JPH0231959B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は胆汁酸の測定方法に関する。

従来、肝機能の検査の一つとして血液中に微量
に含まれる胆汁酸の測定が行なわれる。

血液中には胆汁酸としてコール酸、デオキシコ
ール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸が
夫々遊離型、グリシン抱合型、タウリン抱合型の
形で含まれており、これらの形で存在する15種類
の各胆汁酸成分を分離定量することが、肝胆道系
疾患の病態解析並びに鑑別診断に有用である。

このため従来は例えば特公昭56−38200号公報
におけるように高速液体クロマトグラフイを用い
て、フエニル基を化学的に結合させた10μ前後の
球状シリカ変性ゲルを使用し分離用カラム内に溶
離液と混合された血清等の生体試料を注入して各
胆汁酸成分を分離し、カラムからの流出液に
NAD⁺を含む反応液を混合し3α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ（3α−HSD）が固定
された担体が充填された固定化酵素カラムに通し
て分離された各胆汁酸成分とNAD⁺とを順次反応
させた後、反応生成物の紫外線吸収測定及び／又
は蛍光測定を行つて各胆汁酸成分を検出すること
により胆汁酸を測定することが行なわれている。

ところで上記従来の測定方法においては、液体
クロマトグラフイにおける分離用カラムにシリカ
変性ゲルを使用していたが、蛋白質等の雑多な化
合物を非特異吸着しやすく、その分離性能が急速
に低下するため、これらの非特異吸着物質を除去
するための前処理を必要とし、又アルカリに対し
て不安定でPH8.5以下の溶離液しか使えないので
分離後の胆汁酸成分を3α−HSDと高い酵素活性
で反応させるには分離用カラムから流出後、PH値
を調節する必要があつた。

また固定化酵素カラム内で各胆汁酸成分と
NAD⁺とを反応させるものである為、分離用カラ
ムからの流出液にNAD⁺を加えた反応液を供給す
ることが行なわれてきたが、この場合は各胆汁酸
成分を含有する流出液が反応液によつて稀釈され
ることになり、又混合に際して液の乱れを生ずる
ために高感度で各胆汁酸成分の測定を行なうこと
ができない欠点があつた。

本発明は上記欠点を解消することを目的とする
ものであり、その要旨とするところは、遊離型、
グリシン抱合型及びタウリン抱合型の胆汁酸を含
有する試料液を溶離液と共に分離用カラム内に導
入し液体クロマトグラフイにより各胆汁酸成分に
分離した後、分離用カラムからの各胆汁酸成分を
含む流出液を、固定化された3α−HSDを有する
固定化酵素カラム内に流通させて各胆汁酸成分と
NAD⁺とを反応させ、反応生成物の紫外線吸収測
定及び／又は蛍光測定を行つて各胆汁酸成分を検
出することにより胆汁酸を測定する方法におい
て、分離用カラムの充填剤が、テトラメチロール
メタンｘアクリレート（又はメタクリレート）で
示される単量体（但し、ｘは４又は３）と、下記
一般式で表わされる単量体、 （但し式中R₁、R₂は水素又はメチル基、ｎは３
〜18の整数） との共重合体の粒子からなり、 分離用カラム内に導入される溶離液中にNAD⁺
を存在させておくことを特徴とする、胆汁酸の測
定方法に存する。

次に本発明胆汁酸の測定方法について更に詳細
に説明する。

本発明における試料液としては、血液（血清）、
胆汁等の生体試料液が該当する。かゝる試料液中
には遊離型、グリシン抱合型、タウリン抱合型の
15種類の胆汁酸が含まれている。これらの各胆汁
酸成分を分離するために試料液を溶離液と共に分
離用カラム内に導入し液体クロマトグラフイ、特
に高速液体クロマトグラフイにかける。

１は溶離液槽であり、溶離液としては例えば炭
酸アンモニウム−アセトニトリル混合液、リン酸
アンモニウム−アセトニトリル混合液等が使用さ
れる。この溶離液中にはNAD⁺が加えられてい
る。

２は定流量ポンプであり、溶離液が一定量ずつ
分離用カラム４に送給される。３は試料注入器で
あり、血清、胆汁等の試料液が注入されてNAD⁺
を含有する溶離液と混合される。

試料液はNAD⁺を含有する溶離液と混合されて
分離用カラム４に導かれる。

分離用カラム４内に充填され各胆汁酸成分を分
離するための充填剤としては、テトラメチロール
メタンｘアクリレート（又はメタクリレート）で
示される単量体（但し、ｘは４又は３）(A)と、下
記一般式で表わされる単量体(B)、 （但し式中R₁、R₂は水素又はメチル基、ｎは３
〜18の整数） との共重合体の粒子からなる。

単量体(A)の例としては、例えばテトラメチロー
ルメタンテトラアクリレート、テトラメチロール
メタンテトラメタクリレート、テトラメチロール
メタントリアクリレート、テトラメチロールメタ
ントリメタクリレート等が挙げられ、特にテトラ
メチロールメタンテトラアクリレート、テトラメ
チロールメタントリアクリレート、テトラメチロ
ールメタントリメタクリレートが好適に用いられ
る。

又単量体(B)の例としては、トリエチレングリコ
ールジアクリレート、トリエチレングリコールジ
メタクリレート、テトラエチレングリコールジア
クリレート、テトラエチレングリコールジメタク
リレート、ノナエチレングリコールジアクリレー
ト、ノナエチレングリコールジメタクリレート、
テトラデカエチレングリコールジアクリレート、
テトラデカエチレングリコールジメタクリレート
等が挙げられ、特にテトラエチレングリコールジ
アクリレート、トリエチレングリコールジアクリ
レート、テトラエチレングリコールジメタクリレ
ートが好適に用いられる。単量体(A)と単量体(B)と
の共重合体の粒子を得るには、例えば単量体(A)、
(B)の混合物に必要に応じてラジカル発生触媒を添
加して水性懸濁重合を行なう。

単量体(A)、(B)の使用割合は、単量体(A)100重量
部当り、単量体(B)が100重量部以下となるように
されるのが好適である。

これは単量体(B)の割合が前記の割合よりも多く
なると、得られる共重合体は軟らかくなり、分離
用カラム４に充填し高速液体クロマトグラフイに
かけた場合に機械的強度において問題を生じやす
く、又胆汁酸の分離機能も低下しやすいからであ
る。又単量体(A)対(B)の使用割合が10：１〜10：３
である場合に、最適の充填剤が得られる。

又、単量体(B)における−（CH₂−CH₂−０−）の繰
返し単体の数ｎは、ｎが19以上になると共重合体
粒子の機械的強度の点で問題を生じ、又ｎが１又
は２の場合には分離能が低下するのでｎは３〜18
の範囲とされる。

重合に際して、用いられる単量体を溶解するが
生ずる共重合体を溶解しない有機溶媒を存在させ
ておくと、生成する重合体粒子は多孔質になり、
表面積が増加するので充填剤として好ましいもの
となる。

上記有機溶媒の例としてはトルエン、キシレ
ン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳
香族炭化水素類、ヘキサン、ヘプタン、オクタ
ン、デカン等の飽和炭化水素類、イソアミルアル
コール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコー
ル等のアルコル類などが挙げられ、又、その使用
量は単量体(A)、(B)の混合物100重量部に対して15
〜200重量部用いられるのが好ましく、より好ま
しくは20〜150重量部である。

又、本発明において分離用カラム４に充填され
て用いられる重合体小粒子の粒径は３〜40μの範
囲で均一に揃つているのが好ましい。

そして、重合体小粒子を水中に分散し、定流量
ポンプ等によりステンレスカラム等のカラムに圧
送して充填するのであり、かくして本発明に用い
られる分離用カラム４が用意される。

分離用カラム４内に、NAD⁺を含有する溶離液
と混合された試料液が導かれ、液体クロマトグラ
フイにより各胆汁酸成分の分離が順次なされる。
各胆汁酸成分毎に分離されて分離カラム４から流
出する流出液にはNAD⁺がそのまゝ含有されてい
る。

流出液を、固定化された3α−HSDを有する固
定化酵素カラム５内に流通させる。固定化された
3α−HSDを得るには、例えば数μｍ〜数百μｍ
の大きさの微粒状ないし粉末状セルロースに、例
えば上記セルロース表面を予め適当な試薬、例え
ばシアン化プロマイドで活性化させ、これに3α
−HSDを接触させて該3α−HSDをセルロース表
面に吸着や共有結合等により化学的に結合させて
固定化するのが好適である。

固定化酵素カラム５内において胆汁酸がNAD⁺
の存在下に3α−HSDと接触することにより、該
3α−HSDの触媒作用により胆汁酸とNAD⁺とが
反応して螢光物質（NADH）を生成する。そし
てかゝる反応によつて生じたNADHは365nｍ付
近に吸収スペクトルの極大を示し、465nｍ付近
に螢光スペクトルの極大を示す。従つて励起波長
365nｍ、螢光波長465nｍに設定して検出器６に
よる紫外線吸収測定又は／又び螢光測定を行うこ
とにより胆汁酸を検出し、その結果を記録計７に
より記録する。検出器６を出た試料液は癈液槽８
に導入される。

本発明方法によれば、各胆汁酸を分離する機能
を有する充填剤は前記単量体(A)と単量体(B)との共
重合体の粒子からなるものであり、この充填剤は
蛋白質等の雑多な化合物を非特異吸着しにくく蛋
白質の非特異吸着による、各胆汁酸成分の分離性
能の低下が防がれ、遊離型、グリシン抱合型及び
タウリン抱合型の胆汁酸を含有する試料液を各胆
汁酸成分に良好に分離できる。また前記単量体(A)
と単量体(B)との共重合体の粒子はPH値が10程度迄
は安定であるので、3α−HSD活性を高める高い
PH値の溶離液を使用できる。

本発明においては分離用カラム内に導入される
溶離液中に予じめNAD⁺を存在させておくもので
あるから、各胆汁酸成分を含有する流出液が
NAD⁺液によつて稀釈されないものとなり、又
NAD⁺液の混合に際して液の乱れを生ずることも
ないので、高感度で各胆汁酸成分の測定を行うこ
とができる。

実施例 １ 冷却器、撹拌器、温度計および滴下ロートの設
置された２のセパラプルフラスコに５重量％の
ポリビニルアルコール水溶液400mlとテトラメチ
ロールメタントリアクリレート84ｇおよびテトラ
エチレングリコールジアクリレート16ｇおよびベ
ンゾイルパーオキサイド0.15ｇよりなる混合物を
供給した。さらにトルエン100ｇを添加した。次
に400r.p.m.に撹拌しながら80℃に昇温し、10時
間反応を行なつて冷却した。冷却後、重合生成物
を分離した後、熱水およびアセトンで洗浄して粒
径が５〜20μｍの多孔質球状ポリマーを得た。そ
のうち微粒子および粗粒子を取り除いて得られた
８〜10μｍの粒子を80mlのイオン交換水に分散し
ステンレスカラム（直径7.9mm、長さ30cm）に定
流量ポンプによりイオン交換水を2.0ml／minの
速度で圧送して充填し、分離用カラムを用意し
た。

次にセルロース微粒子（粒径約80ミクロン）を
支持体として用い、該セルロース微粒子５mlに、
イオン交換水５ml、2M炭酸ナトリウム水溶液10
mlを加え、撹拌後、これに予めシアン化ブロマイ
ド２ｇを溶解したアセトニトリル１mlを加え、激
しく撹拌しながら90秒間反応させた。こうして活
性化させたセルロース微粒子をすばやく0.1M炭
酸緩衝液（PH9.5）、イオン交換水及び0.5Mの塩
化ナトリウムを含む0.1M炭酸緩衝液（PH9.5）で
洗浄したのち、3α−HSD44mgを溶解させた0.5M
の塩化ナトリウムを含む0.1M炭酸緩衝液（PH
9.5）５mlを加え、室温で２時間撹拌して反応さ
せた。次に上記の処理により3α−HSDを固定化
したセルロース支持体上になお存在する活性点を
ブロツクするため、0.05％のメルカプトエタノー
ルを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）中で
４℃で２時間反応させた。

かくして得られた3α−HSDが固定化されたセ
ルロース支持体を0.5Mの塩化ナトリウムを含む
0.1M酢酸緩衝液（PH5.0）、イオン交換水及び
0.5Mの塩化ナトリウムを含む0.1M炭酸緩衝液
（PH9.5）で繰り返し洗浄したのち、直径４mm、長
さ10cmのステンレスカラムに充填し、固定化酵素
カラムとした。

これらのカラム及び蛍光検出計を第１図の如く
に接続して胆汁酸の分析を行つた。

溶離液としては0.3％リン酸アンモニウム水溶
液にNH₄OHを加えPH9.5とした水溶液に18VOl％
のアセトニトリルを加えたもの（液）又は0.3
％リン酸アンモニウム水溶液にNH₄OHを加えPH
9.5とした水溶液に27VOl％のアセトニトリルを
加えたものを用いた（液）。

、両液にはNAD⁺を0.22重量％加えてあつ
た。又、サンプルとして、コール酸、ウルソデオ
キシコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシ
コール酸、リトコール酸の５種類の胆汁酸及びこ
れらのそれぞれの胆汁酸についてのグリシン抱合
体とタウリン抱合体の合計15種類が10mgずつ１
のメタノールに溶解されたものを用意した。

分析操作としては、定流量ポンプ２により溶離
液（液）を1.0ml／minの流速で流しながら前
記サンプル10μをインジエクター３より注入
し、タウリン抱合デオキシコール酸（TDCA）
が溶出した時点で溶離液（液）1.5ml／minの
流速に切換えた。

かくして第２図に示される通りの、15種類のす
べてについて明確なピークが描かれた。

実施例 ２ 実施例１と同様にして得られた分離用カラム、
固定化酵素カラム、NAD⁺を含有する溶離液を使
用した同じ装置を用い、実施例１におけると同じ
条件下に正常人血清を前処理することなく注入
し、各成分の測定を行なつた。その結果を第３図
に示す。

比較例 １ 実施例１において溶離液にNAD⁺を使用しない
ものとし、分離カラムからの流出にNAD⁺を含有
する反応液を１ml／minの割合で連続的に添加
し、試料液として正常人血清を前処理することな
く注入した以外は実施例１と同様にして各胆汁酸
成分の測定を行なつた。

その結果を第４図に示すが、第３図に示す結果
に比し感度が著しく低いものであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明胆汁酸の測定方法に使用する装
置の例を示す説明図、第２図は実施例１における
クロマトグラム、第３図は実施例２におけるクロ
マトグラム、第４図は比較例１におけるクロマト
グラムである。 符号の説明、１……溶離液槽、２……定流量ポ
ンプ、３……試料注入器、４……分離用カラム、
５……固定化酵素カラム、６……検出器、７……
記録計、P₁……コール酸、P₂……グリシン抱合
コール酸、P₃……タウリン抱合コール酸、P₄…
…ウルソデオキシコール酸、P₅……グリシン抱
合ウルソデオキシコール酸、P₆……タウリン抱
合ウルソデオキシコール酸、P₇……ケノデオキ
シコール酸、P₈……デオキシコール酸、P₉……
グリシン抱合ケノデオキシコール酸、P₁₀……グ
リシン抱合デオキシコール酸、P₁₁……タウリン
抱合ケノデオキシコール酸、P₁₂……タウリン抱
合デオキシコール酸、P₁₃……リトコール酸、P₁₄
……グリシン抱合リトコール酸、P₁₅……タウリ
ン抱合リトコール酸。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 遊離型、グリシン抱合型及びタウリン抱合型
   の胆汁酸を含有する試料液を溶離液と共に分離用
   カラム内に導入し液体クロマトグラフイにより各
   胆汁酸成分に分離した後、分離用カラムからの各
   胆汁酸成分を含む流出液を、固定化された3α−
   ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを有する
   固定化酵素カラム内に流通させて各胆汁酸成分と
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
   （NAD⁺）とを反応させ、反応生成物の紫外線吸
   収測定及び／又は蛍光測定を行つて各胆汁酸成分
   を検出することにより胆汁酸を測定する方法にお
   いて、分離用カラムの充填剤が、テトラメチロー
   ルメタンｘアクリレート（又はメタクリレート）
   で示される単量体（但し、ｘは４又は３）と、下
   記一般式で表わされる単量体、 （但し式中R₁、R₂は水素又はメチル基、ｎは３
   〜18の整数） との共重合体の粒子からなり、 分離用カラム内に導入される溶離液中にニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD⁺）を存
   在させておくことを特徴とする、胆汁酸の測定方
   法。