JPH0249471B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

生理学的または非生理学的の何れかの、対象と
する広範囲の化合物を、定性的または定量的の何
れかで分析するための便利であり且つ感度の高い
方法を開発しようとする努力が増大している。こ
れらの化合物の多くはハプテン性で、しばしば薬
剤であり且つ哺乳動物の処置において測定され
る。その他の化合物は、たとえば自家抗体及び新
生細胞に対する表面抗原のような異常機能の診断
のために用いられる天然に存する化合物である。
その他の分析は、特に特異な表面抗原によつて証
明されるような、微生物の存在に関するものであ
る。 分析対象物の本性及びその源泉に依存して、分
析の本質が影響を受けることがある。分析対象物
を純粋な状態で取得することができない場合に
は、分析対象物の不純な混合物の標識付けが相当
な量の背景信号をもたらすことがある。大部分の
場合に、単分枝系の抗体のほかは、抗血清は抗体
の複合混合物である。不均一な抗血清の標識付け
もまた、大きな背景信号を与える可能性がある。
その他の考慮としては、試料中の天然起源の物質
による妨害、操作上の便宜、分析対象物の興味の
範囲における濃度の変動に対する感度、使用でき
る装置などがある。 感度と信頼性の増大に対する要望が高まるにつ
れて、新しい試薬を用いる新しい分析方法が求め
られてきた。新しい改良は何れも、過去の経験に
照らしてかろうじて遂行されているのみである。
分析対象物の存在によつて生じる信号を増幅する
ための手段が感度を高めるための一方策となつて
いる。これらの分析の多くは酵素または螢光体に
依存しているが、それは、これらがもたらす多く
の利点のためである。螢光体においては、分析対
象物の各分子に関連して多数の螢光体分子を変調
させることができることが望ましい。 1979年４月９日出願の米国特許願第28640号は
競争的蛋白質結合分析における補集剤としての木
炭の使用を開示している。米国特許第3853987号
は競争的蛋白質結合分析における螢光粒子につい
て述べている。米国特許第3900558号は分析にお
ける乳腺細胞による螢光剤分子の吸収を記してい
る。米国特許第4061466号は分析におけ取り込み
試薬としてのゲル粒子の使用を記している。米国
特許第4102990号は特異的結合錯体によつて相互
に結合する異なる電気泳動性を有する粒子の分析
における使用を記している。米国特許第4138213
号は分析における粒子凝集反応に対する類リウマ
チ因子とClqの使用を述べている。特許願第
964099号は68頁において、フルオレセイン含有粒
子に入り込むことを抑制する消光剤としての木炭
を記している。 本発明は、官能化した螢光粒子及び特異的な非
共有結合によつて螢光粒子に接近するとき、螢光
信号の相当な部分を消光することができる官能化
したエネルギー吸収粒子を用いる分析対象物の測
定方法に関するものである。特に、結合対の構成
員を螢光粒子と吸収体粒子に結合させることによ
つて、やはり特異的結合対の構成員である分析対
象物の測定のための試薬を提供する。官能化した
各粒子を分析対象物の存在において分析媒体中で
混合すると螢光粒子に近接するに至るエネルギー
吸収粒子の数は媒体中の分析対象物の量に関連す
る。 螢光粒子に接近したエネルギー吸収粒子の存在
は、螢光粒子からの螢光の実質的な減少を生じさ
せ、その結果、観測される螢光信号は媒体中の分
析対象物の量の僅かな変化に関連して著るしく変
化する。 簡単、高感度で且つ正確な、低濃度の広く異な
る有機物質の定量方法を提供する。これらの有機
物質としては、たとえば薬剤、合成または天然に
存在する、細胞及びビールスを包含する疾病関連
物質のような生理学的活性を有するもの、並び
に、たとえば汚染物、公害物質、化学処理不純物
などのような、その他の物質が含まれる。本発明
の方法は、特異的結合対の補完対構成員に結合し
た特異的結合対の構成員結合標識及び結合してお
らず溶液中で自由に拡散できる特異的結合対の構
成員結合標識の間の分離工程を必要としないとい
う点で、“均一”分析と呼ばれる部類のものであ
る。（特異的結合対の構成員については後に定義
する）。本発明は分析対象物の濃度きわめて僅か
な相違によつて信号の多大の変化を観測すること
ができるという点で、高度の増幅を提供する。 本発明の方法は、特異的結合対構成員の不純混
合物に関する場合にも、多大の利益を提供する。
多くの場合に、対象とする分析物及び／またはそ
の特異的結合相手または摂受体は、混合物の約50
％未満で存在する。しばしば、精製は固難であり
且つ時には不可能であり、そのために不純な混合
物を取り扱わねばならない。多くの分析におい
て、分析対象物または摂受体の何れかに標識付け
する必要があり、その結果標識の多くが特異的結
合対の構成員以外の成分上に存在する可能性があ
る。分析媒体中の汚染標識の存在は、変調を受け
ないが、非特異的な影響を受けるおそれのある背
景信号をもたらす。背景信号は分析対象物の定量
の多大の誤差を与え、分析対象物の濃度の変化へ
の対応を低下させ且つ間違つた結果の発生率を増
大させる。 本発明において、多数の特異的結合対の構成員
を結合させることができ且つ特異的結合相手の結
合によつて試薬を相互に結合させるときに実質的
な信号を変調を与える、分散可能な粉末状試薬を
提供することによつて、上記の問題が軽減される
か、あるいは解決される。 第一の試薬は、それに対して特異的結合対を、
共有結合的にまたは非共有結合的にの何れかで、
結合させる螢光粒子である。特異的結合構成員の
不純な混合物からの複数の分子を結合させること
によつて、少なくとも１の特異的結合対構成員が
反応媒質中に存在する粒子のそれぞれの一つに結
合するということの十分に高い確率が存在する。
第二の試薬は、媒体中に存在する分析対象物の量
に比例して消光粒子の螢光粒子への結合をもたら
す特異的結合対の構成員をそれに結合させる、消
光粒子である。分析対象物の本質に依存して、螢
光粒子への消光粒子の結合を分析対象物によつて
抑制することができ、または、螢光粒子への消光
粒子の結合を分析対象物によつて達成することが
できる。 螢光粒子抱合体および消光抱含体は何れも分離
した不溶解粒子である。これらの粒子の性質は、
それらが分析媒体中に容易に分散することがで
き、それらの完全性を持続し、且つ特異的な結合
対構成員及び、若しあるならば、特異的結合構成
員を粒子に結合させる結合基による橋かけによつ
て相互に結合させるときに相互に作用して螢光信
号を変調するように選ぶ。 分析対象物は配位子及びその同族抱合体から成
る特異的結合対の構成員である。分析対象物を伴
なう特異的結合対の構成員の中の少なくとも一つ
は、直接的にまたは間接的に、共有結合的にまた
は非共有結合的に、２粒子の中の少なくとも一に
結合する。通常は、分析対象物を伴なう特異的結
合対の構成員のみが粒子への結合にかかわるので
あるが、分析対象物がその構成員となつている特
異的結合対の構成員以外のものが結合にかかわる
多くの情況が存在する。 本発明の方法の遂行に当つては、適当な分析媒
体中で分析対象物含有試料、螢光粒子抱合体、エ
ネルギー吸収または消光粒子抱合体、及び何らか
の付加的な試薬を混合して、分析媒体からの螢光
信号を測定する。観測した信号を既知量の分析対
象物を有する分析媒体から得た信号と比較するこ
とによつて、定性的に、半定量的にまたは定量的
に当該分析対象物を測定することができる。 定 義 分析対象物−測定すべき化合物または組成物を
いい、それはモノ−またはポリエピトピツク、抗
原性またはハプテン性である配位子、少なくとも
１共通エピトピツク部位を共有する単一または複
数の化合物、あるいは摂受体とすることができ
る。 特異的結合対−異なる２分子であつて、その中
の１分子は、表面上または空洞中に、他の分子ま
たは他の分子を伴なう分子錯体の特定の空間的及
び極性的機構に特異的に結合する区域を有してい
る。大部分の場合に対しては、特異的結合対の構
成員は配位子及び摂受体（抗配位体）と呼ばれ
る。特異的結合対の構成員には、免疫学的対の構
成員のみならば、錯体および抗錯体の構成員も包
含される。摂受体が２以上の分子の錯体にのみ結
合する場合には、配位子は錯体と呼ばれ且つ摂受
体は抗錯体と呼ばれる。 配位子−それに対する摂受体が天然に存在する
かまたは調製可能である化合物。 摂受体（抗配位子）−分子の特定の空間及び極
性組織、すなわち決定因子またはエピトピツク部
位を認識するとができる化合物または組成物。摂
受体の例としては、天然に存在する摂受体、たと
えばチロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、フ
アブ（Fab）断片、レクチンなどがある。 錯体−２以上の分子の非共有結合的に結合した
集合体であり、通常は配位子と抗配位子から成つ
ている。 抗錯体−その結合親和力が錯体の個々の構成員
に対するよりも錯体に対して実質的に高い場合
に、たとえば配位子と抗配位子から成る錯体に結
合することができる分子。 配位子類似体−摂受体に対して類似する配位子
と競争することができる修飾した配位子、修飾は
配位子類似体を別の分子に共有結合的に結合させ
るための手段を提供する。配位子類似体は通常
は、配位子とは、配位子類似体を中枢すなわち分
子につなぐ結合による水素の置換より以上に、異
なつている。 螢光粒子−水性の媒体中に容易に分散させるこ
とができ、特異的結合対の構成員をそれに安定に
結合させることができる、少なくとも約50nｍの
直径を有する固体不溶性粒子。大部分の場合に、
これらの固体は、特異的結合対の構成員に対して
非多孔性であり、螢光体の放射範囲の光に対して
少なくとも部分に透明であり且つエネルギー吸収
粒子に対する静電的吸引力はほとんど有していな
い。この粒子は螢光性であるか、または電磁放射
線によつてまたは化学的に活性化すると燐光性と
なる。 エネルギー吸収すなわち消光粒子−特異的結合
対の構成員間の特異的な結合によつて生じる距離
内で螢光粒子の螢光を消光することができる、少
なくとも約50nｍの直径を有する固体不溶性粒
子。消光粒子は螢光粒子と同一であつても異なつ
ていてもよいが、通常は異なるものである。通常
は、消光粒子は、距離を粒子の表面から測定し
て、約50Åよりも大、好ましくは約500Åよりも
大、更に好ましくは約2000Åよりも大の距離にお
いて実質的な消光を与える。 方 法 本発明の分析は、一般に最高の分析感度に近い
適度のPHの水性区域中で、分析成分または生成物
の分離なしに行なわれる。分析対象物の測定のた
めの分析区域は、通常は緩衝した適当な水性媒
体、前処理を施してあつてもよい未知の試料、螢
光粒子、消光粒子、並びに、必要に応じ、特異的
結合対の構成員またはそれらの類似体を用いるこ
とによつて、調製する。 未知試料中の分析対象物−配位子またはその類
似摂受体（抗配位子）−の存在は、消光粒子を螢
光粒子の消光距離内に持ちきたす螢光粒子と消光
粒子間の橋かけを変調する。実際には、分析対象
物は分析媒体中の消光粒子と螢光粒子の間の平均
距離に影響を及ぼして、螢光粒子の消光距離内に
ある消光粒子の数を変化させる。それ故、観測さ
れる信号は試料中の分析対象物の量に関連する。 分析の遂行に当つては、通常は水性の媒体を使
用する。他の極性溶媒、たとえばアルコール、エ
ーテルなどのような、１〜６、更に一般的には１
〜４の炭素原子から成る通常は酸素を有する有機
溶剤をも含有させることができる。通常はこれら
の共溶媒は、約40重量パーセント未満の量で存在
させる。 媒体に対するPHは通常は約４〜11の範囲、更に
一般的には約５〜10の範囲、好ましくは約6.5〜
9.5の範囲とする。PHは、信号発生効率を最高と
しながら摂受体による特異的な結合の有効な水準
を維持するように選ぶ。場合によつては、考慮す
べきこれらの両問題の間で歩み寄りが行なわれ
る。所望のPHを達成し且つ測定中のPHを維持する
ために種々の緩衝剤を用いてもよい。緩衝剤の例
としてはホウ酸塩、燐酸塩、炭酸塩、トリス、バ
ルビタールなどがある。使用する特定の緩衝剤は
本発明にとつて限定的ではないが、個々の分析に
おいて特定の緩衝剤が他のものよりも好適なこと
がある。 分析の遂行には適度の温度が、特に速度の測定
に対しては、測定時間にわたつて通常は一定の温
度として、用いられる、測定のための温度は一般
に約10〜50℃、更に普通には約15〜40℃の範囲で
ある。 分析することができる対象物の濃度は一般に約
10^-4〜10^-15M、更に一般的には約10^-6〜10^-13M
の範囲である。通常は、たとえば分析が定性、半
定量または定量の何れであるかということ、当該
検出方法及び対象とする分析物の濃度というよう
な条件によつて、他の試薬の濃度が決定される。 分析媒体中の種々の試薬の濃度は一般に分析対
象物について問題とする濃度範囲によつて決定さ
れるが、各試薬の最終濃度は通常は、関係する範
囲にわたつて分析の感度を最高とするように、経
験的に決定される。分析対象物に相反する特異的
結合対の構成員の全結合部位は、分析対象物結合
部位に基づいて興味ある最低濃度の約0.1倍以上
で且つ通常は分析対象物結合部位に基づいて興味
ある最大濃度の約100000倍以下、一般には約0.1
〜10000倍、更に一般的には約0.3〜100倍とする。
ここでいう濃度は有効な濃度、すなわち飽和濃度
を意味し、特異的結合対の構成員が同様に結合に
対して有効ではない場合には実際の濃度である必
要はない。 使用する試薬及び分析方法の本質は、存在させ
ることができる各試薬の量に影響する。分析媒体
中における消光粒子の量に対する重大な制限は、
消光粒子が螢光体の吸収及び／または発光帯で不
透明である場合に、分析媒体中に導入することが
できる光の量、及び分析媒体から放射させること
ができる光の量に対して不透明粒子が有する影響
である。一般に、不透明粒子の量は、螢光粒子へ
の不透明粒子の結合が存在しない場合に螢光粒子
から得られる螢光の約98％未満、好ましくは約75
％未満、更に好ましくは約40％未満の低下を与え
るにすぎないようにする。 競争を伴なう状況においては、通常は、分析対
象物に対する理論量よりも少ない１試薬が存在す
る場合に比較的高い感度が得られる。先ず１試薬
を分析対象物を含有すると思われる試料と混合し
且つその混合物を実質的に平衡に至らしめるとき
は、通常比較的小過剰の分析対象物が存在し、一
方、過剰の他の試薬が分析の感度に悪影響を及ぼ
すことがない。粒子は徐々にしか溶液中に拡散し
ない傾向があるから、分析に要する時間と分析に
おいて使用する試薬の量の間に釣合いが存在す
る。 螢光粒子への消光粒子の結合は、特異的結合対
の構成員が１粒子に結合し且つ特異的結合対の反
対の構成員が他の粒子に結合する結果として生ぜ
しめことができる。特異的結合対の反対構成員が
それに抱合する粒子と分析対象物を混合したの
ち、分析対象物またはその類似体が抱合する粒子
を、有効結合部位が分析対象物で満たされるまで
添加することによつて、両粒子の結合が抑制され
る。 粒子の一への分析対象物の結合は、二者択一的
に消光粒子の螢光粒子への結合をもたらすことが
できる。分析対象物が、たとえば抗原及び抗体に
おけるように、多価である場合は、特異的結合対
の反対の構成員が粒子に結合しているときに、分
析対象物は架橋として働らく。かくして、抗体が
分析対象物である場合に、抗原を螢光粒子と消光
粒子の両者に結合させることによつて、抗体は別
の粒子に結合した抗原分子間に橋をかけることが
できる。これは、抗体が同じ粒子と異なる粒子を
区別することができず、そのために螢光粒子同士
及び消光粒子同士の両方を結合することができる
という欠点を有している。同じ清況は、分析対象
物がその特異的結合対の構成員の類似体に関して
多価であるならば、分析対象物が抗原である場合
にもあてはまる。それ故、凝集反応を避けるため
に第一の粒子を理論値よりも少ない試料と混合す
ること、及び理論的に大過剰の第二の粒子を使用
することが好ましい。 二者択一的な方法は、１粒子に抗（抗配位子）
を結合させ且つ他の粒子に配位子を結合させるこ
とである。抗配位子を分析対象物とする場合に
は、試料を過剰の配位子抱合粒子と混合したの
ち、過剰の抗（抗配位子）抱合粒子を添加する。 抗（抗配位子）が抗配位子、たとえば蛋白質Ａ
または単分枝系抗体の単一の部位に結合する場合
には、抗配位子分析対象物を過剰の抗（抗配位
子）抱合粒子に加え、次いで配位子共役粒子を加
えればよい。 別の方法においては、抗原の異なるハプテン性
部位に対する特異性を有する抗配位子、１種の粒
子に抱合させた１特異性を有する抗配位子及び他
の種類の粒子に抱合させた他の特異性を有する抗
配位子を使用する。配位子は各ハプテン性部位を
一つだけ有していなければならない。どのような
添加の順序でもよく且つ両抱合体が過剰に存在し
ていてもよい。抗配位子の一つだけが単一の部位
に対して特異的である場合には、その抗配位子抱
合粒子を最初に加える。両粒子と共に使用する抗
配位子が複数の部位に結合する場合は、低濃度の
抗配位子抱合粒子の一つによる試料の限られた培
養とその後の過剰の他の抗配位子抱合粒子の添加
を用いればよい。 特定の組成物が抗原−抗体錯体を認識するが、
それ自体抗原または抗体に顕著に結合しない場合
には、更に別の方法を用いることができる。この
ような物質は、類リウマチ因子及びClgを包合す
る。この場合には、粒子の中のどちらかまたは両
方を、錯体を認識する１物質、抗錯体と抱合させ
る。両粒子を抗錯体と抱合させる場合には、粒
子、試料及び試料中の特異的結合対の構成員と逆
のその構成員を混合する。１粒子を抗錯体と抱合
させる場合には、他の粒子を抗原と抱合させ且つ
両粒子を抗原に対する抗体（摂受体）を含有する
試料と混合する。 ハプテンまたはモノエピトピツク分析対象物が
関係し且つ橋かけが望ましい場合には、中枢に共
有結合的に結合させた複数の単一エピトープを有
する分子を供給することができる。両粒子上にモ
ノエピトピツク分析対象物のための摂受体を有す
ることによつて、試料中に存在する分析対象物が
粒子上に存在する有効結合部位の一部分を満たす
ことができる。中枢結合エピトープを添加する
と、螢光粒子と消光粒子の間の結合の速度と量
は、粒子上に残る有効結合部位の量、従つて試料
中に存在する分析対象物の量に関係する。抗原に
おいても同種の系を用いることができ、その場合
に単分枝系抗体を使用する。抗原が独特の決定因
子部位を有し且つ抗体が１決定因子部位のみを認
識する限りにおいて、実際にモノエピトピツク分
析対象物 材 料 分析において使用する成分は螢光粒子抱合体、
不透明粒子抱合体、分析対象物、及び、たとえば
特異的結合対の構成員類あるいは多価構成員類な
どのような、適当な他の試薬である。試薬の調製
における使用においては、粒子またはビーズ、ま
たは特異的結合対構成員を使用する。 分析対象物 本発明の配位子分析対象物は、モノエピトピツ
クまたはポリエピトピツクであることによつて特
徴的である。ポリエピトピツク配位子分析対象物
は通常はポリ（アミノ酸）すなわちポリペプチド
及び蛋白質、多糖類、核酸、及びそれらの組合わ
せである。集合物のこのような組合わせは、細
菌、ビールス、染色体、遺伝子、糸状体、核、細
胞膜などである。 大部分の場合に対して、本発明において使用す
るポリエピトピツク配位子分析対象物は、少なく
とも約5000、更に普通には少なくとも約10000の
分子量を有している。ポリ（アミノ酸）の部類で
は、興味あるポリ（アミノ酸）は一般に約5000〜
5000000の分子量、より普通には約20000〜
1000000の分子量であり；興味あるホルモンにお
いては、分子量は通常は約5000〜60000の範囲で
ある。 類似の構造的特徴を有する蛋白質、特有の生物
学的機能を有する蛋白質、特定の微生物に関連す
る蛋白質、著るしく病原性の微生物などの族に関
しては、多様な蛋白質を考慮することができる。 以下のものは構造的に関連する蛋白質の部類で
ある： プロタミン ヒストン アルブミン グロブリン 硬蛋白質 燐蛋白質 粘性蛋白質 色素蛋白質 脂肪蛋白質 核蛋白質 糖蛋白質 プロテオグリカン 分類されない蛋白質、たとえばソマトトロピ
ン、プロラクチン、インシユリンペプシン ヒトの血漿中に存在する多くの蛋白質は臨床的
に重要であつて、以下のものが含まれる： プレアルブミン アルブミン α₁−脂肪蛋白質 α₁−酸性糖蛋白質 α₁−抗トリプトシン α₁−糖プロテイン トランスコルチン ４，6S−ポストアルブミン トリプトフアン欠乏α₁−糖蛋白質 α，Ｘ−糖蛋白質 チロキシン結合グロブリン インタ−α−トリプトシン抑制因子 Gc−グロブリン （Gc1−１） （Gc2−１） （Gc2−２） ハプトグロビン （Hp1−１） （Hp2−１） （Hp2−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α₂−脂肪蛋白質 ミオグロビン Ｃ−反応性蛋白質 α₂−マクログロブリン α₂−HS−糖蛋白質 Zn−α₂−糖蛋白質 α₂−ノイラミノ−糖蛋白質 エリトロポイチン β−脂肪蛋白質 トランスフエリン ヘモペキシン フイブリノゲン プラミノゲン β₂−糖蛋白質 β₂−糖蛋白質 免疫グロブリンＧ （IgG）またはγG−グロブリン 分子式： γ₂k₂またはγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ（IgA） またはγA−グロブリン 分子式： （α₂k₂）ⁿまたは（α₂λ₂）ⁿ 免疫グロブリンＭ （IgM）またはγM−グロブリン 分子式： （u₂k₂）⁵または（u₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ（IgD） またはγD−グロブリン（γD） 分子式： （δ₂k₂）または（δ₂λ₂） 免疫グロブリンＥ（IgE） またはγE−グロブリン（γE） 分子式： （ε₂k₂）または（ε₂λ₂） 遊離ｋ及びλ軽鎖 補体因子類： C′1 C′1q C′1r C′1s C′2 C′3 β₁A α₂D C′4 C′5 C′6 C′7 C′8 C′9 重要な凝血因子は以下のものを含む：

【表】 重要な蛋白質ホルモンは以下のものを含む： ペプチド及び蛋白質ホルモン 上皮小体ホルモン（パラトルモン） チロカルシトニン インシユリン グルカゴン レラキシン エリトロポイエチン メラントロピン （黒血球刺激ホルモン；インテルメジン） ソマトトロピン （成長ホルモン） コルチコトロピン （向副腎皮質性ホルモン） 向甲状腺ホルモン 卵胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン （間質細胞刺激ホルモン） 下垂体前葉催乳ホルモン （ルテオトロピン、プロラクチン） ゴナドトロピン （絨毛膜ゴナドトロピン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシン及び プラジキニン ヒトの胎盤のラクトジエン 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バソプレツシン 解放因子（RF） CRF、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、
GRF、FSH−RF、PIF、MIF 興味ある他の重合体材料は、ムコ多糖類及び多
糖類である微生物から由来する抗原性多糖類の例
は以下のとおりである：

【表】

〔Actinomyeetes（fungus−like bacteria）〕

牛放線菌（Actimomyces lsraelii） 午放線菌（A.bovis） ネスランジ菌（A.naeslundii） 好気抗酸性ノカルジア種（Nocardia
asteroides） ノカルジアブラジリエンシス（N.brasiliensis） スピロヘータ属（Spirochetes） 梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum） 小スピリルム（Spirillum minus） フランベジアトレポネーマ（T.pertunue） ヘーヴアリル熱（Streptobacillus moniliformis） ピンタトレポネーマ（T.carateum） オーベルマイエル回帰熱スピロヘータ （Borrelia recurrentis） 黄疸出血病レプトスピラ （Leptospira icterohemorrhagiae） 犬レプトスピラ（L.canicola） ミコプラズマ（Mycoplasma） ミコプラズマプニユーモニアエ （Mycoplasma pneumoniae） その他の病原体 単球症リステリア（Listeria monocytogenes） 豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae） ヘーヴアリル熱 鼠径肉芽腫菌（Donovania granulomatis） バチルス形バルトネラ （Bartonella bacillirormis） リケツチア属（細菌類似寄生虫） 発疹熱リケツチア（Rickettsia prowayekii） 発疹熱（R.mooseri） パイパー型リケツチア（R.rickettsii） コノリリケツチア（R.conori） オーストラリスリケツチア（R.australis） シビリクスリケツチア（R.sibiricus） リケツチア痘瘡（R.akari） ツツガムシリケツチア（R.tsutsugamushi） Ｑ熱リケツチア（R.brunetii） 暫壕熱（R.quintana） クラミジア（分類不能細菌性／ビールス性寄生
虫） クラミジア（Chlamydia）剤（名称不確実） カビ類 酵母症病原菌（Cryptococcus neoformans） 北アメリカ分芽菌の病原菌 （Blastomyces dermatidis） ヒストプラズマ症病原菌 （Histoplasma capsulatum） コクシジオイデス・イミチス （Coccidioides immitis） ブラジル・パラコクシジオイデス （Paracoccidioides brasiliensis） 鵞口瘡カンジダ 烟色麹菌ケムカビ（Aspergillus fumigatus） 傘状ケカビ（Mucor corymbifer）（アブシジア
コリンビフエラ）（Absidia corymbifera） オリザエクモノスカビ（Rhizopuo oryzae） アルヒズクモノスカビ（R.arrhizus） クモノスカビ（R.nigricans） 藻菌類 スポロトリコ−シス病原菌 （Sporotriehum schenkii） 疣状または潰瘍状糸状菌性皮膚症病原菌 （Fonsecaea pedrosoi） フオンセカエアコンパクタ（Fonsecaea
compacta） フオンセカエアデルマチジス（F.deramtidis） クラドスポリウムカリオニ（Cladosporium
carrionii） 色素分芽症病原菌（Phialophora verrucosa） 為巣性穀菌（Aspergillus nidulans） マズラ足放線菌（Madurella mycetomi） マズレラグリセア（Madurella grisea） 糸状菌腫病原菌（Allescheria boydii） フイアロスフオーラ ジアンセルメイ （Phialosphora jeanselmei） 石膏状小胞子菌（Microsporum gypseum） 毛瘡白癬菌（Trichophyton mentagrophytes） ケラチノマイセス アジエロイ （Keratinomyces ajelloi） 犬小胞子菌（Microsporum canis） 猩紅色白癬菌（Trichophyton rubrum） オーズアン小胞子菌（Microsporum audouinii） ビールス類 アデノビールス 発疹ビールス 単純疱疹（Herpes simplex） 水痘（Varicella）（Chicken pox） 帯状疱疹（Herpes zoster）（Shingles） ビールスＢ シトメガロビールス（Cytomegalovirus） 痘疹ビールス 痘瘡（Variola）（smallpox） ワクシニア症（Vaccinia） 牛痘疹ビールス（Poxvirus bovis） 変態痘（Paravaccinia） 伝染性軟属種（Molluscum contagiosum） ピコルナビールス（Picornavirus） 灰白炎ビールス（Poliovirus） コツクスサツキ−ビールス（Coxsackievirus） エコービールス（Echovirus） ライノビールス（Rhinovirus） ミクソビールス（Myxovirus） インフルエンザ（Ａ、Ｂ及びＣ） パラインフルエンザ（１〜４） オタフクカゼビールス（Mumpo Virus） ニユーカツスル病ビールス 麻疹ビールス 牛疫ビールス 犬ジステンパービールス 呼吸合胞ビールス （Respiratory Syncytial Virus） 風疹ビールス アルボビールス（Arboviruses） 東部馬脳炎ビールス （Eashern Equine Encephalitis V.） 西部馬脳炎ビールス（Wertern E.E.V.） シンドビスビールス（Sindbis V.） チクグンヤビールス（Chikugunya V.） セムリキ森林ビールス（Semliki Forest V.） マヨラビールス（Mayora V.） セントルイス脳炎ビールス カリホルニア脳炎ビールス コロラドダニ熱ビールス 黄熱病ビールス デング熱ビールス レオビールス（Reoviruses） レオビールス１〜３型 肝炎ビールス Ａ型肝炎ビールス Ｂ型肝炎ビールス 腫瘍ビールス ローシエル白血病ビールス（Rausher Leukemia
V.） グロツスビールス（Groso V.） マロニー白血病ビールス（Maloney L.V.） モノエピトピツク配位子分析対象物は一般に約
100〜2000の分子量、更に普通には125〜1000の分
子量である。興味ある分析対象物は、薬剤、代謝
産物、殺虫剤、汚染物、などを包含する。興味あ
る薬剤の中にはアルカロイドがある。アルカロイ
ドの中にはモルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキ
ストロメトルフアン、それらの誘導体及び代謝物
を含むモルヒネアルカロイド類；コカイン及びベ
ンゾイルエクゴニン、それらの誘導体及び代謝物
を包含するコカインアルカロイド類；リゼルグ酸
のジエチルアミドを包含するエルゴツトアルカロ
イド類；ステロイドアルカロイド類；イミナゾイ
ルアルカロイド類；キナゾリンアルカロイド類、
イソキノリンアルカロイド類；キニン及びキニジ
ンを包含するキノリンアルカロイド類；ジテルペ
ンアルカロイド；それらの誘導体及び代謝物があ
る。 薬剤の次のグループにはステロイド類があり、
その中にはエストロゲン、ゲストゲン、アンドロ
ゲン、アンドレノコルチン性ステロイド、胆汁
酸、ジゴクシン及びジゴキシゲニン、サポニン及
びサポゲニンを含む強心性の配糖体及びアグリコ
ン、それらの誘導体及び代謝物が含まれる。その
ほか、たとえばジエチルスチルベストロールのよ
うな、ステロイド擬似物質が含まれる。 薬剤の次のグループは５〜６の環員を有するラ
クタムであり、その中にはバルビツール酸塩、た
とえば、フエノバルビタール及びセコバルビター
ル、ジフエニルヒダントニン、プリミドン、エト
スクシミド及びそれらの代謝物が含まれる。 次のグループの薬剤は、２〜３炭素原子のアル
キル基を有する、アミノアルキルベンゼンであ
り、その中にはエフエドリン、Ｌ−ドーパ、エピ
ネフリン、ナルセイン、パパベリン、それらの代
謝物を含むアミノアルキルベンゼン類がある。 薬剤の次のグループはエフエドリン、Ｌ−ドー
パ、エピネフリン、ナルセイン、パパベリン、そ
れの代謝物及び誘導体を含む、２〜３炭素原子の
アルキルを有する、アミノアルキルベンゼンであ
る。 薬剤の次のグループは、オキサゼパン、クロル
プロマジン、テグレトール、イミプラミン、それ
らの誘導体及び代謝物を含むベンズ複素環化合物
であり、複素環はアゼピン、ジアゼピン及びフエ
ノチアジン類である。 薬剤の次のグループは、テオフイリン、カフエ
イン、それらの代謝物及び誘導体を含むプリン類
である。 薬剤の次のグループは、カンナビノール及びテ
トラヒドロカンナビノールを包含する、マリフア
ナから由来するものを包含する。 薬剤の次のグループは、たとえばビタミンＡ、
Ｂ、たとえばB₁₂、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫ、葉酸、チ
アミンのようなビタミン類を包含する。 薬剤の次のグループはプロスタグランジン類で
あり、これはヒドロキシル化及び不飽和の程度と
部位によつて異なつている。 薬剤の次のグループは抗生物質であつて、これ
はペニシリン、クロロマイセチン、アクチノマイ
セチン、テトラサイクリン、テラマイシン、それ
らの代謝物及び誘導体を含む。 薬剤の次のグループはヌクレオシド及びヌクレ
オチドであり、これはATP、NAD、FMN、ア
デノシン、グアノシン、チミジン及び適当な糖並
びに燐酸置換基を伴なうシチジンを包含する。 薬剤の次のグループはメタドン、メプロバメー
ト、セロトニン、メペリジン、アミトリプチリ
ン、ノルトリプチリン、リドカイン、プロカイン
アミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノ
ロール、グリセオフルビン、バルプロン酸、ブチ
ロフエノン類、アンチヒスタミン、たとえばアト
ロピンのようなコリン抑制性薬剤、それらの代謝
物及び誘導体を包含する種々の薬剤である。 化合物の次のグループはポリヨードチロニン
類、たとえばチロキシン、及びトリヨードチロニ
ン、オキシトシン、ACTH、アンギオテンシン、
メツト−及びロイ−エンケフアリン、それらの代
謝物及び誘導体を含むアミノ酸及び小ペプチドで
ある。 病的状態に関連する代謝物はスペルミン、ガラ
クトース、フエニルピルビン酸、及びポルフイリ
ンタイプを包含する。 薬剤の次のグループは、たとえばゲンタミシ
ン、カナミシン、トブラマイシン及びアミカシン
のような、アミノ酸糖体類である。 興味ある殺虫剤の中には多ハロゲン化ビフエニ
ル、燐酸エステル、チオ燐酸塩、カルバミン酸
塩、ポリハロゲン化スルフエンアミド、それらの
代謝物及び誘導体がある。 摂受体分析対象物に対しては、分子量は一般に
10000〜２×10⁶、更に普通には10000〜10⁶にわた
る。免疫グロブリン、IgA、IgG、IgE及びIgM、
に対しては分子量は一般に約160000〜約10⁶にわ
たる。酵素は一般に約10000〜600000の分子量に
わたる。天然摂受体は広広く異なり、一般には少
なくとも約25000の分子量であり且つ10⁶またはそ
れ以上の分子量とすることができ、たとえばアビ
ジン、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結
合プレアルブミン、トランスコルチンなどを包含
する。 配位子類似体 配位子類似体は、たとえばビドロキシル、アミ
ノ、アリール、チオ、オレフインなどのような活
性官能基を有する他の分子への共有結合を形成す
るための官能性を有する結合または結合基による
水素または官能基の何れかの置換によつて、配位
子とは異なつており、それによつて結果する化合
物は、それに抱合する分子による水素の置換より
以上に配位子とは異なつている。結合基は通常は
水素以外の１〜20原子を有しており、それは炭
素、酸素、硫黄、窒素、及び原子番号17〜35のハ
ロゲンである。関係する官能基はカルボニル、オ
キソ及び非オキソ、活性ハロゲン、ジアゾ、メル
カプト、エチレン、特に活性化したエチレン、ア
ミノなどを包含する。ヘテロ原子のの数は一般に
約０〜６、更に通常は約１〜６好ましくは約１〜
４の範囲である。結合基の記述は米国特許第
3817837号に見出すことができる。 大部分の場合に対して、結合基は脂肪族である
けれども、ジアゾ基においては芳香族基がかかわ
る。一般に、結合基は連鎖中に約１〜10、更に一
般的には１〜６原子を有する２価の連鎖である。
酸素は普通には炭素及び水素に、好ましくは炭素
のみに、結合したオキソまたはオキシとして存在
するのに対して、窒素は通常は炭素のみに結合し
たアミノまたはアミドとして存在し、一方、硫黄
は酸素と類似する。 結合基及び抱合させる分子の間の共有結合の形
成における通常の官能基はアルキルアミン、アミ
ド、アミジン、チオアミド、尿素、チオ尿素、グ
アニジン及びジアゾである。 ポリペプチドへの抱合において特別な応用が見
出される結合基はジイミドと同時に、または炭酸
モノエステルとの混合無水物として、あるいは活
性カルボン酸エステルたとえばＮ−ヒドロキシス
クシンイミドまたはｐ−ニトロフエニルとして、
用いることができるカルボン酸にかかわるもので
ある。窒素類似体イミドエステルとして使用する
ことができる。アルデヒドは、還元性のアミノ化
条件下にイミンを形成させるために、たとえば水
素化ホウ素類の存在においてアルキルアミンを生
成させるために、使用することができる。使用す
ることができるその他の非オキソカルボニル基は
イソシアナート及びイソチオシアナートを含む。
その上に、活性ハロゲン化物、特にブロモアセチ
ル基を用いることができる。 大部分の場合に、配位子は結合基を結合するた
めの部位として使用することができる１以上の官
能基を有している。特に、ヒドロキシ、アミノ及
びアリール基、特に活性化したアリール基が用い
られる。また、オキソ官能基からオキシムを調製
することができ且つたとえばカルボキシメチルの
ような結合基に結合させるための部位としてヒド
ロキシルを用いることができる。 結合基の選択は、配位子中及びその配位子を抱
合させるべき化合物中に存在する官能基、望まし
い結合基の性質と鎖長などに依存して、広く異な
る。 螢光粒子 螢光粒子は直径が約50nｍ以上50ミクロン以
下、通常は約100nｍ以上約25ミクロン以下、好
ましくは約0.5〜５ミクロンの固体不溶性粒子で
ある。粒子は、有機または無機の、好ましくは試
料の特異的結合対の構成員または特異的結合対の
構成員錯体に関して非多孔性の、好ましくはほぼ
水と等しい、一般には約0.7〜約1.5ｇ／mlの密度
のものであり且つ蛍光体によつて吸収及び放射さ
れる波長範囲において少なくとも部分的に透明で
あり、通常は約300〜700nｍの範囲で透明である
発色団を除外した材料から成つている。 有機粒子は通常は、分析媒体中に容易に分散さ
せることができる、付加または縮合重合体の何れ
かの重合体である。有機重合体は、更に、直接ま
たは間接的に、特異的結合対の構成員またはその
他の特定の結合物を結合するための吸着性である
かまたは官能化しうるものである。 粒子は天然に存在する物質、合成的に修飾した
天然に存在する物質及び合成物質から誘導するこ
とができる。特に興味のある有機重合体としては
多糖類、特に、たとえばセフアロースとして市販
されているアガロースのような、架橋した多糖
類、セフアデツクス及びセフアシルとして市販さ
れていデキストラン、セルロース、殿粉など；た
とえばポリスチレン、ポリビニルアルコール、ア
クリル酸及びメタクリル酸の誘導体、特に遊離の
ヒドロキシル官能性を有するエステル及びアミド
の単独重合体及び共重合体などのような付加重合
体である。無機重合体はシリコーン、ビオグラス
として市販されているガラスなどを抱含する。細
胞内脂肪粒子、燐脂質小胞及び細胞のような天然
または合成の集合体をも使用することができる。 粒子を商業的に入手することができる場合に
は、たとえば磨砕、超音波処理、撹拌などのよう
な機械的手段によつて大きな粒子を小さな粒子に
砕くことにより、粒度を変化させることができ
る。 粒子は通常は多官能性であるか、または多官能
性とすることができるか、あるいは特異的または
非特異的非共有結合的相互作用によつて特異的結
合対の構成員を結合することができる。いろいろ
な種類の官能基を用いることができ、あるいは導
入することができる。官能基としてはカルボン
酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン
基、水酸基、メルカプト基などがある。広い種類
の化合物を螢光粒子に結合させるための方法が公
知であり、広く文献に実例が示されている。たと
えばクアトレカサス（Cuatrecsas）、J.Biol.
Chem.245、3059（1970）参照。特異的結合対の構
成員または特異的結合対の構成員類似体への結合
基の長さは、結合させる化合物の性質、結合させ
る化合物と粒子の間隔が特異的結合対の構成員の
結合に与える影響などに依存して、広く変えるこ
とができる。特異的結合対の構成員は実質的に粒
子の外表面に結合する。 粒子に結合させる螢光体は常法で結合させるこ
とができる。通常は螢光体を溶解させ、または粒
子に共有結合的にあるいは非共有結合的に結合さ
せ且つ実質的に均一に粒子によつて結合されるこ
とが多い。 螢光体性としたラテツクス粒子は米国特許第
3853987号に記されており、コバレントテクノロ
ジーコーポレーシヨンからコバスフエアズとして
市販されている。螢光体をラテツクス粒子に結合
させる特定の方法は、結合が実質的な螢光を提供
する限りは、本発明にとつて限定的ではない。 興味ある螢光体は一般に350nｍ以上、通常は
400nｍ以上、好ましくは450nｍ以上の波長の光
を放射する。螢光体は高い量子効率、大きなスト
ークスシフトを有し且つ抱合と使用の条件下に化
学的に安定であることが望ましい。螢光体という
術語は電磁放射線る活性化または化学的活性化に
よつて発光する物質を包含するものとし、螢光性
及び燐光性の物質、シンチレーター、及び化学ル
ミネセンス物質などが含まれる。 興味ある螢光体は、ある種の第一級官能性を有
する種々の部類のものである。これらの第一級官
能性を有するものとしては、１−及び２−アミノ
ナフタレン、ｐ，ｐ−ジアミノスチルベン、ピレ
ン、第四級フエナントリジン塩、９−アミノアク
リジン、ｐ，p′−ジアミノベンゾフエノンイミ
ン、アントラセン、オキサカルボキシアニン、メ
ロシアニン、３−アミノキレニン、ペリレン、ビ
ス−ベンブオキサゾール、ビス−Ｐ−オキサゾリ
ルベンゼン、１，２−ベンゾフエナジン、レチノ
ール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレピ
リゲリン、テトラサイクリン、ステロフエノー
ル、ベンズイミダゾリルフエニルアミン、２−オ
キソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、
７−ヒドロキシクマリン、４，５−ベンズイミダ
ゾール、フエノキサジン、サリチル酸塩、ストロ
フアンチジン、ボルフイリン、トリアリールメタ
ン、フラビン及び希土類キレート酸化物並びに塩
類が含まれる。 結合のための官能性を有するか、またはこのよ
うな官能性を与えるために修飾することができる
個々の螢光性化合物としては、塩化ダンシル、た
とえば３，６−ジヒドロキシ−９−フエニルキサ
ントヒドロンのようなフルオレセイン、ロ−ダミ
ンイソチオシアナート、Ｎ−フエニル−１−アミ
ノ−８−スルホナトナフタレン、Ｎ−フエニル−
２−アミノ−６−スルホナトナフタレン、４−ア
セトアミド−4′−イソチオシアナトスチルベン−
２，2′−ジスルホン酸、ピレン−３−スルホン
酸、２−トルイジノナフタレン−６−スルホナー
ト、臭化エチジウム、アテルブリン、オーロミン
−０，２−（9′−アントロイル）パルミテート、
ダンシルホスフアチジルエタノールアミン、Ｎ−
（Ｐ−２−ベンズイミダゾリル）フエニルマレイ
ミド、４−フエニル−スピロ（フラン−２，1′−
フタラン）−３−3′−ジオン、Ｎ，Ｎ−ジオクタ
デシルオキサカルボシアニン、Ｎ，N′−ジヘキ
シルオキサカルボシアニン、メロシアニン、４−
（3′−ピレニン）ブチレート、ｄ−３−アミノデ
スオキシエクイレニン、12−（9′−アントロイル）
ステアレート、２−メチルアントラセン、９−ビ
ニルアントラセン、２，2′−ビニレン−Ｐ−フエ
ニレン）ビス−ベンズオキサソール、Ｐ−ビス
〔２−（４−メチル−５−フエニル−オキサゾリ
ル）〕ベンゼン、６−ジメチルアミノ−１，２−
ベンゾフエナジン、レチノール、ビス（3′−アミ
ノピリジニウム）−１，10−デカンジイル二沃化
物、ヘレブリゲニンのスルホナフチルヒドラゾ
ン、クロロテトラサイクリン、Ｎ−（７−ジメチ
ルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメ
ニル）マレイミド、Ｎ−〔Ｐ−（２−ベンズイミダ
ゾイル）フエニル〕マレイミド、Ｎ−（４−フル
オランチル）マレイミド、ビス（ホモバニリン
酸）、リザズリン、４−クロロ−７−ニトロ−２，
１，３−ベンゾオキサジアゾール、メロシアニン
540、レゾルフイン、ローズベンガル、２，４−
ジフエニル−３（2H）−フラノン、メチルウンベ
リフエロン、９，10−ジブロモアントラセン、
９，10−ジエチニルアントラセン及びエオシンが
ある。 検出可能な信号としての別の光源は化学ルミネ
センス源である。化学ルミネセンス源としては、
化学反応によつて電気的に励起を受けたのち、検
出可能な信号として働らく光を発するか、または
螢光受容体にエネルギーを供与することができる
化合物である。 化学ルミネセンス源は単一の成分または複数の
成分、通常は２または３の成分を有することがで
きる。化学ルミネセンス源は２部類に分けること
ができる：すなわち酵素触媒の中間性に関係する
もの及び酵素触媒にかかわないものである。 酵素触媒にかかわらない化学ルミネセンス源に
ついては、分析に伴なう他の反応または相互作用
を妨害することのない条件下に化学発光する化学
ルミネセンス源のみを用いることができる。通常
は非水溶媒及びPH11よりも高い強塩基性の条件に
頼つているは有用でないけれども、蛋白質が変質
して顕著な解離が生じる前に変調した発光が実質
的に完了する場合には、迅速な注入または流動法
にかかわる方法を使用することができる。塩基の
注入後に、測定することができる光の突発を観測
する。 種々の条件下に化学ルミネセンスを与える多数
の部類の化合物が知られている。それらの化合物
の１部類は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタル
アジンジオンである。もつとも一般的な化合物
は、５−アミノ化合物であるルミノールである。
この部類の中のその他のものとしては５−アミノ
−６，７，８−トリメトキシ及びジメチルアミノ
〔Ca〕ベンズ類似体がある。これらの化合物は、
アルカリ性過酸化水素または次亜塩素酸カルシウ
ムを用いて発光させることができる。他の部類の
化合物は、親化合物に対する一般名としてロフイ
ンを有する、２，４，５−トリフエニルイミダゾ
ールである。化学発光性の類似体はパラ−ジメチ
ルアミノ及び−メトキシ置換基を包含する。 化学発光性の化合物の次の部類はインドレン−
３−イルヒドロキシベルオキシド、それらの前駆
体及び誘導体である。 次の部類の化合物はビス−９，9′−ビアクリジ
ニウム塩であり、その中でルシゲニン、NN′−
ジメチル−９，9′−ビアクリジニウムジニトレー
トが代表的である。これらの化合物はアルカリ性
過酸化水素との組合わせによつて化学発光する。 次の部類の化合物は９位で置換してあるアクク
ジニエム塩である。特定置換基はカルボン酸エス
テル、特にアリールエーテル、アシル置換基、特
にベンゾイル、及びシアノである。化学ルミネセ
ンスを誘発させるためにはアルカリ性過酸化水素
を使用する。 別の部類の化合物は各種のアシルペルオキシエ
ステル及びビドロペルオキシドであり、それらは
たとえば９，10−ジフエニルアントラセンのよう
な化合物と組合わせて、インサイチユに生成せし
めることができる。 別の化学ルミネセンス源は、金属錯体、特にポ
ルフイリン及びフタロシアニンと組合わせたヒド
ロペルオキシド、たとえばテトラリンヒドロペル
オキシドであるが、ここで金属は鉄及び亜鉛であ
る。 好適な系は、11以下、好ましくは10以下のPHに
おいて化学発光体からの発光の申し分のない量子
効率を与えるものである。 次の部類の化合物は酵素触媒下に化学発光する
化学発光体に基づく。主として、酵素的に触媒さ
れる化学発光体には２グループがある。第一のグ
ループはアルカリ性過酸化水素と組合わせると発
光する化合物である。過酸化水素及び化学発光体
と組合わせたペルオキシダーゼ、たとえばワサビ
ペルオキシダーゼを用いることによつて、化学ル
ミネセンスを達成することができる。代表的な系
は２，３−ジヒドロ−１，４−フタルアジンジオ
ンを包含する。 化学ルミネセンスの第二の酵素源はルシフエリ
ン及びそれらの類似体とルシフエラーゼに基づい
ている。特に重要なものは細菌性のルシフエラー
ゼである。 結合した色源体の吸光及び発光特性は結合して
ない色原体とは異なるということに注意すべきで
ある。それ故、色原体の種々の波長範囲及び特性
について言及する場合には、それは使用時の色原
体についてのものであつて、抱合させてなく且つ
任意の溶剤中で特徴付けた色原体についてのもの
ではない。 エネルギー吸収すなわち消光粒子 人工エネルギー吸収粒子は、約50nｍ乃至50ミ
クロン、更に一般的には100nｍ乃至20ミクロン、
好ましくは200nｍ乃至５ミクロンの直径の範囲
の大きさのものである。エネルギー吸収粒子は更
に大きなものでもよいが、通常は発光粒子すなわ
ち螢光粒子の体積の半分未満、望ましくは1/5未
満、一層望ましくは1/10未満である。粒子の大き
さに対する制限は、粒子が急速な沈降なしに螢光
粒子を効果的に消光しなければならず且つ電磁放
射線を測定するための装置の測定区域中で、その
移動のために信号の変動を生じさせることがない
ということである。粒子は、その組成または消光
官能基が、通常は均一に分散しているが、均一に
分散していても不均一に分散していてもよいとい
う点で、均一または不均一、等方性または異方性
とすることができる。粒子は分析における最高の
消光において発光の１％よりも多く、好ましくは
10％よりも多く、更に好好ましくは50％よりも多
くを吸収するように、十分な消光を提供しなけれ
ばならない。吸光率は粒子の大きさのような要因
に関係し、通常は小さい粒子の消光の効率は大き
な粒子よりも低い。 消光はエネルギーの移動、不透明性または両者
の組合せの結果と考えることができる。螢光粒子
において、螢光粒子を特異的結合対の構成員の結
合によつてきわめて近く接近させそこで螢光粒子
が分析媒体中の光の大きな部分を吸収する場合に
は、螢光の実質的な低下が存在しうる。それ故、
螢光粒子への抱合のための特異的結合対の構成員
の適当な選択によつて、同じ粒子が螢光体及び消
光体の両方として働らくことができる。 不透明な粒子とは、関係する波長範囲の光の10
％未満を透過する粒子として定義される。大部分
の場合に対して不透明粒子が好適であり、特に全
可視範囲で十分に吸収する粒子が好適である。 特異的結合対構成員に共有結合的にまたは非共
有結合的に抱合させることができる消光粒子を使
用する。消光粒子は特異的結合対構成員に対して
結合することが可能であるかまたはこのような結
合の修飾が可能でなければならない。結合は、吸
着の結果としてであつても、または特異的結合対
の構成員との共有結合を形成することができる官
能基の導入によつてであつてもよい。特異的結合
対の構成員は螢光粒子に近付きやすい表面に強く
結合する。 使用することができる粒子は蛋白質に対して吸
着性でも非吸着性でもよい。粒子は天然に存在す
るもの、合成したもの、あるいはそれらの組合わ
せ、単一物質または複数の物質の混合物とするこ
とができ、且つ通常は化学的に不活性なものであ
る。不透明な粒子は興味ある波長の光を吸収し、
黒色であることが多い。不透明材料の例として
は、たとえば活性炭、カーボンブラツク、ランプ
ブラツク、黒鉛及びコロイド状炭素のような炭素
の粒子、コロイド状の金属粒子、金属酸化物粒
子、金属カルコゲニド粒子、たとえば興味ある波
長範囲の光を吸収する、共有結合または非共有結
合によつて粒子中に導入した１以上の発色性官能
基を含有する、吸光性合成重合体粒子、細胞胞内
脂肪粒子、たとえば赤血球などがある。 粒子は分析媒体中で分散可能であつて比較的安
定な分散物を与えるかまたは分散剤の添加によつ
て比較的安定な分散物とすることができるもので
なければならない。測定時間中に粒子が分散状態
を保つことのみが必要なことであるけれども、更
に長時間分散を持続することが望ましい。 不透明粒子が発光を抑制する方式は異なるかも
知れないが、以下の要因の１以上が完全にまたは
部分的に、かかわつているものと思われる：エネ
ルギー受容性；遮蔽；光の吸収；または粒子表面
との化学的または物理的相互作用によるエネルギ
ー水準の動揺。 補助的材料 本発明の分析においては種々の補助材料を使用
することができる。既述のように、モノエピトピ
ツク配位子と共に、分析処方はポリ配位子または
ポリ（配位子類似体）を含有させることを必要と
することがある。他の場合には、特に抗体または
配位子−抗体錯体に対する摂受体を伴なう場合
に、特異的結合対の構成員を包含せしめることが
できる。その上、約0.01〜1Mの緩衝剤濃度を与
えるために十分な緩衝剤を用いてもよい。選択す
る緩衝剤の量は、使用する試料に関させてPHを調
節するために十分なものとする。緩衝剤に加え
て、その他の材料を加えてもよい。すなわち、約
1.5重量％に至るまでの濃度を与えるべき量の蛋
白質、たとえばアルブミン、のような安定剤；約
１重量％の濃度を与えるべき量の制菌剤または殺
菌剤、たとえばナトリウムアジド、のような保護
化合物；並びに特別な効果を与えるためのその他
の物質、たとえば界面活性剤、キレート剤、酸化
抑制剤、たとえばバーコル、塩化セシウムまたは
ハイベークのような媒体の密度を高めるための物
質、たとえばクリセリン及びグルコースのような
粘度を上昇させる物質、並びにたとえばポリエチ
レングリコール及びフツ化ナトリウムのような結
合に影響を与える物質を加えることができる。 キツト 便宜上の問題として、試薬はキツトとして提供
することができるが、その場合に各試薬を、分析
の感度を必要な範囲で実質的に最高とするよう
に、予め定めた比率とする。螢光粒子抱合体及び
不透明粒子抱合体は、粉末状態で、分散可能なゲ
ルとして、または水性媒体中の濃厚物として、存
在させることができる。高密度の添加剤を使用す
るかまたは粒子の密度を調節することによつて、
水性分析媒体と粒子の間の所望の密度の関係を達
成することができる。 キツト中に用意する試薬は、螢光粒子抱合体、
不透明粒子抱合体及び必要に応じて補助試薬であ
る。特定の材料及び分析処方に依存して、螢光粒
子抱合体及び不透明粒子抱合体を各種の他の試薬
と組合わせて単一の試薬として混合するかまたは
別個の試薬として存在させることができる。両粒
子の特定の比率は使用すべき分析処方、関係する
特定の特異的結合対の構成員、及び動的分析範囲
に依存して広く異なる。 以下の実施例は例証のために提供するものであ
つて限定のためのものではない。 実 験 実施例 １ 螢光ビーズへの蛋白質カツプリングのための一
般的方法 コバスフエアズMX（コバレントテクノロジー
コーポレーシヨン）は親水性、螢光性の微細（直
径0.935ミクロン）な単分散ポリスチレン球体で
ある。これは“活性化”してあつて、アミン及び
スルフヒドリル基によつて蛋白質への永久的共有
結合を形成する。 抱合体の調製においては、コバスフエアの1.4
％懸濁液100μを50ミクログラムの蛋白質を含
有する１mlの通常の食塩水に撹拌と共に加える。
試料を室温で１時間温置し、４分間遠心分離した
のち、上澄液を捨てる。残留物をPH7.4のPBS／
NaN₃緩衝液中に再懸濁させ且つ遠心分離するこ
とによつて２回洗浄したのち、0.1％のオバルブ
ミンを含有する0.5mlの上記の緩衝剤中に超音波
処理によつて再懸濁させる。カツプリング反応は
１時間で本質的に完了し、蛋白質の吸収は約
0.025重量％である。次いで将来の使用のために
ビーズを冷凍する。 実施例 ２ 炭素への抗体の抱合 20mgのカーボンブラツク（スターリングＲ、Ｖ
−5373）に、１mlのPBS／NaN₃緩衝液、PH7.4、
中の１mgのウサギの抗入IgGを加える。混合物を
１〜２分超音波処理したのち、混合物を低温で終
夜撹拌する。カーボン粒子を遠心分離し、上澄液
中の蛋白質の量を280nｍにおける吸光によつて
調べて結合を測定すると、それは一般に、存在す
る抗体の75〜95％の範囲である。カーボン残留物
をPBS／NaN₃／ツイーン20緩衝液を用いて２回
洗浄し、0.1％オバルブミン／PBS／NaN₃／ツ
イーン20緩衝液中に再懸濁させる。このとき各回
ごとに遠心分離によつてカーボンブラツクを沈降
させる。 本発明の実証のために、以下の実験を行なつ
た。各管中で１mlの0.1オバルブミン／PBS／
NaN₃緩衝液にカーボン粒子組成物の1/8希釈物
50μを加えることによつて一連の管を用意し
た。人IgGの濃度の異なる一連の溶液を調製し、
それを上記の緩衝液250μによつて希釈したの
ち、上記の管に、重複させて、加えた。次いでこ
の分析混合物を回転させながら室温で90分置い
た。90分の経過後に、人IgGに抱合させた250μ
の螢光ビーズを上記の緩衝液に加え、分析混合物
を更に90分間温置した。次いで分析混合物の螢光
を測定した。 下表にその結果を示す。 第１表 IgG濃度 螢 光 μｇ／分析 任意の単位 100 601 10 593 １ 570 0.1 523 0.01 440 0.001 424 0.0001 408 0.0 399 上記の結果は、特異的結合対の構成員で官能化
した不透明ビーズ、特に木炭、と組合わせ特異的
結合対の構成員で官能化させた螢光ビーズの使用
によつて、感度のよい分析が可能であることを実
証している。螢光ビーズからの螢光の高度の増幅
のために、消光粒子と螢光ビーズとの相互作用に
よる信号の大きな変調を達成することができる。
かくして、分析対象物濃度の僅かな変化に伴なう
信号変化と低濃度の分析対象物に対する感度の著
しい増大が得られる。本発明の方法は特異性の抗
原に対する抗体にかかわる血清学的方法における
特別な応用が見出される。抗原を螢光粒子に結合
させることができる。特異的結合対の補完的構成
員のみを螢光粒子に結合させた抗原に結合させ、
多量の非結合非特異性抗体を媒体中に残す。消光
粒子は、抗原に、または抗人免疫グロブリンある
いは、それ自体でまたは特定の配座においての何
れかで、抗体、たとえば類リウマチ因子、に対し
てあるいは近接する複数の抗体に対して特異的で
あるその他の物質に、結合させることができる。
血清試料中の大量の免疫グロブリンにかかわら
ず、過剰の官能化した消光粒子を使用することに
よつて、特異性抗原に対する抗体の存在において
螢光信号の実質的な変調を与えるために十分な量
の官能化した消光粒子が螢光粒子に結合すること
を可能とする。この方法は、血清試料中に存在す
る免疫グロブリンの全量と比較して関係する抗体
が僅かかな量しか存在しないことにより、大きな
利点を有している。 理解を明確とするための説明及び実施例とし
て、多少詳細に本発明を記述したが、特許請求の
範囲内において、いくつかの変更と修飾を行なう
ことができるということは明白である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分析対象物を含有するものと思われる試料中
   の該分析対象物の存在を確定するための方法であ
   つて、 ここで該分析対象物は特異的結合対の構成員で
   あり、 ここで試薬として： (1) この水不溶性粒子内に分布した光放射を可能
   とする官能性を有し、活性化によつて光を放射
   することができる少なくとも50nｍの水不溶性
   粒子及び該粒子に結合して特異的結合対の構成
   員が結合した光放射性粒子を与える複数の特異
   的結合対の構成員；及び (2) 複数の特異的結合対の構成員が結合して特異
   的結合対の構成員が結合した消光体粒子を与え
   る少くとも50nｍの消光体粒子、ただし該特異
   的結合対の構成員が結合した消光体粒子は特異
   的結合対の構成員架橋によつて該特異的結合対
   の構成員が結合した光放射粒子に結合せしめら
   れるときに、該特異的結合対の構成員が結合し
   た光放射性粒子の光放射に実質的な低下が生じ
   る、 を使用し、且つ ここで該分析対象物の該特異的結合対の構成
   員、該特異的結合対の構成員が結合した光放射
   性粒子及び該特異的結合対の構成員が結合した
   消光体粒子は少なくとも１つの補完対を包含
   し； 該方法は： 水性の分析媒体中で、該分析対象物、該特異
   的結合対の構成員が結合した光放射性粒子及び
   該特異的結合対の構成員が結合した消光体粒子
   を混合せしめ、ここで該特異的結合対の構成員
   が結合した光放射性粒子に結合するに至る特異
   的結合対の構成員が結合した消光体粒子の量は
   該媒体中の分析対象物の量に関連しており；そ
   して 既知量の分析対象物を有する分析媒体と比較
   して該媒体中の光の放射量を決定する、 ことを特徴とする方法。 ２ 該消光体粒子が木炭である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３ 該木炭粒子が50nから50ミクロンまでのもの
   である特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 該光放射粒子が付加重合体蛍光粒子である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 該特異的結合対の構成員が結合した光放射粒
   子の該その構成員と該分析対象物が一つの補完対
   を形成し且つ該特異的結合対の構成員が結合した
   消光体粒子の該その構成員と該分析対象物が同一
   の補完対を形成する特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ６ 該特異的結合対の構成員が結合した光放射粒
   子の該その構成員と該分析対象物が一つの補完対
   を形成し且つ該特異的結合対の構成員が結合した
   消光体粒子の該その構成員と該分析対象物が第二
   の補完対を形成する特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ７ 該分析対象物が蛋白質である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ８ 該蛋白質がガンマーグロブリンである特許請
   求の範囲第７項記載の方法。 ９ 該蛋白質がアルブミンである特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 １０ 該光放射粒子は約350nｍよりも長波長の
   光を吸収しそして約400nｍよりも長波長の光を
   放射ししかも該消光体粒子とは異なつている特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １１ (1) 該水不溶性粒子が約100nｍ乃至20μの
   範囲にある大きさの蛍光性粒子でありそして光
   放射を可能とする該官能性は特異的結合対の構
   成員が結合した蛍光性粒子を与える蛍光官能性
   であり；そして (2) 該消光体粒子は炭素粒子である、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 １２ 該炭素粒子が直系約50μに至るまでの木炭
   粒子でありそして該特異結合対の構成員が結合し
   た蛍光性粒子の大きさの約半分未満の大きさであ
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 該特異結合対の構成員が結合した蛍光性粒
   子が直径約200nｍ乃至5μの範囲の大きさのもの
   でありそして該炭素消光粒子が該蛍光性粒子の大
   きさの半分未満の大きさのものである特許請求の
   範囲第１１項記載の方法。 １４ 分析対象物を含有するものと思われる試料
   中の該分析対象物の存在を測定すための方法であ
   つて、ここで該分析対象物は特異的結合対の構成
   員であり、 ここで試薬として、約100nｍ乃至20μの範囲の
   大きさを有し且つこの粒子内に実質的に均一に分
   布した蛍光官能性を有する蛍光性水不溶性粒子、
   及び該粒子に結合して特異的結合対の構成員が結
   合した蛍光性粒子を与える複数の特異的結合対の
   構成員を使用し、ここで２以上の該特異的結合対
   の構成員が結合した蛍光性粒子が分析対象物への
   結合によるかあるいは特異的結合対の構成員が結
   合した蛍光性粒子上に特異的結合対の補完的構成
   員を有することの結果として、特異的結合対の構
   成員架橋によつて一緒にされるとき、一方の蛍光
   性粒子が他方の蛍光性粒子の蛍光を吸収ないし消
   光して蛍光の実質的な低下が生じ：且つ ここで該分析対象物の該特異的結合対の構成員
   および特異的結合対の構成員が結合した蛍光性粒
   子は少なくとも１つの補完対を包含し； 該方法は： 水性の分散媒体中で、該分析対象物及び該特異
   的結合対の構成員が結合した蛍光性粒子を混合せ
   しめ、これで該特異的結合対の構成員架橋によつ
   て間近な接近に至らしめられる、特異的結合対の
   構成員が結合した蛍光性粒子の量は該媒体中の分
   析対象物の量に関連しており；そして 既知量の分析対象物を有する分析媒体と比較し
   て該媒体中の蛍光の量を決定する、 ことを特徴とする該方法。