Ｇｒａｎ
ｅｌｌｉＰｉｐｅｒｎｏ、 Ａ、とＲｅ１ｃｈ、 Ｅ、
（１９７８年）［ジャーナル・オブ・エキスペリメン
タル・メディスン（Ｊ。The location on the chromosome where the gene is integrated appears to be random, and the number of copies of the integrated DNA is also irregular. After introducing the TPA expression vector (=PA (NB315) expression hector) into cells, a transformed strain can be obtained based on the traits acquired by the selection marker gene.The resulting transformed cells produce PA (NB 315). This can be determined by zymography (Gran) of the plasminogen activator contained in the culture medium of each transformed cell.
elliPiperno, A., and Re1ch, E.
(1978) [Journal of Experimental Medicine (J.
Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、） Ｊ 、 １４８巻、２２３頁〕
をとり、分子量を測定することにより推定できる。ザイ
モグラフィー上では、通常のＴＰＡのＭｒが約６３にで
あるのに対し、ＰＡ （ＮＢ ３１５）は約５９Ｋを示
す。ＰＡ （ＮＢ ３１５）を産生ずる細胞として選択
された細胞は、更に単細胞分離或いは遺伝子増幅を行う
ことにより安定に且つ大量にＰＡ（ＮＢ３１５）を生産
する細胞として育種が可能である。以上の方法により、
ＴＰＡ発現発現ダクターＨＯ−に１細胞（ＡＴＣＣ（ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）、ＣＣ
Ｌ−６１）を形質転換し、ＰＡ （ＮＢ ３１５）を著
量生産するようになった株ＮＢ３１５は、通産省工業技
術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第１９３１号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９３１）として寄託されている
。Exp, Med, ) J, vol. 148, p. 223]
It can be estimated by measuring the molecular weight. On zymography, normal TPA has a Mr of about 63, whereas PA (NB 315) shows about 59K. Cells selected as cells that produce PA (NB 315) can be bred as cells that stably and in large quantities produce PA (NB 315) by further performing single cell separation or gene amplification. By the above method,
1 cell (ATCC (American Type Culture Collection), CC
The strain NB315, which produced a significant amount of PA (NB 315), was transferred to the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, as part of the Microbiological Engineering Research Institute, No. 1931 (FERM BP- 1931).
（３）ＰＡ （ＮＢ３１５）の精製
一般にＰＡ （ＮＢ ３１５）を生産する細胞は通常細
胞の培養に用いられる血清を含んだ培地ばかりでなく、
無血清培地でもＰＡ （ＮＢ ３１５）を生産する。Ｐ
Ａ （ＮＢ ３１５）の生産に無血清培地を用いること
は、ＰＡ （ＮＢ ３１５）の培地からの回収精製をよ
り容易にするものである。ＰＡ（ＮＢ３１５）の培地か
らの回収精製には、いくつかの公知の蛋白精製法が適用
できる。即ち、リジン−セファロース、ＣｏｎＡ−セフ
ァロース、イオン交換体、或いはセファデックス・ゲル
でのクロマトグラフィーや電気泳動で回収、精製できる
。(3) Purification of PA (NB315) Generally, cells that produce PA (NB 315) can be used not only in a serum-containing medium normally used for cell culture.
PA (NB 315) is produced even in serum-free medium. P
Using a serum-free medium for the production of A (NB 315) makes it easier to recover and purify PA (NB 315) from the medium. Several known protein purification methods can be applied to recovery and purification of PA (NB315) from the medium. That is, it can be recovered and purified by chromatography or electrophoresis using lysine-Sepharose, ConA-Sepharose, ion exchanger, or Sephadex gel.
ＰＡ （ＮＢ ３１５）の活性は、プラスミノゲン含有
フィブリン平板を用いる方法［Ｍａｃｋｉｅ、 Ｍ、ら
（１９８１年）「ブリティッシュ・ジャーナル・オプ・
ヘマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ
）Ｉａｅｍａｔｏｌｏ−ｇｙ） Ｊ 、 ４７ＪＪ、
７７頁〕やプラスミンの合成発色基質５２２５１の分
解を測定する方法（ＡＩｌｅｎ、 Ｒ。The activity of PA (NB 315) was determined using a method using plasminogen-containing fibrin plates [Mackie, M. et al. (1981) British Journal Op.
Hematology (British Journal Of
) Iaematolo-gy) J, 47JJ,
77] and a method for measuring the degradation of plasmin's synthetic chromogenic substrate 52251 (Allen, R.
Ａ、とＰｅｐｐｅｒ、 Ｄ、 Ｓ、 （１９８１年）
ｒＴｈｒｏｍｂｏｓ、 Ｈａｅｍ−ｏｓｔａｓ、Ｊ
、 ４５巻、４３頁〕によって測定できる。A., and Pepper, D. S. (1981).
rThrombos, Haem-ostas, J.
, Vol. 45, p. 43].
（４）ＰＡ （ＮＢ３１５）のアミノ酸配列の決定精製
されたＰＡ （ＮＢ ３１５）のアミノ酸配列は、公知
のアミノ酸配列決定法により決定できる。(4) Determination of the amino acid sequence of PA (NB315) The amino acid sequence of purified PA (NB 315) can be determined by a known amino acid sequencing method.
精製されたＰＡ （ＮＢ ３１５）をそのままシーケン
スすることもできる。また化学的に、或いは酵素的に分
解したＰＡ （ＮＢ３１５）のペプチド断片を液体クロ
マトグラフィー等により分画、精製し、各々の断片をシ
ーケンスすることにより、全配列を決定することができ
る。Purified PA (NB 315) can also be sequenced as is. Furthermore, the entire sequence can be determined by fractionating and purifying peptide fragments of chemically or enzymatically degraded PA (NB315) by liquid chromatography or the like, and sequencing each fragment.
精製したＴＰＡとＰＡ （ＮＢ ３１５）を各々トリプ
シン処理し、生じたペプチド断片を液体クロマトグラフ
ィーで分画した結果、ＴＰＡにはないＰＡ （ＮＢ ３
１５）由来のペプチドが存在していることがわかった。Purified TPA and PA (NB 315) were each treated with trypsin, and the resulting peptide fragments were fractionated by liquid chromatography.
15) was found to exist.
そのペプチド断片のシーケンスを行ったところ、５ＥＲ
−ＴＹＲ−ＧＬＮ−ＡＳＰ−ＴＨＲ−ＡＲＧのアミノ酸
配列を有していた。このアミノ酸配列は、Ｔ Ｐ Ａ
（Ｐｅｎｎｉｃａ、 Ｄ。When we sequenced the peptide fragment, we found that 5ER
-TYR-GLN-ASP-THR-ARG. This amino acid sequence is T P A
(Pennica, D.
ら（１９８３年）「ネイチャー（同上） Ｊ 、 ３０
１巻２１４頁〕の１番目から８９番目のアミノ酸配列か
ら、４番目から８６番目のアミノ酸配列が除かれた配列
であることがわかった。このことは、ＰＡ（ＮＢ３１５
）のアミノ酸配列が請求項１に記載した新規なアミノ酸
配列であることを示している。(1983) Nature (ibid.) J, 30.
It was found that the amino acid sequence from the 4th to the 86th amino acid sequence was removed from the amino acid sequence from the 1st to the 89th in [Vol. 1, p. 214]. This means that PA (NB315
) indicates that the amino acid sequence is the novel amino acid sequence described in claim 1.
ＴＰＡのアミノ末端アミノ酸はＳＥＰとされているが［
Ｐｅｎｎ１ｃａ、 ｏ、 ら（１９８３年）［ネイチャ
ー（同上） Ｊ 、 ３０１巻、２１４頁〕、アノミ末
端ＣＬＹ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−からなるトリペプチドが余
計についているＴＰＡも知られている（Ｊｏｒｎｖａｌ
ｌ。The amino terminal amino acid of TPA is considered to be SEP [
Penn1ca, O, et al. (1983) [Nature (ibid.) J, vol. 301, p. 214], TPA with an extra tripeptide consisting of an anomiterminal CLY-ALA-ARG- is also known (Jornval et al.
l.
１１、ら（１９８３年） ｒＦＥＢＳレター（同上）
Ｊ 、 １５６巻４７頁〕。そのようなアミノ末端にお
けるヘテロ性がＰＡ （ＮＢ ３１５）にも存在してい
る可能性が高いと考えられる。11, et al. (1983) rFEBS Letter (Ibid.)
J, vol. 156, p. 47]. It is considered highly likely that such heterogeneity at the amino terminus also exists in PA (NB 315).
（５）ＰＡ （ＮＢ３１５）をコードするｃ ＤＮＡの
クローニングとその塩基配列
ＰＡ （ＮＢ３１５）をコードするｃＤＮＡは、ＰＡ
（ＮＢ ３１５）を生産する細胞から常法に従いクロー
ニングされ、その塩基配列は決定される。(5) Cloning of cDNA encoding PA (NB315) and its base sequence The cDNA encoding PA (NB315) is
(NB 315) is cloned from cells producing it according to conventional methods, and its nucleotide sequence is determined.
またｃＤＮＡ配列から、そのｃＤＮＡがコードしている
蛋白のアミノ酸配列が決定できる。Furthermore, from the cDNA sequence, the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA can be determined.
ＰＡ （ＮＢ ３ Ｌ ５）産生細胞からクローニング
したｃＤＮＡの塩基配列とそれから推定されるリーダー
ペプチドを含むアミノ酸配列を、第４図（１）〜（３）
に示した。The base sequence of cDNA cloned from PA (NB 3 L 5) producing cells and the amino acid sequence including the leader peptide deduced from it are shown in Figure 4 (1) to (3).
It was shown to.
ＰＡ （ＮＢ ３１５）のアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡ配列は新規に見出されたＤＮＡ配列であり、ＰＡ
（ＮＢ ３１５）発現ベクターを作製する上で有用で
ある。c encoding the amino acid sequence of PA (NB 315)
The DNA sequence is a newly discovered DNA sequence, and PA
(NB 315) Useful in creating expression vectors.
（６）ＰＡ （ＮＢ３１５）発現ベクターの作製動物培
養細胞をＰＡ （ＮＢ３１５）生産細胞に形質転換させ
るＰＡ （ＮＢ ３１５）発現ベクターは、上記（５）
で得られたｃＤＮＡを用いて作製が可能であった。一般
に、動物培養細胞でアミノ酸配列をコードする構造遺伝
子を発現させるためには、その遺伝子の５°側にｍＲＮ
Ａの合成に必要なプロモーター配列を位置させる必要が
あり、３°側にｍＲＮＡの転写終了のシグナルが存在す
るのが望ましい。また、真核生物に見出されているイン
トロン構造を適切な位置に挿入させてもよい。第５図に
、ＰＡ （ＮＢ ３１５）をコードするｃＤＮＡ配列を
有するＰＡ （ＮＢ３１５）発現ベクターｐＳＶ２ＮＢ
ＰＡの構造を示した。このベクターには、ｃＤＮＡ配列
の５°側にＳＶ４０の初期遺伝子プロモーター、３”側
にはＳＶ４０のイントロン及び転写終了シグナルが存在
している。(6) Preparation of PA (NB315) expression vector The PA (NB 315) expression vector used to transform cultured animal cells into PA (NB315) producing cells is the one described in (5) above.
It was possible to produce this using the cDNA obtained in . Generally, in order to express a structural gene encoding an amino acid sequence in cultured animal cells, mRNA must be placed on the 5° side of the gene.
It is necessary to locate the promoter sequence necessary for the synthesis of A, and it is desirable that a signal for the termination of mRNA transcription be present on the 3° side. Furthermore, an intron structure found in eukaryotes may be inserted at an appropriate position. FIG. 5 shows the PA (NB315) expression vector pSV2NB, which has a cDNA sequence encoding PA (NB315).
The structure of PA is shown. This vector contains the SV40 early gene promoter on the 5° side of the cDNA sequence, and the SV40 intron and transcription termination signal on the 3'' side.
ＰＡ （ＮＢ３１５）発現ベクターは、他に、上述ＰＡ
（ＮＢ ３１５）をコードするｃＤＮＡを用いた発現
ベクターに、ＴＰＡ染色体遺伝子に存在するイントロン
のうちの幾つかのイントロンが、各々のイントロンが存
在していた固有の位置に挿入された形のベクターであっ
てもよい。そのようなベクターは、例えば、第５図に示
したＰＡ（ＮＢ３１５）発現ベタターｐＳＶ２ＮＢＰＡ
のＰＡ（ＮＢ３１５）をコードするｃＤＮＡ内に存在す
るＥｃｏＲＩ約４ｓｏｂｐ断片の代わりに、第１図に示
したＴＰＡ染色体遺伝子のＥｃｏＲＩ約２゜４ｋｂ断片
を挿入することにより作製できる。The PA (NB315) expression vector also includes the above-mentioned PA (NB315) expression vector.
(NB 315) is a vector in which several introns of the introns present in the TPA chromosome gene are inserted into the unique position where each intron existed. There may be. Such vectors include, for example, the PA (NB315) expression vector pSV2NBPA shown in FIG.
It can be produced by inserting an approximately 2.4 kb EcoRI fragment of the TPA chromosomal gene shown in FIG. 1 in place of the approximately 4 sobp EcoRI fragment present in the cDNA encoding PA (NB315).
（７）ＰＡ （ＮＢ３１５）の性状
ＰＡ （ＮＢ ３１５）がグリコシル化されているかは
、精製したＰＡ （ＮＢ３１５）の糖含量を測定すれば
よい。より簡便には、精製したＰＡ（ＮＢ３１５）を５
ＤＳ−ゲル電気泳動し、ＲＡＳ染色する。グリコシル化
された糖蛋白は染色され赤色に卑まるが、単純蛋白は染
まらない。それにより蛋白がグリコシル化されているか
否かが判定でキル。ＰＡ （ＮＢ ３１５）を５ＤＳ−
ゲル電気泳動し、ＰＡＳ染色をおこなった結果、ＰＡＳ
染色陽性である事がわかった。(7) Properties of PA (NB315) Whether PA (NB 315) is glycosylated can be determined by measuring the sugar content of purified PA (NB315). More conveniently, purified PA (NB315) is
DS-gel electrophoresis and RAS staining. Glycosylated glycoproteins are stained red, but simple proteins are not. This determines whether the protein is glycosylated or not. PA (NB 315) 5DS-
As a result of gel electrophoresis and PAS staining, PAS
It was found that the staining was positive.
ＴＰＡは、グリコシル化の態様によりタイプ■とタイプ
■に分類されている。ＴＰＡには４カ所のＮ−グリコシ
ル化部位（Ａ Ｓ Ｎ −Ｘ −Ｓ Ｅ Ｐ或いはＴＨ
Ｒ）が存在し、タイプＩはアミノ末端から１．２．１番
目、タイプ■は１．４番目のＮグリコシル化部位にｔＩ
Ｍ鎖の修飾を受けている（Ｐ。TPA is classified into type (2) and type (2) depending on the aspect of glycosylation. TPA has four N-glycosylation sites (A S N -X -S E P or TH
Type I has tI at the 1.2.1st N-glycosylation site from the amino terminus, and Type II has tI at the 1.4th N-glycosylation site from the amino terminus.
The M chain has been modified (P.
ｈｌ、 Ｇ、ら（１９８４年）「バイオケミストリー（
ＢｉｏｃｈｅｍＮ 、 ２３巻、 ３７０１頁）、ＰＡ
（ＮＢ３１５） にも４ケ所のＮ−グリコシル化部位
があり、ＴＰＡと同様なグリコシル化を受けていると推
定して間違いはないものと考えられる。hl, G. et al. (1984) “Biochemistry (
BiochemN, vol. 23, p. 3701), PA
(NB315) also has four N-glycosylation sites, and it is safe to assume that it undergoes glycosylation similar to TPA.
プラスミノゲン活性化因子の血中半減期に関する幾つか
の報告がある（Ｂｅｅｂｅ、 Ｄ、 Ｐ、ら（１９８６
年）［トロンボシス・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ
Ｒｅ５−ｅａｒｃｈＮ 、 ４３巻、６６３頁； Ｍ
ａｔｔｓｓｏｎ、 Ｃｈ・ら（１９８３年） （同上）
３０巻、９１頁〕。それらの報告に記載の方法でＰＡ
（ＮＢ ３１５）の血中半減期は測定できる。ＰＡ （
ＮＢ３１５）をウサギに投与し、その血中半減期を測定
した結果、ＴＰＡよりも明らかに長い血中半減期を持つ
ことが判明した。There are several reports regarding the blood half-life of plasminogen activator (Beebe, D, P, et al. (1986).
) [Thrombosis Research
Re5-earchN, volume 43, page 663; M
attsson, Ch. et al. (1983) (ibid.)
Volume 30, page 91]. PA in the manner described in those reports.
The blood half-life of (NB 315) can be determined. PA (
As a result of administering NB315) to rabbits and measuring its blood half-life, it was found that it had a clearly longer blood half-life than TPA.
以下に実施例を示すが、本発明に係わる諸実験は内閣総
理大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行っ
た。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種
々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下に挙げる
雑誌、底置を参考にした。Examples are shown below, and experiments related to the present invention were conducted in accordance with the "Recombinant DNA Experiment Guidelines" established by the Prime Minister. Further, the detailed operations for handling phages, plasmids, DNA, various enzymes, Escherichia coli, etc. in the Examples were referred to the magazines and books listed below.
１、遺伝子操作マニュアル、高木康隆 編著（１９８２
年）、講談社
２ 、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ １
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、 Ｔ。1. Gene manipulation manual, edited by Yasutaka Takagi (1982)
), Kodansha 2, Mo1ecular Cloning a 1
laboratory manual, T.
Ｍａｎｉａｔｉｓら編（１９８２年） Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ −ｂｏｒａｔｏｒｙ
３ 、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、６５巻、６８巻、１００巻、１０１巻、１５２Ｓ及
び１５３巻、Ａｃ−ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
実施例Ｉ
ＴＰＡ発現ベクターの作製
増幅可能な遺伝子を有するＴＰＡ発現ヘクターｐＳＶｅ
ＰＡ−３は第２図に示した手順によりｐＳＶｅＰＡ−１
（ｐＳＶｅＰＡ−１の作製については特開昭６２−１４
７８３に記述した）及びｐｓＶ２ｄ ｈ ｆ ｒ （Ｓ
ｕｂｒａｍａｎｉ、 Ｓ、 ら（１９８１年）［モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（同上）」
、１巻８５４頁〕を出発材料として作製した。Edited by Maniatis et al. (1982) Cold S
pring Harbor Laboratory 3, Methods in Enzymology
, Vol. 65, Vol. 68, Vol. 100, Vol. 101, Vol. 152S and Vol. 153, Ac-academic Press Example I Preparation of TPA expression vector TPA expression Hector pSVe with an amplifiable gene
PA-3 is converted to pSVePA-1 by the procedure shown in Figure 2.
(For the preparation of pSVePA-1, please refer to JP-A-62-14
783) and psV2d h f r (S
ubramani, S., et al. (1981) [Molecular and Cellular Biology (ibid.)]
, Vol. 1, p. 854] as a starting material.
即ち、ｐＳＶｅＰＡ−１を制限酵素ＫｐｎＩで切断し、
アンピシリン耐性遺伝子を持つＤＮＡ断片を環化し、ｐ
ＴＰＡ−１を作製した。ｐＳＶ２ｄｈｒｒのｐｖｕ１１
部位をＢａｍＨＩリンカ−を用いてＢａｍＨ１部位に改
めたプラスミドｐＳＶ２Ｂｄｈｆｒを作製した。次にこ
のプラスミドからｄｈｆ ｒ遺伝子を含むＢａｍＨＩ断
片を単離し、この断片をｐＴＰＡ−１のＢａｍＨ１部位
に挿入したプラスミドｐＴＰＡ−２を作製した。このプ
ラスミドの３ａ１１部位を無くしたプラスミドｐＴＰＡ
−３を作製した。次にｐＴＰＡ−３のＫｐｎ１部位にｐ
ＳＶｅＰＡ １のＴＰＡ遺伝子を持つＫｐｎｌ約１９
ｋｂ断片を挿入し、ｐｓＶｅＰＡ−３を作製した。That is, pSVePA-1 was cut with the restriction enzyme KpnI,
The DNA fragment containing the ampicillin resistance gene was circularized and p
TPA-1 was produced. pvu11 of pSV2dhrr
A plasmid pSV2Bdhfr was created in which the site was changed to a BamH1 site using a BamHI linker. Next, a BamHI fragment containing the dhfr gene was isolated from this plasmid, and plasmid pTPA-2 was prepared by inserting this fragment into the BamH1 site of pTPA-1. Plasmid pTPA in which the 3a11 site of this plasmid has been deleted
-3 was produced. Next, p
Kpnl with TPA gene of SVePA 1 about 19
kb fragment was inserted to create psVePA-3.
実施例２
発現ベクターの動物培養細胞への導入とＰＡ（ＮＢ３．
１５）生産細胞の選択
ＣＨＯ−に１細胞ｒＡＴＣＣ（同上）、ＣＣＬ６１〕を
発現ベクターｐＳＶｅＰＡ ３で形質転換（Ｗｉｇｌ
ｅｒ、 Ｍ、ら（１９７７年）「セル（同上）」１１巻
、２２３頁コした。プラスミド−リン酸カルシウム共沈
澱物を予め５％の牛胎児血清（Ｆｅ２）を含む培地で生
育させた細胞（２Ｘ１．Ｏ５細胞／３−培地／直径６ｃ
ｍ培養皿）に加え、１５時間後に培地を更新し、４８時
間培養した。次に培地を５％ＦＣ３，２５μｇ／−ミコ
フェノール酸、２００μｇ／ｍｌキサンチン、２５μｇ
／−アデニン、５μｇ／−チミジン、０．１μｇ／−ア
ミノプテリンを含むヌクレオシド不含ＭＥＭα培地に替
え、約３週間培養した。生じたミコフェノール酸耐性コ
ロニーを分離し、２４穴マルチウエルプレートに生育さ
せ、培地を５％のＦｅ２を含む培地に更新後、４８時間
後の培地中に含まれるプラスミノゲン活性化因子をプラ
スミノゲン含有フィブリン平板を用いて測定した。その
ようにして、０．１μｇ ７ｍｌ （Ｔ Ｐ Ａ換算）
以上のプラスミノゲン活性化因子を生産する形質転換細
胞約１． ＯＯ０株を得た。次に各々の細胞の培養液の
ザイモグラフィーをとり、生産されたプラスミノゲン活
性化因子の分子量を測定した。ザイモグラフィー上では
、通常のＴＰＡのＭｒが約６３にであるのに対し、ＰＡ
（ＮＢ３１５）は約５９Ｋを示す。その結果、ＰＡ
（ＮＢ ３１５）を生産する２株の形質転換細胞が選択
された。その中の１株を単細胞分離した。Example 2 Introduction of expression vector into cultured animal cells and PA (NB3.
15) Selection of production cells One cell rATCC (same as above), CCL61] was transformed into CHO- with the expression vector pSVePA 3 (Wigl
Er, M. et al. (1977) Cell (ibid.), Vol. 11, p. 223. Plasmid-calcium phosphate co-precipitate was grown in cells (2×1.O5 cells/3-medium/diameter 6c
After 15 hours, the medium was renewed and cultured for 48 hours. Next, the medium was mixed with 5% FC3, 25 μg/- mycophenolic acid, 200 μg/ml xanthine, 25 μg
The medium was changed to a nucleoside-free MEMα medium containing /-adenine, 5 μg/-thymidine, and 0.1 μg/-aminopterin, and cultured for about 3 weeks. The resulting mycophenolic acid-resistant colonies were isolated and grown in a 24-well multi-well plate, and the medium was updated to a medium containing 5% Fe2. After 48 hours, the plasminogen activator contained in the medium was replaced with plasminogen-containing fibrin. Measured using a flat plate. In this way, 0.1μg 7ml (TPA conversion)
Transformed cells producing the above plasminogen activator about 1. Obtained OO0 shares. Next, zymography of the culture solution of each cell was taken, and the molecular weight of the produced plasminogen activator was measured. On zymography, normal TPA has a Mr of about 63, whereas PA
(NB315) shows approximately 59K. As a result, P.A.
Two transformed cell lines producing (NB 315) were selected. Single cells were isolated from one of the strains.
そのようにして得られた細胞ＮＢ３１５株は、０゜１〜
０．２／Ｊｇ／ｄのＰＡ （ＮＢ ３１５）を生産した
。The cell line NB315 thus obtained was 0°1~
0.2/Jg/d of PA (NB 315) was produced.
実施例３
ＰＡ （ＮＢ ３１５）の精製
実施例２で得られたＮＢ３１５株を培養し、培養液約１
０Ｌを得た。特開昭６３−９１０８０に記載の方法によ
りＣＰＧ （コンドロールド・ボアー・グラス）に吸着
洗浄後、ε−アミノカプロン酸を含む緩衝液で溶出した
。次に、Ｃｏｎ−Ａセファロース・カラムクロマトグラ
フィー、オクチル−セファロース・カラムクロマトグラ
フィーブルーセファロース・カラムクロマトグラフィー
更にセファクリルＳ−２００におけるゲル濾過により精
製を行い、ＰＡ （ＮＢ ３１５）の精製品約２■を得
た。Example 3 Purification of PA (NB 315) The NB315 strain obtained in Example 2 was cultured, and the culture solution was
Obtained 0L. After adsorption and washing on CPG (chondral bore glass) according to the method described in JP-A No. 63-91080, the mixture was eluted with a buffer containing ε-aminocaproic acid. Next, purification was performed by Con-A Sepharose column chromatography, octyl-Sepharose column chromatography, Blue Sepharose column chromatography, and gel filtration on Sephacryl S-200 to obtain approximately 2 μm of purified PA (NB 315). Obtained.
実施例４
ＰＡ （ＮＢ ３１５）の部分アミノ酸配列の決定精製
したＰＡ （ＮＢ３１５）０．１＋ｎ＋ｒを１０ｍＭの
ジチオスレイトールで還元処理しく３７℃、３０分、Ｎ
２気流中）、２５ｍＭのモノヨード酢酸（２５℃、２０
分）でカルボキシメチル化した。Example 4 Determination of partial amino acid sequence of PA (NB 315) Purified PA (NB 315) 0.1+n+r was reduced with 10 mM dithiothreitol at 37°C for 30 minutes with N
2 gas flow), 25 mM monoiodoacetic acid (25 °C, 20
Carboxymethylation was carried out (min).
透析後、トリプシン処理しく３７℃、２４時間）、生じ
たペプチド断片を液体クロマトグラフィー（山村化学、
ＯＤＳ ＡＰ−３０３）により分画した（第３図）。After dialysis, trypsinization was performed at 37°C for 24 hours, and the resulting peptide fragments were subjected to liquid chromatography (Yamamura Kagaku,
ODS AP-303) (Fig. 3).
その結果、図中に矢印で示したペプチド断片はＴＰＡを
同様な処理をしても生じないことが判明した。そのペプ
チド断片を回収し、プロティン・シークエンサー・モデ
ル４７７Ａ（アプライド・バイオシステムズ社）で解析
した。As a result, it was found that the peptide fragments indicated by arrows in the figure were not produced even if TPA was treated in the same manner. The peptide fragments were collected and analyzed using a protein sequencer model 477A (Applied Biosystems).
その結果、そのペプチドは、５ＥＲ−ＴＹＲ−ＧＬＮ−
ＡＳＰ−ＴＨＲ−ＡＲＧのアミノ酸配列を有していた。As a result, the peptide is 5ER-TYR-GLN-
It had the amino acid sequence of ASP-THR-ARG.
ＴＰＡはＡ鎖とプロテアーゼ活性を有するＢ鎖から構成
されている。ＴＰＡ及びＰＡ（ＮＢ３１５）のＢ鎖をそ
れぞれＲｉｊｋｅｎとＧｒｏｅｎｅｖｅｌｄの方法（Ｒ
ｉｊｋｅｎ、 Ｄ、 Ｃ，とＧｒｏｅｎｅｖｅｌｄ、
Ｅ、 （１９８６年）「ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（同上） Ｊ 、 ２６１巻
、 ３０９８頁〕で調製し、両者を５ＤＳ−ゲル電気泳
動により解析したところ、両者には差が認められなかっ
た。TPA is composed of an A chain and a B chain that has protease activity. The B chains of TPA and PA (NB315) were prepared by the method of Rijken and Groeneveld (R
ijken, D., C., and Groeneveld,
E. (1986) ``The Journal of Biological Chemistry (Ibid.) J, vol. 261, p. 3098] and analyzed both by 5DS-gel electrophoresis, it was found that there was a difference between the two. I couldn't.
実施例５
ＰＡ （ＮＢ ３１５）をコードするｃＤＮＡのクロー
ニングとその塩基配列の決定
ＰＡ （ＮＢ ３１５）生産細胞ＮＢ３１５株を培養し
、細胞を２Ｘ１０”個得た。細胞から全ＲＮＡをグアニ
ジン・ホットフェノール法（Ｐｅｒａｍｉｓｃ−ｏ、
Ｊ、 Ｒ，ら（１９８２年）［ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（同上） Ｊ 、 ２５
７巻、 １１０２４頁］により抽出した。次に全ＲＮＡ
からポリ （Ａ）ＲＮＡをオリゴｄ （Ｔ）−セルロー
ス・カラムクロマトグラフィーを２回行い精製した。ｃ
ＤＮＡは、市販されているｃＤＮＡ合成システム（アマ
ジャム社）及びｃＤＮＡクローニング・キット（アマシ
中ム・ｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔｌｏ）を用
いてｍＲＮＡから合成され、λｇｔｌＯにクローニング
した。ＰＡ（ＮＢ３１５）のｃＤＮＡをクローニングし
ている組換エファージを、二ツクトランスレージコン法
によって３２ｐラベルしたｐＳＶｅＰＡ−１がら調製さ
れるＸｂａｌ約２．５ ｋ ｂ断片（第１図）をプロー
ブとしてプラークハイブリダイゼーシコンにより検出し
た。選択された複数の組換え型ファージに含まれるｃＤ
ＮＡのＨ４ｎｄＩ［［約１．９ ｋ ｂ断片をプラスミ
ドｐＵｃ１Ｂにサブクローニングし、ｐＵｃＮＢｌ、９
を作製した。第５図にプラスミドｐＵｃＮ８１．９の構
造を示した。Example 5 Cloning of cDNA encoding PA (NB 315) and determination of its base sequence The PA (NB 315) producing cell NB315 strain was cultured to obtain 2 x 10" cells. Total RNA was extracted from the cells using guanidine hot phenol. Law (Peramisc-o,
J, R, et al. (1982) [The Journal of
Biological Chemistry (ibid.) J, 25
Volume 7, page 11024]. Next, total RNA
Poly(A) RNA was purified by oligo d(T)-cellulose column chromatography twice. c.
DNA was synthesized from mRNA using a commercially available cDNA synthesis system (Amajam) and cDNA cloning kit (Amashi Nakamu cDNA cloning system λgtlo) and cloned into λgtlO. A recombinant Ephage cloning the cDNA of PA (NB315) was plated using an approximately 2.5 kb Xbal fragment (Fig. 1) prepared from 32p-labeled pSVePA-1 by the two-translage condensation method as a probe. Detected by hybridization. cD contained in multiple selected recombinant phages
The H4ndI [[approximately 1.9 k b fragment of NA was subcloned into plasmid pUc1B and pUcNBl, 9
was created. FIG. 5 shows the structure of plasmid pUcN81.9.
プラスミドｐＵｃＮＢ１．９からＰＡ（ＮＢ３１５）の
）（Ｌｎｄｌ［ｌ約１．９ ｋ ｂ断片をアガロースゲ
ル電気泳動により調製した。このＤＮＡ断片を制限酵素
５ａｕ３ＡＩ Ａｌｕｌ、Ｈａｅｍ Ｒｓａｌ、Ａｃ
ｃｌｌ、ＨｐａＩ［或いはＴ ａ ｑ Ｉで切断し、フ
ァージＭ１３ｍｐＨ（アマジャム ジャパンより購入）
のＢａｍＨＩ、ＳｍａＴ或いはＡＣＣＩ部位に挿入し、
大腸菌ＪＭ１０３（ファルマシア（株）より購入）を宿
主として＆ｌＩ換え型ファージのプラークを形成させた
。分離した組換え型ファージから１本鎖ファージＤＮＡ
を調製し、これとＤＮＡ合成プライマー５ ’ −ＣＡ
ＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧ−３’ （宝酒造製
）を用いてダイデオキシ法による塩基配列の決定を行っ
た。第４図（１）〜（３）に決定したＰＡ （ＮＢ３１
５）をコードするｃＤＮＡの塩基配列及び配列から決定
されるアミノ酸配列を示した。An approximately 1.9 k b fragment of PA(NB315) from plasmid pUcNB1.9 was prepared by agarose gel electrophoresis. This DNA fragment was digested with restriction enzymes 5au3AI Alul, Haem Rsal, Ac
cll, HpaI [or cut with T aq I, phage M13mpH (purchased from AmaJam Japan)
inserted into the BamHI, SmaT or ACCI site of
Plaques of &lI recombinant phage were formed using Escherichia coli JM103 (purchased from Pharmacia Co., Ltd.) as a host. Single-stranded phage DNA from isolated recombinant phage
and the DNA synthesis primer 5'-CA
The base sequence was determined by the dideoxy method using AAAGGGTCAGTGCTG-3' (manufactured by Takara Shuzo). PA determined in Figure 4 (1) to (3) (NB31
The base sequence of the cDNA encoding 5) and the amino acid sequence determined from the sequence are shown.
実施例６
ＰＡ （ＮＢ３１５）発現ベクターの作製とＣＨＯ−に
１細胞での発現
ＰＡ （ＮＢ ３１５．）発現ベクターｐ Ｓ Ｖ 、
ｅ Ｎ ＢＰＡは、第５図に示した手順によって作製し
た。Example 6 Preparation of PA (NB315) expression vector and expression in CHO-1 cell PA (NB 315.) expression vector pSV,
eN BPA was prepared by the procedure shown in FIG.
プラスミドｐ Ｓ Ｖ ２ ｄ ｈ ｆ ｒ （Ｓｕ
ｂｒａｍａｎｉ、 Ｓ、 ら（１９８１年）「モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（同上）」、
１巻、８５４頁〕をＢｇＩＩＩで切断後、ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｋｌｅｎ。Plasmid pSV2dhfr (Su
bramani, S. et al. (1981) Molecular and Cellular Biology (ibid.),
1, p. 854] with BgIII, and then digested with DNA polymerase (Klen.
Ｗ）で平滑末端にし、Ｈ４ｎｄｌｌ［リンカ−（ＣＡＡ
ＧＣＴＴＧ）を付加し、制限酵素Ｈ４ｎｄｌ［Ｉで消化
１１ｔＴ４リガーゼで環化し、Ｉ）ＳＶ２）Ｊｉｎｄ■
を作製した。このｐｓＶ２Ｈ４ｎｄＩ［＋の）（ｉｎｄ
Ｉ［１部位にｐＵｃＮ８１．９から切り出したＰＡ（Ｎ
Ｂ、３．１５）のｃＤＮＡを含むＨ４ｎｄｌ［ｌ約１゜
９ｋｂ断片を挿入し、ｐＳＶｅＮＢＰＡを作製した。W) to blunt ends, and H4ndll[linker (CAA
GCTTG), digested with the restriction enzyme H4ndl[I, cyclized with tT4 ligase, I)SV2)Jind■
was created. This psV2H4ndI[+)(ind
PA(N
An approximately 1°9 kb fragment of H4ndl[l containing the cDNA of B, 3.15) was inserted to create pSVeNBPA.
ＣＨＯ−に１細胞（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−６１）を発現ベ
クターｐ Ｓ Ｖ ｅ Ｎ Ｂ Ｐ ＡとｐＳＶ２ｇｐ
ｔ （Ｍｕｌｌｉｇａｎ、 Ｒ，Ｃ，とＢｅｒｇ、
Ｇ、 （１９８１年）［プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニス
ニー（同上）Ｊ、７８巻、 ２０７２頁〕とでコ・トラ
ンスフェクションした。プラスミド−リン酸カルシウム
共沈澱物を予め５％ＦＣ３を含む培地で生育させた細胞
（２Ｘ１０５細胞／ ３ ｍｉ培地／直径６悄培養皿）
に加え、１５時間後に培地を更新し、４８時間培養した
。次に培地を５％ＦＣ３，２５μｇ ／ ｍｌミコツエ
ノール酸、２００μｇ ／ ｍｌキサンチン、２５ｐｇ
／ｍｌアデニン、５．ｃｒｇ／−チミジン、０．１μｇ
／ ｍｌアミノプテリンを含むヌクレオシド不合ＭＥ
Ｍα培地に替え、約３週間培養した。生じたミコフェノ
ール酸耐性コロニーを分離し、２４穴マルチウエルプレ
ートに生育させ、培地を５％ＦＣＳを含む培地に更新後
、４８時間後の培地中に含まれるプラスミノゲン活性化
因子をプラスミノゲン含有フィブリン平板を用いて測定
した。そのようにして、０．１μｇ ／ｍｌ （Ｔ Ｐ
Ａ換算）以上のプラスミノゲン活性化因子を生産する
形質転換細胞３株を得た。次に、この３株の細胞の培用
液のザイモグラフィーをとったところ、生産されたプラ
スミノゲン活性化因子の分子量は約５９Ｋを示し、ＰＡ
（ＮＢ３１５）の分子量（Ｍｒ）と一致した。1 cell (ATCC, CCL-61) in CHO-expressing vectors pSVeNBPA and pSV2gp
t (Mulligan, R.C., and Berg,
G. (1981) [Proceedings of the
National Academy of Sciences Ninisny (ibid.) J, Vol. 78, p. 2072]. Cells in which the plasmid-calcium phosphate co-precipitate was grown in a medium containing 5% FC3 (2 x 105 cells/3 mi medium/6-diameter culture dish)
In addition, the medium was renewed 15 hours later and cultured for 48 hours. The medium was then supplemented with 5% FC3, 25 μg/ml mycotenolic acid, 200 μg/ml xanthine, 25 pg
/ml adenine, 5. crg/-thymidine, 0.1 μg
/ml Nucleosidic ME containing aminopterin
The medium was changed to Mα medium and cultured for about 3 weeks. The resulting mycophenolic acid-resistant colonies were isolated and grown in a 24-well multi-well plate, and the medium was updated to a medium containing 5% FCS. After 48 hours, the plasminogen activator contained in the medium was transferred to a plasminogen-containing fibrin plate. Measured using In that way, 0.1 μg/ml (T P
Three transformed cell lines producing plasminogen activator of A (equivalent to A) or higher were obtained. Next, zymography of the culture medium of these three cell lines showed that the molecular weight of the produced plasminogen activator was approximately 59K, and PA
It matched the molecular weight (Mr) of (NB315).
実施例７
ＰＡ （ＮＢ ３１５）の性状
精製したＰＡ （ＮＢ３１５）を５ＤＳ−ゲル電気泳動
し、ＰＡＳ染色を行った結果、ＰＡ （ＮＢ３１５）は
ＰＡＳ染色陽性であり、グリコシル化されていることが
判明した。Example 7 Properties of PA (NB 315) Purified PA (NB 315) was subjected to 5DS-gel electrophoresis and PAS staining. As a result, PA (NB 315) was positive for PAS staining and was found to be glycosylated. did.
精製したＰＡ （ＮＢ３１５）の６０５μｇをウサギに
耳介静脈より単回投与し、その血中半減期を測定した結
果、通常のＣＨＯ−Ｋ Ｉで作られたＴＰＡが０．９分
であるのに対し、ＰＡ（ＮＢ３１５）は明らかに長い血
中半減期（２１分）を持ち、血中持続性が良いことが判
明した（第６図）。A single dose of 605 μg of purified PA (NB315) was administered to rabbits via the auricular vein, and the half-life in the blood was measured. On the other hand, PA (NB315) was found to have a clearly long half-life in the blood (21 minutes) and to have good persistence in the blood (Figure 6).
第１図、ＴＰＡをコードする染色体Ｄ Ｎ Ａ ｔｉ域
、第２図は、ベクターｐＳＶｅＰＡ−３の作製法を示す
模式図、第３図は、ＰＡ （ＮＢ ３１５）のペプチド
断片の液体クロマトグラフィーのクロマトチャートと決
定されたペプチドのアミノ酸配列、第４図（１）〜（３
）は、ＰＡ （ＮＢ３１５）をコードするｃＤＮＡ配列
と推定されるアミノ酸配列、第５図は、ＰＡ （ＮＢ３
１５）発現ベクターｐＳＶ２ＮＢＰＡの作製法を示す模
式図、そして第６図は、ウサギに投与したＰＡ （ＮＢ
３１５）の血中減衰曲線を示す。
第１．２及び５図中、Ｐ、 Ｅ、 Ｂａ、 Ｂｇ、 Ｓ
ｓ、Ｃ，Ｈｐ、Ｈ４，に、Ｘｂ及びＳａは、それぞれ制
限酵素ＰｖｕＩ［、ＥｃｏＲｌ、ＢａｍＨｌ。
ＢｇｌＩＩ、 ５ｓｔｌ、 Ｃ１ａｌ、 Ｈｐａ
ｌ、 ＨｉｎｄＩ［Ｉ、Ｋｐｎｌ、Ｘｂａｌ及び３ａ
ｌ＋の認識部位を示す。またＴＰＡ、Ａｍｐ、ＳＶｅ、
ｏｒｔ、Ｅｃｏｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ｐｏｌｙＡは、それ
ぞれＴＰＡ遺伝子或いはＴＰＡ遺伝子の一部、アンピシ
リン耐性遺伝子、ＳＶ４０のＤＮＡ複製起点を含む初期
遺伝子プロモーター領域、プラスミドの複製起点、Ｅｃ
ｏｇｐｔ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ＳＶ４
０のポリ （Ａ）付加シグナルを含む領域を示す。
特許出願人 鐘淵化学工業株式会社
’１（ｒｔ −４：＝（−＋ ｔｃ
％
凹
丘
ＣＧＣＴＧＴＧＡＡ
ＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＭｅｔＡｓｐＡ
ＩａＭｅｔＬｙｓＡｒｇＧｌｙＬｅｕＣｙｓＣｙｓＶａ
ｌＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣ
ＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＬｅｕＬｅｕＬｅｕＣ
ｙｓＧｌｙＡｌ ａＶａｌＰｈｅＶａｌＳｅｒＰｒｏＳ
ｅｒＧｌｎＧＡＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＣＧ、ＡＴＴＣＡ
ＧＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＧｌｕｌｌ
ｅＨｉｓＡｌａＡｒｇＰｈｅＡｒｇＡｒｇＧｌｙＡｌａ
ＡｒｇＳｅｒＴｙｒＣＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡ
ＣＧＴＧＣＴＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＧｌ
ｎＡｓｐＴｈｒＡｒｇＡｌａＴｈｒＣｙｓＴｙｒＧ１ｕ
ＡｓｐＧ１ｎＧ１ｙＩｌｅＡＧＣＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡ
ＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＧＣ
ＣＳｅｒＴｙｒＡｒｇＧｌｙＴｈｒＴｒｐＳｅｒＴｈｒ
ＡｌａＧｌｕＳｅｒＧ１ｙＡ１ａｙｓＳｅｒＴｈｒＣｙ
ｓＧ１ｙＬｅｕＡｒｇＴＴＣＧＣＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧ
ＧＧＣＴＣｈｅＡｒｇｌ ｌｅＬｙｓＧｌｙＧ１ｙＬｅ
ｕＡＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣｉｓＰｒ
ｏＴｒｐＧｌｎＡｌａＡ１ａｌｌｅＣＧＣＣＣＧＧＡＧ
ＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴＧｅｒＰｒｏＧｌｙＧ１ｕＡｒｇ
ＰｂｅＬｅｕ１ｕＡｒｇＰｈｅＰｒｏＰｒｏＨｉｓＨｉ
ｓＧＡＡＣＡＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＴＬｅｕＴ
ｈｒＶａｌ Ｉ ｌｅＬｅｕＧ１ｙＡｒｇＴｈｒＴ
ｙｒＡｒｇＶａｌＶａｌＰｒｏＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡ
ＧＣＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴｃＧＡＡＡＡＡＴＡｃ
ＡＴＴＧｌｙＧｌｕＧｌｕＧｌｕＧｌｎＬｙｓＰｈｅＧ
ｌｕＶａｌＧｌｕＬｙｓＴｙｒ Ｉ ＩｅＡ１ａＧｌｎ
Ｇ１ｕＳｅｒＳｅｒＶａｌＶａｌＡｒｇＴｈｒＶａｌＣ
ｙｓＬｅｕＰｒｏＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴ
ＧＣＣＧＧＡＣＴＧＧＡＣＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＰｒｏ
ＡｌａＡｓｐＬｅｕＧｌｎＬｅｕＰｒｏ八ｓｐＴｒｐＴ
ｈｒＧｌｕｃｙｓｃ；ｌｕＡＴＧＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣ
ＴＣＣＴＴＴＣｉｓＧ１ｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＰｒｏＰ
ｈｅＡＧＧＣＴＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＴＡＣｌｕＡ
１ａＨｉｓＶａｌＡｒｇＬｅｕＴｙｒＣＡＣＡＡＣＡＴ
ＴＴＡＣＴＴＡＡＣＡＧＡＰｒｏＳｅｒＳｅｒＡｊｇＣ
ｙｓＴｈｒＳｅｒＧｌｎＨｉｓＬｅｕＬｅｕＡｓｎＡｒ
ｇＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＣＧＧｅｕｃｙ
ｓＡｌａＧＩｙＡｓｐＴｈｒＡｒｇＡＣＴＴＧＣＡＣＧ
ＡＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＳｅｒＧ１ｙＧ １ｙＰｒｏＧ
１ｎＡｌ ａＡｓｎＬｅｕＨｉ ｓＡｓｐＡ１ａｃｙｓ
ＧＩｎ図
ＧＧＣＧＡＴＴＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴ
ＧＴＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧＧＣＧｌｙＡｓｐＳｅｒＧｌ
ｙＧ１ｙＰｒｏＬｅｕＶａｌＣｙｓＬｅｕＡｓｎＡｓｐ
Ｇ１ｙＣＧＣＡＴＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡ
ＴＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡｒｇＭｅｔＴｈ
ｒＬｅｕＶａｌＧｌｙｌ Ｉｅｌ ｌｅＳｅｒＴｒｐＧ
ｌｙＬｅｕＧｌｙＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴ
ＣＣｙｓＧｌｙＧｌｎＬｙｓＡｓｐＶａｌＡＣＣＡＡＣ
ＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＧＧＴｈｒＡｓｎＴｙｒＬｅｕＡ
ｓｐＴｒｐＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＡＣＴＣ
ＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＧＣＣＴ
ＣＴＴＣＴＴＣＴＴFigure 1: Chromosomal DNA region encoding TPA; Figure 2: Schematic diagram showing the method for producing vector pSVePA-3; Figure 3: Liquid chromatography of the peptide fragment of PA (NB 315). Chromatography chart and amino acid sequence of the determined peptide, Figure 4 (1) to (3)
) is the amino acid sequence deduced to be the cDNA sequence encoding PA (NB315), and FIG.
15) A schematic diagram showing the method for producing the expression vector pSV2NBPA, and FIG.
315) is shown. In Figures 1.2 and 5, P, E, Ba, Bg, S
s, C, Hp, H4, Xb and Sa are restriction enzymes PvuI[, EcoRl, BamHl, respectively. BglII, 5stl, C1al, Hpa
l, HindI[I, Kpnl, Xbal and 3a
The l+ recognition site is shown. Also TPA, Amp, SVe,
ort, Ecogpt, dhfr, and polyA are the TPA gene or a part of the TPA gene, the ampicillin resistance gene, the early gene promoter region containing the SV40 DNA replication origin, the plasmid replication origin, and Ec.
ogpt gene, dihydrofolate reductase gene, SV4
The region containing 0 poly(A) addition signals is shown. Patent applicant Kanebuchi Chemical Industry Co., Ltd.'1 (rt -4:=(-+ tc % concave hill CGCTGTGAA AGAGGGCTCTGCTGTGTGMetAspA
IaMetLysArgGlyLeuCysCysVa
lCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTC
GTTTCGCCCAGCCAGLeuLeuLeuC
ysGlyAl aValPheValSerProS
erGlnGAAATCCATGCCCG,ATTCA
GAAGAGGAGCCAGATCTTACGlull
eHisAlaArgPheArgArgGlyAla
ArgSerTyrCAAGATACCAGGGCCA
CGTGCTACGAGGACCAGGGCATCGl
nAspThrArgAlaThrCysTyrG1u
AspG1nG1yIleAGCTACAGGGGCA
CGTGGAGCACAGCGGAGAGTGGCGC
CSerTyrArgGlyThrTrpSerThr
AlaGluSerG1yA1aysSerThrCy
sG1yLeuArgTTCGCATCAAGGAG
GGCTCheArgl leLysGlyG1yLe
uACCCCTGGCAGGCTGCCATCisPr
oTrpGlnAlaA1alleCGCCCGGAG
AGCGGTTCCTGerProGlyG1uArg
PbeLeu1uArgPheProProHisHi
sGAACATACCGGGTGGTCCCTLeuT
hrVal I leLeuG1yArgThrT
yrArgValValValProGGCGAGGAGGA
GCAGAAATTTGAAGTcGAAAAATAc
ATTGlyGluGluGluGlnLysPheG
luValGluLysTyr I IeA1aGln
G1uSerSerValValArgThrValC
ysLeuProCCGGCGGACCTGCAGCT
GCCGGACTGGACGGAGTGTGAGPro
AlaAspLeuGlnLeuPro8spTrpT
hrGlucysc; luATGAGGCCTTGTC
TCCTTTCisG1uAlaLeuSerProP
heAGGCTCATGTCAGACTGTACluA
1aHisValArgLeuTyrCACAACAT
TTACTTAACAGAProSerSerAjgC
ysThrSerGlnHisLeuLeuAsnAr
gTGTGTGCTGGAGACACTCGeucy
sAlaGIyAspThrArgACTTGCACG
ACGCCTGCCAGSerG1yG 1yProG
1nAl aAsnLeuHi sAspA1acys
GIn diagramGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGT
GTCTGAACGATGGCGlyAspSerGl
yG1yProLeuValCysLeuAsnAsp
G1yCGCATGACTTTGGTGGGCATCA
TCAGCTGGGGCCTGGGCArgMetTh
rLeuValGlyl Iel leSerTrpG
lyLeuGlyTGTGGACAGAAGGATGT
CCysGlyGlnLysAspValACCAAC
TACCTAGACTGGThrAsnTyrLeuA
spTrpTGACCAGGAACACCCGACTC
CTCAAAAGCAAATGAGATCCCGCCT
CTTCTTCTT
Claims (1)
はＮＨ＿２であり、ＮＨ＿２−はアミノ末端を示し、−
ＣＯＯＨはカルボキシ末端を示す）（以下、アミノ酸配
列Ａと記す）で示される配列を有するグリコシル化され
たプラスミノゲン活性化因子。 ２、動物培養細胞で産生される請求項１記載のプラスミ
ノゲン活性化因子。 ３、動物培養細胞が、形質転換された細胞である請求項
２記載のプラスミノゲン活性化因子。 ４、動物培養細胞が、ＮＢ３１５株（微工研条寄第１９
３１号）である請求項３記載のプラスミノゲン活性化因
子。 ５、血中持続性の改良された請求項１乃至４記載のプラ
スミノゲン活性化因子。 ６、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子をコードする染
色体ＤＮＡ配列に、動物培養細胞で機能する他の遺伝子
のプロモーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有す
るＤＮＡによって形質転換され、上記アミノ酸配列Ａで
示される配列を有するグリコシル化されたプラスミノゲ
ン活性化因子を生産する動物培養細胞。 ７、動物培養細胞が、ハムスター由来の細胞である請求
項６記載の動物培養細胞。 ８、動物培養細胞が、ＮＢ３１５株（微工研条寄第１９
３１号）である請求項７記載の動物培養細胞。 ９、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子をコードする染
色体ＤＮＡ配列に、動物培養細胞で機能する他の遺伝子
のプロモーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有す
るＤＮＡによって形質転換された動物培養細胞を培養し
、上記アミノ酸配列Ａで示される配列を有するグリコシ
ル化されたプラスミノゲン活性化因子を生成せしめ、こ
れを採取するプラスミノゲン活性化因子の製造方法。 １０、形質転換された動物培養細胞が、ハムスター由来
の細胞である請求項９記載の製造方法。 １１、形質転換された動物培養細胞が、ＮＢ３１５株（
微工研条寄第１９３１号）である請求項１０記載の製造
方法。 １２、上記アミノ酸配列Ａで示される配列を有するプラ
スミノゲン活性化因子をコードするｃＤＮＡ配列。 １３、ｃＤＮＡ配列の塩基配列が、 【遺伝子配列があります】 である配列を含むＤＮＡ配列である請求項１２記載のｃ
ＤＮＡ配列。 １４、上記アミノ酸配列Ａで示される配列を有するプラ
スミノゲン活性化因子をコードするｃＤＮＡ配列を含む
発現ベクターによって形質転換された動物培養細胞。 １５、上記アミノ酸配列Ａで示される配列を有するプラ
スミノゲン活性化因子をコードするｃＤＮＡ配列を含む
発現ベクターによって形質転換された動物培養細胞を培
養して、プラスミノゲン活性化因子を生成せしめ、これ
を採取するプラスミノゲン活性化因子の製造方法。[Claims] 1. Amino acid sequence: [There is an amino acid sequence] (In the sequence, R is NH_2-GLY-ALA-ARG or NH_2, NH_2- indicates the amino terminal, -
A glycosylated plasminogen activator having a sequence represented by the following (hereinafter referred to as amino acid sequence A) (COOH indicates the carboxy terminus). 2. The plasminogen activator according to claim 1, which is produced in cultured animal cells. 3. The plasminogen activator according to claim 2, wherein the cultured animal cells are transformed cells. 4. The animal cultured cells were NB315 strain (Feikoken Joyori No. 19
The plasminogen activator according to claim 3, which is No. 31). 5. The plasminogen activator according to claims 1 to 4, which has improved persistence in blood. 6. Transformed with a DNA having a DNA sequence that connects the chromosomal DNA sequence encoding human tissue plasminogen activator with the sequence of the promoter region of another gene that functions in cultured animal cells, and is represented by the amino acid sequence A above. A cultured animal cell that produces a glycosylated plasminogen activator having the sequence. 7. The cultured animal cell according to claim 6, wherein the cultured animal cell is a cell derived from a hamster. 8. The animal cultured cells were NB315 strain (Feikoken Joyori No. 19
The cultured animal cell according to claim 7, which is No. 31). 9. Cultivating cultured animal cells transformed with DNA having a DNA sequence that connects the chromosomal DNA sequence encoding human tissue plasminogen activator with the sequence of the promoter region of another gene that functions in cultured animal cells; A method for producing a plasminogen activator, which comprises producing a glycosylated plasminogen activator having the amino acid sequence A and collecting the same. 10. The production method according to claim 9, wherein the transformed animal cultured cells are hamster-derived cells. 11. The transformed animal cultured cells are NB315 strain (
11. The manufacturing method according to claim 10. 12. A cDNA sequence encoding a plasminogen activator having the amino acid sequence A above. 13. The cDNA sequence according to claim 12, wherein the base sequence of the cDNA sequence is a DNA sequence containing the following sequence: [There is a gene sequence]
DNA sequence. 14. A cultured animal cell transformed with an expression vector containing a cDNA sequence encoding a plasminogen activator having the amino acid sequence A above. 15. Cultivate cultured animal cells transformed with an expression vector containing a cDNA sequence encoding a plasminogen activator having the sequence shown in the amino acid sequence A above to produce a plasminogen activator, and collect the same. Method for producing plasminogen activator.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63200798A JPH0249586A (en) | 1988-08-10 | 1988-08-10 | Novel thrombolytic agent and production thereof |
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|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0249586A (en) |
-
1988
- 1988-08-10 JP JP63200798A patent/JPH0249586A/en active Pending
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