HU210541A9 - Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, dna molecules encoding them, vectors, and host cells - Google Patents
Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, dna molecules encoding them, vectors, and host cells Download PDFInfo
- Publication number
- HU210541A9 HU210541A9 HU9400022P HU9400022P HU210541A9 HU 210541 A9 HU210541 A9 HU 210541A9 HU 9400022 P HU9400022 P HU 9400022P HU 9400022 P HU9400022 P HU 9400022P HU 210541 A9 HU210541 A9 HU 210541A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- variant
- wild
- amino acid
- fibrin
- type
- Prior art date
Links
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 title claims description 357
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 title claims description 356
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 title claims description 353
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 title claims description 78
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 title claims description 78
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 title claims description 77
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 77
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 title description 13
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 title description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 74
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 73
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 70
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 68
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 35
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 claims description 30
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 claims description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 24
- 108010031891 KHRR 296-299 AAAA T103N Proteins 0.000 claims description 14
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 12
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 11
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 11
- 102000047823 human PLAT Human genes 0.000 claims description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 9
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 8
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 8
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 62
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 54
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 29
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 23
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 23
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 22
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 22
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 18
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 18
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 16
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 15
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 11
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 10
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 10
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 9
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 8
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 7
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 7
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 6
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 5
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- -1 ATCC 44 Chemical compound 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 239000001825 Polyoxyethene (8) stearate Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000001882 Soybean hemicellulose Substances 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000711 locust bean gum Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 102220566256 Acid-sensing ion channel 3_Y67N_mutation Human genes 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 102100033571 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N (4r,4ar,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,4a,5,6,7a,13-octahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one;2,3-dihydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(O)C(O)=O.O=C([C@@H]1O2)CC[C@H]3[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 OJHZNMVJJKMFGX-RNWHKREASA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102220466012 Angiogenin_R29A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101000882917 Penaeus paulensis Hemolymph clottable protein Proteins 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 1
- 229940045687 antimetabolites folic acid analogs Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003339 best practice Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000216 gellan gum Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N l-leucine l-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O BRHPBVXVOVMTIQ-ZLELNMGESA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960004838 phosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000007347 radical substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 229960003147 reserpine Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 101150108727 trpl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 230000034365 zymogen activation Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A jelen találmány bizonyos szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) zimogénekre, ilyen zimogének előállítási eljárásaira, valamint ezeket a zimogéneket a gyógyászat területén hasznosító eljárásokra és kompozíciókra vonatkozik. Ezen kívül a találmány foglalkozik olyan módosított szerkezetű variánsokkal is, amelyek aminosav-helyettesítéseket tartalmaznak a t-PA proteáz doménjén belül, amely módosítás a variánst zimogénné teszi - azaz viszonylag inaktívvá egyláncú formájában, de aktívvá, amikor kétláncú formává alakul át fibrin jelenlétében -, és/vagy még fibrin (vagy plazma-rög) speciftkusabbá alakítja a vad típusú (vt) t-PA-nál.The present invention relates to certain tissue plasminogen activator (t-PA) zimogens, to processes for the preparation of such zimogens, and to methods and compositions for use in the medical field. In addition, the invention relates to modified variants having amino acid substitutions within the protease domain of t-PA, which modifies the variant as a zymogen, i.e., relatively inactive in its single-chain form but active when converted in the presence of fibrin in the presence of fibrin, and / or even more fibrin (or plasma clot) more specific than wild-type (vt) t-PA.
2. A technika állásának ismertetése2. Description of the state of the art
A plazminogén aktivátorok olyan enzimek, amelyek aktiválják a zimogén plazminogént a szerin proteáz plazmin létrehozására (elhasítva az Arg561-Val562 között), amely lebontja a különböző fehérjéket, köztük a fibrint is. A tanulmányozott plazminogén aktivátorok közé tartozik a sztreptokináz, amely egy bakteriális fehérje, az urokináz, amely a vesében és egyéb helyeken szintetizált enzim, melyet eredetileg a vizeletből izoláltak, és a humán szöveti plazminogén aktivátor (t-PA), amely az érfalakat borító sejtek által termelt enzim.Plasminogen activators are enzymes that activate the zymogen plasminogen to produce the serine protease plasmin (cleaved between Arg561-Val562), which degrades various proteins, including fibrin. Plasminogen activators studied include streptokinase, a bacterial protein, urokinase, an enzyme synthesized in the kidney and other sites, originally isolated from urine, and human tissue plasminogen activator (t-PA), which is produced by cells enzyme produced.
Az egyes plazminogén aktivátorok hatásmechanizmusa eltérő: a sztreptokináz egy komplexet képez a plazminogénnel vagy a plazminnal, kialakítva a plazminogén-aktiváló aktivitást; az urokináz közvetlenül elhasítja a plazminogént; míg a t-PA, a fibrin és a plazminogén együttes kölcsönhatásban vannak a maximális aktivitás létrehozására.The mechanism of action of each plasminogen activator is different: streptokinase complexes with plasminogen or plasmin to produce plasminogen activating activity; urokinase directly cleaves plasminogen; while t-PA, fibrin and plasminogen interact to produce maximal activity.
A t-PA-t azonosították és egy különösen fontos és hatásos új biológiai gyógyászati szerként írták le, amely rendkívüli eredményeket mutat az érbetegségek, pl. a szívizom-infarktus kezelésében, részben nagy fibrin fajlagossága, részben jelentős in vivő vérrög-oldó képessége miatt.T-PA has been identified and described as a particularly important and potent novel biological therapeutic agent that has shown remarkable results in the treatment of vascular diseases, e.g. in the treatment of myocardial infarction, partly due to its high fibrin specificity and partly due to its significant in vivo ability to clot.
Bár a t-PA jelenlétét különböző tudományos munkacsoportok számos vizsgálata sugallta, lényegében tiszta izolátumként természetes forrásból először Collen és mtsai azonosították és mérték a velejáró plazminogén aktivátor hatást in vivő /4,752,603 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, nyilvánosságra került 1988. 06. 21-én; lásd még Rijken és mtsai: J. Bioi. Chem. 256,7035(1981)/.Although the presence of t-PA has been suggested by numerous studies in various scientific working groups, essentially pure isolates were first identified from a natural source by Collen et al., And the accompanying plasminogen activator effect was measured in vivo / 4,752,603. U.S. Pat. see also Rijken et al., J. Bioi. Chem. 256, 7035 (1981)].
Ezt követően a t-PA-t teljes mértékben azonosították és jellemezték a DNS-szekvencia és az ebből kikövetkeztetett aminosav-szekvencia meghatározásával, mely a rekombináns DNS technológiát alkalmazó sikeres munkán alapult, amely lehetővé tette nagy mennyiségű t-PA előállítását elkülönült környezetben. Ezt a munkát ismerteti Pennica és mtsai: Natúré 301, 214 (1983) és a 4,766,075 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (nyilvánosságra került 1988. 08.Subsequently, t-PA was fully identified and characterized by DNA sequencing and deduced amino acid sequencing based on successful work using recombinant DNA technology to produce large amounts of t-PA in isolated environments. This work is described in Pennica et al., Natura 301, 214 (1983) and U.S. Patent 4,766,075. U.S. Pat.
23-án).23).
Ezen leírások alapján az már nyilvánvaló, hogy a t-PA molekula öt olyan domént (tartományt) tartalmaz, amelyeket már meghatároztak homológ vagy egyéb módon hasonló szerkezetekben, melyeket különféle egyéb fehérjékben, mint pl. tripszinben, kimotripszinben, plazminogénben, protrombinban, fibronektinben és epidermális növekedési faktorban (EGF) azonosítottak. Ezeket a doméneket - a t-PA aminosav-szekvenciájának N-terminálisától kezdve - a következőképpen nevezték el: 1) az ujj-régió (F), amelyet sokféleképpen határoztak meg, mint az 1-től a kb. 44-ik aminosavat magában foglaló területet; 2) a növekedési régió (G), amelyet különféleképpen definiáltak, mint a kb. 45. aminosavtól a 91. aminosavig húzódó területet (az EGF-fel való homológiáján alapul); 3) az „első horog” (KI), amelyet a kb. 92. aminosavtól a kb. 173. aminosavig tartó területként határoztak meg; 4) a „második horog” (K2), amelyet kb. a 180. aminosavtól kb. a 261. aminosavig tartó területként definiáltak; és 5) az úgynevezett szerin proteáz tartomány (P), amelyet általában úgy határoztak meg, hogy kb. a 264. aminosavtól a molekula C-terminálisáig tartó területet fogja át. Ezek a tartományok, amelyek rendszerint egymás szomszédságában helyezkednek el vagy rövid „linker” (kapcsoló) régiókkal vannak elkülönítve egymástól, a t-PA vélt érett formája 1-527 aminosavainak teljes aminosavszekvenciáját ki adják.From these descriptions, it is already apparent that the t-PA molecule contains five domains (domains) that have already been defined in homologous or otherwise similar constructs that have been identified in various other proteins, e.g. trypsin, chymotrypsin, plasminogen, prothrombin, fibronectin and epidermal growth factor (EGF). These domains, named from the N-terminus of the amino acid sequence of t-PA, are named as follows: 1) the finger region (F), which is defined in many ways, from 1 to approx. The 44th amino acid region; 2) the growth region (G), defined in different ways, such as the approx. Amino acid 45 to amino acid 91 (based on EGF homology); 3) the "first hook" (OFF), which is set at approx. 92 amino acids to ca. 173. defined as an amino acid region; 4) the "second hook" (K2), which is approx. from amino acid 180, approx. defined as the region up to 261 amino acids; and 5) the so-called serine protease domain (P), which is generally defined to be about 1 to about 5 ppm. covers the region from 264 amino acids to the C-terminus of the molecule. These domains, usually adjacent to each other or separated by short "linker" regions, represent the complete amino acid sequence of 1-527 amino acids of the putative mature form of t-PA.
Az egyes doménekről különbözőképpen írták le, hogyan osztoznak bizonyos specifikus biológiailag lényeges tulajdonságokban. Az ujj doménre az jellemző, hogy legalább egy nagyon fontos szekvenciát tartalmaz, amelynek nagy a kötődési affinitása a fibrinhez. (Erről az aktivitásról úgy vélik, hogy lényeges szerepe van abban a nagyfokú specifitásban, melyet a t-PA mutat a vérrögoldásban a fibrinben gazdag trombusok helyén.) A növekedési faktor-szerű régió hasonlóképpen a sejtfelületi kötő aktivitással kapcsolatos. A második horog régió szintén erős kapcsolatban van a fibrin kötéssel és a fibrinnek azon képességével, hogy stimulálja a t-PA aktivitását. A szerin proteáz dómén felelős a plazminogén - plazmint eredményező - enzimes hasításáért.Different domains have been described differently in how they share certain specific biologically relevant properties. The finger domain is characterized by having at least one very important sequence which has a high binding affinity for fibrin. (This activity is believed to play an important role in the high specificity that t-PA exhibits in the clotting of fibrin-rich thrombi.) The growth factor-like region is similarly related to cell surface binding activity. The second hook region is also strongly associated with fibrin binding and the ability of fibrin to stimulate t-PA activity. The serine protease domain is responsible for the enzymatic cleavage of plasminogen, resulting in plasmin.
A természetes t-PA-val, mint vérrög-oldó szerrel együtt járó jelentős előnyök ellenére sem lehet azt hinni, hogy a természetes fehérje képviseli szükségszerűen az optimális t-PA-t minden körülmények között. Ezért számos variánst javasoltak és terveztek acélból, hogy fokozzák a t-PA fajlagos tulajdonságait. Ezen variánsok némelyike megszünteti a természetes t-PA felhasználásával járó hátrányokat olyan esetekben, ahol egy hosszabb félélettartamú vagy lassabb kiürülési sebességgel rendelkező szer előnyösebb lenne, pl. mélyvénás trombózis kezelésében vagy az infarktusban szenvedők egymást követő reperfúziójában, vagy ahol egy egyszálú szer lenne az előnyösebb.Despite the significant benefits associated with natural t-PA as a blood clotting agent, it is not believed that natural protein necessarily represents optimal t-PA under all conditions. Therefore, many variants of steel have been proposed and designed to enhance the specific properties of t-PA. Some of these variants overcome the disadvantages of using natural t-PA in cases where an agent with a longer half-life or slower clearance rate would be more advantageous, e.g. in the treatment of deep vein thrombosis or sequential reperfusion of infarct patients or where a single-stranded agent would be preferred.
így például a teljes ujj-doménnek vagy egy jelentősFor example, the entire finger domain or a significant one
HU 210 54! A9 részének az eltávolítása egy olyan molekulát eredményez, amely lényegesen csökkent fibrin-kötő tulajdonságokkal bír, noha ennek ellenére bekövetkezik egy csökkenés a megmaradó rész kiürülésének teljes sebességében is (WO 89/00197 sz. PCT-beli közrebocsátási irat, melyet 1989.01. 12-én publikáltak).HU 210 54! Removal of part of A9 results in a molecule that has significantly reduced fibrin-binding properties, although there is nevertheless a decrease in the total rate at which the remainder is cleared (PCT Publication No. WO 89/00197, issued January 12, 1989). published).
A 199,574 sz. európai közrebocsátási iratban olyan variánsokat írtak le, amelyek aminosav-helyettesítéseket tartalmaznak a proteolitikus hasítási helyeknél aNo. 199,574. Variants containing amino acid substitutions at the proteolytic cleavage sites have been described in
275., 276. és 277. pozíciókban. Ezekre a variánsokra, amelyek előnyösen úgy jellemezhetők, mint a 275. pozícióban az arginintől eltérő aminosavat tartalmazó t-PA variánsok, úgy hivatkozunk, mint proteáz-rezisztens egyláncú t-PA variánsokra, amelyek - eltérően a természetes t-PA-tói, amely egyláncú vagy kétláncú formában létezhet - rezisztensek a proteáz hasításra a 275. helyen és ennek következtében nem alakulnak át metabolikusan in vivő egy kétláncú formába. Erről az egyláncú formáról úgy vélik, hogy bizonyos előnyökkel bír biológiai és kereskedelmi szempontokból, amennyiben stabilabb, miközben a fibrin-kötés és fibrin-stimulálás is megnövekszik a kétláncú t-PA-hoz viszonyítva. Továbbá leírtak olyan plazminogén aktivátorokat, amelyek egy, a fibrinnel kölcsönhatásba lépni képes domént és az urokináz proteáz doménjét tartalmazzák; ennek egyik kiviteli formája egy olyan módosított urokináz, amely kevésbé hajlamos a kétláncú urokináz formálására (lásd WO 88/05081 sz. PCT-beli közrebocsátási irat, melyet 1988.07.14-én publikáltak).Positions 275, 276 and 277. These variants, which are preferably characterized as t-PA variants containing amino acid residues other than arginine at position 275, are referred to as protease resistant single chain t-PA variants which, unlike natural t-PA, which is single chain or in a two-chain form - resistant to protease cleavage at position 275 and consequently not metabolically converted in vivo to a two-chain form. This single-chain form is believed to have some biological and commercial benefits when it is more stable while increasing fibrin binding and fibrin stimulation relative to double-chain t-PA. Furthermore, plasminogen activators comprising a domain capable of interacting with fibrin and a protease domain of urokinase have been described; an embodiment thereof is a modified urokinase which is less prone to the formation of double-chain urokinase (see PCT Publication No. WO 88/05081, published July 14, 1988).
A t-PA proteáz hasítási helyének módosítására vonatkozó további szabadalmi irodalmak pl. a következők: 241,209 sz. európai szabadalmi leírás; 201,153 sz. európai közrebocsátási irat (nyilvánosságra jutott 1986.Further patents for modifying the cleavage site of the t-PA protease, e.g. are as follows: No. 241,209 European Patent Specification; No. 201,153 European Publication Bulletin (published in.
11. 12-én); 233,013 sz. európai közrebocsátási irat (nyilvánosságra jutott 1987. 08. 19-én); 292,009 sz., 293,936 sz. és 293,934 sz. európai közrebocsátási iratok (nyilvánosságra jutottak 1988. 11. 23-án ill. 1988.11 on 12); No. 233,013 European Patent Publication (published August 19, 1987); 292,009, 293,936; 293,934; European Publication Documents (published on 23.11.1988 and 1988).
12. 07-én ill. 1988.12.07-én) és WO 88/10119 sz. PCTbeli közrebocsátási irat.July 12 and 7 December 12, 1988) and WO 88/10119. PCT Publication Document.
A 117-119., 184-186. és 448-450. helynél glükozilezett mutánsok nagyobb fajlagos aktivitást mutatnak, mivel a szénhidrát mólszázaléka lecsökken (227,462 sz. európai közrebocsátási irat, melyet 1987. 07. 01-én publikáltak). Ez a szabadalmi bejelentés ezen kívül leírja egy fibrin/fibrin-bomlástermék vizsgálati eljárás alkalmazását és kitanítást ad arról, hogy a t-PA molekulát lehet módosítani a 272-280. helyeken is, vagy eltávolíthatunk maximum 25 aminosavat a C-terminálisról. Ezen kívül az Asnll9, Alal86 és Asn450 aminosavakkal bíró t-PA mutánsokról, amelyekből az N-glükozilezési helyeket DNS-módosítással szelektíven eltávolították, de az O-kapcsolt szénhidrátokat tartalmazzák, kimutatták, hogy kb. kétszer olyan hatékonyak mint a melanóma t-PA egy in vitro lízis vizsgálatban (225,286 sz. európai közrebocsátási irat, melyet 1987. 06. 10-én publikáltak).A 117-119., 184-186. and 448-450. glycosylated mutants exhibit greater specific activity as the molar percentage of carbohydrate is reduced (European Patent Publication No. 227,462, published July 1, 1987). This patent application further describes the use of a fibrin / fibrin degradation product assay and teaches that the t-PA molecule may be modified as described in U.S. Pat. sites, or remove up to 25 amino acids from the C-terminus. In addition, t-PA mutants with Asn119, Alal86 and Asn450 amino acids from which the N-glycosylation sites have been selectively removed by DNA modification but contain O-linked carbohydrates have been shown to be ca. is twice as effective as melanoma t-PA in an in vitro lysis assay (European Patent Publication No. 225,286, published June 10, 1987).
A t-PA 449. aminosavának helyettesítését bármely, arginintől eltérő aminosavval a glikozilezési hely módosítására, valamint az Arg 275 módosítását vagy a -3. és 91. helyek közti terület kiiktatását is ismertették már (WO 87/04722 sz. PCT-beli közrebocsátási irat, mely nyilvánosságra jutott 1987. 08. 13-án). Leírtak egy aminosav-helyettesítést a t-PA 448. helyénél acélból, hogy eltöröljék a glikozilezés lehetőségét (1988. 12. 28-án publikált 297,066 sz. európai közrebocsátási irat). A 448-450. helyeken történő módosításoknak és az N-terminális 1-82. aminosavak deléciójának kombinációját ismerteti a WO 89/00191 sz. PCT-beli közrebocsátási irat (nyilvánosságra került 1989. 01. 12-én). Ezen kívül módosították az urokinázt is az Asp302Ser303-Thr3-4 régióban, hogy megakadályozzák a glikozilezést (299,706 sz. európai közrebocsátási irat, melyet 1989. 01. 18-án publikáltak).Substitution of amino acid 449 for t-PA with any amino acid other than arginine to modify the glycosylation site and modification of Arg 275 or the -3-amino acid residue. and the elimination of sites between sites 91 and 91 (PCT Publication No. WO 87/04722, published August 13, 1987). An amino acid substitution at position 448 of t-PA from steel to eliminate the possibility of glycosylation has been described (European Patent Publication No. 297,066, published December 28, 1988). A 448-450. and N-terminal 1-82. A combination of amino acid deletions is disclosed in WO 89/00191. PCT Application Publication (published January 12, 1989). In addition, urokinase in the Asp302Ser303-Thr3-4 region has been modified to prevent glycosylation (European Patent Publication No. 299,706, published January 18, 1989).
Azonban úgy tűnik, hogy a glikozilezési helyeken, különösen a 117. aminosav-helyen történő változtatások mindig olyan molekulát eredményeznek, amelyek megváltozott oldhatósági jellemzőkkel bírnak, ezek pedig változásokat eredményezhetnek a vérkeringési félélettartamban és/vagy a fibrin-kötő tulajdonságokban (1987. 09. 23-án publikált 238,304 sz. európai közrebocsátási irat).However, changes in glycosylation sites, particularly amino acid 117, appear to always result in a molecule with altered solubility characteristics, which may result in changes in circulatory half-life and / or fibrin-binding properties (23.09.1987). European Patent Publication No. 238,304, published on.
Amikor a t-PA növekedési faktor doménjét kiiktatták, az így kapott variáns még aktív és kötődik a fibrinhez, amint erről A. J. van Zonneveld és mtsai beszámolnak /Thrombos. Haemostas. 54 (1), 4 (1985)/. Beszámoltak különböző deléciókról a növekedési faktor doménen belül a szabadalmi irodalomban is /lásd 241,209 sz. európai közrebocsátási irat (dez-51-87); 241,208 sz. európai közrebocsátási irat (dez-51-87 és dez-51-173); WO 87/04722 sz. PCT-beli közrebocsátási irat (az 1-91 N-terminális egészének vagy egy részének kiiktatása); 231,624 sz. európai közrebocsátási irat (a teljes növekedési faktor dómén kiiktatása); 242,836 sz. európai közrebocsátási irat és a 62-269688 sz. japán közzétételi irat (Kokai) (a növekedési faktor dómén egészének vagy egy részének deléciója/.When the growth factor domain of t-PA was deleted, the resulting variant was still active and bound to fibrin, as reported by A.J. van Zonneveld et al. / Thrombos. Haemostas. 54 (1), 4 (1985). Various deletions within the growth factor domain have also been reported in the patent literature / see No. 241,209. European Patent Publication (des-51-87); No. 241,208 European Patent Publication (des-51-87 and des-51-173); WO 87/04722; PCT Application Publication (deletion of all or part of the N-terminal 1-91); No. 231,624 European Patent Publication (deletion of total growth factor domain); No. 242,836 European Patent Publication No. 62-269688; Japanese Publication Document (Kokai) (Deletion of all or part of the growth factor domain).
Kimutatták továbbá, hogy a t-PA-t lehet módosítani mind az első horog tartományban, mind a növekedési faktor tartományban, ez a módosítás megnövekedett vérkeringési félélettartamot eredményez (241,208 sz. európai közrebocsátási irat, mely 1987. 10.14-én került nyilvánosságra). Az 51. és 87. aminosavak közötti területet (beleértve a határokat is) ki lehet iktatni a t-PAból, ez egy olyan variánst eredményez, melynek lassabb a kiürülése a plazmából /1 Bioi. Chem. 263, 1599-1602 (1988)/. Tehát a t-PA-t lehet módosítani hátrányos biológiai tulajdonságok nélkül az érett, natív t-PA 67-69 aminosavai közti területen oly módon, hogy bizonyos aminosavakat kiiktatnak vagy egy vagy több aminosavat eltérő aminosavakkal helyettesítenek (1987. 10. 07-én publikált 240,334 sz. európai közrebocsátási irat).It has also been shown that t-PA can be modified both in the first hook region and in the growth factor region, resulting in an increased circulatory half-life (European Patent Publication No. 241,208, published October 10, 1987). The region between amino acids 51 and 87 (including the boundaries) can be deleted from t-PA, resulting in a variant that has a slower plasma clearance / 1 Bioi. Chem. 263: 1599-1602 (1988). Thus, t-PA can be modified in the region between the mature native t-PA 67-69 without deleterious biological properties by deleting certain amino acids or replacing one or more amino acids with different amino acids (published October 10, 1987). European Patent Publication No. 240,334).
Leírtak egy olyan t-PA/urokináz hibridet is, amely a t-PA 273-527 aminosavait átfogó területet használja fel (290,118 sz. európai közrebocsátási irat, nyilvánosságra került 1988. 11. 09- én).A t-PA / urokinase hybrid which utilizes the 273-527 amino acid region of t-PA has also been described (European Patent Publication No. 290,118, published November 9, 1988).
A humán t-PA szerpin-rezisztens mutánsait, melyekben a proteáz doménben van változtatás, beleértve a d296-302 t-PA-t, az R304S t-PA-t és az R304E t-PA-t, Madison és mtsai írták le /Natúré 339, 721-724Serpine-resistant mutants of human t-PA having alterations in the protease domain including d296-302 t-PA, R304S t-PA and R304E t-PA have been described by Madison et al. Natur 339, 721-724
HU 210 541 A9 (1989)/, valamint Ringe Dagmar (a kísérő közlemény ugyanebben a számban).EN 210 541 A9 (1989), and Ringe Dagmar (accompanying publication in the same issue).
A plazminogén aktivátorokról és a második generációs származékaikról egy általános áttekintés található Harris közleményében: Protein Engineering 1,449-458 (1987). A t-PA variánsokról további áttekintést adnak Pannekoek és mtsai: Fibrinolysis 2, 123-132 (1988) és Ross és mtsai: Annaual Reports in Medicinái Chemistry, Vol. 23, Chapter 12 (1988).A general review of plasminogen activators and their second-generation derivatives can be found in Harris, 1987, Protein Engineering 1,449-458. For a further review of t-PA variants, see Pannekoek et al., Fibrinolysis 2: 123-132 (1988) and Ross et al., Annaual Reports in Medicinal Chemistry, Vol. 23, Chapter 12 (1988).
Bár a fentiekben megadott leírások bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy újabb és - különböző szempontokból - jobb t-PA szerek állnak rendelkezésre, eddig még nem írtak le olyan t-PA molekulákat, amelyek csak akkor aktiválódnak, amikor elérik a feloldandó vérrög helyét. Jelenleg a t-PA molekulák fibrin és/vagy plazmafehérjék vagy a teljes vér jelenlétében aktívak, akár egyláncú akár kétláncú formában vannak. Kívánatos lenne, ha egy olyan zimogén t-PA állna rendelkezésre, amely fibrin jelenlétében megkövetelné egyláncú formájának összekapcsolódását kétláncú formájává, hogy teljesen aktívvá váljék. Az ilyen variáns molekulák valószínűleg kevesebb mellékhatást mutatnának, mint pl. kisebb vérzés, és fibrinogén-takarékos tulajdonságokkal rendelkeznének, ezáltal az orvostudománynak fontos új alternatívákat nyújtva a szív- és érrendszeri betegségek és számos egyéb gyógyászati eset kezelésében, amelyek a véredények tromboembolitikus elzáródásából alakulnak ki, valamint az addhéziók képződésének megelőzésében.Although the above descriptions provide evidence that newer and, in various respects, better t-PA agents are available, no t-PA molecules that are activated until they reach the site of the clot to be solved have not yet been described. Currently, t-PA molecules are active in the presence of fibrin and / or plasma proteins or in whole blood, either in single-chain or double-chain form. It would be desirable to have a zymogen t-PA which, in the presence of fibrin, would require its single-chain form to be linked to its two-chain form to become fully active. Such variant molecules are likely to show fewer side effects, such as. with reduced bleeding and fibrinogen-saving properties, thus providing important new alternatives for medicine in the treatment of cardiovascular disease and many other medical conditions that result from thromboembolytic blockage of blood vessels and the prevention of adhesions.
Kívánatos lenne egy olyan t-PA molekula megalkotása is, amely a vadtípusú t-PA-hoz képest magasabb fibrin-stimulált (vagy egy plazma vérrög-stimulált) aktivitással mint fibrinogén-stimulált (vagy plazma-stimulált) aktivitással rendelkezik, vagyis fibrin (vagy plazma vérrög)-specifikus, úgyhogy csak a vérrög helyén fog hatni és nem szisztémásán.It would also be desirable to provide a t-PA molecule that has a higher level of fibrin-stimulated (or plasma-clot-stimulated) activity than wild-type t-PA than fibrinogen-stimulated (or plasma-stimulated) activity, i.e., fibrin (or plasma clot) -specific, so it will act only at the site of the clot and not systemically.
Következésképpen a jelen találmány tárgya olyan zimogén és/vagy fibrin-specifikus t-PA molekulák előállítása, amelyek javított terápiás és gyógyszerészeti tulajdonságokkal rendelkeznek.Accordingly, it is an object of the present invention to provide zymogen and / or fibrin-specific t-PA molecules which have improved therapeutic and pharmaceutical properties.
A találmány további tárgyát azok a kezelési körülmények képezik, melyek lehetővé teszik azon vérrögoldó szerek alkalmazását, amelyek csak a vérrög helyén aktívak és magasabb szinten használhatók mint az egyéb ilyen jellegű szerek.It is a further object of the present invention to provide treatment conditions that allow the use of anticoagulant agents which are active only at the site of the thrombus and can be used at a higher level than other such agents.
A találmány ezen és egyéb tárgyai nyilvánvalók a szakterületen jártasak számára.These and other objects of the invention will be apparent to those skilled in the art.
A TALÁLMÁNY RÖVID ÖSSZEFOGLALÁSABRIEF SUMMARY OF THE INVENTION
A találmány fent említett szempontjait úgy valósíthatjuk meg, hogy létrehozunk egy szöveti plazminogén aktivátort (t-PA), amely képes plazminnal végzett hasításkor a t-PA enzimatikusan aktív formájává alakulni. Egy másik szempont szerint a találmány egy olyan t-PA variánst nyújt, amely a t-PA proteáz doménjén belül egy vagy több helyen aminosav-változtatásokat tartalmaz a vadtípusú t-PA-hoz képest, amely változtatás zimogénné teszi a molekulát a megfelelő vadtípusú t-PA-hoz viszonyítva.The above aspects of the invention may be accomplished by providing a tissue plasminogen activator (t-PA) capable of converting into an enzymatically active form of t-PA upon plasmin cleavage. In another aspect, the invention provides a t-PA variant that contains amino acid changes at one or more sites within the t-PA protease domain relative to wild-type t-PA, which renders the molecule zymogenic with the corresponding wild-type t-PA. Relative to PA.
Az egyik különösen előnyös kiviteli módban a t-PA egy humán t-PA és a változás a 305 körüli régióban van, beleértve a 305. helyet is, mint pl. a hisztidin kicserélése fenilalaninra a megfelelő vadtípusú t-PA 305. pozíciójában.In one particularly preferred embodiment, t-PA is a human t-PA and the change is in the region around 305 including site 305, such as the site 305. exchange of histidine for phenylalanine at position 305 of the corresponding wild-type t-PA.
További kiviteli módokban a találmány vonatkozik egy DNS-szekvenciára, amely a fent leírt zimogént és variánst kódolja, a DNS-szekvenciát egy transzformált gazdasejtben kifejezni képes replikálható expressziós vektorokra és a nevezett vektorokkal transzformált mikroorganizmusokra és sejttenyészetekre.In still other embodiments, the invention relates to a DNA sequence encoding the zymogen and variant described above, replicable expression vectors capable of expressing the transformed host cell, and microorganisms and cell cultures transformed with said vectors.
A találmány egy még további kiviteli módjában eljárást nyújt, amely magában foglalja:In yet another embodiment, the invention provides a process comprising:
(a) egy aminosav-variáció bevezetését a t-PA proteáz doménjébe, és (b) az így kapott t-PA variánsok átvizsgálását (screenelését) a zimogén jellegre.(a) introducing an amino acid variation into the protease domain of t-PA; and (b) screening the resulting t-PA variants for zymogenicity.
A találmány másik tárgya egy humán szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) variáns, amely a kővetkező biológiai aktivitások közül eggyel vagy többel rendelkezik: zimogén aktivitás, fibrin fajlagosság vagy plazma vérrög fajlagosság; mely variánsra az jellemző, hogy a proteáz doménben egy aminosav-változást tartalmaz a megfelelő vadtípusú t-PA-hoz viszonyítva, mely változtatás felelős a nevezett biológiai aktivitásért, azzal a megkötéssel, hogy az ilyen változtatások kizárólag a 270-280, 448-450 és 502-527 régiókon kívül vannak. Előnyös az a variáns, melyben a változás egy helyettesítés.Another aspect of the present invention is a human tissue plasminogen activator (t-PA) variant having one or more of the following biological activities: zymogen activity, fibrin specificity or plasma clot specificity; which variant is characterized in that it contains an amino acid change in the protease domain relative to the corresponding wild-type t-PA, which is responsible for said biological activity, provided that such changes are restricted to the 270-280, 448-450 and They are outside regions 502-527. The variant in which change is a substitution is preferred.
A találmány további tárgya egy eljárás, mely az alábbi lépésekből áll:Another aspect of the present invention is a process comprising the steps of:
(a) bevezetünk egy aminosav-variációt a szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) proteáz doménjébe, és (b) megvizsgáljuk az így kapott t-PA variánsokat azon képességükre, hogy mutatnak-e egy vagy több biológiai aktivitást az alábbiak közül: zimogén aktivitás, fibrin fajlagosság vagy plazma vérrög fajlagosság.(a) introducing an amino acid variation into the protease domain of the tissue plasminogen activator (t-PA), and (b) examining the resulting t-PA variants for their ability to exhibit one or more of the following biological activities: zymogenic activity , fibrin specificity or plasma clot specificity.
További kiviteli módokban a találmány a fent említett variánsokat kódoló DNS-szekvenciákat és replikálható vektorokat, valamint ezekkel transzformált gazdasejteket szolgáltat.In further embodiments, the invention provides DNA sequences and replicable vectors encoding the above variants, and host cells transformed with them.
Egy még további kiviteli módban a jelen találmány egy kompozícióra irányul az érrendszer állapotának vagy betegségének kezelésére, amely egy találmány szerinti zimogén vagy variáns gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt. Ide tartozik egy olyan kompozíció is, amely a fibrin-lerakódás vagy -összetapadás kialakulásának vagy újraképződésének megelőzésére szolgál, és a találmány szerinti zimogén vagy variáns egy gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazza valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt.In yet another embodiment, the present invention is directed to a composition for treating a vascular condition or disease comprising a therapeutically effective amount of a zymogen or variant of the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier. Also included is a composition for preventing the formation or remodeling of fibrin deposition or adhesion, which comprises a therapeutically effective amount of a zymogen or variant of the invention together with a pharmaceutically acceptable carrier.
Egy még további kiviteli módban a találmány eljárást nyújt az érrendszer állapotának vagy betegségének kezelésére emlősökben, amely magában foglalja a fent leírt alkalmas kompozíció egy hatékony mennyiségének az emlősbe történő beadását.In yet another embodiment, the invention provides a method of treating a vascular condition or disease in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of a suitable composition as described above.
A találmány továbbá eljárást szolgáltat emlősök kezelésére a fibrin lerakódásának vagy adhéziójánakThe invention further provides a method for treating mammalian fibrin deposition or adhesion
HU 210 541 A9 illetve ezek újraképződésének megelőzésére, amely abban áll, hogy a potenciális fibrin lerakodási vagy összetapadási helyre a fent leírt alkalmas kompozíció egy hatékony mennyiségét juttatjuk be.A method of preventing the formation of a fibrin deposition or adhesion site by administering an effective amount of a suitable composition as described above.
A jelen találmány - többek között - azon a különösen sikeres kutatáson alapul, amely kimutatta, hogy bizonyos t-PA molekulák zimogének a t-PA aktivitás egy stimulátora, mint amilyenek a plazmin által lebontott fibrinogén-fragmensek, jelenlétében és így fibrinolitikus aktivitásuk lecsökken, amikor szokásos módon a plazmában vannak, és aktiválódnak, amikor közel kerülnek a plazminhoz a vérrög helyén. így tehát a zimogén úgy aktiválódik, ahogy ezt a specifikusan lokalizált vérrög terápia megköveteli. A találmány szerinti zimogénektől az várható el, hogy „fibrinogén-takarékosak” és így rendszerint magasabb dózisokban alkalmazhatók, mint a nem-zimogén megfelelőik, ez pedig gyorsabb vérrög-oldódást és több vérrög oldódását eredményezi.The present invention is based, inter alia, on particularly successful research which has shown that certain t-PA molecules are zymogens in the presence of a stimulator of t-PA activity, such as plasmin-degrading fibrinogen fragments, and thus their fibrinolytic activity is reduced when they are normally found in plasma and are activated when they are close to plasmin at the site of the blood clot. Thus, the zymogen is activated as required by specifically localized clot therapy. The zymogens of the present invention are expected to be "fibrinogen-sparing" and, thus, usually used in higher doses than their non-zymogen counterparts, resulting in faster clot dissolution and more clot dissolution.
A jelen találmány további célja egy olyan t-PA molekula nyerése, amely fibrin (vagy plazma vérrög) specifikusabb, úgy hogy az előnyösebben hat a vérrög helyén, mint a módosítatlan t-PA.It is a further object of the present invention to provide a t-PA molecule that is more specific to fibrin (or plasma clot) so that it acts more favorably at the site of the clot than unmodified t-PA.
AZ ÁBRÁK ISMERTETÉSEDESCRIPTION OF THE FIGURES
Az 1. ábra a t-PA primer szerkezetét ábrázolja, bemutatva az öt dómén helyzetét, a diszulfíd-híd képződést és az aktiválási helyet, ahol a molekula kétláncú molekulává kapcsolódik össze.Figure 1 depicts the structure of the t-PA primer showing the position of the five domains, the disulfide bridge formation and the activation site where the molecule is linked to a double chain molecule.
A 2. és 3. ábra a pCISt-PA előállítására szolgáló alkalmas eljárás vázlatos bemutatása, bizonyos jelentős restrikciós helyek leírásával együtt.Figures 2 and 3 are schematic representations of a suitable method for the production of pCISt-PA, together with a description of certain significant restriction sites.
A 4. ábra a p7-lH előállítására szolgáló megfelelő eljárás sematikus bemutatása, bizonyos jelentős restrikciós helyek leírásával együtt.Figure 4 is a schematic representation of a suitable method for the production of p7-1H, together with a description of certain significant restriction sites.
Az 5. ábra a túlnyomóan egyláncú F305H (zárt háromszögek), a kétláncú F305H (zárt körök kettős vonallal), az egyláncú vadtípusú t-PA (zárt négyzetek), a kétláncú vadtípusú t-PA (zárt rombuszok) és az egyláncú és kétláncú vadtípusú t-PA keverékének (nyitott háromszögek) fibrin kötését mutatja be 10 ng/ml t-PA koncentrációnál.FIG. shows the fibrin binding of a mixture of t-PA (open triangles) at 10 ng / ml t-PA.
A 6-9. ábrák a plazminogén-plazmin átalakulás kinetikájának függvényeit mutatják be plazminnal degradált fibrinogén jelenlétében a túlnyomóan egyláncú vadtípusú t-PA (6. ábra), a kétláncú vadtípusú t-PA (7. ábra), a zömmel egyláncú F305H t-PA (8. ábra) és a kétláncú F305H t-PA (9. ábra) által. A négyzetek, vonalak és körök reprezentálják a plazminogén és t-PA különböző koncentrációit a vizsgálati pufferben, amelyet az I. példa végén részletezünk. Ezekben az ábrákban az ordináta a 405 nm-nél mért abszorbancia és az abszcissza azon percek számának négyzete, amelyeknél az abszorbanciát mérjük.6-9. Figures 3A and 4B show plots of plasminogen-plasmin conversion kinetics in the presence of plasmin-degraded fibrinogen in the predominantly single-chain wild-type t-PA (Fig. 6), in the two-chain wild-type t-PA (Fig. 8), and ) and the two-chain F305H t-PA (Figure 9). The squares, lines, and circles represent the various concentrations of plasminogen and t-PA in the assay buffer detailed at the end of Example I. In these figures, ordinate is the absorbance at 405 nm and the square of the number of minutes of absorbance at which the absorbance is measured.
AZ ELŐNYYÖS KIVITELI MÓDOK RÉSZLETES LEÍRÁSA A. DefiníciókDETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS A. Definitions
Amint itt használjuk, a „humán szöveti plazminogén aktivátor”, a „humán t-PA” és a „t-PA” ki fejezések olyan humán belső (szöveti típusú) plazminogén aktivátort jelölnek, amelynek két funkciós területe van, amely áll egy proteáz doménből, mely képes a plazminogént plazminná átalakítani, és egy N-terminális régióból, melyről úgy hisszük, hogy a fibrin kötésért felelős. Ez a három kifejezés ennélfogva olyan polipeptideket foglal magában, amelyek a teljes szekvencia részeként tartalmazzák ezeket a funkcionális doméneket. A t-PA megfelelően termelhető, pl. rekombináns sejttenyészet rendszerekben, biológiailag aktív formákban, amelyek tartalmazzák a proteáz területet és a t-PA olyan területeit, melyek a t-PA forrását tekintve egyébként natívak. Belátható, hogy természetes alléi variánsok is léteznek és előfordulnak egyénről egyénre, melyek az aminosav-különbség/ek/ben mutatkoznak meg a teljes szekvenciában.As used herein, the terms "human tissue plasminogen activator", "human t-PA" and "t-PA" denote a human intrinsic (tissue-type) plasminogen activator having two functional domains consisting of a protease domain , which is capable of converting plasminogen to plasmin, and from an N-terminal region believed to be responsible for fibrin binding. These three terms therefore include polypeptides that include these functional domains as part of the entire sequence. T-PA can be properly produced, e.g. in recombinant cell culture systems, in biologically active forms containing the protease region and regions of t-PA that are otherwise native to the source of t-PA. It will be appreciated that natural allele variants also exist and occur from person to person, which are expressed in the amino acid difference (s) throughout the sequence.
Amint itt használjuk, a „vadtípusú t-PA” olyan tPA-ra vonatkozik, amelyet a 4,766,075 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett cDNS kódol (a leírás kitanítását referenciaként beépítjük ezen bejelentésbe). Az így kódolt t-PA alkalmasan egy, akár natív forrásból akár rekombináns expressziós rendszerből származó t-PA molekula, beleértve a 293. vagy 294. sejteket, a kínai hörcsög ovárium sejteket, stb.As used herein, "wild-type t-PA" refers to tPA disclosed in U.S. Patent No. 4,766,075. cDNA, the disclosure of which is incorporated herein by reference. The t-PA encoded in this manner is suitably a t-PA molecule, whether native or recombinant, including 293 or 294 cells, Chinese hamster ovary cells, and the like.
Ahogyan itt használjuk, a „proteáz dómén” a vadtípusú t-PA érett formájának a 264. aminosavtól az 527. aminosavig terjedő régiójára vonatkozik (beleértve a határokat is).As used herein, the "protease domain" refers to the region of the mature form of wild-type t-PA from amino acid 264 to amino acid 527 (including borders).
Ahogyan itt használjuk, a „zimogén”, „zimogénszerü” és „zimogén aktivitás” kifejezéseket olyan találmány szerinti t-PA leírására alkalmazzuk, melynek ki kell elégíteni az alábbi definíciók egyikét vagy mindkettőt. Az első meghatározásban ezek a kifejezések azt jelentik, hogy plazmin-degradált fibrinogén jelenlétében a t-PA megköveteli, hogy egyláncú formája kétláncú formává („enzimatikusan aktív”) kapcsolódjék össze amint ez plazmin jelenlétében történik, hogy enzimatikus aktivitása növekedjen, mint azt később meghatározzuk az alábbiakban leírt vizsgálati körülmények között.As used herein, the terms "zymogen", "zymogen", and "zymogen activity" are used to describe the t-PA of the present invention that must meet one or both of the following definitions. In the first definition, these terms mean that, in the presence of plasmin-degraded fibrinogen, t-PA requires its single-chain form to be fused to a two-chain ("enzymatically active") form in the presence of plasmin to increase its enzymatic activity. under the test conditions described below.
Fibrinogén fragmensek jelenlétében a t-PA egyláncú formája (zimogén) - amint itt meghatározzuk - kevésbé aktív az alábbiakban leírt vizsgálattal mérve, mint a vadtípusú kétláncú t-PA, és átalakul enzimesen még aktívabb formába, amikor aktiváljuk olyan plazmin-szintnek kitéve, mely az egyláncú forma teljes átalakulását idézi elő kétláncú formává. Általában az egyláncú forma aktivitása a kétláncú forma aktivitásának 50%-ára vagy még kevesebbre, előnyösen 20%-ra vagy kevesebbre csökken, még előnyösebben kevesebb, mint az aktivitás 10%-a; majd a kétláncú formává történő összekapcsolódás során az aktivitás kb. 20%-ról megnő 100% fölé, előnyösen a vadtípusú kétláncú forma aktivitásának legalább 50%-ára.In the presence of fibrinogen fragments, the single chain form (zymogen) of t-PA, as defined herein, is less active, as assayed below, than wild-type two-chain t-PA, and is enzymatically converted to more active form when exposed to plasmin levels. causes a complete transformation of a single chain form to a two chain form. In general, the activity of the single-chain form is reduced to 50% or less of the activity of the double-chain, preferably to 20% or less, more preferably less than 10% of the activity; then, when coupled to the two-chain form, the activity is reduced to about 10%. It increases from 20% to more than 100%, preferably to at least 50% of the activity of the wild-type bivalent form.
A variánst oly módon vizsgáljuk meg enzimes aktivitásra, hogy meghatározzuk a plazminogén plazminná való átalakulásának kinetikáját fibrinogén fragmensek jelenlétében, az S-2251 kromogénThe variant is assayed for enzymatic activity by determining the kinetics of the conversion of plasminogen to plasmin in the presence of fibrinogen fragments, the S-2251 chromogen.
HU 210 541 A9 szubsztrátot használva és az I. példában leírt vizsgálatot alkalmazva.EN 210 541 using the A9 substrate and using the assay described in Example I.
A találmány céljára a zimogén - első definícióját tekintve - egy olyan anyag, amely a fenti körülmények között elkülönült lag fázist mutat a plazmin-termelésben, és így az A405-ben való növekedésben, és amikor az idő négyzetével szemben ábrázoljuk, lineáris kinetikát mutat a növekvő idővel. Az idő kinetika leírása megtalálható az alábbi irodalmi helyen: Nieuwenhuizen W., Voskuilen M., Traas D., Hoegee-de Nobel B. és Verheijen J. H.: Fibrinogen-Structural Variants and Interaction /szerkesztők: Henschen A., Hessel B., Mc Donagh J. és Saldeen T. (1985)/, 331-342. oldal, ennek teljes kitanítását beépítjük referenciaként. Anélkül, hogy bármely elméletre korlátoznánk magunkat, ez a hatás valószínűleg az egyláncú formának a kétláncú formává való plazmin-katalizált átalakulásának tulajdonítható, amely a t-PA zimogén aktiválásához vezet. Ez ellentétes a vad típusú egyláncú tPA-nál, a vad típusú kétláncú t-PA-nál és a zimogén t-PA kétláncú formájánál a vizsgálat kezdetétől megfigyelt lineáris kinetikával.For the purposes of the present invention, zymogen, by its first definition, is a substance which exhibits a distinct lag phase in plasmin production, and thus growth in A405, and, when plotted against time squared, exhibits linear kinetics with increasing with time. Time kinetics is described in W. Nieuwenhuizen, M. Voskuilen, D. Traas, B. Hoegee-de Nobel and Verheijen J. H. Fibrinogen-Structural Variations and Interaction / editors: A. Henschen, B. Hessel, Mc Donagh J. and Saldeen T. (1985) 331-342. pages, the full teachings of which are incorporated herein by reference. Without being limited to any theory, this effect is likely due to the plasmin-catalyzed transformation of the single-chain form to the double-chain form, leading to the zymogen activation of t-PA. This is in contrast to the linear kinetics observed for wild-type single-chain tPA, wild-type two-chain t-PA, and the zymogen t-PA form from the start of the study.
Egy második, alternatív definíció szerint a „zimogén” kifejezés olyan t-PA molekulára vonatkozik, amely az enzimatikus aktivitás vizsgálatában nagyobb aktivitás-különbséget mutat az egyláncú és kétláncú forma között, mint a vadtípusú rekombináns t-PA (rtPA). A zimogén aktivitás-különbsége előnyösen legalább 1,5-szöröse a vad típusú rt-PA-nál megfigyelt aktivitás-különbségnek. Ezt az aktivitás-különbséget úgy kaphatjuk meg, hogy csökkenéskor az egyláncú forma aktivitása nagyobb mértékben csökken, mint a kétláncú formáé a vadtípusú t-PA-hoz viszonyítva; ugyanakkor növekedéskor a kétláncú forma aktivitása nagyobb mértékben nő, mint az egyláncú formáé a vadtípusú t-PA-hoz viszonyítva; vagy a fent leírt események bármely kombinációja ezt a leírt hatást eredményezi. A vadtípusú t-PA zimogén jellegét leírták Losealzo /J. Clin. Invest. 82, 1391-1397 (1988)/ és Ranby és mtsai /Thrombosis Research. 27, 175-183 (1982)/.In a second alternative definition, the term "zymogen" refers to a t-PA molecule that exhibits a greater difference in activity between single-chain and double-chain forms in its enzymatic activity assay than wild-type recombinant t-PA (rtPA). Preferably, the difference in zymogenic activity is at least 1.5 times that observed for wild-type rt-PA. This difference in activity can be obtained by decreasing the activity of the single-chain form to a greater extent than the double-chain form when compared to wild-type t-PA; at the same time, with growth, the activity of the double-chain form is increased to a greater extent than that of the single-chain form compared to wild-type t-PA; or any combination of the events described above produces this described effect. The zymogenicity of wild-type t-PA has been described by Losealzo / J. Clin. Invest. 82, 1391-1397 (1988) and Ranby et al., Thrombosis Research. 27, 175-183 (1982).
A „fibrin fajlagosság” kifejezés egy mutáns olyan aktivitására vonatkozik, amely a fibrin-függő fajlagos aktivitás és a fibrinogén-függő fajlagos aktivitás magasabb arányát mutatja az S-2251 vizsgálatban (mind egyláncú mind kétláncú formában), mint a vadtípusú rt-PA, és előnyösen ez az arány legalább 1,5.The term "fibrin specificity" refers to the activity of a mutant showing a higher ratio of fibrin-dependent specific activity to fibrinogen-dependent specific activity in assay S-2251 (both single-chain and double-chain) than wild-type rt-PA, and preferably this ratio is at least 1.5.
A „plazma-vérrög fajlagosság kifejezés egy mutáns olyan aktivitására vonatkozik, amely a plazmavérrög-függő fajlagos aktivitás és a plazma-függő fajlagos aktivitás magasabb arányát mutatja az S-2251 vizsgálatban (mind egyláncú mind kétláncú formában), mint a vadtípusú rt-PA, és előnyösen ez az arány legalább 1,5."Plasma clot specificity refers to the activity of a mutant that exhibits a higher ratio of plasma clot-specific activity to plasma-dependent specific activity in assay S-2251 (both single-stranded and double-stranded) than wild-type rt-PA, and preferably the ratio is at least 1.5.
Amint itt használjuk, az „átmeneti expressziós rendszer” egy olyan sejttenyészetet jelöl, amely egy t-PA variánst kódoló vektorral transzfektált sejteket tartalmaz, amely vektor a variánst kódoló DNS-szekvenciát átmenetileg fejezi ki, azaz lehet, hogy nem stabil módon. Az ilyen sejteket tartjuk „átmeneti expresszióra képes”-nek.As used herein, a "transient expression system" refers to a cell culture comprising cells transfected with a vector encoding a t-PA variant, which vector expresses the DNA sequence encoding the variant transiently, i.e., may not be stable. Such cells are considered to be "transient expression".
B. Általános eljárásokB. General Procedures
1. Aminosav-szekvencia variánsok1. Variants of an amino acid sequence
A találmány szerinti variánsok tárgyalása céljából, hivatkozunk az 1. ábrára, amely a t-PA primer struktúráját mutatja be.Referring to Figure 1, which illustrates the primary structure of t-PA, for discussion of the variants of the invention.
Az 1. ábrán a körökben lévő betűk az aminosavak egybetűs kódjai, a láncok közötti összekötő vonalak a diszulfid-hidakat jelzik, a nyitott körök a glikozilezési helyeket szemléltetik és az F, GF KI, K2 és SP jelölések az ujj, növekedési faktor, 1. horog, 2. horog illetve a szerinproteáz doméneket mutatják be.In Figure 1, the letters in the circles represent the one letter codes of the amino acids, the linking lines between the chains represent the disulfide bridges, the open circles represent the glycosylation sites, and the F, GF KI, K2 and SP marks the finger, growth factor, 1. hook, hook 2 and the serine protease domains.
Az itt bemutatott t-PA variánsok „gyorsírásos” jelölésénél megjegyezzük, hogy a számok az aminosavgyökök helyzetére vonatkoznak a feltételezett érett tPA aminosav-szekvenciája mentén (93,619 sz. európai közrebocsátási irat). Az aminosavak azonosítására az aminosavak egybetűs ABC-jét használjuk, vagyisIn the "shorthand" designation of the t-PA variants disclosed herein, it is noted that the numbers refer to the position of the amino acid residues along the putative mature tPA amino acid sequence (European Patent Publication No. 93,619). To identify amino acids, we use the one letter alphabet of the amino acids, i.e.
A leírásban található szubsztitúciós variánsoknál a jelölés egy betűből, egy ezt követő számból, majd ismét egy betűből áll. Az első (baloldali) betű a vadtípusú érett t-PAban lévő aminosavat jelöli. A szám az aminosav helyére utal, ahol a helyettesítés történik, és a második (jobboldali) betű jelöli azt az aminosavat, amelyet a vadtípusú aminosav helyettesítésére alkalmazunk. Egy inszerciós (beiktatásos) variánsnál a jelölés egy i betűből áll, amelyet egy szám követ; ez a vadtípusú érett t-PA-ban azon gyök helyét jelzi, amely előtt az inszerció kezdődik; ezután következik egy vagy több nagybetű, amely jelzi, hogy milyen beiktatás történt. Egy deléciós (kiiktatásos) variánsnál a jelölés egy d betűből áll, amelyet a deléció kiindulási helyének száma, majd kötőjellel a deléció befejezési helyének száma követ; a helyek számozása a vadtípusú érett t-PA számozásán alapul. A többszörös mutációkat vesszővel választjuk el egymástól a jelölésben az olvasás megkönnyítésére.For the substitution variants herein, the designation consists of a letter, a subsequent number, and a letter again. The first (left) letter represents the amino acid in wild-type mature t-PA. The number refers to the position of the amino acid where the substitution occurs, and the second letter (right) indicates the amino acid used to replace the wild-type amino acid. In an insertion variant, the notation consists of a letter i followed by a number; this indicates the location of the root before insertion in wild-type mature t-PA; followed by one or more uppercase letters indicating the type of installation. In a deletion (deletion) variant, the notation consists of a letter d followed by the number of the start of the deletion, followed by the number of the end of the deletion; site numbering is based on wild-type mature t-PA numbering. Multiple mutations are separated by commas in the notation for ease of reading.
Az elnevezést az alábbi példákkal szemléltetjük: egy olyan szubsztitúciós variáns, amelyben a vadtípusú t-PA 305. helyénél a fenil-alanin hisztidinnel van he6The name is exemplified by the following examples: a substitution variant in which wild-type t-PA at position 305 is substituted with phenylalanine histidine.
HU 210 541 A9 lyettesítve, F305H jelölést kap. Egy olyan szubsztitúciós variáns, amelyben többszörös helyettesítés található a 296-299. egymást kővető helyeken KHRRről AAAA-ra, a K296A, H297A, R298A, R299A jelölést kapja. Egy olyan inszerciós variánst, ahol a cisztein és valin van beiktatva a vadtípusú t-PA 305. helye után, Í305 CV-nek jelölünk. Egy olyan deléciós variánst, ahol a 300-305. helyeken lévő aminosavak a vadtípusú érett t-PA-ból ki vannak iktatva, d300-305-nek jelölünk. A „t-PA” jelölés az egyes mutánsok után következik.EN 210 541 A9 replaced with F305H. A substitution variant having multiple substitutions is described in paragraphs 296-299. in successive locations from KHRR to AAAA, designated K296A, H297A, R298A, R299A. An insertion variant where cysteine and valine are inserted after the 305th position of wild-type t-PA is designated as ³305 CV. A deletion variant wherein 300-305. sites are deleted from wild-type mature t-PA, designated d300-305. The designation "t-PA" follows each mutant.
A zimogének egyik előnyös osztályát azok a zimogének képezik, amelyekben a helyettesítések, inszerciók és deléciók a 305. pozícióban vagy akörül történnek. Ezek közé a variánsok közé tartoznak azok, amelyek a megfelelő vadtípusú t-PA 305. helyén a fenilalanintól eltérő aminosavat tartalmaznak. Előnyösebbek azok a variánsok, amelyek a 305. helyen olyan oldallánccal bíró aminosavat tartalmaznak, amely képes hidrogén-kötő donorként működni vagy működik, mint pl. a hidroxil-csoportot vagy nitrogénatomot tartalmazók. Még előnyösebb ilyen aminosavak az arginin, lizin, tirozin, aszparagin, glutamin és hisztidin, legelőnyösebb a hisztidin. Az ilyen típusú előnyös inszerciós zimogén variánsok azok, amelyek egy vagy több aminosav-beiktatást tartalmaznak a 304. vagy 305. aminosav után, mint amilyeneket a fentiekben leírtunk, vagyis egy hidrogén-kötő donorként működő vagy működni képes oldallánccal, pl. hidroxil-csoportot vagy nitrogénatomot tartalmazó oldallánccal bíró aminosavak, mint amilyenek az arginin, lizin, tirozin, aszparagin, glutamin és hisztidin, legelőnyösebb a hisztidin. Előnyös deléciós zimogén mutánsok azok, amelyek a vad típusú t-PA 297-305 területén (beleértve a határokat is) tartalmaznak deléciókat, ide tartoznak a d297 t-PA, d298 t-PA, stb. és ezek kombinációi, pl. a d297-299 t-PA vagy a d297,d305 t-PA.A preferred class of zimogens are those in which substitutions, insertions, and deletions occur at or around position 305. These variants include those containing the 305th position of the corresponding wild-type t-PA other than phenylalanine. More preferred are variants that contain at position 305 a side-chain amino acid capable of acting or acting as a hydrogen-binding donor, such as, e.g. containing a hydroxyl group or a nitrogen atom. More preferred such amino acids are arginine, lysine, tyrosine, asparagine, glutamine and histidine, most preferably histidine. Preferred insertional zymogen variants of this type include those containing one or more amino acid insertions after amino acids 304 or 305, such as those described above, that is, or are capable of acting as a hydrogen bonding donor, e.g. side chain amino acids having hydroxyl or nitrogen, such as arginine, lysine, tyrosine, asparagine, glutamine and histidine, most preferably histidine. Preferred deletion zymogen mutants include those that contain deletions in the wild-type t-PA 297-305 region (including borders), including d297 t-PA, d298 t-PA, and the like. and combinations thereof, e.g. d297-299 t-PA or d297, d305 t-PA.
A fentebb jelzett zimogén variánsok előnyös kiviteli alakjai közé tartoznak az alábbiak: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; i304 H t-PA; i304 T t-PA; i304 N t-PA; Í304 K t-PA; Í304 R t-PA; Í304 Q t-PA; Í304 HH t-PA; Í305 H t-PA; i305 T t-PA; Í305 N t-PA; Í305 K t-PA; i305 R t-PA; i305 Q t-PA; Í304 Η, i305 H t-PA; i305 HH t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d3O3 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297304 t-PA; d297-305 t-PA; d3OO-3Ol t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA; d300-304 t-PA; d3OO-3O5 t-PA; d304-305 t-PA; d297, d300 t-PA; d297, d305 t-PA; dl-44,N184D,F305H t-PA; dl-44,F305H t-PA; dl44,1210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; dl44,1210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; dl44,T252R.F305H t-PA; dl-44,V213K,T252R,F305H tPA; dl-44,121 OK,F305H t-PA; dl-44,I210R, G211H,K212Q, V213K, F305H t-PA; I210R, G211H.K212-Q, V213K, F305H t-PA; I210R,G211A, K212R.V213R, F305H t-PA; dl-44,N184D, I210R,G211A, K212R, V213R, T252R,F305H t-PA;Preferred embodiments of the above zymogenic variants include: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; i304 H t-PA; i304 T t-PA; i304 N t-PA; 304 K t-PA; R 304 R t-PA; 30 304 Q t-PA; 304 HH t-PA; 305 H t-PA; i305 T t-PA; 305 N t-PA; 305 K t-PA; i305 R t-PA; i305 Q t-PA; 30 304 Η, i305 H t-PA; i305 HH t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d3O3 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297304 t-PA; d297-305 t-PA; d3OO-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA; d300-304 t-PA; d3OO-305 t-PA; d304-305 t-PA; d297, d300 t-PA; d297, d305 t-PA; dl-44, N184D, F305H t-PA; dl-44, F305H t-PA; d144.1210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d144.1210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl44, T252R.F305H t-PA; dl-44, V213K, T252R, F305H tPA; dl-44.121 OK, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211H, K212Q, V213K, F305H t-PA; I210R, G211H.K212-Q, V213K, F305H t-PA; I210R, G211A, K212R.V213R, F305H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA;
N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; d92-179,I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179,I210R,G211- A,K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; Y67N,F305H t-PA; dl-44,Y67N,F3O5H t-PA; és ezek T252R vagy NI845 analógjai valamint ezek kombinációi. (Aproteáz doméntől eltérő doménekben lévő változásokat a későbbiekben írjuk le.)N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; d92-179, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179, I210R, G211- A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; Y67N, F305H t-PA; dl-44, Y67N, F3O5H t-PA; and their T252R or NI845 analogs and combinations thereof. (Changes in domains other than the aprotease domain will be described later.)
A fentiek közül előnyös zimogén variánsok.az F305H t-PA; F305T t-PA; F3O5N t-PA; F305K t-PA; F3O5R t-PA; F305Q t-PA; Í304 H t-PA, dl-44,F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; dl-44,Nl-84D,F305H tPA; dl-44,I210R,G211A,K212R, V213R,F305H t-PA; dl-44,1210R, G211A, K212R,V213K,F305H t-PA; I210R, G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92179,I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92179,N184D.I210R,G211 A,K212R, V213R,F305H tPA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F3O5H t-PA; dl-44, N184D, I210R,G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; és N184D, 1210R,G211 A,K212R,V213R,T252R,F305H t-PA.Preferred zymogenic variants are F305H t-PA; F305T t-PA; F3O5N t-PA; F305K t-PA; F3O5R t-PA; F305Q t-PA; I304 H t-PA, dl-44, F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; dl-44, Nl-84D, F305H tPA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl-44.1210R, G211A, K212R, V213K, F305H t-PA; I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92179, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92179, N184D.I210R, G211 A, K212R, V213R, F305H tPA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F3O5H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; and N184D, 1210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA.
A zimogének első osztályának különösen előnyös variánsai az F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305Q t-PA; i304 H t-PA; dl-44,F305H t-PA; d92179,F305H t-PA és a legelőnyösebb az F3O5H t-PA.Particularly preferred variants of the first class of zimogens are F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305Q t-PA; i304 H t-PA; dl-44, F305H t-PA; d92179, F305H t-PA and most preferably F3O5H t-PA.
A találmány szerinti zimogének egy másik előnyös osztályát valamint a variánsok egy másik osztályát amelyek alternatív módon vagy többletként fíbrin (vagy plazma vérrög) fajlagosak - azok a proteáz dómén kis régióiban egy vagy több változással, a töltéssel bíró aminosav-oldalláncokban, rendelkező variánsok alkotják, ahol a nevezett régiók vagy ezekkel szomszédos területek lehetnek felelősek a t-PA és egyéb anyagok kölcsönhatásáért, amelyek hathatnak a t-PA különböző aktivitásaira.Another preferred class of zymogens of the present invention and another class of variants which are alternatively or in excess of fibrin (or plasma clot) are variants having one or more changes in the charged amino acid residues in small regions of the protease domain, wherein said regions or adjacent regions may be responsible for the interaction of t-PA with other substances that may affect various activities of t-PA.
A régiók, melyeket ezzel a módszerrel az aktivitás vizsgálattal azonosítottunk, a megfelelő vadtípusú t-PA alábbi számú gyökeinek felelnek meg: 267, 283-287, 296-299, 303-304, 322, 326-327, 331-332, 339-342, 347-351, 353-356, 360-362, 364-366, 369-371, 378383, 387-392, 400-405, 408, 410, 416-418, 426-430, 432-434, 440, 445-449, 449-453, 460-462, 471-472, 477, 487-489, 505-506,513, 519-523 és 523-526.The regions identified by the activity assay by this method correspond to the following wild-type t-PA residues: 267, 283-287, 296-299, 303-304, 322, 326-327, 331-332, 339- 342, 347-351, 353-356, 360-362, 364-366, 369-371, 378383, 387-392, 400-405, 408, 410, 416-418, 426-430, 432-434, 440, 445-449, 449-453, 460-462, 471-472, 477, 487-489, 505-506,513, 519-523 and 523-526.
Ezen régiók közül egyet vagy többet, vagy ezek alegységeit megváltoztatjuk, hogy meghatározzuk vajon a kívánt biológiai tulajdonságot vagy tulajdonságokat megkapjuk-e. A töltéssel rendelkező aminosav-maradékok (Arg, Asp, His, Lys és Glu) megfelelően azonosíthatók az alanin-letapogató („scanning”) mutagenezis technikával /Cunningham és Wells: Science 244, 1081-1085 (1989), melynek teljes kitanítását referenciaként beépítjük ezen bejelentésbe/, és helyettesíthetők egy semleges vagy negatívan töltött aminosavval, hogy befolyásoljuk az aminosavak kölcsönhatását az őket körülvevő vizes környezettel a sejten belül és a sejten kívül.One or more of these regions, or subunits thereof, are altered to determine whether the desired biological property or properties are obtained. Charged amino acid residues (Arg, Asp, His, Lys and Glu) can be appropriately identified by alanine scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989), the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. and may be replaced by a neutral or negatively charged amino acid to influence the interaction of the amino acids with the surrounding aqueous environment within and outside the cell.
A zimogének és fibrin-specifikus molekulák ezen második előnyös osztályába tartozó mutánsok azok,Mutants of this second preferred class of zimogens and fibrin-specific molecules are those
HU 210 541 A9 amelyekben az aminosavakat a megfelelő vadtípusú t-PA következő helyein helyettesítettük: 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 és/vagy 477, ahol a + jel azt jelenti, hogy csak a megadott helyeken, míg a azt jelenti, hogy az Összes megadott helyen történik helyettesítés.In which the amino acids were substituted at the following wild-type t-PA sites: 267, 283 + 287, 296-299, 303-304, 331-332, 339 + 342, 347-349 + 351, 364-366, 408 , 410, 416-418, 426-427 + 429-430, 432434, 440, 445 + 449, 449 + 453, 460 + 462, and / or 477, where the + sign means that only in the specified locations, means that all will be replaced at the specified locations.
Az alanin-letapogató mutagenezishez az előnyösebb, hogy egy olyan aminosavat helyettesítünk be, amely semlegesíteni fogja a vadtípusú t-PA megfelelő aminosavának töltését, mint egy olyant, amely ellentétes töltést ad a molekulának. Bármely hidrofób, lényegében töltés nélküli vagy ellentétes töltésű aminosavat alkalmazhatunk, beleértve a következő előnyös aminosavakat: alanin, glicin, szerin, treonin, aszparagin, glutamin, valin, leucin, izoleucin, fenil-alanin és tirozin. Ezek közül a kisebb aminosavak, így az alanin, szerin és treonin, előnyösebbek a nagyobb aminosavaknál, mint a valin, leucin és izoleucin. A töltéssel rendelkező aminosavak, mint az aszparaginsav vagy glutaminsav kevésbé előnyösek.For alanine scanner mutagenesis, it is more preferred to substitute an amino acid that will neutralize the charge of the wild type t-PA as opposed to one that gives the molecule an opposite charge. Any hydrophobic, substantially uncharged or oppositely charged amino acid may be used, including the following preferred amino acids: alanine, glycine, serine, threonine, asparagine, glutamine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, and tyrosine. Of these, smaller amino acids such as alanine, serine and threonine are preferred over larger amino acids such as valine, leucine and isoleucine. Charged amino acids such as aspartic acid or glutamic acid are less preferred.
Még előnyösebben, a helyettesítésre használt aminosavak vagy az alanin, szerin, treonin, aszparagin, glutamin, fenilalanin vagy a tirozin, és legelőnyösebbek az alanin, szerin és treonin. Erre a célra a legelőnyösebb aminosav az alanin, mivel eliminálja az oldalláncot a béta-szénatom mögött és így kevésbé valószínű, hogy megváltozik a vadtípusú t-PA molekula főlánc-konformációja. Továbbá, az alanin gyakran előfordul mind a védett mind az exponált helyeken /Creighton T. E.: The Proteins (kiadó: Freeman W.H. & Co., N. Y.); Chothia C„ J. Mól. Bioi. 150, 1 (1976)/.More preferably, the amino acids used for substitution are either alanine, serine, threonine, asparagine, glutamine, phenylalanine or tyrosine, with alanine, serine and threonine being most preferred. The most preferred amino acid for this purpose is alanine, since it eliminates the side chain behind the beta carbon atom and is thus less likely to alter the backbone conformation of the wild-type t-PA molecule. Further, alanine is frequently found at both protected and exposed sites / Creighton T.E .: The Proteins (published by Freeman W.H. & Co., N.Y.); Chothia C. J. Mol. Biol. 150: 1 (1976).
A zimogének vagy fibrin (vagy plazma vérrög) specifikus variánsok ez utóbbi osztályának előnyös variánsai azok, amelyekben a módosítások a t-PA proteáz doménjén belül vannak, kivéve az alábbi variánsokat: D365At-PA; R462L t-PA; A4735 t-PA; Ü296-304 t-PA; d296-302 t-PA; R298E t-PA; R299E t-PA; R304E t-PA; R304S t-PA; Ó296-299 t-PA és K296E,R298E,R299E t-PA.Preferred variants of the latter class of zimogens or fibrin (or plasma clot) specific variants are those in which the modifications are within the protease domain of t-PA, with the exception of the following variants: D365At-PA; R462L t-PA; A4735 t-PA; Ü296-304 t-PA; d296-302 t-PA; R298E t-PA; R299E t-PA; R304E t-PA; R304S t-PA; O296-299 t-PA and K296E, R298E, R299E t-PA.
Még pontosabban, előnyös variánsok azok, amelyek egy vagy több helyettesítést tartalmaznak a vadtípusú t-PA következő pozícióiban: 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 311, 332, 339, 342, 347, 348, 349, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 416, 417, 418, 426, 427, 429, 430, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 vagy 477, vagy ezek kombinációi.More specifically, preferred variants are those containing one or more substitutions at the following positions of wild-type t-PA: 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 311, 332, 339, 342, 347, 348 , 349, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 416, 417, 418, 426, 427, 429, 430, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 or 477, or combinations thereof .
Még előnyösebbek azok a proteáz-domén variánsok, amelyekben a megfelelő vadtípusú t-PA alábbi helyein vannak helyettesítések: 267, 283+287, 296299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432+434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 és 477, ahol a + jel azt jelenti, hogy a helyettesítések csak ajelölt pozíciókban történnek, de közöttük nem, és a jel azt jelenti, hogy az összes jelölt pozícióban, beleértve a közöttük lévőket is, történik módosítás.Even more preferred are the protease domain variants in which the wild-type t-PA is substituted at the following sites: 267, 283 + 287, 296299, 303-304, 331-332, 339 + 342, 347-349 + 351, 364366, 408 , 410, 416-418, 426-427 + 429-430, 432 + 434, 440, 445 + 449, 449 + 453, 460 + 462 and 477, where the + sign means that the substitutions only occur at the positions indicated, but not between them, and the sign means that all candidate positions, including those between them, are being changed.
A zimogén vagy fibrin (illetve plazma vérrög) specifikus variánsok ez utóbbi osztályának még ennél is előnyösebb variánsai az R267A t-PA; D283A, H287A t-PA; K296A, H297A, R298A, R299A t-PA; E3O3A, R304A t-PA; H331A, H332A t-PA; R339A, R342A t-PA; E347A, E348A, E349A, K351A t-PA; D364A, D365A.D366A t-PA; E408A t-PA, E410A t-PA; K416A, H417A, E418A t-PA; E426A,R427A,K429A,E430A t-PA; H432A, R434A t-PA, R440A t-PA; H445A,R449A t-PA; R449A,D453A t-PA; D460A, R462A t-PA és a D447A t-PA.Even more preferred variants of this latter class of zymogen or fibrin (or plasma clot) specific variants are R267A t-PA; D283A, H287A t-PA; K296A, H297A, R298A, R299A t-PA; E3O3A, R304A t-PA; H331A, H332A t-PA; R339A, R342A t-PA; E347A, E348A, E349A, K351A t-PA; D364A, D365A.D366A t-PA; E408A t-PA, E410A t-PA; K416A, H417A, E418A t-PA; E426A, R427A, K429A, E430A t-PA; H432A, R434A t-PA, R440A t-PA; H445A, R449A t-PA; R449A, D453A t-PA; D460A, R462A t-PA and D447A t-PA.
Ezek közül a legelőnyösebb helyettesítés az, amikor a vadtípusú t-PA 296-299. helyein lévő gyökök mindegyike helyébe alanin gyököt helyettesítünk, azaz a K296A,H297A,R298A,R299A t-PA.Of these, the most preferred substitution is when wild-type t-PA 296-299. each of its residues is replaced by an alanine residue, i.e., K296A, H297A, R298A, R299A t-PA.
A zimogén vagy fibrin-specifikus aktivitású előnyös inszerciós variánsok azok, amelyekben egy vagy több aminosavat iktatunk be a 296, 297, 298 és/vagy 299 helyekre. Erre a célra előnyösek azok a proteáz dómén variánsok is, amelyekbe tirozin, aszparagin, lizin, arginin vagy glutamin van beiktatva.Preferred insertion variants with zymogenic or fibrin-specific activity are those in which one or more amino acids are inserted at sites 296, 297, 298 and / or 299. Also preferred are protease domain variants incorporating tyrosine, asparagine, lysine, arginine or glutamine.
Egyéb variánsok egy vagy több aminosav változtatással (deléció, szubsztitúció vagy inszerció, de előnyösen szubsztitúció) a natív t-PA molekula proteáz doménjén belül (264-527 aminosava) úgy azonosíthatók, hogy kimutatjuk a zimogén tulajdonságokat a vadtípusú t-PA-val összehasonlítva, az alábbiakban megadott egy vagy több screenelő eljárással.Other variants can be identified by one or more amino acid changes (deletion, substitution, or insertion, but preferably substitution) within the protease domain (264-527 amino acids) of the native t-PA molecule by demonstrating zymogenic properties compared to wild-type t-PA, using one or more of the following screening methods.
A találmány szerinti t-PA variánsok azon kívül, hogy eltérnek a natív szekvenciától egy vagy több proteáz dómén helyen úgy, hogy zimogén és/vagy fibrin (vagy plazma vérrög) fajlagos tulajdonságokat hordoznak, kívánt esetben a natív szekvencia más területein is tartalmazhatják gyökök szubsztitúcióit, delécióit vagy inszercióit, hogy a molekula bizonyos tulajdonságai megjavuljanak, feltéve, hogy a változások nem akadályozzák meg a t-PA egyláncú formájának hasítását kétláncú formájúvá vagy nem változtatják meg más módon a kívánt biológiai tulajdonságokat, melyeket a proteáz dómén találmány szerinti módosításával vagy módosításaival hoztunk létre. Az előnyös változásokat ezekben az egyéb tartományokban az első típusú legelőnyösebb zimogén variánsok fent ismertetett listájában adjuk meg.In addition to differing from the native sequence at one or more protease domain sites by having specific properties for zymogen and / or fibrin (or plasma clot), the t-PA variants of the invention may optionally include radical substitutions in other regions of the native sequence, deletions or insertions to improve certain properties of the molecule, provided that the changes do not prevent the single chain form of t-PA from being cleaved into the double chain or otherwise alter the desired biological properties created by modifications or modifications of the protease domain according to the invention. . Preferred changes in these other domains are given in the above list of the most preferred zymogenic variants of the first type.
Ilyen variánsok például azok, amelyek célszerűen mentesek az ujj dómén, a növekedési faktor dómén és/vagy az első horog dómén legalább egy részétől, és/vagy mentesek a glikozilezési lehetőségtől a 194. aminosav körüli glikozilezési helyen, és célszerűen tartalmaznak aminosav-módosításokat az 1. és 2. horog feltételezett lizin-kötó helyénél.Such variants are, for example, those which are preferably free of at least a portion of the finger domain, the growth factor domain and / or the first hook domain, and / or are free of glycosylation at the glycosylation site around amino acid 194 and preferably contain amino acid modifications at and 2. hook at the putative lysine binding site.
Továbbá, a t-PA fibrin kötését lehet módosítani, legelőnyösebben helyreállítani vagy fokozni pozitívan vagy negatívan töltött aminosav-maradékok megfelelő helyettesítésével a t-PA 2. horog doménjének feltételezett ligandum-kötó „zsebének” szembenlévő élein. A találmány szerinti variánsokat általában helyre irányított mutagenezissel vagy kivágási/ligálási technikákkal állítjuk elő, melyeket a továbbiakban írunk le.Further, the fibrin binding of t-PA can be modified, most preferably, restored or enhanced by appropriate substitution of positively or negatively charged amino acid residues at the contiguous ligand-binding "pocket" edges of the t-PA 2 domain. Variants of the invention are generally prepared by site-directed mutagenesis or excision / ligation techniques, which are described below.
Az ilyen variánsokra speciális példa az a molekula, amelyből hiányzik az 1-44. aminosav (jele dl-44) és a molekula aszparaginsavat tartalmaz a 184. pozícióbanA specific example of such variants is the molecule lacking the amino acid residues 1-44. amino acid (designated dl-44) and the molecule contains aspartic acid at position 184
HU 210 541 A9 (jele N184D). Az 1-44 aminosav-hiányos variánsokról részletesen írnak a már idézett WO 89/00197 sz. PCTbeli közrebocsátási iratban.HU 210 541 A9 (Ref. N184D). The 1-44 amino acid deficient variants are described in detail in WO 89/00197, cited above. PCT Application.
Az összes fent említett variáns adott esetben módosítható a molekula különböző más régióiban is, ha az ilyen módosítások még kielégítik a zimogén és/vagy fibrin (vagy plazma vérrög) specifikus jellemzőkre itt megadott kritériumokat. Ilyen módosítások közé tartoznak például:All of the above variants may optionally be modified in various other regions of the molecule, provided that such modifications still meet the criteria for zymogen and / or fibrin (or plasma clot) specific properties herein. Examples of such changes include:
1. / az 1. horog módosítások, pl. a 92-179. helyek deléciója, és/vagy1st / 1st hook modifications, eg. 92-179. site deletion, and / or
2. / a 2. horog módosítások, pl. a kb. 174-261. helyek deléciója vagy módosítás a kb. 205-215 aminosavak, különösen a 210-213 aminosavak területében, és/vagy2nd / 2nd hook modifications, eg. the app. 174-261. deletion or modification of locations in approx. 205-215 amino acids, in particular 210-213 amino acids, and / or
3. / módosítások a mintegy 244-255. aminosavaknál, különösen a 252.-nél vagy annak a helyén, és/vagy3. / Amendments to about 244-255. amino acids, particularly at or in place of 252, and / or
4. / módosítások a kb. 233-242. aminosavaknál, különösen a 236-238.-nál, és/vagy4. / Modifications to app. 233-242. amino acids 236-238, and / or
5. / módosítások az ismert glikozilezési helyeken, pl. a5. / Modifications at known glycosylation sites, e.g. the
184. aminosavnál, és/vagy184, and / or
6. / módosítás a glikozilezésben a növekedési faktor doménen belül, mint azt a függő, 1988. 05. 20-án,6. / modification of glycosylation within the growth factor domain as dependent on 20.05.1988,
07/196,909 számon benyújtott USA-beli bejelentésben leírják, melynek teljes tartalmát beépítjük referenciaként ezen bejelentésbe. Részletesebben, a t-PA molekula N- vagy O-glikozilezett a növekedési faktor doménjén belül, előnyösen a 67-69. helyeken, ahol a tirozint a 67. pozícióban aszparagin gyökkel helyettesítették, hogy megváltoztassák a t-PA molekula félélettartamát.U.S. Patent Application Serial No. 07 / 196,909, the entire contents of which is incorporated herein by reference. More specifically, the t-PA molecule is N- or O-glycosylated within the growth factor domain, preferably at positions 67-69. sites where tyrosine at position 67 was replaced with an asparagine residue to alter the half-life of the t-PA molecule.
Ezen módosítások többsége szignifikánsan megváltoztathatja a kiürülési sebességeket és a fibrin kötést a natív t-PA-hoz viszonyítva. Azok, akik a szakterületen jártasak, képesek meghatározni alkalmas vizsgáló módszerrel az egyes variánsok azon optimális tulajdonságait, melyek kívánatosak egy adott esetben.Most of these modifications can significantly alter clearance rates and fibrin binding relative to native t-PA. Those skilled in the art will be able to determine, by a suitable assay method, the optimal properties of each variant desired in a particular case.
A módosításokat, hogy kicseréljük vagy beiktassuk a megfelelő aminosav(ak)at a natív molekulába a fenti szekvencia-variánsok létrehozására, bármely ismert módszer segítségével elvégezhetjük, így pl. helyre-írányított mutagenezissel, vagy a megfelelő szekvencia ligálásával a szóban forgó fehérjét kódoló DNS-be, amint ezt az alábbiakban leírjuk.Modifications to replace or insert the appropriate amino acid (s) into the native molecule to generate the above sequence variants can be accomplished by any known method, e.g. by targeted mutagenesis, or by ligating the appropriate sequence into the DNA encoding the protein of interest, as described below.
2. Hely-specifikus mutagenezis2. Site-specific mutagenesis
A t-PA variánsok előállítását az itt leírtakkal összhangban előnyösen egy olyan DNS hely-specifikus mutagenezisével végezzük, amely a fehérje egy korábban előállított variánsát vagy egy nem-módosított formáját kódolja. A hely-specifikus mutagenezis lehetővé teszi a t-PA variánsok előállítását olyan specifikus oligonukleotid-szekvenciák felhasználásával, amelyek a kívánt mutáns DNS-szekvenciáját kódolják, valamint megfelelő számú szomszédos nukleotidot tartalmaznak, hogy egy alkalmas méretű és szekvencia-komplexitású primer szekvenciát képezzenek egy stabil duplex képződéséhez az áthidaló kapcsolás mindkét oldalán. Tipikusan egy kb. 20-25 nukleotid hosszúságú primer az előnyös, kb. 5-10 gyökkel a megváltoztatandó szekvencia kapcsolódásának mindkét oldalán. Általában, a hely-specifikus mutagenezis technikája jól ismert a szakterületen, melyre példákat szolgáltat Adelman és mtsai közleménye, melynek teljes kitanítását beépítjük referenciaként jelen bejelentésbe /DNA 2, 183 (1983)/.The production of t-PA variants, as described herein, is preferably accomplished by site-directed mutagenesis of a DNA encoding a previously produced variant or unmodified form of the protein. Site-specific mutagenesis allows for the production of t-PA variants using specific oligonucleotide sequences encoding the desired mutant DNA sequence and a sufficient number of adjacent nucleotides to form a primer sequence of suitable size and sequence complexity. formation on both sides of the jumper. Typically an approx. A primer of 20-25 nucleotides in length is the preferred primer. 5-10 residues on each side of the junction of the sequence to be changed. In general, the technique of site-specific mutagenesis is well known in the art and exemplified by Adelman et al., The disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety (DNA 2, 183 (1983)).
A hely-specifikus mutagenezis technika egy fág vektort alkalmaz, amely mind egyszálú mind kétszálú formában létezik. A helyre-irányított mutagenezisben használható tipikus vektorok közé tartozik pl. az M13 fág /Messing és mtsai: Third Cleveland Symposium on Macromolekules and Recombinant DNA, kiadó: Walton A, Elsevier, Amsterdam (1981), melynek teljes kitanítását referenciaként beépítjük ide/. Ezek a fágok már a kereskedelemben hozzáférhetők és használatuk általánosan ismert a szakember számára. Alternatív módon, plazmid vektorokat is alkalmazhatunk, melyek a replikáció egyszálú fág origóját tartalmazzák /Veira és mtsai: Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)/, hogy egyszálú DNS-t nyerjünk.The site-specific mutagenesis technique uses a phage vector that exists in both single-stranded and double-stranded forms. Typical vectors for site-directed mutagenesis include e.g. phage M13 / Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, published by Walton A, Elsevier, Amsterdam (1981), the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. These phages are already commercially available and are well known in the art. Alternatively, plasmid vectors containing the origin of the single-stranded replication phage may be used. Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987) to obtain single-stranded DNA.
Általánosan, a helyre-irányított mutagenezist az itt leírtakkal összhangban úgy végezzük, hogy először egy egyszálú vektort nyerünk, amely szekvenciáján belül magában foglalja a szóbanforgó t-PA-t kódoló DNS-szekvenciát. Előállítunk egy, a kívánt mutált szekvenciát hordozó oligonukleoíid prímért, rendszerint szintetikusan, pl. Crea és mtsai módszere szerint/Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 5765 (1978)/. Ezt a prímért azután anneáljuk az egyszálú, t-PAszekvenciát tartalmazó vektorral, és DNS-polimerizáló enzimek, mint pl. az E. coli polimeráz I Klenowfragmense, hatásának tesszük ki, hogy a mutációt hordozó szál szintézisét teljessé tegyük. így olyan heteroduplex képződik, ahol az egyik szál az eredeti nem-mutált heteroduplex vektort kódolja, melyet ezután alkalmas sejtek, mint pl. JM101 sejtek transzformálására alkalmazunk, és azokat a kiónokat szelektáljuk hibridizálás útján, amelyek a mutált szekvencia-elrendezést hordozó rekombináns vektorokat foglalják magukban. A hibridizálást olyan radioaktív próbákhoz végezzük, amelyek a 32P-vel jelzett mutagenezis primerből állnak.In general, site-directed mutagenesis, as described herein, is performed by first obtaining a single-stranded vector comprising the DNA sequence encoding said t-PA within its sequence. An oligonucleotide primer carrying the desired mutated sequence is prepared, usually synthetically, e.g. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 5765 (1978)]. This primer is then annealed with the single-stranded vector containing the t-PA sequence and DNA polymerizing enzymes, such as. Klenowfragmense of E. coli polymerase I, to effect completion of the synthesis of the mutation-carrying fiber. Thus, a heteroduplex is formed in which one strand encodes the original non-mutated heteroduplex vector, which is then encoded by suitable cells, e.g. Clones containing recombinant vectors carrying the mutated sequence arrangement were used to transform JM101 cells and selected by hybridization. Hybridization is performed on radioactive probes consisting of a 32 P-labeled mutagenesis primer.
Miután egy ilyen kiónt szelektáltunk, a mutált t-PA régiót eltávolíthatjuk és behelyezhetjük a t-PA termelésére egy alkalmas vektorba, általában egy olyan típusú expressziós vektorba, melyet tipikusan egy megfelelő eukarióta gazdaszervezet transzformálására alkalmazunk. A jelen találmánnyal összefüggésben a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtek vagy a 293 sejtek /humán vese sejtek, melyeket Graham és mtsai írtak le: J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)/ előnyösek a hosszú ideig stabil t-PA termelő sejtek előállításához. A találmány azonban nem korlátozódik CHO általi termelésre, mivel ismeretes, hogy számos egyéb típusú sejt is megfelelően alkalmazható, különösen ott, ahol csak az enzim átmeneti termelésére van szükség vizsgálati célokra. így pl. az alábbiakban leírunk egy, a 293 sejteket alkalmazó, átmeneti rendszert, amely kényelmes rendszert jelent a t-PA variánsok termelésére analitikai célokra.Once such a clone is selected, the mutated t-PA region can be removed and inserted into a suitable vector for the production of t-PA, typically an expression vector of the type typically used to transform an appropriate eukaryotic host. In the context of the present invention, Chinese hamster ovary (CHO) cells or the 293 cells / human kidney cells described by Graham et al., J. Gene. Virol. 36, 59 (1977)) are preferred for the production of long-term stable t-PA producing cells. However, the invention is not limited to CHO production, as it is known that many other types of cells can be used appropriately, especially where only the enzyme transient production is required for assay purposes. so e.g. a transient system employing 293 cells, which provides a convenient system for the production of t-PA variants for analytical purposes, is described below.
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
3. Hasítási/ligálási technika3. Cleavage / ligation technique
Egy másik módszer mutációk létrehozására a t-PA-t kódoló DNS-szekvenciában magában foglalja a t-PA-t kódoló DNS hasítását a megfelelő helynél restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel, az alkalmasan hasított DNS kinyerését, a kívánt aminosavat kódoló oligonukleotid és a szegélyező területek mint pl. tompa végű polilinkerek szintézisét (vagy polilinkerek alkalmazása helyett a szintetikus oligonukleotid emésztését azokkal a restrikciós enzimekkel, melyeket a t-PA-t kódoló DNS hasításához is felhasználtunk, ezáltal kohenzív végeket kialakítva), és a szintetikus DNS ligálását a t-PA-t kódoló struktúrgén megmaradó részéhez.Another method for generating mutations in the DNA sequence encoding t-PA involves cleavage of the t-PA coding DNA at the appropriate site by restriction enzyme digestion, extraction of the suitably cleaved DNA, oligonucleotide encoding the desired amino acid, and flanking regions. e.g. synthesis of blunt-ended polylinkers (or digestion of the synthetic oligonucleotide with the restriction enzymes used to cleave DNA encoding t-PA instead of using polyl linkers to form cohesive ends), and ligation of synthetic DNA to the structural gene encoding t-PA for the rest.
4. Gazdasejt-tenyészetek és vektorok4. Host cell cultures and vectors
Bár a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtekben történő expresszió végülis előnyös a t-PA termelésére, az itt leírt vektorok és módszerek alkalmasak az eukarióta szervezetek széles körében, mint gazdasejtben történő felhasználásra.Although expression in Chinese hamster ovary (CHO) cells is ultimately beneficial for the production of t-PA, the vectors and methods described herein are suitable for use in a wide variety of eukaryotic organisms as host cells.
Általában természetesen a DNS-szekvenciák kezdeti klónozásánál és a találmány szerinti vektorok megszerkesztésénél a prokarióták az előnyösek. Különösen előnyös pl. az E. coli KI2 294 törzs (ATCC 31,446) és az E. coli W3110 törzs (ATCC 27,325). Egyéb alkalmas mikrobiális törzsek közé tartoznak az E. coli törzsek, mint pl. az E. coli B és E. coli XI776 (ATCC 31,537). Ezek a példák természetesen csak illusztráló és nem korlátozó jellegűek.In general, of course, prokaryotes are preferred for the initial cloning of DNA sequences and for constructing the vectors of the invention. Especially preferred is e.g. E. coli K12294 strain (ATCC 31,446) and E. coli W3110 strain (ATCC 27,325). Other suitable microbial strains include E. coli strains, such as E. coli. E. coli B and E. coli XI776 (ATCC 31,537). These examples are, of course, only illustrative and not limiting.
Prokarióták is felhasználhatók az expresszióhoz. A fent említett törzsek, valamint a Bacillusok, pl. a Bacillus subtilis és más Enterobacteriumok, mint pl. Salmonella typhimurium vagy Selmatia marcesars, és a különböző Pseudomonas fajok törzsei felhasználhatók gazdaszervezetként az expresszióhoz.Prokaryotes may also be used for expression. The aforementioned strains as well as Bacillus, e.g. Bacillus subtilis and other Enterobacteria, such as. Salmonella typhimurium or Selminia marcesars, and strains of various Pseudomonas species can be used as hosts for expression.
Általában olyan plazmid vektorokat alkalmazunk ezekkel a a gazdaszervezetekkel összefüggésben, amelyek a gazdasejttel kompatibilis (összeférhető) fajokból származó replikont és kontroll szekvenciákat tartalmaznak. A vektor szokásosan hordoz egy replikációs helyet, valamint marker szekvenciákat, melyek képesek a transzformált sejtekben a fenotípusos szelekciót elősegíteni. így pl. az E. colit tipikusan a p BR322 felhasználásával transzformáljuk, amely egy E. coli fajból származó plazmid /lásd pl. Bolivár és mtsai: Gene 2,95 (1977)/. A pBR322 tartalmaz ampicillin- és tetraciklin-rezisztencia géneket és így a transzformált sejtek könnyen azonosíthatók. A pBR322 plazmidnak vagy más, mikrobiális plazmidoknak vagy fágoknak kell tartalmazniuk - vagy úgy kell módosítani, hogy tartalmazzanak - promotereket is, amelyeket a mikrobiális szervezet saját fehérjéinek kifejezésére tud felhasználni.In general, plasmid vectors containing replicon and control sequences from species compatible with the host cell are used in conjunction with these host organisms. The vector typically carries a replication site as well as marker sequences that are capable of promoting phenotypic selection in transformed cells. so e.g. E. coli is typically transformed using p BR322, a plasmid from E. coli species, see e.g. Bolivar et al., Gene 2.95 (1977). PBR322 contains the ampicillin and tetracycline resistance genes and thus transformed cells can be easily identified. Plasmid pBR322, or other microbial plasmids or phages, must also contain, or be modified to include, promoters that can be used to express the microbial organism's own proteins.
A rekombináns DNS technikában legáltalánosabban használt promoterek közé tartoznak a béta-laktamáz (penicillináz) és a laktóz promoter rendszerek /Chang és mtsai: Natúré 375, 615 (1978); Itakura és mtsai: Science 198, 1056 (1977); Goeddel és mtsai: Natúré 281,544 (1979)/ és egy triptofán (trp) promoter rendszer /Goeddel és mtsai: Nucl. Acids Rés, 8, 4057 (1980); 36,776 sz. európai közrebocsátási irat/ és az alkálikus foszfatáz rendszerek. Bár ezek a leggyakrabban használt promoterek, más mikrobiális promotereket is leírtak és alkalmaztak, és nukleotid-szekvenciájukkal kapcsolatban részleteket is közöltek már, így a szakember képes összekapcsolni ezeket működőképesen a plazmid vektorokkal /lásd pl. Síebenlist és mtsai: Cell 20, 269 (1980)/.The most commonly used promoters in the recombinant DNA technique include the beta-lactamase (penicillinase) and lactose promoter systems (Chang et al., Nat. 375, 615 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Natur. 281,544 (1979) / and a tryptophan (trp) promoter system / Goeddel et al., Nucl. Acids Sl 8: 4057 (1980); No. 36,776 European Patent Publication / and alkaline phosphatase systems. Although these are the most commonly used promoters, other microbial promoters have been described and used, and details of their nucleotide sequence have already been disclosed, so that one skilled in the art can link these operably to plasmid vectors. Sebenlist et al., Cell 20: 269 (1980).
A prokarióták mellett eukarióta mikroorganizmusok, pl. az élesztők is megfelelően felhasználhatók a találmányban. A Sachcharomyces cerevisiae-t, vagy a közönséges sütő élesztőt alkalmazzák a legáltalánosabban az eukarióta mikroorganizmusok közül, bár nagyszámú egyéb törzs is rendelkezésre áll. így pl. Saccharomycesben való kifejezéshez az YRp7 plazmidot általánosan alkalmazzák /Stinchcomb és mtsai: Natúré 282, 39 (1979); Kinsman és mtsai: Gene 7, 141 (1979); Tschemger és mtsai: Gene 12, 157 (1980)/. Ez a plazmid már tartalmazza a trpl gént, amely szelekciós markéiként szolgál azon élesztő mutáns törzsek számára, amelyek elvesztették a triptofánon való növekedés képességét; ilyen pl. az ATCC 44,076 vagy a PEP4-1 törzs/Jones: Genetics 85, 12 (1977)/. A trpl-lézió jelenléte, mint a gazdasejt genomjának egy jellemzője, ezután egy hatékony környezetet biztosít az olyan transzformánsok detektálására, amelyek triptofán távollétében is képesek növekedni.In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms, e.g. yeasts are also useful in the invention. Sachcharomyces cerevisiae, or common baker's yeast, is the most commonly used of eukaryotic microorganisms, although numerous other strains are available. so e.g. For expression in Saccharomyces, plasmid YRp7 is commonly used (Stinchcomb et al., 1979, Nat. 282, 39; Kinsman et al., 1979, Gene 7, 141; Tschemger et al., Gene 12: 157 (1980). This plasmid already contains the trpl gene, which serves as a selectable marker for yeast mutant strains that have lost their ability to grow on tryptophan; such as ATCC 44,076 or strain PEP4-1 (Jones: Genetics 85, 12 (1977)). The presence of trpl lesion, as a feature of the host cell genome, then provides an efficient environment for the detection of transformants that can grow in the absence of tryptophan.
Az élesztő vektorokban alkalmazható promoter szekvenciák közé tartoznak a 3-foszfoglicerát kináz /Hitzeman és mtsai: J. Bioi. Chem. 255, 2073 (1980)/ vagy egyéb glikolitikus enzimek promoterei /Hess és mtsai: J. Adv. Enzyme Rém. 7, 149 (1986); Holland és mtsai: Biochemistry 17, 4900 (1978)/, mint az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglükóz izomeráz és a glükokináz promotere. A megfelelő expressziós plazmidok megszerkesztésében ezekkel a génekkel kapcsolt terminációs szekvenciákat is ligálunk a szekvencia 3 végéhez az expressziós vektorba, hogy a m RNS poliadenilezése és a termináció végbemenjen. Egyéb promoterek, melyek a növekedés körülményei által szabályozott transzkripció további előnyeivel rendelkeznek, a következő enzimek promoter régiói: alkohol dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savas foszfatáz, a nitrogénmetabolizmussal kapcsolatos bontó enzimek, és a fent említett giceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, továbbá a maltóz és a galaktóz hasznosításáért felelős enzimek. Bármely plazmid vektor, amely élesztő-kompatibilis promotert, replikációs origót és terminációs szekvenciákat tartalmaz, használható.Promoter sequences useful in yeast vectors include 3-phosphoglycerate kinase / Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980) / or promoters of other glycolytic enzymes / Hess et al., J. Adv. Enzyme Rém. 7, 149 (1986); Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)] such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, isomerase and glucokinase promoter. In the construction of appropriate expression plasmids, termination sequences linked to these genes are also ligated to the 3 end of the sequence in the expression vector to allow polyadenylation and termination of the m RNA. Other promoters that have the additional advantages of growth-regulated transcription include the promoter regions of the following enzymes: alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, nitrogen metabolism degrading enzymes, and the aforementioned glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and and the enzymes responsible for the utilization of galactose. Any plasmid vector containing a yeast-compatible promoter, origin of replication, and termination sequences may be used.
A mikroorganizmusokon kívül többsejtű organizmusokból származó sejtek tenyészetei is alkalmazhatók gazdaszervezetekként. Elvileg bármely sejttenyészet működőképes, akár gerincesből, akár gerinctelenből származó tenyészet. Azonban legnagyobb érdeklődésre a gerincesek sejtjei tartanak számot, és a gerinces sejtek szaporítása sejttenyészetben (szövettenyésztés) rutin eljárássá vált az utóbbi években /Tissue Culture,In addition to microorganisms, cultures of cells derived from multicellular organisms may also be used as hosts. In principle, any cell culture is functional, whether vertebrate or invertebrate. However, vertebrate cells are of major interest and the proliferation of vertebrate cells in cell culture (tissue culture) has become routine in recent years / Tissue Culture,
HU 210 541 A9 kiadók: Kruse és Patterson, Academic Press (1973)/. Az ilyen felhasználható gazda sejtvonalakra példák a VERŐ és HeLa sejtek, CHO sejtvonalak, a W138, BHK, COS-7, 293 és MDCK sejtvonalak. Az ilyen sejtekhez az expressziós vektorok szokásosan hordoznak (ha szükséges) egy replikációs origót, egy promotert a kifejezendő gén előtt bármilyen szükséges riboszóma kötőhellyel együtt, RNS összekötő helyeket, poliadenilező helyeket és transzkripciós terminátor szekvenciákat.HU 210 541 A9 Publishers: Kruse and Patterson, Academic Press (1973). Examples of such usable host cell lines are VERŐ and HeLa cells, CHO cell lines, W138, BHK, COS-7, 293 and MDCK cell lines. For such cells, expression vectors typically carry (if necessary) an origin of replication, a promoter with any necessary ribosome binding site before the gene to be expressed, RNA binding sites, polyadenylation sites, and transcriptional terminator sequences.
Az emlős sejtekben történő alkalmazásnál az expressziós vektorokban a kontroll funkciókat gyakran vírus-eredetű anyagok szolgáltatják. így pl. az általánosan alkalmazott promoterek a polióma, adenovírus 2 vírusokból, és leggyakrabban a Simian Virus 40-ből (5V40) származnak. Az 5V40 korai és késői promoterei azért különösen alkalmasak, mert mindkettőt könnyen kinyerhetjük a vírusból egy olyan fragmensként, mely az 5V40 virális replikációs origót is tartalmazza /Fiers és mtsai: Natúré 273, 113 (1978)/. A kisebb vagy nagyobb 5V40 fragmensek szintén alkalmazhatók, feltéve, hogy tartalmazzák azt a megközelítőleg 250 bp hosszúságú szekvenciát, amely a virális replikációs origóban lévő Hindin helytől a BglI helyig terjed. Továbbmenően az is lehetséges és gyakran kívánatos, hogy olyan promoter vagy kontroll szekvenciákat alkalmazzunk, amelyek normál esetben összekapcsolódnak a kívánt gén-szekvenciával, feltéve, hogy ezek a kontroll szekvenciák összeférhetek a gazdasejt rendszerekkel.When used in mammalian cells, control functions in expression vectors are often provided by viral substances. so e.g. commonly used promoters are derived from polio, adenovirus 2 viruses, and most commonly from Simian Virus 40 (5V40). The early and late promoters of 5V40 are particularly suitable because both can be readily recovered from the virus as a fragment that also contains the 5V40 viral origin of replication (Fiers et al., 1978, Nat. 273, 113). Smaller or larger 5V40 fragments may also be used provided they contain a sequence of approximately 250 bp extending from the Hindin site to the BglI site in the viral origin of replication. Furthermore, it is possible and often desirable to use promoter or control sequences that are normally linked to the desired gene sequence, provided that these control sequences are compatible with the host cell systems.
Egy replikációs origót tipikusan előállíthatunk vagy egy exogén origót magában foglaló vektor megszerkesztése által, amely származhat SV40-ből vagy más virális forrásból (pl. polióma, adeno, VSV, BPV), vagy a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusa által. Ha a vektor a gazdasejt kromoszómájába integrálódott, ez utóbbi gyakran elegendő.Typically, an origin of replication may be generated either by constructing a vector containing an exogenous origin, which may be derived from SV40 or other viral sources (e.g., polio, adeno, VSV, BPV) or by the chromosomal replication mechanism of the host cell. Once the vector is integrated into the host cell chromosome, the latter is often sufficient.
Kielégítő mennyiségű humán t-PA termelhető sejttenyészetekkel; azonban az eljárás finomítása - egy másodlagos kódoló szekvencia felhasználásával - arra szolgál, hogy még tovább fokozzuk a termelési szinteket. A másodlagos kódoló szekvencia tartalmazza a dihidrofolát reduktázt (DHFR), amely egy kívülről szabályozott paraméteren keresztül, mint pl. a metotraxát (MTX), hat, így lehetővé válik az expresszió szabályozása az MTX-koncentráció szabályozása által.A sufficient amount of human t-PA can be produced by cell cultures; however, refining the process using a secondary coding sequence serves to further increase production levels. The secondary coding sequence contains dihydrofolate reductase (DHFR), which through an externally regulated parameter, such as. methotraxate (MTX), thereby enabling expression to be regulated by regulating MTX concentration.
A találmány szerinti, mind a t-PA variánst mind a DHFR fehérjét kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazó vektorokkal való transzfekcióhoz egy előnyös gazdasejt kiválasztásában célszerű, ha tekintetbe vesszük az alkalmazott DHFR fehérje típusát. Ha vad-típusú DHFR fehérjét alkalmazunk, előnyös olyan gazdasejtet kiválasztani, amely DHFR-hiányos, így lehetővé válik a DHFR-t kódoló szekvencia markerként történő felhasználása a sikeres transzfekcióhoz olyan szelektív tápközegben, amely nem tartalmaz hipoxantint, glicint és timidint. Ebben az esetben alkalmas gazdasejt a DHFR-aktivitásban hiányos CHO sejtvonal, melyet úgy állítunk elő és szaporítunk, ahogy Urlaub és Chasin leírták /Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,4216 (1980)/.For transfection with vectors containing the DNA sequences encoding both the t-PA variant and the DHFR protein of the present invention, it is convenient to select a preferred host cell having regard to the type of DHFR protein used. When using wild-type DHFR protein, it is preferable to select a host cell deficient in DHFR, thus allowing the use of the DHFR coding sequence as a marker for successful transfection in a selective medium free of hypoxanthine, glycine and thymidine. In this case, a suitable host cell is the CHO cell line deficient in DHFR activity, prepared and propagated as described by Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,4216 (1980).
Másrészről, ha az MTX-hez egy alacsony kötőaffinitással rendelkező DHFR fehérjét alkalmazunk kontroll szekvenciaként, nem szükséges DHFR-hiányos sejteket alkalmaznunk. Mivel a mutáns DHFR rezisztens az MTX-re, az MTX-tartalmú tápközeg használhatjuk a szelekció eszközeként, feltéve, hogy a gazdasejtek maguk MTX-szenzitívek. A legtöbb eukarióta sejt, amely képes az MTX adszorbeálására, úgy tűnik, hogy érzékeny az MTX-re. Egy ilyen alkalmas sejtvonal egy CHO vonal, a CHO-K1 (ATCC CCL 61).On the other hand, when using a DHFR protein with low binding affinity for MTX as a control sequence, it is not necessary to use DHFR-deficient cells. Because the mutant DHFR is resistant to MTX, the MTX-containing medium can be used as a means of selection, provided that the host cells themselves are MTX-sensitive. Most eukaryotic cells that are capable of adsorbing MTX appear to be sensitive to MTX. One such suitable cell line is a CHO line, CHO-K1 (ATCC CCL 61).
5. Tipikus, alkalmazható, klónozó és expressziós módszerek5. Typical, applicable, cloning and expression methods
Ha gazdasejtként emlős sejteket alkalmazunk, a transzfekciót általában a kalcium-foszfátos kicsapással végezzük, melyet Graham és Van dér Eb írtak le /Virology 52, 546 (1978)/. A DNSnek a sejtekbe történő bevezetésére azonban más alkalmas eljárások is rendelkezésre állnak, mint pl. injektálás a sejtmagba, elektroporáció vagy protoplasztfúzió.When mammalian cells are used as host cells, transfection is generally carried out by calcium phosphate precipitation as described by Graham and Van Der Eb (Virology 52, 546 (1978)). However, other suitable methods for introducing DNA into cells, such as injection into the nucleus, electroporation or protoplast fusion.
Ha élesztőt használunk gazdaszervezetként, a transzfekciót általában polietilénglikol alkalmazásával hajtjuk végre, amint ezt Hinnen ismertette /Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 21, 1929-1933 (1978)/.When yeast is used as a host, transfection is generally carried out using polyethylene glycol as described by Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. 21, 1929-1933 (1978).
Ha prokarióta sejteket vagy lényeges sejtfal-konstrukciókat tartalmazó sejteket használunk, a transzfekció előnyös módszere a kalciumos kezelés kalcium alkalmazásával, mint azt Cohen és mtsai ismertették /Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972)/, vagy még előnyösebb az utóbbi időben az elektroporáció.When prokaryotic cells or cells containing essential cell wall constructs are used, a preferred method of transfection is calcium treatment using calcium as described by Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972), or more recently, electroporation.
A kívánt kódoló és kontroll szekvenciákat tartalmazó megfelelő vektorok megszerkesztéséhez standard ligálási technikákat alkalmazunk. Az izolált plazmidokat vagy DNS-fragmenseket hasítjuk, a célnak megfelelően alakítjuk és újra ligáljuk a kívánt formában, hogy a szükséges plazmidokat kialakítsuk.Standard ligation techniques are used to construct appropriate vectors containing the desired coding and control sequences. Isolated plasmids or DNA fragments are cleaved, engineered and ligated in the desired form to produce the required plasmids.
A hasítást restrikciós enzimes (vagy enzimekkel történő) kezeléssel végezzük a megfelelő pufferben. Általánosan kb. 1 gg plazmidot vagy DNS-fragmenst használunk kb. 1 egység enzimre kb. 20 μΐ puffer-oldatban. (A megfelelő puffereket és a szubsztrát-menynyiségeket az egyes restrikciós enzimekhez az enzim gyártója mindig megadja.) Az inkubációs idő kb. 1 óra, és az inkubációs hőmérséklet 37 °C. Inkubálás után a fehérjét fenolos és kloroformos extrakcióval eltávolítjuk és a nukleinsavat a vizes frakcióból etanolos kicsapással kinyerjük.Cleavage is performed by restriction enzyme treatment (or enzyme treatment) in the appropriate buffer. Generally approx. 1 µg of plasmid or DNA fragment was used at ca. 1 unit enzyme approx. In 20 μΐ buffer solution. (Appropriate buffers and substrate volumes for each restriction enzyme are always provided by the enzyme manufacturer.) 1 hour and incubation temperature 37 ° C. After incubation, the protein is removed by phenol and chloroform extraction and the nucleic acid is recovered from the aqueous fraction by ethanol precipitation.
Ha tompa végek szükségesek, a készítményt kezelhetjük 15 percig, 15 °C-on, 10 egység DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével (Klenow), majd fenolos-kloroformos extrakciót és etanolos kicsapást végzünk.If blunt ends are required, the preparation can be treated for 15 minutes at 15 ° C with 10 units of Klenow fragment of DNA polymerase I (Klenow) followed by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
A hasított fragmensek méret szerinti elkülönítését 6%-os poliakrilamid gélen, Goeddel és mtsai által leírtak szerint végezzük /Nucleic Acids Rés. 8, 4057 (1980)/.Size separation of the cleaved fragments was performed on a 6% polyacrylamide gel as described by Goeddel et al. / Nucleic Acids Slit. 8, 4057 (1980).
A ligálásnál a kívánt komponensek - melyek megfelelő végeit úgy alakítottuk, hogy helyesen illeszkedjenek egymáshoz - körülbelül ekvimoláris mennyiségeit kezeljük kb. 10 egység T4 DNS-ligázzal 0,5 μg DNS-re számítva. (Amikor hasított vektorokat haszná11For ligation, approximately equimolar amounts of the desired components, which have the appropriate ends shaped so as to be correctly attached to one another, are treated for about 10 minutes. 10 units with T4 DNA ligase per 0.5 μg DNA. (When using split vectors11
HU 210 541 A9 lünk komponensekként, hasznos lehet, hogy megakadályozzuk bakteriális alkalikus foszfatázos előkezeléssel a hasított vektor újraligálását.)As a component, it may be useful to prevent bacterial alkaline phosphatase pretreatment to re-ligate the cleaved vector.)
Amint fentebb tárgyaltuk, a t-PA variánsokat előnyösen speciális mutációk segítségével állítjuk elő. A jelen találmány gyakorlatában alkalmazott variánsokat legkönnyebben olyan speciális oligonukleotid-szekvenciák felhasználásával alakítjuk ki, amelyek a kívánt mutáció DNS-szekvenciáját kódolják, valamint megfelelő számú szomszédos nukleotidot tartalmaznak, hogy megfelelő méretű és szekvencia-komplexitású szekvenciát képezzenek ahhoz, hogy egy stabil duplex képződjék az átfedő mutáció mindkét oldalán.As discussed above, t-PA variants are preferably produced by specific mutations. The variants used in the practice of the present invention are most readily constructed using specific oligonucleotide sequences which encode the DNA sequence of the desired mutation and contain a sufficient number of adjacent nucleotides to form sequences of sufficient size and sequence complexity to form a stable duplex. mutation on both sides.
A megszerkesztett plazmidokban lévő korrekt szekvenciák igazolására végzett analízishez a ligálási keveréket tipikusan E. coli KI2294 (ATCC 31,446) törzs vagy más alkalmas E. coli törzsek transzformálására használjuk, és a sikeres transzformánsokat a törzstől függően ampicillin- vagy tetraciklin-rezisztencia alapján szelektáljuk. A plazmidokat a transzformánsokból kipreparáljuk és analizáljuk restrikciós térképezéssel és/vagy DNS-szekvencia elemzéssel Messing és mtsai szerint /Nucleic Acids Rés. 9, 309 (1981)/ vagy Maxam és mtsai módszere szerint /Methods of Enzymology 65, 499 (1980)/.For analysis of correct sequences in the constructed plasmids, the ligation mixture is typically used to transform E. coli KI2294 (ATCC 31,446) or other suitable E. coli strains and the successful transformants are selected for ampicillin or tetracycline resistance depending on the strain. The plasmids were prepared from the transformants and analyzed by restriction mapping and / or DNA sequence analysis according to Messing et al., Nucleic Acids Slit. 9, 309 (1981) or Maxam et al., Methods of Enzymology 65, 499 (1980).
Miután a DNS-t az emlős gazdasejtbe bevezettük és a stabil transzformánsokat megfelelő tápközegen kiválasztottuk, elvégezzük a DHFR-fehéijét-kódoló szekvenciák sokszorozását (amplifikálás) mintegy 20,000500,000 p M/l MTX-koncentráció jelenlétében, amely a DHFR-aktivitás kompetitív inhibitora. A koncentráció tényleges tartománya természetesen nagy mértékben függ a DHFR-gén és -fehérje természetétől, valamint a gazdaszervezet jellemzőitől. Világos, hogy általánosságban meghatározott alsó és felső határokat nem lehet megállapítani. Más folsav-analógok vagy egyéb, DHFR-t gátló vegyületek megfelelő koncentrációit is alkalmazhatjuk. De az MTX maga is alkalmas, könynyen hozzáférhető.After introducing the DNA into the mammalian host cell and selecting the stable transformants on appropriate medium, amplification of the DHFR protein coding sequences is performed in the presence of approximately 20,000500,000 pM / l MTX concentration, which is competitive with DHFR activity. inhibitor. The actual range of concentration will, of course, be highly dependent on the nature of the DHFR gene and protein and the characteristics of the host. It is clear that generally defined lower and upper limits cannot be set. Appropriate concentrations of other folic acid analogs or other compounds that inhibit DHFR may also be used. But MTX itself is suitable, readily available.
Abból a célból, hogy a példákat egyszerűsítsük, néhány gyakran előforduló eljárásra „gyorsírásos” címszavakkal utalunk.In order to simplify the examples, some commonly used procedures are referred to as "shorthand" keywords.
A „plazmid”-okat kis p betűvel jelöljük, majd ezt követi a betűs és numerikus jelölés. A kiindulási plazmidok a kereskedelmi forgalomban vannak vagy a köz számára korlátlan mennyiségben hozzáférhetők, vagy az ilyen hozzáférhető plazmidokból ismert eljárásokkal előállíthatók. Ezen kívül egyéb ekvivalens plazmidok is ismertek a szakterületen és nyilvánvalóak az átlagos szakember számára.The "plasmids" are designated by the lower case letter p followed by the alphanumeric designation. The starting plasmids are either commercially available in unlimited quantities or can be prepared from such accessible plasmids by known methods. In addition, other equivalent plasmids are known in the art and will be apparent to one of ordinary skill in the art.
A DNS-nek az „emésztése” a DNS katalitikus hasítására vonatkozik egy olyan enzimmel, amely a DNSben csak bizonyos helyeken hat. Az ilyen enzimeket restrikciós enzimeknek nevezik, és a helyeket, amelyekre specifikusak, restrikciós helynek. Az itt használt különböző restrikciós enzimek kereskedelmi forgalomban vannak, és a reakció körülményeket, kofaktorokat és egyéb követelményeket a gyártó cég utasításai szerint alkalmazzuk. A restrikciós enzimeket általában olyan rövidítésekkel jelölik, amely egy nagy betűből áll, melyet további betűk követnek azt a mikroorganizmust reprezentálva, melyből eredetileg az adott restrikciós enzimet kinyerték, és ezután egy szám következik az adott enzim jelölésére. Általában kb. 1 pg plazmidot vagy DNS-fragmenst használunk mintegy 2 egység enzimmel együtt kb. 20 μΐ puffer-oldatban. Az alkalmas puffereket és a szubsztrát-mennyiségeket az adott retsrikciós enzimekhez az enzim gyártói minden esetben megadják. Az inkubációs időként kb. egy óra a szokásos 37 °C hőmérsékleten, de ez változhat a gyártó utasításai szerint. Az inkubálás után a fehérjét fenoloskloroformos extrakcióval eltávolítjuk és az emésztett nukleinsavat a vizes frakcióból etanolos kicsapással kinyerjük. A restrikciós enzimes emésztést néhány esetben követi a terminális 5-foszfátok hidrolízise bakteriális alkálikus foszfatázzal, hogy megelőzzük a DNS-fragmens két restrikciós hasított végének cirkularizációját vagy egy zárt hurok képződését, amely megakadályozná egy másik DNS-fragmens beépülését a restrikciós helynél. Hacsak másképpen nem jelezzük, a plazmidok emésztését nem követi az 5’-terminális defoszforilezés. A defoszforilezésre szolgáló eljárások és reagensek hagyományosak /Maniatis T. és mtsai: Molecular Cloning, 133-134. oldal (1982)/."Digestion" of DNA refers to the catalytic cleavage of DNA by an enzyme that acts only at certain sites in the DNA. Such enzymes are called restriction enzymes and the sites for which they are specific are called restriction sites. The various restriction enzymes used herein are commercially available, and reaction conditions, cofactors, and other requirements are used according to the manufacturer's instructions. Restriction enzymes are usually denoted by abbreviations which consist of a capital letter followed by additional letters representing the microorganism from which the particular restriction enzyme was originally obtained, followed by a number to denote the particular enzyme. Usually approx. 1 µg of plasmid or DNA fragment was used together with about 2 units of enzyme for approx. In 20 μΐ buffer solution. Suitable buffers and substrate amounts for each restriction enzyme are always provided by the enzyme manufacturers. The incubation time is approx. one hour at the normal temperature of 37 ° C, but this may vary according to the manufacturer's instructions. After incubation, the protein is removed by phenol-chloroform extraction and the digested nucleic acid is recovered from the aqueous fraction by ethanol precipitation. In some cases, restriction enzyme digestion is followed by hydrolysis of the terminal 5-phosphates with bacterial alkaline phosphatase to prevent circularization of the two restriction fragments of the DNA fragment or the formation of a closed loop that would prevent the insertion of another DNA fragment at the restriction site. Plasmid digestion is not followed by 5'-terminal dephosphorylation unless otherwise noted. Methods and reagents for dephosphorylation are conventional / Maniatis T. et al., Molecular Cloning, 133-134. (1982).
Egy adott DNS-fragmens „kinyerés”-e vagy „izolálás”-a valamely restrikciós emésztésből az emésztett elegy szétválasztását jelenti poliakrilamid vagy agaróz gélen elektroforézissel, a szóban forgó fragmensek azonosítását mozgékonyságuk összehasonlításával ismert molekulatömegű marker DNS-fragmensekkel, a kívánt fragmenst tartalmazó gélszakasz eltávolítását és a gélből a DNS elkülönítését. Ez az eljárás általánosan ismert /lásd pl. Lawn R. és mtsai: Nucleic Acids Rés. 9, 6103-6114 (1981) és Goeddel D. és mtsai: Nucleic Acids Rés. 8,4057 (1980)/."Extraction" or "isolation" of a particular DNA fragment from a restriction digest is the separation of the digested mixture by polyacrylamide or agarose gel electrophoresis, identification of said fragments by comparison of their motility with known molecular weight DNA fragments, removal of the desired fragment fragment. and isolating DNA from the gel. This procedure is generally known; Lawn R. et al., Nucleic Acids Slit. 9, 6103-6114 (1981) and Goeddel, D., et al., Nucleic Acids Sl. 8, 4057 (1980).
A „Southern analízis” egy olyan módszer, amellyel DNS-szekvenciák jelenléte igazolható az emésztett vagy DNS-tartalmú elegyben hibridizálással egy ismert jelzett oligonukleotidhoz vagy egy DNS-fragmenshez. A találmány céljaira, hacsak másképp nem jelezzük, a Southern analízis a következő lépéseket jelenti: az emésztett elegyet szétválasztjuk 1 %-os agarózon, denaturáljuk és átvisszük nitrocellulózra Southern E. módszerével /J. Mól. Bioi. 98, 503-517 (1975)/ és hibridizáljuk Maniatis T. szerint/687-701 0.(1978)/."Southern analysis" is a method for verifying the presence of DNA sequences in a digested or DNA-containing mixture by hybridization to a known labeled oligonucleotide or DNA fragment. For the purposes of the present invention, unless otherwise indicated, Southern analysis comprises the steps of separating the digested mixture on 1% agarose, denaturing and transferring it to nitrocellulose by Southern E.J. Mole. Biol. 98, 503-517 (1975)) and hybridized according to Maniatis T. (1977) 687-701.
A „transzformálás” a DNS bevezetését jelenti egy organizmusba úgy, hogy a DNS replikálható legyen, vagy extrakromoszomális elemként vagy a kromoszómába integrálódva. Hacsak másképp nem jelezzük, az itt alkalmazott eljárás az E. coli transzformálására Mandel és mtsai kalcium-kloridos módszere /J. Mól. Bioi. 53, 154(1970)/."Transformation" refers to the introduction of DNA into an organism so that it can be replicated either as an extrachromosomal element or integrated into the chromosome. Unless otherwise indicated, the calcium chloride method of Mandel et al. Mole. Biol. 53, 154 (1970).
A „ligálás” olyan eljárásra vonatkozik, amely két kettős szálú nukleinsav-fragmens közötti foszfodiészter kötések kialakulásához vezet (Maniatis T, a fentebb idézett munka, 146. oldal). Hacsak másképp nem jelezzük, a ligálást ismert pufferek és körülmények alkalmazásával hajtjuk végre 10 egység T4 DNS-ligázzal („ligáz”) a mintegy ekvimoláris mennyiségű DNSfragmens 0,5 pg-jára számítva."Ligation" refers to a process that leads to the formation of phosphodiester bonds between two double-stranded nucleic acid fragments (Maniatis T, cited above, p. 146). Unless otherwise noted, ligation is performed using known buffers and conditions with 10 units of T4 DNA ligase ("ligase") per 0.5 µg of approximately equimolar amount of DNA fragment.
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
A DNS „előállítás”-a a transzformánsokból a plazmid DNS izolálását jelenti a mikrobiológiai tenyészetből. Hacsak másképp nem adjuk meg, Maniatis és munkatársai alkálikus SDS módszerét alkalmazzuk (a korábban idézett munka, 90. oldal)."Production" of DNA refers to the isolation of plasmid DNA from transformants from a microbiological culture. Unless otherwise noted, Maniatis et al. Use the alkaline SDS method (previously cited, page 90).
Az „oligonukleotidok” rövid egy- vagy kétszálas polidezoxinukleotidok, amelyeket kémiai úton szintetizálunk ismert eljárásokkal, majd poliakrilamid gélen tisztítunk."Oligonucleotides" are short single or double stranded polydeoxynucleotides that are chemically synthesized by known methods and then purified on a polyacrylamide gel.
C. Gyógyászati kompozíciókC. Pharmaceutical Compositions
A találmány szerinti vegyületeket a gyógyászatilag felhasználható kompozíciók előállítására szolgáló ismert eljárásokkal szerelhetjük ki, melynek során a t-PA terméket keverék formájában kombináljuk egy gyógyászatilag elfogadható hordozó segédanyaggal. Alkalmas hordozó segédanyagok és ezek formulázását, beleértve egyéb humán fehéijéket, pl. humán szérum albumint, ismertetik pl. a „Remington s Pharmaceutical Sciences” című szakkönyvben /16. kiadás, kiadó: Mack Publishing Co., szerkesztők: Oslo és mtsai (1980), melynek teljes kitanítását beépítjük referenciaként ezen bejelentésbe/. Az ilyen kompozíciók tipikusan tartalmazzák a találmány szerinti variáns egy hatékony mennyiségét, pl. körülbelül 0,5 - 5 mg/ml tartományban, egy megfelelő hordozó alkalmas mennyiségével együtt, hogy a beteg hatékony kezelésére alkalmas, gyógyászatilag elfogadható kompozíciót állítsunk elő. Az adott t-PA variánst beadhatjuk parenterálisan a kardiovaszkuláris betegségben szenvedő vagy ilyen állapotban lévő egyéneknek, vagy bevezethetjük egyéb eljárásokkal is, amelyek biztosítják a gyógyszer bejutását a véráramba hatékony formában.The compounds of the invention may be formulated according to known methods for the preparation of pharmaceutically acceptable compositions comprising combining the t-PA product in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carrier excipients and their formulation, including other human proteins, e.g. human serum albumin, e.g. in Remington s Pharmaceutical Sciences / 16. Mack Publishing Co., eds. Oslo et al. (1980), the full disclosure of which is incorporated herein by reference. Such compositions typically contain an effective amount of a variant of the invention, e.g. in the range of about 0.5 to 5 mg / ml, together with a suitable amount of a suitable carrier, to provide a pharmaceutically acceptable composition for effective treatment of the patient. The particular t-PA variant may be administered parenterally to individuals suffering from or in the presence of cardiovascular disease, or may be introduced by other methods that ensure effective delivery of the drug to the bloodstream.
A jelen találmány gyakorlatában alkalmazott t-PA termékek klinikai beadásához különösen jól használható kompozíciók közé tartoznak pl. a steril vizes oldatok vagy a steril hidratálható porok, pl. a liofilizált fehérjék. Általában célszerű a kiszerelésben valamely gyógyászatilag alkalmas só megfelelő mennyisége, általában olyan mennyisége, amely elegendő ahhoz, hogy a kiszerelés izotóniás legyen. Valamely pH szabályozóra is szükség van, pl. arginin bázis és foszforsav, megfelelő mennyiségben a kellő pH fenntartásához, amely rendszerint 5,5 és 7,5 közötti. Ezen kívül abból a célból, hogy a vizes kiszerelések fél-élettartama vagy stabilitása javuljon, kívánatos további szerek, pl. glicerin hozzáadása is. Ilyen módon a t-PA variáns formulázások alkalmassá válnak parenterális beadásra, de különösen intravénás beadásra.Compositions which are particularly useful for the clinical administration of t-PA products used in the practice of the present invention include e.g. sterile aqueous solutions or sterile hydrated powders, e.g. lyophilized proteins. In general, it is desirable to provide a suitable amount of a pharmaceutically acceptable salt in the formulation, usually in an amount sufficient to render the formulation isotonic. A pH regulator is also required, e.g. arginine base and phosphoric acid, in sufficient amounts to maintain a sufficient pH, usually between 5.5 and 7.5. In addition, to improve the half-life or stability of aqueous formulations, further agents, e.g. addition of glycerol. In this way, the t-PA variant formulations are suitable for parenteral administration, but particularly intravenous administration.
Ajelen találmány szerinti gyógyászati kompozíciók dózisai és kívánatos gyógyszerkoncentrációi változhatnak az adott felhasználási területtől függően. így pl. mélyvénás trombózis vagy perifériás érbetegségek kezelésében tipikusan a „bólusz” dózisok az előnyösek, mintegy 0,05-0,2 mg/kg között, egymást követő beadásban a viszonylag állandó vérszint fenntartására, előnyösen 3 pg/ml körüli értéken.Dosages and desired drug concentrations of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on the particular application. so e.g. for the treatment of deep vein thrombosis or peripheral vascular disease, bolus doses typically of about 0.05-0.2 mg / kg are administered in successive administrations to maintain relatively stable blood levels, preferably around 3 pg / ml.
Azonban, a sürgős orvosi ellátással kapcsolatos esetekben, amikor infúziós lehetőség rendszerint nem áll rendelkezésre, valamint azokban az esetekben, ahol a szóban forgó betegség (embólia, infarktus) általában kritikus természetű, célszerű valamivel nagyobb kezdeti dózisokat alkalmazni, mint pl. egy intravénás bóluszt 0,3 mg/kg körüli mennyiségben.However, in cases involving urgent medical care, where infusion facilities are usually not available, and in cases where the disease in question (embolism, infarction) is usually of a critical nature, slightly higher initial doses such as an intravenous bolus of about 0.3 mg / kg.
A találmány szerinti t-PA variánst például alkalmasan beadhatjuk parenterálisan a kardiovaszkuláris betegségben szenvedő vagy erre hajló egyéneknek. Az adagolás mennyisége és sebessége párhuzamos lehet azzal vagy magasabb lehet annál, mint amelyet egyéb kardiovaszkuláris trombolitikus szereknél a klinikai kezeléskor jelenleg alkalmazunk, pl. 1-2 mg/testtömeg kg intravénás vagy intraartériás adagokban 1,5-12 óránként szívizom-infarktusban, tüdőembóliában, stb. szenvedő betegeknél. Magasabb dózisok is tolerálhatok, mivel a jelen találmány szerinti variánsok kevesebb mellékhatással rendelkeznek mint a vadtípusú tPA, ugyanakkor gyorsabb és teljesebb vérrög-lízist idéznek elő.For example, the t-PA variant of the invention may be conveniently administered parenterally to individuals suffering from or predisposed to cardiovascular disease. The amount and rate of administration may be parallel to or higher than that currently used for other cardiovascular thrombolytic agents in clinical treatment, e.g. 1-2 mg / kg body weight in intravenous or intra-arterial doses every 1.5-12 hours in myocardial infarction, pulmonary embolism, etc. patients. Higher doses may also be tolerated since the variants of the present invention have fewer side effects than wild-type tPA, while at the same time producing faster and more complete blood clotting.
Egy megfelelő dózis formára példaként szerepelhet egy ampulla, amely 50 mg t-PA-t, arginint, foszforsavat és poliszorbát 80-at tartalmaz, melyet kiegészítünk 50 ml injekció minőségű steril vízzel és összekeverünk megfelelő térfogatú 0,9%os nátrium-klorid injekcióval.An example of a suitable dosage form is an ampoule containing 50 mg of t-PA, arginine, phosphoric acid, and polysorbate 80, supplemented with 50 ml of sterile water for injection and mixed with an appropriate volume of 0.9% sodium chloride injection.
A találmány szerinti t-PA variánsok alkalmasak a fibrinlerakódás vagy -adhézió képződésének vagy újraképződésének megakadályozására. Ennek a felhasználásnak egyik előnyös kiviteli formáját írja le a WO 89/00049 sz. PCT-beli közrebocsátási irat (nyilvánosságra jutott 1989. 01. 12-én), melynek teljes kitanítását beépítjük ide referenciaként. Az ilyen kezelés általában magában foglalja valamely kompozíció helyi beadását a fibrin-lerakódás vagy letapadás feltételezett helyére, ahol a nevezett kompozíció tartalmazza a t-PA variáns gyógyászatilag hatékony mennyiségét fokozatosan oldódó formában, amely fokozatosan bocsátja ki a helyszínen a hatóanyagot mintegy 3 nap és két hét közötti időtartamon át. Tipikusan a t-PA variánst olyan dózisban adjuk be, amely elegendő a fibrin lerakódásának vagy az adhézió kialakulásának megakadályozására sebészeti műtét, fertőzés, baleset vagy gyulladás után. Ez a mennyiség tipikusan 0,02 mg/g gél és 2,5 mg/g gél között van, a legelőnyösebb tartomány pedig a 0,25 mg/g és kb. 1,0 mg/g gél közötti.The t-PA variants of the present invention are useful in preventing the formation or re-formation of fibrin deposition or adhesion. A preferred embodiment of this use is described in WO 89/00049. PCT Application Publication (published January 12, 1989), the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. Such treatment generally involves the topical administration of a composition to a putative site of fibrin deposition or adhesion, wherein said composition comprises a therapeutically effective amount of the t-PA variant in a gradual dissolution that will gradually release the active ingredient locally for about 3 days to two weeks. . Typically, the t-PA variant is administered at a dose sufficient to prevent fibrin deposition or adhesion formation following surgery, infection, accident, or inflammation. This amount is typically between 0.02 mg / g of gel and 2.5 mg / g of gel, with the most preferred range being between 0.25 mg / g and approx. 1.0 mg / g gel.
A vivőanyag (vehikulum), amelyben a t-PA-t tipikusan kiszereljük az adhézió kialakulásának megelőzésére, egy félszilárd, nyálkás, gyógyászatilag közömbös hordozó, amely elősegíti, hogy az enzim a lehetséges adhéziós helynél helyezkedjen el. Az ilyen hordozók közé tartoznak a hosszú szénláncú szénhidrogének, vagy azok az étolajok és viaszok, amelyek a telített és telítetlen zsírsav-gliceridek keverékeiből vagy módosított telített és telítetlen zsírsav-gliceridek keverékeiből tevődnek össze. Ezekre példák a felszilárd hordozók, mint a vazelin, vagy a félszintetikus gliceridek, polihidroxi-oldószerek, mint pl. a glicerin, hosszú láncú szénhidrogének, biológiai úton lebontható polimerek és a liposzómák.The vehicle, in which t-PA is typically formulated to prevent the formation of adhesion, is a semi-solid, mucous, pharmaceutically inert carrier which helps to locate the enzyme at a possible adhesion site. Such carriers include long chain hydrocarbons or edible oils and waxes consisting of mixtures of saturated and unsaturated fatty acid glycerides or mixtures of modified saturated and unsaturated fatty acid glycerides. Examples of these are solid carriers such as petroleum jelly or semi-synthetic glycerides, polyhydroxy solvents such as petroleum jelly. glycerol, long chain hydrocarbons, biodegradable polymers and liposomes.
Az alábbi példák a jelen találmány gyakorlatában a jelenleg legjobbnak tartott eljárásokat ismertetik, de ezek nem tekinthetők korlátozó jellegűnek.The following examples illustrate the best practices currently practiced in the practice of the present invention, but are not to be construed as limiting.
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
Az összes hivatkozott irodalmat és szabadalmi bejelentést kifejezetten beépítjük a leírásba referenciaként.All references and patent applications cited herein are expressly incorporated herein by reference.
/. PÉLDA/. EXAMPLE
A. t-PA variánsok rekombináns előállítására szolgáló expreszsziós vektorok megalkotása és felhasználásaA. Construction and Use of Expression Vectors for the Recombinant Production of T-PA Variants
1. A p7-lHplazmid megszerkesztése a) p CIST-PA plazmid1. Construction of plasmid p7-1Hp a) p CIST-PA
A pCIST-PA plazmidot úgy alkotjuk meg, amint leírták pl. az 1987. 07. 09-én 07/071,506 számon benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Összefoglalva, a pCIHt-PA vektor, amely tartalmazza a citomegalovírus enhancert (fokozót) és promotert, a citomegalovírus összekötő (splice) donor helyet és intront, az lg variábilis régió összekötő akceptor helyet, a t-PA-t kódoló cDNS-t /Pennica és mtsai: Natúré 301, 214 (1983)/ és a hepatitisz felületi antigén poliadenilezési és transzkripciós terminációs helyet, megalkotásához először.Plasmid pCIST-PA was constructed as described e.g. United States Patent Application Serial No. 07 / 071,506, issued July 9, 1987. In summary, the pCIHt-PA vector containing the cytomegalovirus enhancer and promoter, the cytomegalovirus splice donor site and intron, the Ig variable region acceptor site, the cDNA encoding t-PA / Pennica et al., Natura 301, 214 (1983) / and the first site for the polyadenylation and transcription termination of hepatitis surface antigen.
megszerkesztjük a pF8CIS vektort, amely tartalmazza a citomegalovírus enhancert /Boshart és mtsai: Cell 41, 520 (1985)/ és promotert /Thomsen és mtsai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81,659 (1984)/, a citomegalovírus összekötő donor helyet és egy intron egy részét /Sternberg és mtsai: J. of Virol. 49, 190 (1984)/, az lg variábilis régió intront és összekötő akceptor helyet, a VIII faktort kódoló cDNS-t és az SV40 poliadenilező helyet. A megszerkesztés három részét az alábbiakban részletezzük.constructing the pF8CIS vector containing the cytomegalovirus enhancer (Boshart et al., Cell 41: 520 (1985)) and the promoter (Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 659 (1984), a cytomegalovirus donor site and a portion of an intron (Sternberg et al., J. of Virol. 49, 190 (1984)], the Ig variable region intron and linker acceptor site, the factor VIII coding cDNA and the SV40 polyadenylation site. The three parts of the construction are detailed below.
1. A végső vektor ampicillin rezisztencia markere és replikációs origója a pUC13pML plazmidból származik, ez a pML plazmid egy variánsa /Lusky és mtsai: Natúré 293, 79 (1981)/. A pUC13pML-t úgy alkotjuk meg, hogy a pUC13 polilinkerét /Veira és mtsai: Gene 12, 259 (1982)/ átvisszük a pML EcoRI és Hindül helyeire. A második kiindulási glazmid a pUC8CMV, mely a CMV enhancer, promoter és összekötő donor helyek forrása. A pUC8CMV-t úgy szerkesztjük meg, hogy behelyezzük a CMV enhancer, gromoter és öszszekötő donor 1-732 nukleotidból álló szekvenciát a pUCBPstl és SphII tompa helyeire - lásd Veira fent idézett közleményét. Szintetikus BamHI-HindlII linkereket (melyek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők a New England Biolabs-nál) ligálunk a kohezív BamHI-véghez, így kialakítva egy HindlII helyet. Ezt a ligálást követően egy HindlII-HindlII emésztést hajtunk végre. Ez az emésztés egy kb. 800 bp fragmenst eredményez, amely tartalmazza a CMV enhancert, promotert és összekötő donor helyet. Gélen végzett izolálás után ezt a 800 bp nagyságú fragmenst a pUC13pML egy 2900 bp darabjához ligáljuk. A pFBCIS megalkotásához szükséges fragmenst úgy kapjuk meg, hogy a fenti köztes plazmidot Sall-gyel és HindlII-mal emésztjük. Ez a 3123 bp-ú darab tartalmazza az ampicillin rezisztencia markert, a replikációs origót a pUC13pML-ből és a CMV kontroll szekvenciáit, beleértve a fokozót, promotert és összekötő donor helyet.1. The ampicillin resistance marker and origin of replication of the final vector is derived from plasmid pUC13pML, a variant of pML13 (Lusky et al., 1981, Nat. 293, 79). PUC13pML was constructed by transferring the pUC13 polylinker (Veira et al., Gene 12, 259 (1982)) to the EcoRI and HindIII sites of pML. The second starting glaze is pUC8CMV, a source of CMV enhancer, promoter, and linker donor sites. PUC8CMV was constructed by inserting a 1-732 nucleotide sequence of the CMV enhancer, gromoter, and binding donor into the blunt sites of pUCBPst1 and SphII - see Veira, supra. Synthetic BamHI-HindIII linkers (commercially available from New England Biolabs) are ligated to the cohesive BamHI end to form a HindIII site. Following this ligation, a HindIII-HindIII digestion was performed. This digestion is an approx. This results in an 800 bp fragment containing the CMV enhancer, promoter and linker donor site. After gel isolation, this 800 bp fragment was ligated to a 2900 bp fragment of pUC13pML. The fragment required for the construction of pFBCIS is obtained by digestion of the above intermediate plasmid with SalI and HindIII. This 3123 bp fragment contains the ampicillin resistance marker, origin of replication from pUC13pML, and CMV control sequences including enhancer, promoter, and linker donor site.
2. Az lg variábilis régió intron és összekötő akceptor szekvenciát egy szintetikus oligomer felhasználásával konstruáljuk meg. Az IgG intronhoz egy 99-mert és az összekötő akceptor helyhez egy 30-mert szintetizálunk kémiai úton, melyek az alábbi szekvenciákkal rendelkeznek/Bthwell és mtsai: Cell 24, 625 (1981)/:2. The Ig variable region intron and linker acceptor sequence is constructed using a synthetic oligomer. A 99-mer for the IgG intron and a 30-mer for the linker acceptor site are synthesized by the following sequences (Bthwell et al., Cell 24, 625 (1981)):
5'-AGTAGCAAGCTTGACGTGTGGCAGGCTTGA... 31 GATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGA...5'-AGTAGCAAGCTTGACGTGTGGCAGGCTTGA ... 31 GATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGA ...
CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT...CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT ...
8 GTCCACTCCCAG-3'8 GTCCACTCCCAG-3 '
3'-CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGTCGGA-5' DNS polimeráz I-gyel (Klenow-fragmens) betöltjük a szintetikus daradok végeit és kettős szálú fragmenst hozunk létre /Wartell és mtsai: Gene 9, 307 (1980)/. Ezt követi egy kettős emésztés Pstl-gyel és HindlII-mal. Ezt a szintetikus linkért klónozzuk a pUC13-ba (Veira és mtsai fent idézett cikke) a PstI és Hind III helyeknél. A szintetikus oligonukleotidot tartalmazó kiónt, melyet pUCIg.lO-zel jelölünk, Pstl-gyel emésztjük. Ehhez a fragmenshez egy Clal helyet adunk egy Pstl-Cla I kapcsoló alkalmazásával. Hind-III-mal végzett emésztést követően egy 118 bp nagyságú darabot izolálunk gélen, mely az lg intron egy részét és az lg variábilis régió összekötő akceptor helyét tartalmazza.3'-CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGTCGGA-5 'DNA polymerase I (Klenow fragment) is loaded at the ends of the synthetic fragments and a double-stranded fragment is created (Wartell et al., Gene 9, 307 (1980)). This is followed by a double digestion with Pstl and HindIII. This synthetic linker was cloned into pUC13 (Veira et al., Supra) at the PstI and Hind III sites. The clone containing the synthetic oligonucleotide, designated pUCIg.10, was digested with PstI. To this fragment is added a ClaI site using a PstI-Cla I linker. Following Hind III digestion, a 118 bp fragment was isolated on a gel containing a portion of the Ig intron and the Ig variable region acceptor site.
3. A megszerkesztési séma harmadik részében helyettesítjük a hepatitisz felületi antigén 3’ végét az SV40 korai régiójának poliadenilező helyével és transzkripciós terminációs helyével. Egy vektort, a pUC.SV40-et, amely tartalmazza az SV40 szekvenciákat beiktatjuk a pUCB-ba a BamHI helynél Veira és mtsai leírása szerint (lásd fent). Ezután a pUC.5V40-t emésztjük EcoRI-gyel és Hpa I-gyel. Ebből az emésztésből gélen izolálunk egy 143 bp-ú fragmenst, mely csak az SV40 poliadenilező helyet tartalmazza. Két további fragmenst is izolálunk a gélről a pSVE.8clD emésztését követően (160,457 sz. európai közrebocsátás! irat).- A 4,8 kb nagyságú fragmens az EcoRI-es és Clal-es emésztésből származik, és tartalmazza az SV40-DHFR transzkripciós egységet, a pML replikációs origóját és az ampicillin rezisztencia markert. A Clal-gyel és Hpal-gyel végzett emésztéssel kialakított3. In the third part of the construction scheme, the 3 'end of the hepatitis surface antigen is replaced by the polyadenylation site and the transcription termination site of the SV40 early region. A vector, pUC.SV40, containing the SV40 sequences was inserted into the pUCB at the BamHI site as described by Veira et al., Supra. PUC.5V40 is then digested with EcoRI and Hpa I. From this digestion, a 143 bp fragment containing only the SV40 polyadenylation site was isolated on gel. Two additional fragments were isolated from the gel following digestion of pSVE.8clD (European Patent Publication No. 160,457). The 4.8 kb fragment is derived from Eco RI and Cla I digestion and contains the SV40-DHFR transcription unit. , the origin of pML replication and the ampicillin resistance marker. It is formed by digestion with Clal and Hpal
7,5 kb nagyságú fragmens tartalmazza a VIII faktor cDNS-ét. Egy háromrészes ligálás eredményezi a pSVE,8c24 D-t. Ezt a köztes plazmidot Clal-gyel és Sall-gyel emésztjük, hogy megkapjunk egy 9611 bp nagyságú fragmenst, mely tartalmazza a VIII faktor cDNS-ét az SV40 poliadenilező hellyel és transzkripciós terminációs helyekkel együtt, amelyeket az SV40DHFR transzkripciós egységet követ.The 7.5 kb fragment contains the factor VIII cDNA. A tripartite ligation results in pSVE, 8c24 D. This intermediate plasmid was digested with Clal and SalI to obtain a 9611 bp fragment containing the factor VIII cDNA with the SV40 polyadenylation site and transcription termination sites followed by the SV40DHFR transcription unit.
Az utolsó háromrészes, pF8CIS-t eredményező ligáláshoz felhasználjuk: a) a 3123 bp SalI-HindlII fragmenst, mely a replikációs origót, az ampicillin rezisztencia markert és a CMV enhancert, promotert és öszszekötő donort tartalmazza; b) a 118 bp-ú HindlII-Clal fragmenst, mely az lg intront és az összekötő akceptort tartalmazza; és c) egy 9611 bp Clal-Sall fragmenst, mely a VIII faktor cDNS-ét, az SV40 poliadenilező helyet és az SV40-DHFR transzkripciós egységet tartalmazza.For the final three-part ligation resulting in pF8CIS: a) the 3123 bp SalI-HindIII fragment containing the origin of replication, the ampicillin resistance marker and the CMV enhancer, promoter and binding donor; b) the 118 bp HindIII-ClaI fragment comprising the Ig intron and the linker acceptor; and c) a 9611 bp Clal-SalI fragment comprising the factor VIII cDNA, the SV40 polyadenylation site and the SV40-DHFR transcription unit.
Ezt követően a pCIHt-PA plazmid teljes megalkotá14Subsequently, the plasmid pCIHt-PA was completely constructed
HU 210 541 A9 sáhoza pClat-PA köztes plazmidból és a fenti pFBCIS plazmidból az alábbiak szerint járunk el:EN 210 541 A9 from the plasmid pClat-PA and the plasmid pFBCIS above were prepared as follows:
A t-PA cDNS-t először pML-be klónozzuk, hogy kialakítsunk egy Clal helyet a gén 5 végénél. Ahhoz, hogy ezt megtehessük, a pSVpa-DHFR-ből (egyébként mint pETPFR-re hivatkozunk, lásd fent) egy 3238 bp-ú fragmenst beiktatunk a pMLHindHI helyére (Lusky és mtsai, lásd fent). A telepeket átvizsgáljuk olyan kiónokra, amelyek a Clal hely melletti cDNS 5’ végével rendelkeznek. A köztes plazmidot pCLAt-PA-nak nevezzük. A t-PA cDNSt, melyet a 3’-poliadenilező régió követ, egy 2870 bp nagyságú Clal-KgnI fragmensként izoláljuk. Ezt a fragmenst a pF8CIS 5146 bg fragmenséhez ligáljuk. A pF8CIS vektornak ez a Call-KpnI fragmense szolgáltatja az 5’ kontroll régiót, az SV40DHFR transzkripciós egységet, az ampicillin rezisztencia gént és a pML-ből származó origó régiót (lásd 2. ábrát).The t-PA cDNA is first cloned into pML to form a Clal site at the 5 terminus of the gene. To do this, a 3238 bp fragment of pSVpa-DHFR (otherwise referred to as pETPFR, see above) was inserted into the site of pMLHindHI (Lusky et al., Supra). The colonies are screened for clones having the 5 'end of the cDNA adjacent to the Clal site. The intermediate plasmid is called pCLAt-PA. The t-PA cDNA, followed by the 3'-polyadenylation region, was isolated as a 2870 bp Clal-KgnI fragment. This fragment was ligated to the 5146 bg fragment of pF8CIS. This Call-KpnI fragment of the pF8CIS vector provides the 5 'control region, the SV40DHFR transcription unit, the ampicillin resistance gene and the origin of the pML (see Figure 2).
A t-PA expressziós szintjeit úgy kagjuk meg, hogy transzfektálunk pCIHt-PA-val CHO vagy 293 sejteket önmagában ismert és a fentiekben leírt eljárásokkal. A transzfektált 293 sejtekből kapott tápközegből, például méréssel, kimutatjuk, hogy a pCIHt-PA 420 ng/ml tPA-t termel.Expression levels of t-PA are cleaved by transfection of pCIHt-PA with CHO or 293 cells by methods known per se and described above. From the medium obtained from the transfected 293 cells, for example by measurement, it is shown that pCIHt-PA produces 420 ng / ml tPA.
Végül megszerkesztjük a pCISt-PA vektort, mely a citomegalovírus enhancert, promotert, citomegalovírus összekötő donor helyet és intront, az lg variábilis régió összekötő akceptor helyet, a t-PA-t kódoló cDNS-t és az SV40 poliadenilező szekvenciát tartalmazza, az alábbiak szerint:Finally, the pCISt-PA vector containing the cytomegalovirus enhancer, promoter, cytomegalovirus binding donor site and intron, Ig variable region binding acceptor site, cDNA encoding t-PA, and the SV40 polyadenylation sequence was constructed as follows. :
A kiindulási vektorok ehhez a konstrukcióhoz a pCIHt-PA és a pFBCIS (lásd fent). Ez utóbbi vektor azonos 5 kontroliokkal bír mint a pCIHt-PA, de magában foglalja a VIII faktor cDNS-ét és az SV40 poliadenilező helyet is. A t-PA cDNS 3’ hasításához a SecII-t használjuk. A kapott 3’ túlnyúló véget T4 polimerázzal tompa végűvé tesszük. A pCIHt-PA-t ezután Clal-gyel elhasítjuk. Ez a hely elválasztja a kiméra intront, a CMV intron-szekvenciák és az lg variábilis régió intron között hasítva. A Clal kezelésből egy 2870 bp fragmenst izolálunk a gélről. A pF8CIS-ből izoláljuk az SV40 poliadenilező helyet, a DHFR-t, a transzkripciós szabályzót, a bakteriális replikációs origót és az ampicillin rezisztencia gént, valamint a CMV enhancert és promotert és összekötő donort. Ezeket az elemeket mint egy 2525 bp Sall-BamHI fragmensként és egy 3113 bp-ú Hapl-Sall fragmensként izoláljuk. Egy háromrészes ligálás a Kpnl(tompa)-Clal fragmens, a Hpal-Sall és a Sall-BamHI fragmensek között eredményezi a pCISt-PA-t, amely kifejeződik mind a CHO mind a 293 sejtekben, mint azt fentebb a pCIHt-PA plazmidnál tárgyaltuk, 55 és 3000 ng/ml t-PA expreszsziós szinteket adva (lásd 3. ábrát).The starting vectors for this construct are pCIHt-PA and pFBCIS (see above). The latter vector has the same controls as pCIHt-PA, but also includes the factor VIII cDNA and the SV40 polyadenylation site. SecII was used to cleave the t-PA cDNA 3 '. The resulting 3 'overhang is blunt-ended with T4 polymerase. The pCIHt-PA is then cleaved with Clal. This site separates the chimeric intron between the CMV intron sequences and the Ig variable region intron. A 2870 bp fragment was isolated from the gel from Clal treatment. The SV40 polyadenylation site, DHFR, transcriptional regulator, bacterial origin of replication and the ampicillin resistance gene, as well as the CMV enhancer and promoter and binding donor were isolated from pF8CIS. These elements were isolated as a 2525 bp SalI-BamHI fragment and a 3113 bp HapI-SalI fragment. A tripartite ligation between the KpnI (blunt) -Ca Ia fragment, Hpal-SalI and the SalI-BamHI fragment results in pCISt-PA, which is expressed in both CHO and 293 cells as discussed above for plasmid pCIHt-PA. , 55 and 3000 ng / ml t-PA expression levels (see Figure 3).
b) A p7-lH végső megszerkesztéseb) Final construction of p7-1H
A pCISt-PA plazmidot Spel-gyel emésztjük, majd E. coli DNS polimeráz I nagy fragmenssel (Klenow) és dezoxiribonukleozid-trifoszfátokkal kezeljük, hogy tompa végeket alakítsunk ki. Az így kapott lineáris fragmenst ligáljuk - T4 DNS ligáz alkalmazásával - az fi egyszálú DNS fágból származó, a +szál origót tartalmazó, 0,45 kb-ú Rsal/AhalII fragmenshez, amint azt Zinder és mtsai leírták /Microbial. Rév. 49, 101 {1985)/. Azokat a ligálási termékeket izoláljuk, melyekbe beépült az florigó mindkét lehetséges orientációban a pCISt-PA fragmens Spel helyénél. Egy plazmidot, mely ezt az origót olyan orientációban tartalmazza, hogy a t-PA gén antisense szála vironokba van bepakolva segítő (helper) fág jelenlétében, kiválasztunk és p7-lH-nak nevezünk el (lásd 4. ábrát).Plasmid pCISt-PA was digested with SpeI and then treated with a large fragment of E. coli DNA polymerase I (Klenow) and deoxyribonucleoside triphosphates to form blunt ends. The resulting linear fragment was ligated using the T4 DNA ligase to the 0.45 kb Rsal / AhalII fragment containing the + strand origin from the single-stranded DNA phage as described by Zinder et al. / Microbial. Port. 49, 101 (1985)). The ligation products which contain the florigo in both possible orientations at the SpeI site of the pCISt-PA fragment are isolated. A plasmid containing this origin in the orientation that the antisense strand of the t-PA gene is encapsulated in virons in the presence of helper phage is designated and designated as p7-1H (see Figure 4).
2. Az expressziós plazmid mutagenezise2. Mutagenesis of the expression plasmid
a) Templát-előállítás(a) Template production
A p7-IH plazmidot bevezetjük E. coli JM101 (ATCC 33,876) törzsbe kalcium-klorid-közvetített transzformációval. Ezeket a sejteket azután fertőzzük M13K07 helper vírussal, és egyszálú p7-lH DNS-t állítunk elő, amint ezt Veira és mtsai leírták /Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)/. Röviden ismertetve, transzformáit sejtek 2YT tápközegben keletkezett telített tenyészetének 0,3 ml-éhez hozzáadunk 109-l 0'° pfu (tarfoltképző egység) Ml3K07-et, és a keveréket 15 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 1,5 ml friss 2YT tápközeget, amely 50 pg/ml karbenicillint is tartalmaz, adunk hozzá és a tenyészetet óvatosan kevertetjük 16 órán át 37 °C hőmérsékleten. Miután a sejteket pelletizáltuk, a fágot és a bepakolt plazmid DNS-t kinyerjük, és egyszálú DNS-t állítunk elő oly módon, ahogyan azt Anderson leírta /Nucl. Acids. Rés. 9, 3015 (1981)/.Plasmid p7-IH was introduced into E. coli strain JM101 (ATCC 33,876) by calcium chloride-mediated transformation. These cells are then infected with M13K07 helper virus, and single-stranded p7-1H DNA is prepared as described by Veira et al. / Meth. Enzymol. 153: 3 (1987). Briefly, 0.3 ml of a saturated culture of transformed cells in 2YT medium is supplemented with 10 9 -10 ° pfu (plaque-forming unit) M133O07 and the mixture is incubated for 15 minutes at 37 ° C. 1.5 ml of fresh 2YT medium containing 50 pg / ml carbenicillin was added and the culture was gently stirred for 16 hours at 37 ° C. After pelleting the cells, the phage and the encapsulated plasmid DNA were recovered and single-stranded DNA was prepared as described by Anderson / Nucl. Acids. Gap. 9, 3015 (1981)].
b) Helyre irányított in vitro mutagenezis(b) Site-directed in vitro mutagenesis
A p7-lH-n a mutagenezist az 5’-CGGAGAGCGGCACCTGTGCGGGG-3’ oligodezoxiribonukleotid felhasználásával végezzük, lényegében Zoller és mtsai szerint /Meth. Enzymol. 100, 468 (1983)/, kivéve a phe305 -> his305 mutációval rendelkező mutánst, melyet tarfolt hibridizálás helyett inkább telephibridizálással azonosítunk. A mutációkat közvetlenül az egyszálú plazmid DNS-en igazoljuk DNS szekvenciaelemzéssel, a didezoxinukleotid lánc-terminációs módszert alkalmazva /Sanger és mtsai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 5463 (1977)/.Mutagenesis on p7-1H is performed using the 5'-CGGAGAGCGGCACCTGTGCGGGG-3 'oligodeoxyribonucleotide, essentially according to Zoller et al., Meth. Enzymol. 100, 468 (1983)], except for the mutant with the phe305 → his305 mutation, which is identified by telephybridization rather than plaque hybridization. Mutations are confirmed directly on single-stranded plasmid DNA by DNA sequence analysis using the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74, 5463 (1977)).
3. Expresszió és tisztítás a) Plazmid-előállítás3. Expression and purification a) Plasmid preparation
A transzformált sejteket telítésig növesztjük 500 ml LB-tápközegen, amely 50 gg/ml karbenicillint is tartalmaz. A sejteket centrifugálással üledékbe visszük és reszuszpendáljuk 40 ml, 50 mM glükózt, 10 mM EDTA-t és 25 mMTris-HCl-t (pH 8,0) tartalmazó oldatban. Ehhez a szuszpenzióhoz hozzáadunk 60 ml, 1 %-os nátrium-dodecil-szulfátot és 0,07 M NaOH-ot, és az elegyet 2 percen át inkubáljuk 25 °C-on, majd 10 percig 0 °C-on. Ehhez 52 ml 4 M ecetsavat és 3 M nátrium-acetátot adunk és az elegyet 30 percen át inkubáljuk 0 °C-on.The transformed cells are grown to saturation in 500 ml of LB medium containing 50 µg / ml carbenicillin. The cells are pelleted by centrifugation and resuspended in 40 ml of a solution containing 50 mM glucose, 10 mM EDTA and 25 mM Tris-HCl, pH 8.0. To this suspension was added 60 ml of 1% sodium dodecyl sulfate and 0.07 M NaOH, and the mixture was incubated for 2 minutes at 25 ° C and for 10 minutes at 0 ° C. To this was added 52 ml of 4 M acetic acid and 3 M sodium acetate and the mixture was incubated for 30 minutes at 0 ° C.
Ezután 20 percen keresztül 11 500 fordulat/perccel centrifugáljuk, a felülúszót összekeverjük két térfogatnyi 100%-os hideg etanollal, és a kapott csapadékot centrifugálással kinyerjük. A pelletet, amely a plazmid DNS-t és RNS-t tartalmazza, megszárítjuk és újra oldjuk 100 mM Tris-t (pH 8,0), 10 mM EDTA-t és 1 μg/ml RNáz A-t tartalmazó oldatban. Az így kapott oldat centrifugálással történő tisztítása után 0,5 mg/mlAfter centrifugation for 20 minutes at 11,500 rpm, the supernatant was mixed with two volumes of 100% cold ethanol and the resulting precipitate was recovered by centrifugation. The pellet containing plasmid DNA and RNA was dried and redissolved in 100 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA and 1 μg / ml RNase A. After purification of the resulting solution by centrifugation, 0.5 mg / ml
HU 210 541 A9 koncentráció eléréséig etidium-bromidot és azonos tömegű CsCl-ot adunk hozzá. A DNS-t ezután Beckman VT165 rotorban centrifugáljuk 16 órán át 55 000 ford/percnél 18 °C hőmérsékleten. A DNS réteget oldalról tűvel leszívjuk, n-butanollal extraháljuk, hogy eltávolítsuk az etidium-bromidot, majd vízzel meghígítjuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t újra oldjuk 1 mg/ml végkoncentrációban 10 mM Tris-t (pH 8,0) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldatban.Until a concentration of A9 is reached, ethidium bromide and an equal weight of CsCl are added. The DNA was then centrifuged in a Beckman VT165 rotor for 16 hours at 55,000 rpm at 18 ° C. The DNA layer is aspirated with a needle, extracted with n-butanol to remove ethidium bromide, then diluted with water and precipitated with ethanol. The DNA was redissolved in a final concentration of 1 mg / ml in 10 mM Tris pH 8.0 and 1 mM EDTA.
b) Transzfekció és expressziób) Transfection and expression
293 sejteket növesztünk összefolyásig. 10 pg t-PA plazmid DNS mutánst összekeverünk 1 pg VARNS gént kódoló DNS-sel /Thimmappaya és mtsai: Cell 31, 543 (1982)/, és feloldjuk 500 pl oldatban, mely 1 mM Tris.HCl-t, 0,1 mM EDTA-t és 0,277 M CaCl2-ot tartalmaz. Hozzáadjuk (cseppenként míg vortexeljük) 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl és 1,5 mM NaPO4 500 pl elegyét, és a csapadékot 10 percen át 25 °C hőmérsékleten hagyjuk megképződni. A szuszpendált csapadékot ezután hozzáadjuk a sejtekhez (100 mM-ban lemezenként), és 4 órán át hagyjuk leülepedni az inkubátorban. A tápközeget ezután leszívjuk és 2 ml 20%-os glicerint /foszfáttal puff erőit sóoldatban (PBS)/ adunk hozzá 30 másodperc alatt. A sejteket ezután kétszer mossuk 5 ml szérummentes tápközeggel, majd friss tápközeget adunk hozzá, és a sejteket 5 napon át inkubáljuk.293 cells were grown to confluence. 10 pg of the plasmid DNA mutant t-PA is mixed with 1 pg of DNA encoding the VARNS gene (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)) and dissolved in 500 µl of 1 mM Tris.HCl, 0.1 mM. Contains EDTA and 0.277 M CaCl 2 . A mixture of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl and 1.5 mM NaPO 4 500 µl (dropwise while vortexing) was added and the precipitate allowed to form for 10 minutes at 25 ° C. The suspended pellet was then added to the cells (100 mM per plate) and allowed to settle for 4 hours in the incubator. The medium is then aspirated and 2 ml of 20% glycerol / phosphate-buffered saline (PBS) is added over 30 seconds. The cells are then washed twice with 5 ml of serum-free medium, then fresh medium is added and the cells are incubated for 5 days.
A t-PA variánst kifejező, stabil CHO sejtvonalak megalkotásához a t-PA-t kódoló szekvenciák legnagyobb részét hordozó 1,4 kb Bgl II/Apal fragmenst (a BglII hely átfogja a teljes hosszúságú t-PA-t kódoló DNS-1 és 1 kodonjai közti területet, és az Apai hely átfogja a teljes hosszúságú t-PA-t kódoló DNS 465-466 kodonjait) ligálhatjuk a pPADHFR-6 vektorból (amelyet a 93,619 sz. európai közrebocsátási irat ismertet) származó 6,0 kb BglI/Apa I fragmenshez. Az így kapott plazmidot ezután bevezetjük CHO sejtekbe és indukáljuk a t-PA variánsok túl-kifejezésére (over-express) oly módon, hogy a kódoló szekvenciát metotraxát-tartalmú tápközegben végzett szelekció segítségével megsokszorozzuk.To generate stable CHO cell lines expressing the t-PA variant, the 1.4 kb Bgl II / Apal fragment carrying the majority of the t-PA coding sequences (the BglII site encodes the full-length t-PA coding DNA and 1). codon and the ApaI site spans codons 465-466 of the full-length t-PA coding DNA) can be ligated into the 6.0 kb BglI / Apa I vector from pPADHFR-6 (disclosed in European Patent Application No. 93,619). fragment. The resulting plasmid is then introduced into CHO cells and induced to overexpress t-PA variants by amplifying the coding sequence by selection in methotrexate-containing medium.
c) Tisztításc) Cleaning
A t-PA termék tisztítását úgy végezzük, hogy a kondicionált tápközeget átengedjük egy szabályozott méretű üveggyöngyöket tartalmazó oszlopon (ágytérfogat 1 ml), amelyhez előzőleg anti-t-PA kecske poliklonális A6 antitestet (melyet önmagában ismert eljárással állítottunk elő) kötöttünk. Mielőtt a tápközeget fel vinnénk, az oszlopot kiegyensúlyozzuk 0,1 M Tris.HCl-t (pH 7,5) és 1 M NaCl-ot tartalmazó oldattal. AtPA-t 0,1 M ecetsavat, 0,15 M NaCl-ot, 0,02 ar ginint és 0,01 o Tween 80-at (p H 2,0) tartalmazó oldattal eluáljuk, és a frakciókat azonnal semlegesítjük Tris-bázissal. A frakciókat összegyűjtés előtt 0,01% Tween 80-ra állítjuk be. A redukáló SDS gélen úgy találjuk, hogy a t-PA zömmel (80%) egyláncú.Purification of the t-PA product was accomplished by passing the conditioned medium through a column of controlled-size glass beads (bed volume, 1 mL) previously bound with anti-t-PA goat polyclonal antibody A6 (prepared by a known method). Before applying the medium, the column was equilibrated with a solution containing 0.1 M Tris.HCl pH 7.5 and 1 M NaCl. AtPA is eluted with a solution of 0.1 M acetic acid, 0.15 M NaCl, 0.02 ar ginine, and 0.01 o Tween 80 (p H 2.0), and the fractions are immediately neutralized with Tris base . Fractions were adjusted to 0.01% Tween 80 prior to collection. On the reducing SDS gel, t-PA is found to be mostly single-chain (80%).
B. Biológiai vizsgálatokB. Biological studies
I. A t-PA mennyiségi meghatározásaI. Quantification of t-PA
A fehérje-koncentrációkat rutinszerűen azzal az ELISA módszerrel határozzuk meg, melyet a natívszekvenciájú t-PAra standardizáltak (lásd 93,619 sz. európai közrebocsátási iratot). A fehérje-tisztaságot ésProtein concentrations are routinely determined by the ELISA standardized on native sequence t-PA (see European Patent Publication No. 93,619). Protein purity and
-homogenitást poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk nátrium-dodecil-szulfát (PAGE-SDS) jelenlétében Laemmli-féle puffer rendszerben /Natúré 227, 680 (1970)/. Tipikusan 7-17% gradiens géleket alkalmazunk és a fehérjéket Morrissey ezüstfestési technikájával tesszük láthatóvá /Anal. Biochem. 117, 307 (1981)/. A fent leírt módon előállított t-PA variánsról úgy találjuk, hogy e szerint a módszer szerint tiszta és homogén.homogeneity by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (PAGE-SDS) in the Laemmli buffer system (Naturre 227, 680 (1970)). Typically, 7-17% gradient gels are used and the proteins are visualized by Morrissey silver staining / Anal. Biochem. 117, 307 (1981)]. The t-PA variant produced as described above was found to be pure and homogeneous by this method.
2. S-2251 vizsgálat2. Test S-2251
A vérrög-lízis és az S-2251 vizsgálatok eredményei néhány független megfigyelés átlagait mutatják (vérrög-lízis: 2 meghatározás; S-2251: 3 meghatározás).The results of blood clot lysis and S-2251 assays are averages of some independent observations (clot lysis: 2 determinations; S-2251: 3 determinations).
A t-PA-nak azt a képességét, hogy a plazminogént aktiválja, egy in vitro vizsgálattal mérhetjük oly módon, hogy a t-PA-t és a plazminogént előinkubáljuk, majd hozzáadjuk a plazmin-specifikus H-D-valil-H-leucil-H-lizin-paranitro-anilid (S-2251) szubsztrátot. Ennek a reakciónak a maximális sebessége fibrin(ogén) vagy fibrin(ogén) fragmensek jelenlétében figyelhető meg, amelyek ezen reakció stimulátoraiként hatnak.The ability of t-PA to activate plasminogen can be measured by in vitro assay by preincubating t-PA and plasminogen and adding plasmin-specific HD-valyl-H-leucyl-H lysine paranitroanilide (S-2251) substrate. The maximum rate of this reaction is observed in the presence of fibrin (ogen) or fibrin (ogen) fragments which act as stimuli for this reaction.
A plazminra fajlagos S-2251 szubsztrátot egy kétlépcsős vizsgálatban alkalmazzuk, hogy a minta plazminogént aktiváló képességét mérjük. A fibrinogént stimulátorként használhatjuk oly módon, hogy a mintát 0,02 ml 20 mg/ml koncentrációjú fibrinogén-oldattal inkubáljuk 0,12 ml össztérfogatban, a következő összetételű oldatban: 0,05 M Tris.HCl, 0,12 M NaCl és 0,01% Tween 80 (pH 7,4).The plasmin-specific substrate S-2251 was used in a two-step assay to measure the plasminogen activation ability of the sample. Fibrinogen can be used as a stimulant by incubating the sample with 0.02 ml of a 20 mg / ml solution of fibrinogen in a total volume of 0.12 ml of 0.05 M Tris.HCl, 0.12 M NaCl and 0. 01% Tween 80 (pH 7.4).
Glu-plazminogén-oldatot (amely kereskedelmi forgalomban beszerezhető) adunk hozzá, mégpedig 0,03 ml-t egy 2,0 mg/ml koncentrációjú oldatból 0,05 M Tris- és 0,12 M NaCl-pufferben (p H 8,0). 10 gercen át 37° C-on tartjuk, majd hozzáadunk 0,35 ml 0,86 MA commercially available solution of Glu-plasminogen was added, 0.03 ml of a 2.0 mg / ml solution in 0.05 M Tris and 0.12 M NaCl buffer (p H 8.0). ). After 10 hours at 37 ° C, 0.35 mL of 0.86 M was added
S-2251 oldatot 0,037 M Tris-t, 0,086 M NaCl-t és 0,007% Tween 80-at tartalmazó oldatban (pH 7,4). Ezt a keveréket 5 percen át inkubáljuk; ezután a reakciót 0,1 ml 50%-os jégecet hozzáadásával leállítjuk. Az abszorbanciát 405 nm-nél mérjük. Az aktivitást úgy fejezzük ki mint az abszorbancia változását a szubsztrátum jelenlétében nanogrammonként és percenként.S-2251 in 0.037 M Tris, 0.086 M NaCl and 0.007% Tween 80 (pH 7.4). This mixture was incubated for 5 minutes; the reaction was quenched with 0.1 ml of 50% glacial acetic acid. Absorbance was measured at 405 nm. Activity is expressed as the change in absorbance per nanogram per minute in the presence of substrate.
Az eredmények azt mutatják, hogy az F305H variáns fibrinogénnel a vadtípusú fajlagos aktivitás 78%val rendelkezik; ez valószínűleg az A405 növekedések előtti lag-szakasznak tulajdonítható.The results show that the F305H variant has 78% of the wild-type specific activity with fibrinogen; this is probably due to the pre-growth lag phase of the A405.
3. Vérrög-lízis3. Blood clot lysis
Vad-típusú és F305H t-PA-t vizsgálunk azon képességükre, hogy hogyan lizálják a fibrint a plazminogén telítő-koncentrációi jelenlétében, Carlsen és mtsai módszere szerint /Anal. Biochem. 168, 428-435 (1988)/. Az in vitro vérrög-lízis vizsgálat a t-PA-k aktivitását turbidimetriával méri, mikrocentrifugáló analitikai berendezést alkalmazva. Trombin és t-PA teszt minták keverékét centrifugáljuk fibrinogén és plazminogén keverékébe, hogy beindítsuk a vérrög képződést és az azt követő vérrög feloldódást. Az így kialakuló, abszorbancia az idő függvényében profilt elemezzük, hogy meghatározzuk a vizsgálat végpontját. A t-PA variánsok aktivitásait összehasonlítjuk az rt-PA standard görbéjével (lásd 93,619 sz. európai köz16Wild-type and F305H t-PA are tested for their ability to lyse fibrin in the presence of saturation concentrations of plasminogen according to Carlsen et al., Anal. Biochem. 168: 428-435 (1988). The in vitro blood clot lysis assay measures the activity of t-PAs by turbidimetry using a microcentrifuge analytical instrument. The mixture of thrombin and t-PA test samples is centrifuged into a mixture of fibrinogen and plasminogen to induce clot formation and subsequent clot dissolution. The resulting absorbance versus time profile is analyzed to determine the end point of the assay. The activities of the t-PA variants are compared with the standard curve of rt-PA (see European Patent Publication No. 93,619).
HU 210 541 A9 rebocsátási iratot). A vizsgálat folyamán alkalmazott puffer 0,06 M nátrium-foszfát puffer (pH 7,4), amely 0,01 (tf/tf) Tween 80-at és 0,01% (tömeg/térfogat) nátrium-azidot tartalmaz. A humán trombin 33 egység/ml koncentrációban van jelen. A fibrinogént jeges vízben lehűtjük (2,0 mg/ml rögképző fehérje-koncentrációnál), hogy a fibronektint kicsapjuk, majd gravitációval szűrjük. A glu-plazminogén 1 mg/ml koncentrációban van jelen. Az analizáló kamra hőmérséklete 37 °C-ra van beállítva. A beadagoló berendezés úgy van beállítva, hogy 20 μΐ rt-PA-t (kb. 62,5 ng/ml 1,0 pg/ml-re számítva) adagoljon mintaként a standard görbéhez, vagy 20 μΐ rt-PA variánst adagoljon egy koncentrációban a trombinhoz, amelyet másodlagos reagensként használunk, és 200 μΐ-t az 50:1 arányú (tf/tf) fibrinogén:plazminogén keverékből, melyet elsődleges reagensként alkalmazunk. Az abszorbancia/idő programot 5 perces inkubálás után alkalmazzuk, 340 nm-es szűrővel és 90-intervallumos leolvasással.EN 210 541 A9 release document). The buffer used in the assay was 0.06 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.01 (v / v) Tween 80 and 0.01% (w / v) sodium azide. Human thrombin is present at a concentration of 33 units / ml. The fibrinogen was cooled in ice water (2.0 mg / ml clotting protein) to precipitate the fibronectin and filter by gravity. Glu-plasminogen is present at a concentration of 1 mg / ml. The analyzer chamber temperature is set to 37 ° C. The dispenser is set to either add 20 μΐ rt-PA (approximately 62.5 ng / ml 1.0 pg / ml) as a sample to the standard curve, or add 20 μΐ rt-PA at a single concentration. thrombin used as a secondary reagent and 200 μΐ of the 50: 1 (v / v) fibrinogen: plasminogen mixture used as the primary reagent. The absorbance / time program was applied after 5 minutes of incubation with a 340 nm filter and 90-reading intervals.
Az eredmények azt jelzik, hogy az F305H variáns ezt a vizsgálatot alkalmazva - a normál vad-típusú t-PA vérrög-oldó aktivitásának mintegy 46%-ával rendelkezik.The results indicate that the F305H variant, when used in this assay, has approximately 46% of the blood clotting activity of normal wild-type t-PA.
4. Fibrin-kötődés4. Fibrin binding
A fibrin-kötődésre használt eljárás a Rijken és mtsai által leírt módszer módosított /J. Bioi. Chem. 257, 2920 (1982)/ változata. A vizsgálandó t-PA mintát hozzáadjuk egy olyan oldathoz, amely 0,05 M Tris-t (pH 7,4), 0,12 M NaCl-ot, 0,01% Tween 80-at, 1 mg/ml humán szérum albumint és plazminogén-mentes fibrin különböző koncentrációit (0, 0,05, 0,1, 0,25 és 0,5 mg/ml) tartalmazza. A végső reakciótérfogat 1 ml és a t-PA-koncentráció mintánként 10 ng/ml. A mintákat 37 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd 1 egység trombint adunk hozzájuk. A mintákat ezután egy órán át 37 °C-on inkubáljuk. A vérrögöket centrifugálással eltávolítjuk és a felülúszóban megmaradt, nem-kötődött t-PA mennyiségét ELISA-val meghatározzuk.The method used for fibrin binding is modified by the method described by Rijken et al. Biol. Chem. 257, 2920 (1982). The sample t-PA to be tested is added to a solution of 0.05 M Tris pH 7.4, 0.12 M NaCl, 0.01% Tween 80, 1 mg / ml human serum albumin and various concentrations of plasminogen-free fibrin (0, 0.05, 0.1, 0.25 and 0.5 mg / ml). The final reaction volume is 1 ml and the concentration of t-PA is 10 ng / ml per sample. Samples were incubated at 37 ° C for 5 minutes and then 1 unit of thrombin was added. The samples were then incubated for one hour at 37 ° C. Blood clots are removed by centrifugation and the amount of unbound t-PA remaining in the supernatant is determined by ELISA.
Az eredmények (5. ábra) azt mutatják, hogy a főként egyláncú F305H t-PA (zárt háromszögek) az alkalmazott vizsgálati körülmények között csaknem olyan jól kötődik a fibrinhez, mint az egyláncú vad-típusú t-PA (zárt négyzetek) és az egyláncú és kétláncú vad-típusú t-PA keveréke (nyitott háromszögek). A kétláncú F3O5H t-PA is (zárt körök) legalább olyan jól kötődik a fibrinhez, mint a kétláncú vad-típusú t-PA (zárt rombuszok).The results (Figure 5) show that predominantly single-chain F305H t-PA (closed triangles) are almost as well bound to fibrin under the assay conditions as single-chain wild-type t-PA (closed squares) and single-chain t-PA (closed squares). and a mixture of two-stranded wild-type t-PA (open triangles). The two-chain F3O5H t-PA (closed loops) also binds to fibrin at least as well as the two-chain wild-type t-PA (closed diamonds).
5. Zimogén-kinetika S-2251-gyel5. Zymogen kinetics with S-2251
a) Fibrinogén előállítása(a) Production of fibrinogen
A humán fibrinogént (Calbiochem) fibrinogénmentesítjük oly módon, hogy felvisszük egy lizin-Sepharose oszlopra és az átfolyó folyadékot összegyűjtjük. Az így kapott egyesített fibrinogént lebontjuk egy éjszakán át tartó plazmin-Sepharose-oszlopos kezeléssel. A létrejövő alvadóképesség 7%. A koncentrációt ezután beállítjuk 1,51 mg/ml-re.Human fibrinogen (Calbiochem) is de-fibrinogenated by loading it on a lysine-Sepharose column and collecting the effluent. The combined fibrinogen thus obtained is decomposed by an overnight plasmin-Sepharose column treatment. The resulting clotting capacity is 7%. The concentration is then adjusted to 1.51 mg / ml.
b) Eljárás(b) Procedure
Meghatározzuk a plazminogénnek a vad-típusú t-PA és az F3O5H t-PA által plazminná történő átalakulásának kinetikáját fibrinogén jelenlétében az S-2251 kromogén plazmin-szubsztrát felhasználásával. A vad-típusú és az F3O5H t-PA molekulákat mind főként egyláncú formában (melyet a fent leírt tisztítással kapunk), mind kétláncú, összekapcsolt formában alkalmazzuk (amelyet a főként egyláncú forma plazmin-Sepharose-zal 1 órán át 37 °C-on végzett inkubálásával nyerünk).The kinetics of the conversion of plasminogen to wild-type t-PA and F3O5H t-PA in the presence of fibrinogen are determined using the chromogenic plasmin substrate S-2251. The wild-type and F3O5H t-PA molecules were used both in the single-chain form (obtained by the purification described above) and in the double-chain linked form (which was performed mainly with plasmin-Sepharose for 1 hour at 37 ° C). incubation).
1,2 μΜ plazminnal-lebontott fibrinogén-fragmensek jelenlétében, melyeket a fentiek szerint állítottunk elő, a reakciót 0,08-0,89 μΜ plazminogén-koncentrációnál és 2,3-9,0 nM t-PA-koncentrációnál hajtjuk végre 0,12M NaCl, 0,05 M Tris és 0,01% Tween 80 (pH 7,4) elegyében. A plazminogént, a fibrinogént és a puffért 3 órán át szobahőmérsékleten előinkubáljuk. AzIn the presence of 1.2 μΜ plasmin-degraded fibrinogen fragments prepared as above, the reaction is performed at 0.08-0.89 μΜ plasminogen concentration and 2.3-9.0 nM t-PA concentration, 12M NaCl, 0.05 M Tris and 0.01% Tween 80 (pH 7.4). Plasminogen, fibrinogen and buffer were preincubated for 3 hours at room temperature. The
S-2251 -et 0,9 mM végső koncentrációban adjuk hozzá, és a mintákat 37 °C-on kb. 5 percen át melegítjük. A nulla időpontban a t-PA mintákat hozzáadjuk, és minden egyes minta abszorbanciáját 30 másodperces intervallumokban leolvassuk 10 percen át 37 °C hőmérsékleten.S-2251 was added at a final concentration of 0.9 mM and the samples were incubated at 37 ° C for approx. Heat for 5 minutes. At zero time t-PA samples are added and the absorbance of each sample is read at 30 second intervals for 10 minutes at 37 ° C.
Az eredményeket a 6. és 7. ábrákban (a vad-típusú, egyláncú illetve kétláncú t-PA-ra) és a 8. és 9. ábrákban (az F305H egyláncú illetve kétláncú t-PA-ra) adjuk meg. Az ábrákban az ordináta az abszorbancia 405 nm-nél és abszcissza azon percek számának négyzete, amelynél az abszorbanciát mérjük. A zárt körök 0,9 μΜ plazminogént (és 15,7 nM vad-típusú kétláncú t-PA-t, 10,8 nM F305H kétláncú t-PA-t, 16,1 nM vadtípusú egyláncú t-PA-t és 17,2 nM F3O5H egyláncú t-PA-t) képviselnek; a zárt háromszögek 0,11 μΜ plazminogént (és 11,8 nM vad-típusú kétláncú t-PA-t, 8,1 nM F305H kétláncú t-PA-t, 12,1 nM vad-típusú egyláncú t-PA-t, 12,9 nM F305H egyláncú t-PA-t) képviselnek; a zárt négyzetek 0,16 μΜ plazminogént (és 9,8 nM vad-típusú kétláncú t-PA-t, 6,7 nM F305H kétláncú t-PA-t, 10,1 nM vad-típusú egyláncú t-PA-t, 10,8 nM F305H egyláncú t-PA-t) képviselnek; a nyitott körök 0,22 μΜ plazminogént (és 7,9 nM vad-típusú kétláncú t-PA-t, 5,4 η M F305H kétláncú t-PA-t, 8,1 nM vad-típusú egyláncú t-PA-t és 8,6 η M F305H egyláncú t-PA-t) képviselnek; a nyitott háromszögek 0,44 μΜ plazminogént (és 3,9 nM vad-típusú kétláncú t-PA-t,The results are shown in Figures 6 and 7 (for wild-type, single-chain and two-chain t-PA) and Figures 8 and 9 (for F305H single-chain and two-chain t-PA). In the figures, the ordinate is the absorbance at 405 nm and the abscissa is the square of the number of minutes during which the absorbance is measured. Closed circles contained 0.9 μΜ plasminogen (and 15.7 nM wild-type t-PA, 10.8 nM F305H t-PA, 16.1 nM wild-type t-PA, and 17, 2 nM F3O5H single chain t-PA); closed triangles with 0.11 μΜ plasminogen (and 11.8 nM wild-type t-PA, 8.1 nM F305H t-PA, 12.1 nM wild-type t-PA, Represent 12.9 nM F305H single chain t-PA); closed squares 0.16 μΜ plasminogen (and 9.8 nM wild-type double-stranded t-PA, 6.7 nM F305H double-stranded t-PA, 10.1 nM wild-type single-stranded t-PA, Represent 10.8 nM F305H single chain t-PA); open circles 0.22 μΜ plasminogen (and 7.9 nM wild-type double-stranded t-PA, 5.4 η M F305H double-stranded t-PA, 8.1 nM wild-type single-stranded t-PA and 8.6 η M F305H single chain t-PA); open triangles 0.44 μΜ plasminogen (and 3.9 nM wild-type double-stranded t-PA,
2,7 nM F305H kétláncú t-PA-t, 4,0 nM vad-típusú egyláncú t-PA-t, 4,3 nM F3O5H egyláncú t-PA-t) képviselnek; a nyitott négyzetek 0,9 μΜ plazminogént (ésRepresent 2.7 nM F305H double chain t-PA, 4.0 nM wild-type single chain t-PA, 4.3 nM F3O5H single chain t-PA); open squares 0.9 μΜ plasminogen (and
3,9 nM vad-típusú kétláncú t-PA-t, 2,7 nM F3O5H kétláncú t-PA-t, 4,0 nM vad-típusú egyláncú t-PA-t és3.9 nM wild-type double-stranded t-PA, 2.7 nM F3O5H double-stranded t-PA, 4.0 nM wild-type single-stranded t-PA, and
4,3 nM F3O5H egyláncú t-PA-t) képviselnek.Represent 4.3 nM F3O5H single chain t-PA).
A görbék azt mutatják, hogy csak a főként egyláncú F395H variáns abszorbanciája mutat kimondott lag-fázist a reakció kezdeti szakaszában, ezután emelkedést mutat az aktivitásban. A kétláncú F305H variáns nem mutatja ezt a lag-fázist; úgy tűnik, hogy ez olyan kinetikai tulajdonságokkal rendelkezik, melyek az egyvagy kétláncú t-PA-hoz hasonlók. Ez a viselkedés az F305H variáns zimogén természetét demonstrálja, amelyet a vad-típusú t-PA-nál nem figyeltünk meg.The curves show that only the absorbance of the predominantly single chain F395H variant exhibits a pronounced lag phase in the early stages of the reaction, followed by an increase in activity. The two-chain F305H variant does not show this lag phase; this appears to have kinetic properties similar to single or double-chain t-PA. This behavior demonstrates the zymogenic nature of the F305H variant, which was not observed in wild-type t-PA.
//. PÉLDA//. EXAMPLE
Az alanin-letapogató mutagenezisként ismert stra17The alanine scanner is known as stra17
HU 210 541 A9 tégiát (ALA-scan), melyet Cunningham és Wells írtak le (lásd fent), alkalmazzuk az ebben a példában értékelt variánsok létrehozására. Ez az eljárás magában foglalja a t-PA proteáz dómén azon kis felületeinek azonosítását, amelyek töltött aminosav-oldalláncokat tartalmaznak. Anélkül, hogy bármely elmélethez ragaszkodnánk, úgy véljük, hogy vagy ezek a régiók, melyek a töltések csoportjait tartalmazzák, vagy a szomszédos régiók, vagy mindkettő felelős a t-PA molekula kölcsönhatásáért szubsztrátjával és különböző más anyagokkal, amelyek módosítják az aktivitását. Az egyes régiókban a töltéssel rendelkező aminosavakat (pl. Arg, Asp, His, Lys és Glu) helyettesítjük alaninnal (régiónként egy mutáns molekulával), hogy megállapítsuk az adott régió jelentőségét a t-PA molekula általános aktivitásában. Az eredményeket az alábbiakban ismertetjük.The A9 scan (ALA scan) described by Cunningham and Wells (see above) is used to generate the variants evaluated in this example. This method involves identifying small surfaces of the t-PA protease domain that contain charged amino acid residues. Without wishing to be bound by any theory, it is believed that either these regions containing charge groups or adjacent regions, or both, are responsible for the interaction of the t-PA molecule with its substrate and various other substances that modify its activity. In each region, charged amino acids (e.g., Arg, Asp, His, Lys, and Glu) are replaced with alanine (one mutant molecule per region) to determine the importance of that region in the overall activity of the t-PA molecule. The results are described below.
1. A pRK7-t-PA megalkotása1. Construction of pRK7-t-PA
A pRK7 plazmidot vektorként alkalmazzuk t-PA mutánsok kialakításához. A pRK7 lényegében a pRKStel (307,247 számú európai közrebocsátási irat, publikálva 1989. 03. 15-én) azonos, azzal a különbséggel, hogy az endonukleáz restrikciós helyek sorrendje a polilinker régióban fordított a Clal és Hindin között. A t-PA cDNS-t /Pennica és mtsai: Natúré 301, 214 (1983)/ előkészítjük a vektorba való beiktatáshoz, hasítva HindlII restrikciós endonukleázzal (amely 49 bázispárt hasít az ATG startkodon 5-nél) és Ball restrikciós endonukleázzal (amely 276 bázispárt hasít a TGA stopkodontól lefelé). Ezt a cDNS-t az előzőleg már HindlII-mal és Smal-gyel hasított pRK7-be ligáljuk standard ligálási módszerekkel /Maniatis és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)/. Ezt a konstrukciót p RK7-t-PA-nak nevezzük.Plasmid pRK7 was used as a vector to generate t-PA mutants. PRK7 is essentially the same as pRKS (European Patent Publication No. 307,247, published March 15, 1989), except that the sequence of endonuclease restriction sites in the polylinker region is reversed between Clal and Hindin. The t-PA cDNA (Pennica et al., Natura 301, 214 (1983)) was prepared for insertion into the vector by digestion with HindIII restriction endonuclease (which cleaves 49 bp at ATG start codon 5) and Ball restriction endonuclease (which backs 276 bp). cleaves down from the TGA stop codon). This cDNA was ligated to pRK7 previously digested with HindIII and SmaI according to standard ligation methods / Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982). This construct is called p RK7-t-PA.
2. A pRK7-t-PA helyre-irányított mutagenezise2. Site-directed mutagenesis of pRK7-t-PA
A t-PA c DNS helyre-irányított mutagenezisét Taylor és mtsai eljárásával /Nucl. Acids. Rés. 13, 8765 (1985)/ hajtjuk végre az Amersham Corporationtól (katalógusszám: RPN 1253) vásárolt készlet felhasználásával. A kívánt mutánsok létrehozására a kívánt amino5 sav-helyettesítéseket kódoló szekvenciák oligonukleotidjait megszintetizáljuk, és ezeket printerként alkalmazzuk. Ezeket az oligonukleotidokat hozzáforrasztjuk az egyszálú p RK7-t-PA-hoz, amelyet előzőleg standard eljárásokkal preparáltunk /Viera és mtsai:Site-directed mutagenesis of t-PA c DNA according to Taylor et al., Nucl. Acids. Gap. 13, 8765 (1985)] using a kit purchased from Amersham Corporation (Cat. No. RPN 1253). To generate the desired mutants, oligonucleotides of the sequences encoding the desired amino5 acid substitutions are synthesized and used as printers. These oligonucleotides are soldered to the single-stranded p RK7-t-PA previously prepared by standard procedures / Viera et al.
Meth.Enz. 143, 3 (1987)/.Meth.Enz. 143: 3 (1987).
Három dezoxiribonukleotid-trifoszfát, a dezoxiriboadenozin-trifoszfát (dATP), a dezoxiriboguanozintrifoszfát (dGTP) és a dezoxiribotimidin-trifoszfát (dTTP) keverékét kombináljuk egy módosított, dCTP(ds)-nek nevezett tio-dezoxiribocitozinnel, amely a fenti kitben található, és hozzáadjuk az egyszálú pRK7-t-PA-hoz, amelyhez az oligonukleotidot anneáltuk.A mixture of three deoxyribonucleotide triphosphates, deoxyribo-adenosine triphosphate (dATP), deoxyribo-boguanosine triphosphate (dGTP) and deoxyribibimimidine triphosphate (dTTP) is combined with a modified dCTP (ds single-stranded pRK7-t-PA to which the oligonucleotide was annealed.
Amikor DNS-polimerázt adunk ehhez a keverék20 hez, kialakul egy egyszálú DNS, amely azonos a pRK7-t-PA-val, kivéve a mutált bázisokat. Ezen kívül ez az új szál dCTP helyett dCTP(ds)-t tartalmaz, amely a restrikciós endonukleázos emésztés elleni védelmet szolgálja. Miután a kettős szálú heterodup25 lex templát szálát egy alkalmas restrikciós enzimmel elvágtuk, a templát szálat ExoIII nukleázzal emésztjük az a régió után, amely a mutagén oligomert tartalmazza. A reakciót ezután leállítjuk, hogy egy olyan molekula maradjon, amely csak részben egyszálú.When DNA polymerase is added to this mixture, a single-stranded DNA identical to pRK7-t-PA is formed, except for the mutated bases. In addition, this new strand contains dCTP (ds) instead of dCTP, which serves to protect against restriction endonuclease digestion. After cutting the double-stranded heterodup25 lex template strand with a suitable restriction enzyme, the template strand is digested with ExoIII nuclease after the region containing the mutagenic oligomer. The reaction is then stopped to leave a molecule that is only partially monofilament.
Ezután egy komplett kettős szálú DNS homoduplex molekulát alakítunk ki DNS-polimerázzal mind a négy dezoxiribonukleotid-trifoszfát, ATP és DNS-ligáz jelenlétében.Subsequently, a complete double-stranded DNA homoduplex molecule is formed with DNA polymerase in the presence of all four DNAs, ATP and DNA ligase.
Az alábbi oligonukleotidokat állítjuk elő, hogy pri35 merként felhasználjuk a pRK7-t-PA molekulák fent leírt ALA-scan módszer segítségével történő kialakításában:The following oligonucleotides were prepared for use as a pri35 marker in the construction of pRK7-t-PA molecules by the ALA-scan method described above:
5'-GGCTGTACTGGGCCAGGCCGCA-3' (R267A)5'-GGCTGTACTGGGCCAGGCCGCA-3 '(R267A)
5'-GGCAGCCTGCCAGGGGGCGGAGGCGATGGCGGCGAAGAG-3 (D2 8 3A,H2 8 7A)5'-GGCAGCCTGCCAGGGGGCGGAGGCGATGGCGGCGAAGAG-3 (D2 8 3A, H2 8 7A)
5'-CCGCTCTCCGGGCGACGCCGCGGCCGCGGCAAAGAT-3' (K296A, H297A,R298A,R299A)5'-CCGCTCTCCGGGCGACGCCGCGGCCGCGGCAAAGAT-3 '(K296A, H297A, R298A, R299A)
5'-GCCCCCGCACAGGAACGCCGCTCCGGGCGA-3' (E303A,R304A)5'-GCCCCCGCACAGGAACGCCGCTCCGGGCGA-3 '(E303A, R304A)
5'-CTCCTGGAAGCAGGCGGCGGCAGA-3' (H322A)5'-CTCCTGGAAGCAGGCGGCGGCAGA-3 '(H322A)
5'-GTGGTGGGGCGGAAACGCCGCCTGGAACGA-3' (E3 2 6A, R327A)5'-GTGGTGGGGCGGAAACGCCGCCTGGAACGA-3 '(E3 26A, R327A)
5'-CAAGATCACCGTCAGGGCGGCGGGCGGAA-3' (H331A,H332A)5'-CAAGATCACCGTCAGGGCGGCGGGCGGAA-3 '(H331A, H332A)
5'-CTCGCCAGGGACCACCGCGTATGTTGCGCCCAAGAT-3' (R339A,R342A) 5/-TTTTTCGACTTCAAATGCCTGCGCCGCCGCGCCAGGGAC-3 E347A,E348A,E349A, K351A) 5'-CTTATGGACAATGTATGCTGCGACTGCAAATTTCTG-3' (E3 5 3A,E3 5 5A,K3 5 6A) (H360A,K361A,E362A) (D364A,D365A,D366A) (D369A,D371A) (K378A,D380A,R383A) (E387A,R392A) (D400A,D405A)CTCGCCAGGGACCACCGCGTATGTTGCGCCCAAGAT 5'-3 '(R339A, R342) 5/3--TTTTTCGACTTCAAATGCCTGCGCCGCCGCGCCAGGGAC E347A, E348A, E349A, K351) CTTATGGACAATGTATGCTGCGACTGCAAATTTCTG 5'-3' (5 3A E3, E3 5 5A, 6A K3 5) (H360, K361A , E362A) (D364A, D365A, D366A) (D369A, D371A) (K378A, D380A, R383A) (E387A, R392A) (D400A, D405A)
5'-AGTGTCATCATCGAATGCCGCAGCGACAATGTA-3 1 5'-GTCATTGTCGTAAGTGGCAGCAGCGAATTCCTT-3 ‘5'-AGTGTCATCATCGAATGCCGCAGCGACAATGTA-3 1 5'-GTCATTGTCGTAAGTGGCAGCAGCGAATTCCTT-3 '
5'-CTGCAGCAGCGCAATGGCATTGGCGTAAGTGTC-3‘CTGCAGCAGCGCAATGGCATTGGCGTAAGTGTC 5'-3 '
5'-CTCCTGGGCACAGGCGGACGAAGCCGATGCCAGCTGCAG-3'CTCCTGGGCACAGGCGGACGAAGCCGATGCCAGCTGCAG 5'-3 '
5'-AAGGCACACAGTGGCGACCACGCTGCTGCGCTGGGCACA-3‘AAGGCACACAGTGGCGACCACGCTGCTGCGCTGGGCACA 5'-3 '
5'-ACACTCCGTCCAGGCCGGCAGCTGCAGGGCCGCCGGGGG-3‘ACACTCCGTCCAGGCCGGCAGCTGCAGGGCCGCCGGGGG 5'-3 '
5'-GGAGAGCTGACA.GGCCGTCCAGTC- 3'(E408A)5'-GGAGAGCTGACA.GGCCGTCCAGTC-3 '(E408A)
5'-GTAGCCGGAGAGGGCACACTCCGT-3'(E410A)GTAGCCGGAGAGGGCACACTCCGT 5'-3 '(E410)
5'-AGGAGACAAGGCCGCAGCCGCGCCGTAGCC-3' (K416A,H417A,E418A)5'-AGGAGACAAGGCCGCAGCCGCGCCGTAGCC-3 '(K416A, H417A, E418A)
5'-TCTGACATGAGCCGCCGCCAGCGCCGCCGAATAGAA-3' (E426A,R427A,K429A,E430A) 5!-GGATGGGTACAGTGCGACAGCAGCCTCCTT-3' (H432A,R434A)5'-TCTGACATGAGCCGCCGCCAGCGCCGCCGAATAGAA-3 '(E426A, R427A, K429A, E430A) 5' -GGATGGGTACAGTGCGACAGCAGCCTCCTT-3 '(H432A, R434A)
5'-TTGTGATGTGCAGGCGCTŰGATGG-3' (R4 4 0A)5'-TTGTGATGTGCAGGCGCTGGGG-3 '(R4 40A)
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
5'-GTCGGTGACTGTTGCGTTAAGTAAAGCTTGTGATGT-3' (R445A,R449A)5'-GTCGGTGACTGTTGCGTTAAGTAAAGCTTGTGATGT-3 '(R445A, R449A)
5'-ACACAGCATGTTGGCGGTGACTGTTGCGTTAAGTAA-3 (R4 4 9A, D4 5 3A)5'-ACACAGCATGTTGGCGGTGACTGTTGCGTTAAGTAA-3 (R4 4 9A, D4 5 3A)
5'-GGGCCCGCCGCTCGCAGTGGCTCCAGCACA-3, (D460A,R462A)5'-GGGCCCGCCGCTCGCAGTGGCTCCAGCACA-3, (D460A, R462A)
5'-GCCCTGGCAGGCGGCGGCCAAGTTTGC-3' (H471A,D472A)5'-GCCCTGGCAGGCGGCGGCCAAGTTTGC-3 '(H471A, D472A)
5'-GGGGCCTCCCGAAGCGCCCTGGCA-3'(D477A)GGGGCCTCCCGAAGCGCCCTGGCA 5'-3 '(D477A)
5'-CACCAAAGTCATGGCGCCAGCGTTCAGACA-3' (D487A,R489A)5'-CACCAAAGTCATGGCGCCAGCGTTCAGACA-3 '(D487A, R489A)
5'-CACACCCGGGACAGCCGCCTGTCCACA-3' (K505A,D506A)5'-CACACCCGGGACAGCCGCCTGTCCACA-3 '(K505A, D506A)
5'-GTAGTTGGTAACGGCTGTGTACAC-3' (K513A)5'-GTAGTTGGTAACGGCTGTGTACAC-3 '(K513A)
5'-CGGTCGCATGTTGGCAGCAATCCAGGCTAGGTAGTT-3' (D519A, R52 2A, D5 2 3A) 5'-TCCTGGTCACGGTGCCATGTTGGCACGAATCCA-3' (D523A,R526A)5'-CGGTCGCATGTTGGCAGCAATCCAGGCTAGGTAGTT-3 '(D519A, R52 2A, D5 2 3A) 5'-TCCTGGTCACGGTGCCATGTTGGCACGAATCCA-3' (D523A, R526A)
3. Baktérium-transzformálás és DNS előállítás3. Bacterial transformation and DNA production
A fenti lépések segítségével kialakított mutáns t-PA szerkezeteket transzformáljuk E. coli MM294ton A gazdaszervezetbe a standard kalcium-kloridos eljárással (Maniatis és mtsai fentebb idézett munkája) a kompetens sejtek preparálásához és transzformálásához. Az M14294ton A-t (amely rezisztens a TI fágra) úgy készítjük el, hogy egy TnlO transzpozont beiktatunk a tón A génbe és ezt követően nem precíz módon kimetszszük. Ezt a gént ezután inszertáljuk - transzpozon inszerciós mutagenezist /Kleckner és mtsai: J. Mól. Bioi. 116, 125-159 (1977)/ alkalmazva - E. coli MK294 (ATCC 31,446) gazdaszervezetbe.Mutant t-PA constructs generated by the above steps are transformed into E. coli MM294ton A using the standard calcium chloride method (Maniatis et al., Supra) for the preparation and transformation of competent cells. M14294ton A (which is resistant to the T1 phage) is prepared by inserting a Tn10 transposon into the ton A gene and subsequently excising it in an inaccurate manner. This gene is then inserted - transposon insertion mutagenesis / Kleckner et al., J. Mol. Biol. 116, 125-159 (1977)), to E. coli MK294 (ATCC 31,446).
A DNS-t extraháljuk a baktérium-transzformánsok egyes telepeiből Maniatis és mtsai standard minprep eljárása segítségével (lásd fent idézett munkát). A plazmidokat tovább tisztítjuk Sepharose CL6B forgó oszlopon átengedve, majd szekvencia-elemzéssel, restrikciós endonukleázos emésztéssel és agaróz gélelektroforézissel analizáljuk.The DNA was extracted from each colony of bacterial transformants using the standard minprep procedure of Maniatis et al., Supra. The plasmids were further purified by passage through a Sepharose CL6B rotary column and analyzed by sequence analysis, restriction endonuclease digestion and agarose gel electrophoresis.
Ezen transzformánsok egyikét, amely tartalmazza a K296A,H297A,R298A,R29A mutánst kódoló plazmidot, pTPA33-2-vel jelöltük, és az American Type Culture Collection-nál 1989. 07. 18-án ATCC 68,059 számon deponáltuk.One of these transformants containing the plasmid encoding the mutants K296A, H297A, R298A, R29A was designated pTPA33-2 and deposited with the American Type Culture Collection on July 18, 1989 under ATCC No. 68,059.
4. Humán embrió 293 vesesejtek transzfekciója (kisléptékű)4. Transfection of human embryo 293 kidney cells (small scale)
293 sejteket növesztünk összefolyásig 6-lyukú lemezeken. 25 gg t-PA plazmid DNS mutánst feloldunk 150 μΐ oldatban, amely 1 mM Tris.HCl-t, 0,1 mM EDTA-t és 0,227 M kalcium-kloridot tartalmaz. Ehhez cseppenként hozzáadunk (míg vortexeljük) 150 μΐ 50 mM HEPESpuffert (pH 7,35), 280 mM NaCl-ot, 1,5 mM NaPO4-ot és a csapadékot 10 percig 25 °C hőmérsékleten hagyjuk megképződni. A szuszpendált csapadékot ezután hozzáadjuk a 6-lyukú lemezen lévő egyes sejtekhez, és 4 órán át inkubátorban hagyjuk leülepedni. A tápközeget ezután leszívjuk és 1 ml 20%-os glicerint (PBS-ben) adunk hozzá 30 másodperc alatt. A sejteket kétszer mossuk, először 3 ml, majd 1 ml szérum-mentes tápközeggel. Ezután 3 ml friss tápközeget adunk hozzá és a sejteket 5 napon át inkubáljuk. A tápközeget ezután összegyűjtjük és megvizsgáljuk.293 cells were grown to confluency in 6-well plates. 25 µg of the plasmid DNA mutant t-PA were dissolved in 150 μΐ containing 1 mM Tris.HCl, 0.1 mM EDTA and 0.227 M calcium chloride. To this was added dropwise (while vortexing) 150 μΐ 50 mM HEPES buffer (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO 4 and the precipitate was allowed to form for 10 minutes at 25 ° C. The suspended pellet was then added to each cell on a 6-well plate and allowed to settle in an incubator for 4 hours. The medium is then aspirated and 1 ml of 20% glycerol (in PBS) is added over 30 seconds. The cells were washed twice, first with 3 ml and then with 1 ml serum-free medium. Thereafter, 3 ml of fresh medium was added and the cells were incubated for 5 days. The medium is then collected and assayed.
Amikor egyláncú t-PA a kívánt termék, az eljárást a fent leírtak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy plazminogénben kimerült szérumot alkalmazunk a sejtek növesztési fázisában.When single chain t-PA is the desired product, the procedure is carried out as described above, except that plasminogen depleted serum is used in the cell growth phase.
5. Humán embrionális 293 vesesejtek transzfekciója (nagyléptékű)5. Transfection of human embryonic 293 kidney cells (large-scale)
A nagy mennyiségek előállításához használatosUsed to produce large quantities
K296A,H297-A,R298A,R299A variáns nagyléptékű tisztításához azt a transzfekciós eljárást alkalmazzuk, amely a Current Protocols in Molecular Biology című szakkönyvből megismerhető /szerkesztők: Ausubel és mtsai; kiadó: Wiley Intersciensce (1988)/ és ezt részben módosítottuk az alábbiak szerint. Humán embrió 293 vesesejtek szuszpenzióját növesztjük egy sejttenyésztő tápközegben és üledékképzéssel koncentráljuk. Az üledéket újraszuszpendáljuk kb. 108 sejt/milliliter koncentrációra és a sejteket szérum-mentes tápközeggel mossuk, amíg szükséges. DNS-dextrán oldatot adunk hozzá 250 μg DNS/500 ml sejtkoncentrációban, és ezt a keveréket enyhe rázatás mellett 37 °C-on inkubáljuk 90 percig. DMSO-t adunk hozzá 10% végkoncentrációig, majd kb. 2 perc múlva friss tápközeget adunk hozzá, hogy a sejteket kb. 106/milliliter koncentrációra hígítsuk. A sejteket ezután 7 napon keresztül inkubáljuk, majd a felülúszókat összegyűjtjük.For large-scale purification of K296A, H297-A, R298A, R299A, the transfection procedure known from Current Protocols in Molecular Biology is edited by Ausubel et al; published by Wiley Intersciensce (1988) / and modified in part as follows. A suspension of human embryonic kidney cells 293 is grown in a cell culture medium and concentrated by pellet formation. The pellet was resuspended for approx. 10 8 cells / ml and the cells are washed with serum-free medium until necessary. DNA dextran solution was added at a concentration of 250 μg DNA / 500 ml cell and incubated for 90 minutes at 37 ° C with gentle shaking. DMSO was added to a final concentration of 10% and then ca. After 2 minutes, fresh medium was added to allow the cells to grow for approx. Dilute to 10 6 / ml. The cells are then incubated for 7 days and the supernatants collected.
Ennek a mutánsnak a tisztítását úgy végezzük, hogy a felülúszót átvezetjük egy olyan oszlopon, amely anti-t-PA kecske poliklonális A6 antitesttel összekapcsolt üveggyöngyökből áll. Ezt az oszlopot előzőleg előkondicionáljuk PBS-sel. Miután a felülúszót felvittük, az oszlopot kiegyensúlyozzuk Tris-konyhasó-pufferrel /0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) és 1 M NaCl/. A t-PA variánst ezután eluáljuk 0,1 M ecetsavból, 0,15 M NaCl-ból, 0,02 M argininból és 0,01% Tween 80-ból álló oldattal. A frakciókat azonnal semlegesítjük Triszbázissal és 0,01 Tween 80 koncentrációra állítjuk be.Purification of this mutant is accomplished by passing the supernatant through a column consisting of glass beads coupled with anti-t-PA goat polyclonal antibody A6. This column was pre-conditioned with PBS. After loading the supernatant, the column was equilibrated with Tris-saline buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 7.5) and 1 M NaCl. The t-PA variant is then eluted with a solution of 0.1 M acetic acid, 0.15 M NaCl, 0.02 M arginine, and 0.01% Tween 80. Fractions were immediately neutralized with Trisbase and adjusted to 0.01 Tween 80.
6. Biológiai vizsgálatok6. Biological studies
A. A t-PA mennyiségi meghatározásaA. Quantification of t-PA
A sejttenyészet-felülúszókban lévő t-PA mennyiségét ELISA eljárással határozzuk meg, vad-típusú t-PA ellen termelt poliklonális antitestek felhasználásával.The amount of t-PA in cell culture supernatants was determined by ELISA using polyclonal antibodies raised against wild-type t-PA.
B. S-2288 vizsgálatB. Test S-2288
Az S-2288 vizsgálatot arra használjuk, hogy mérjük a mutánsok proteolitikus aktivitását mind az egyláncú, mind a kétláncú formában. Ez a vizsgálat a t-PA proteolitikus aktivitásának direkt vizsgálata; a t-PA elhasítja a kis peptid és a paranitro-anilid kromofór közötti kötést.Assay S-2288 is used to measure the proteolytic activity of the mutants in both single-chain and double-chain forms. This assay is a direct study of the proteolytic activity of t-PA; t-PA cleaves the bond between the small peptide and the paranitroanilide chromophore.
Standard-görbe mintákat állítunk elő oly módon, hogy a vad-típusú rt-PA-t hígítjuk a sejttenyészet tápközegével. A standard-görbe mintákat és az rt-PA mutáns mintákat adjuk a mikrotiter-lemezek mélyedéseihez. Ha a vizsgálatot a kétláncú rt-PA aktivitásának mérésére alkalmazzuk, egy humán plazminnal végzett inkubációs lépés is beletartozik az eljárásba. A humán plazmint (Kabi Vitrum) 0,13 CU (kazein egység)/mlStandard curve samples were prepared by diluting wild-type rt-PA with cell culture medium. Standard curve samples and rt-PA mutant samples are added to the wells of the microtiter plates. If the assay is used to measure the activity of b-chain rt-PA, an incubation step with human plasmin is also included. Human plasmin (Kabi Vitrum) is 0.13 CU (unit casein) / ml
HU 210 541 A9 végkoncentrációig adagoljuk. A mintákat 90 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Amikor a mintákat egyláncú formában mérjük, a plazmin-oldatot PBS-sel helyettesítjük és a 90 perces inkubálást elhagyjuk.EN 210 541 A9 is added to a final concentration. Samples were incubated for 90 minutes at room temperature. When samples are measured in single-chain form, the plasmin solution is replaced with PBS and the 90-minute incubation is omitted.
Ezután aprotinint /Sigma, körülbelül 14 TIU (tripszin inhibitor egység/mg) adunk a plazmin-aktivitás gátlására, és a mintákat szobahőmérsékleten 15 percig inkubáljuk. Az S-2288-nak 2,16 M oldatát hígítjukAprotinin / Sigma, approximately 14 TIU (trypsin inhibitor units / mg) is then added to inhibit plasmin activity and the samples are incubated at room temperature for 15 minutes. A 2.16 M solution of S-2288 was diluted
1,45 m M-ra azzal az oldattal, amely 0,1 M Tris-t, 0,106 mM NaCl-ot, 0,02% nátrium-azidot (pH 8,4) tartalmaz, és az így kapott oldat 100 μΐ-ét adjuk a mikrotiter-lemezek minden egyes mélyedésébe (végső térfogat az egyes mélyedésekben 200 μΐ). A szín kifejlődését 405 nm-nél figyeljük meg. Meghatározzuk az abszorbancia-idő függvénygörbe meredekségét az egyes standardoknál és mintáknál. Standard-görbét veszünk fel az rt-PA standardokra meghatározva az abszorbancia-idő görbe meredekségét mint az rt-PA aktivitásának egy funkcióját. Ezután a mutánsok relatív aktivitás-koncentrációit határozzuk meg a standard görbéből. Az egyes mutánsok aktivitás-koncentrációját elosztjuk az rt-PA ELISA-val kapott mutáns-koncentráció értékkel, és az így kapott fajlagos aktivitást a vad-típusú t-PA-hoz viszonyítva fejezzük ki, amelynek az 1,0 értéket adjuk.1.45 m M with a solution of 0.1 M Tris, 0.106 mM NaCl, 0.02% sodium azide (pH 8.4) and 100 μΐ of the solution thus obtained. Add to each well of the microtiter plates (final volume in each well is 200 μΐ). The color development is observed at 405 nm. Determine the slope of the absorbance-time curve for each standard and sample. A standard curve is plotted against rt-PA standards, defining the slope of the absorbance time curve as a function of rt-PA activity. The relative activity concentrations of the mutants are then determined from the standard curve. The activity concentration of each mutant is divided by the mutant concentration obtained by the rt-PA ELISA and the resulting specific activity is expressed relative to wild-type t-PA, which is given as 1.0.
Az I. táblázatban az adatok két vizsgálat átlagai és a vad-típusú rt-PA-ra vonatkoztatott realtív aktivitásként vannak megadva. Az eredmények azt mutatják, hogy az összes bemutatott mutánsnál a kétláncú forma aktívabb (legalább 1,5-szer, de egyes esetekben közel 60szor), mint az egyláncú forma, a vad-típusú rt-PA-hoz viszonyítva, jelezve, hogy ezen mutánsok mindegyike zimogénnek tekinthető ebben a vizsgálatban.The data in Table I are the mean of two assays and the real activity relative to wild-type rt-PA. The results show that the two-chain form is more active (at least 1.5-fold but in some cases nearly 60-fold) than the single-chain form compared to wild-type rt-PA in all mutants shown, indicating that these mutants all of which are considered zymogens in this study.
/. táblázat/. spreadsheet
C. S-2251 vizsgálatC. Test S-2251
Ez a vizsgálat a t-PA aktivitás közvetett vizsgálata. Ebben a vizsgálatban a plazminogén átalakul plazminná a t-PA tevékenysége révén, a plazmin pedig azThis assay is an indirect assay for t-PA activity. In this assay, plasminogen is converted to plasmin by t-PA activity and plasmin is converted to plasmin
S-2251 szubsztrátot hasítja úgy, hogy felszabadul a paranitro-analid kromofór. Ennek a kromofómak a keletkezését mérjük az idő függvényében.It cleaves substrate S-2251 to release the paranitro-analyte chromophore. The production of this chromophore is measured as a function of time.
1. Fibrinstimulált S-2251 vizsgálat1. Fibrin stimulated S-2251 assay
Standard-görbe mintákat készítünk oly módon, ahogyan azt az S-2288 vizsgálatnál leírtuk. A kétláncú formában vizsgált mintákat plazmin-Sepharose-zal inkubáljuk. A plazmin-Sepharose-t úgy állítjuk elő, hogy összekapcsolunk kb. 20,8 CU humán plazmint (Kabi Vitrum) 1 ml cianogén-bromiddal aktivált Sepharosezal (Pharmacia). A plazmin-Segharose-t (50 μΐ 5%-os zagyban) rázatás közben 90 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten a minta 150 μΐ-ével. Ezt követően a gyantát centrifugálással eltávolítjuk és a mintából 10 μΐ-t adunk egy mikrotiter-lemez mélyedéseibe.Standard curve samples were prepared as described for S-2288. Samples tested in double-chain form were incubated with plasmin-Sepharose. Plasmin Sepharose is prepared by coupling approx. 20.8 CU of human plasmin (Kabi Vitrum) in 1 ml of cyanogen bromide activated Sepharose (Pharmacia). Plasmin-Segharose (50 μΐ in 5% slurry) was incubated for 90 minutes at room temperature with 150 μΐ of the sample. Subsequently, the resin was removed by centrifugation and 10 μΐ of the sample was added to the wells of a microtiter plate.
Az egyláncú formában vizsgált mintáknál 50 μΐ sejttenyészet tápközeget adunk a gyanta helyett, és az inkubálási lépést elhagyjuk. Az egyes mélyedésekhez humán trombint adunk (10 μΐ-t egy 42 egység/ml-es oldatból). Az egyes mélyedésekben a reakciót úgy indítjuk be, hogy az alábbi összetételű koktélt (130 μΐ) adjuk hozzá: 28 μΐ humán Glu-plazminogén (5,3 μΜ), 10 μΐ plazminogénmentes humán fibrinogén (10 μΜ), 30 μΐ S-2251 (3 mM, KabiVitrum) és 62 μΐ PBS. A szín kifejlődését 405 nmnél követjük, és a 492 nm referencia hullámhossznál mért abszorbanciát minden pontnál kivonjuk. Az abszorbancia - (idő) görbe meredekségét meghatározzuk minden egyes standardnál és minden mutáns mintánál. Egy standard görbét úgy készítünk el, hogy az abszorbancia (idő) görbe meredekségét az rt-PA koncentráció függvényében ábrázoljuk az rt-PA standardoknál. A relatív fajlagos aktivitás meghatározását a mutánsoknál az S-2288 vizsgálatnál már leírtuk.For single-stranded samples, 50 μΐ cell culture medium was added instead of resin and the incubation step was omitted. To each well was added human thrombin (10 μΐ from a 42 unit / ml solution). In each well, the reaction is initiated by adding the following cocktail (130 μΐ): 28 μΐ human Glu-plasminogen (5.3 μΜ), 10 μΐ plasminogen-free human fibrinogen (10 μΜ), 30 μΐ S-2251 ( 3 mM, KabiVitrum) and 62 μΐ PBS. Color development is monitored at 405 nm and the absorbance at 492 nm is subtracted at each point. The slope of the absorbance (time) curve is determined for each standard and for each mutant sample. A standard curve is constructed by plotting the slope of the absorbance (time) curve as a function of rt-PA concentration for rt-PA standards. The determination of the relative specific activity of the mutants has already been described in assay S-2288.
2. Fibrinogénstimulált S-2251 vizsgálat2. Fibrinogen stimulated S-2251 assay
A vizsgálatot ugyanúgy végezzük, mint ahogyan azt a fibrin-stimulált S-2251 vizsgálatnál leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a trombint PBS helyettesíti.The assay is performed as described for the fibrin-stimulated S-2251 assay, except that thrombin is replaced by PBS.
3. Plazma vérrög S-2251 vizsgálat3. Plasma Clot S-2251 Test
A standard-görbe minta előállítását és az egyláncú rt-PA átalakítását kétláncú rt-PA-vá plazmin-Sepharose alkalmazásával ugyanúgy végezzük, mint azt a fibrinnel stimulált S-2251 vizsgálatnál már leírtuk. Humán trombint adunk (10 μΐ-t egy 31 μg/ml-es oldatból) a mikrotiter lemez minden egyes mélyedéshez. A standard és mutáns mintákat hozzáadjuk a lemezhez, és a reakciót beindítjuk 90 pl citromsavas glükózos humán plazma és 10 μΐ 9,1 mM S-2251 (Kabi Vitrum) elegyéből 100 μΐ-nek a hozzáadásával. A szín kifejlődését 405 nm-nél mérjük és a 492 nm referencia hullámhossznál mért abszorbanciát mindegyik időpontnál kivonjuk. Az adatok elemzését a fibrin-stimulált S-2251 vizsgálatnál már leírtuk,Preparation of the standard curve sample and conversion of single-stranded rt-PA to double-stranded rt-PA using plasmin-Sepharose was performed as described previously for the fibrin-stimulated S-2251 assay. Human thrombin (10 μΐ from a 31 μg / ml solution) was added to each well of the microtiter plate. Standard and mutant samples are added to the plate and the reaction is initiated by the addition of 90 µl of a mixture of 90 µl citric acid glucose in human plasma and 10 µl of 9.1 mM S-2251 (Kabi Vitrum). Color development is measured at 405 nm and the absorbance at 492 nm is subtracted at each time point. Data analysis has already been described for the fibrin-stimulated S-2251 assay,
4. Plazma S-2251 vizsgálat4. Plasma S-2251 examination
Ezt a vizsgálatot ugyanúgy végezzük, mint ahogyan azt a plazma vérrög S-2251 vizsgálatnál leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy PBS-sel helyettesítjük a trombint.This assay was performed as described for the plasma clot S-2251 except that thrombin was substituted for PBS.
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
A mutánsokat a zimogén tulajdonságokra fibrinfüggő és plazma vérrög-függő assay-kben vizsgáljuk, és a kapott eredményeket - a vad-típushoz viszonyítva - a Π. és III. táblázatban mutatjuk be. Az egyláncú formában lévő mutánsoknál az értékek két meghatározás átlagai. A kétláncú formájú mutánsokra megadott értékek négy meghatározás átlagai.Mutants for zymogenicity were assayed in fibrin-dependent and plasma clot-dependent assays, and the results obtained were compared to wild-type Π. and III. is shown in Table. For single-chain mutants, values are the average of two determinations. The values given for the two-chain mutants are the average of four determinations.
II. táblázatII. spreadsheet
III. táblázatIII. spreadsheet
ND = nem határoztuk megND = not determined
Az I-HI. táblázatokban lévő adatok összefoglalását az alábbi IV. táblázatban adjuk meg, megjelölve, hogy az egyes mutánsok mely vizsgálatban mutatnak zimogenicitást.It's I-HI. See Table IV below. Table I below indicates which assays each mutant exhibits zymogenicity.
IV. táblázatARC. spreadsheet
A IV. táblázatban felsorolt zimogén t-PA-kat S2251 fibrin specifikus vizsgálatban elemezzük mind egyláncú, mind kétláncú formában. Az egyláncú és kétláncú t-PA variánsoknál kapott eredményeket az V. illetve VI. táblázat mutatja be.The IV. The zymogenic t-PAs listed in Table II are analyzed in the S2251 fibrin-specific assay in both single-chain and double-chain forms. The results for the single-chain and two-chain t-PA variants are shown in Figs. Table.
Az V. és VI. táblázat adatainak összegezését a VII. táblázat adja meg. Látható, hogy a IV. táblázatban szereplő zimogén rt-PA-k mindegyike fibrin- és/vagy plazmavérrög specifikus a vad-típusú t-PA-hoz viszonyítva. Az X azt jelenti, hogy a fibrin-fibrinogén vagy plazmavérrög-plazma arány 1,5-nél nagyobb S-2251 vizsgálattal mérve és az V. és VI. táblázatban megadtuk.Articles V and VI Table VII summarizes the data in Table VII. table. It can be seen that the IV. Each of the zymogenic rt-PAs in Table 1A is specific for fibrin and / or plasma clot relative to wild-type t-PA. X means that the fibrin-fibrinogen or plasma clot-to-plasma ratio is greater than 1.5 in the S-2251 assay and is determined in accordance with Sections V and VI. in Table.
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
V táblázatTable V.
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
Fg = FibrinogénFg = Fibrinogen
Fb = FibrinFb = Fibrin
Pl = PlazmaPl = Plasma
PC = Plazma-vérrögPC = Plasma Clot
Átl = ÁtlagAvg = Avg
SD = Standard eltérésSD = Standard deviation
VI. táblázatVI. spreadsheet
Az rt-PA VARIÁNSOK (KÉTLÁNCÚ) FIBRIN- ÉS PLAZMA-VÉRRÖG FAJLAGOSSÁGA Az aktivitások a vad-típusú rt-PA-hoz vannak viszonyítva (ahol a vad-típus 1,0)Specificity of rt-PA Variants (DUPLEX) FIBRIN AND PLASMA BLOOD The activities are relative to wild type rt-PA (where wild type is 1.0)
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
Az rt-PA VARIÁNSOK (KÉTLÁNCÚ) FIBRIN- ÉS PLAZMA-VÉRRÖG FAJLAGOSSÁGA Az aktivitások a vad-típusú rt-PA-hoz vannak viszonyítva (ahol a vad-típus 1,0)Specificity of rt-PA Variants (DUPLEX) FIBRIN AND PLASMA BLOOD The activities are relative to wild type rt-PA (where wild type is 1.0)
Fg = FibrinogénFg = Fibrinogen
Fb - FibrinFb - Fibrin
Pl = PlazmaPl = Plasma
PC = Plazma-vérrögPC = Plasma Clot
Átl = ÁtlagAvg = Avg
SD = Standard eltérésSD = Standard deviation
VII. táblázatVII. spreadsheet
HU 210 541 A9HU 210 541 A9
Szoros korreláció van azok között az rt-PA variánsok között, amelyek fibrin és/vagy plazma-vérrög fajlagosságot mutatnak és azok között, amelyek kimentik a zimogenicitás fentebb meghatározott fogalmát. Ezen kívül két rtPA variánsról úgy találtuk, hogy fibrin-specifikus, de nem zimogén a vad-típusú rt-PA-hoz viszonyítva. A VIII. táblázat bemutatja a fibrin-specifikus és plazmavérrög-specifikus variánsokra vonatkozó S-2251 vizsgálat adatait.There is a strong correlation between the rt-PA variants that exhibit fibrin and / or plasma clot specificity and those that exemplify the concept of zymogenicity as defined above. In addition, two rtPA variants were found to be fibrin-specific but not zymogenic compared to wild-type rt-PA. VIII. Table 5 presents data for the S-2251 assay for fibrin-specific and plasma-clot specific variants.
Vili. táblázatVili. spreadsheet
FIBRIN- ÉS PLAZMA-VÉRRÖG-SPECIFIKUS, NEM-ZIMOGÉN rt-PA VARIÁNSOKFIBRIN AND PLASMA BLOOD-SPECIFIC, NON-ZIMOGENE Rt-PA VARIATIONS
Fg = Fibrinogén Fb = Fibrin Pl = Plazma PC = Plazma-vérrög lch = egyláncú 2ch = kétláncú Átl = Átlag SD = Standard eltérésFg = Fibrinogen Fb = Fibrin P1 = Plasma PC = Plasma Clot lch = single chain 2ch = double chain Avg = Mean SD = Standard deviation
Az anyagok letétbe helyezéseDeposit of materials
Az alábbi tenyészetet deponáltuk az American TypeThe following culture was deposited with American Type
Culture Collection-nál (ATCC; 12301 Parklawn Drive, 50 Rockville, Maryland, USA):Culture Collection (ATCC; 12301 Parklawn Drive, 50 Rockville, Maryland, USA):
Ez a letétbe helyezés A mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezésének 60 nemzetközi elismeréséről szóló Budapesti Szerződés és annak végrehajtási szabályzata (Budapesti Szerződés) előírásai szerint történt. Ez biztosítja egy élő tenyészet fenntartását a letétbe helyezés napjától számítva 30 évig. Az organizmust az ATCC a Budapesti Szerződés szabályai szerint bocsátja rendelkezésre, és tárgya egy Genentech és ATCC közötti szerződésnek, mely a tenyészet leoltott származékainak állandó és korlátlan hozzáférhetőségét biztosítja a köz számára a vonatkozó USA-beli szabadalom megadásától vagy bármely USA-beli vagy külföldi szabadalmi bejelentés nyilvánosságra hozatalától kezdve - a korábbi időpont számít - és biztosítja a tenyészet leoltott származékai25This deposit was made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and its Implementing Rules (the Budapest Treaty). This ensures the maintenance of a live breeding stock for 30 years from the date of deposit. The organism is provided by the ATCC in accordance with the rules of the Budapest Treaty and is the subject of a contract between Genentech and the ATCC providing permanent and unrestricted access to the inoculated culture derivative from the grant of the relevant US patent or any US or foreign patent application. from the date of publication, the earliest date to be taken into account, and to provide for inoculated derivatives of the culture25
HU 210 541 A9 nak hozzáférhetőségét egy olyan személy számára, akit az Amerikai Egyesült Államok Szabadalmi és Védjegy Hivatalának Elnöke erre kijelöl és felhatalmaz a 35 USC 122 &-a és az ennek megfelelő elnöki rendelet alapján (beleértve a CFR Section 1.14 &-t, különös tekintettel a 886 OG 638 rendeletre).EN 210,541 A9 to a person designated and authorized by the President of the United States Patent and Trademark Office pursuant to 35 USC 122 & and the corresponding presidential decree (including CFR Section 1.14 & having regard to Decree 886 OG 638).
A jelen találmány bejelentője vállalja, hogy ha a deponált tenyészet kipusztulna, elveszne vagy elpusztulna annak ellenére, hogy megfelelő körülmények között történt a tenyésztés, akkor azt azonnal pótolja egy azonos tenyészet életképes képviselőjével az értesítést követően. A deponált törzs hozzáférhetősége nem tekinthető licencként a találmány gyakorlatba vételére bármely kormány szabadalmi törvényeivel összhangban álló, a joghatósága alatt engedélyezett jogokkal szemben.Applicant of the present invention undertakes to immediately replace the deposited culture with a viable representative of the same culture, after notification, if the culture is destroyed, lost or destroyed despite being cultivated under appropriate conditions. The availability of the deposited strain shall not be construed as a license for the practice of the invention in respect of rights granted under its jurisdiction in accordance with any government patent law.
A fentiekben leírtakat elégségeseknek tekintjük ahhoz, hogy a találmányt a szakember megvalósítsa. A jelen találmány nem korlátozódik a deponált szerkezet által meghatározott oltalmi körre, mivel a deponált előnyös kiviteli alak csak egyetlen illusztrációként szolgál a találmány egyik tárgyához, és bármely konstrukció, amely funkcionálisan ekvivalens ezzel, a találmány oltalmi körén belül van. Az anyagnak a letétbe helyezése nem jogosít fel arra, hogy a leírásban foglaltak ne legyenek elegendők a találmány bármely tárgyának a megvalósításához, beleértve a legjobb megoldást, nem értelmezhető az oltalmi kör korlátozásaként sem arra a specifikus példára, amelyet reprezentál. Az itt leírt és bemutatott példákon kívül a találmánynak számos módosítása létezhet, amely az előzőkben leírtakból a szakember számára nyilvánvaló, és ezek is a találmány oltalmi körén belül vannak.The foregoing is considered sufficient to enable the practitioner to carry out the invention. The present invention is not limited to the scope defined by the deposited structure, since the preferred embodiment of the deposited is only one illustration of an object of the invention, and any construct which is functionally equivalent thereto is within the scope of the invention. The deposit of the material does not justify that the description herein is not sufficient to accomplish any object of the invention, including the best solution, nor should it be construed as limiting the scope of the specific example it represents. In addition to the examples described and illustrated herein, many modifications of the invention may be apparent to those skilled in the art and are within the scope of the invention.
SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS
Claims (14)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU9400022P HU210541A9 (en) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, dna molecules encoding them, vectors, and host cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU9400022P HU210541A9 (en) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, dna molecules encoding them, vectors, and host cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU210541A9 true HU210541A9 (en) | 1995-05-29 |
Family
ID=10984372
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9400022P HU210541A9 (en) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, dna molecules encoding them, vectors, and host cells |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
HU (1) | HU210541A9 (en) |
-
1994
- 1994-09-01 HU HU9400022P patent/HU210541A9/en unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU626323B2 (en) | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties | |
US5821105A (en) | Tissue plasminogen activator having zymognic or fibrin specific properties | |
US5385732A (en) | Variants of tissue plasminogen activator, compositions and methods of use for same | |
US5338546A (en) | Tissue plasminogen activator variants with decreased clearance | |
JP2928798B2 (en) | Variant of plasminogen activator and method for producing the same | |
US5258180A (en) | Tissue plasminogen activator having fibrin specific properties and deletion of amino acids 466-970, compositions and methods of treatment | |
US5714145A (en) | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties | |
AU642984B2 (en) | Tissue plaminogen activator having fibrin specific properties | |
EP0542869B1 (en) | Tissue plasminogen activator variants with decreased clearance | |
JP3696617B2 (en) | T-PA substitution mutants with improved fibrin specificity | |
US5736134A (en) | Tissue plasminogen activator variants | |
HU210541A9 (en) | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, dna molecules encoding them, vectors, and host cells | |
AU670774B2 (en) | Novel tissue plasminogen activator variants | |
EP0563280B1 (en) | Tissue plasminogen activator substitution variant | |
US5756093A (en) | Tissue plasminogen activator variants | |
HU210529A9 (en) | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |