JPH02290893A - モノヌクレオチドの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、２種類以上のモノヌクレオチドを含む混合液
からモノヌクレオチドを工業的に分離する方法に関する
。詳しくは強酸性陽イオン交換樹脂を用いてクロマト分
離により、モノヌクレオチドを相互分離する方法に関す
るものであり、特に用いる陽イオン交換樹脂に特徴を有
する。

（従来の技術） アデニル酸（以下ＡＭＰと称す）、グアニル酸（以下Ｇ
ＭＰと称す）、シチジル酸（以下ＣＭＰと称す）そして
、ウリジル酸く以下ＵＭＰと称す）等のモノヌクレオチ
ド類は、調味料あるいは医薬原料等として有用な化合物
であり、近年増々その需要は拡大しつつある。

一般にモノヌクレオチドの生産は、核酸（ＲＮＡ）分解
法、発酵法、化学合成法等あるいはそれ等の組み合わせ
により行われている。ところが類似化合物が混在してい
る為、いずれの方法においても目的成分を高純度で単離
することは困難である。

そこで、種々の晶析法、活性炭や吸着樹脂を用いた吸着
法、イオン交換樹脂を用いるイオン交換樹脂法等の手法
が用いられている。しかし、吸着法やイオン交換樹脂法
では、ヌクレチオド類の分別溶離（クロマト分離）を行
わせる為に、ｐＨおよび塩濃度を異にする多数の溶離剤
を多量に用いる必要がありかつヌクレチオドも大きく希
釈化され後工程である濃縮晶析操作にも労力を要し、し
かもこれ等の工程には長時間を必要とする。

たとえば、強酸性陽イオン交換樹脂を用いてＡＭＰ，Ｃ
ＭＰ，ＧＭＰ，ＵＭＰ等のモノヌクレオチドをクロマト
分離する方法は公知の技術であるが、この方法は分析的
手法として用いられるものであり、そのまま工業的規模
に適応するには多くの困難がある。すなわち、上記４種
のヌクレオチドを完全に相互分離する為には、樹脂看に
対し処理液量を少なくし、かつ溶離液を多量に用いなけ
ればならず、又その溶離液は鉱酸や有機酸等を添加した
ものであるので経済的に適当ではない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、より簡便な工業規模のヌクレオチド類のクロ
マト分離方法の提供を目的とするものであり、上記の如
き不利な経済性を解決し、工業的規模として用いうるク
ロマト分離手法を見い出すべく用いる強酸性イオン交換
樹脂の物性に関して鋭意検討した結果完成されたもので
ある。

（課題の解決手段） 本発明の要旨は、交換容量が、０．０５〜ｌ．１０ｅｑ
／ｌ−Ｒの強酸性陽イオン交換樹脂を用いてクロマト分
離することを特徴とするモノヌクレオチドの分離方法で
ある。

さらに詳しく説明すると、一般に市販されている強酸性
陽イオン交換樹脂よりも交換容量の低い樹脂を用いるこ
とに特徴がある。市販されている通常の強酸性陽イオン
交換樹脂（スチレン・ジビニルベンゼン母体）の交換容
景は、架橋度が４％のもので１．２　〜１．４ｅｑ／β
一Ｒ，６％のもので１．５　〜１．７ｅｑ／ｆ−Ｒ，８
％のもノ−ｃ’１．９〜２．ｌｅｑ／ｆ−Ｒである（現
在実際に最も多く用いられている樹脂は８％以上の樹脂
である。４％乃至６％の低架橋度樹脂は特殊用途として
僅かに使用されているにすぎない。）が、これらよりも
低交換容量の樹脂の方がモノヌクレオチドのクロマト分
離に適していることを本発明者は見い出し本発明を完成
したのである。

１．２ｅｑ／４２以上の交換容量を持つ強酸性陽イオン
交換樹脂を用いて、モノヌクレオチド類のクロマト分離
を行った場合、クロマト展開に必要な溶離剤（純水ある
いは酸性水溶液》を多く必要とする。また溶離してくる
モノヌクレオチドのピークは、クロマト分離条件である
温度、流速の影響を大きく受け、低温、高流速になるほ
どピークのテーリング、リーディング、すなわちブロー
ド化が起こり好ましくない。またヌクレオチドは、低い
ｐＨにある樹脂内部で、非常に不安定である。さらに、
樹脂の再生において、苛性ソーダや塩酸等の再生薬剤を
多《必要とする。従って、工業的にこの様に高い交換容
攬を持つ強酸性陽イオン交換樹脂を用いることは不利で
ある。本件発明者は、これ等の問題を解決すべく検討し
た結果、低交換容量の樹脂を用いることにより、すべて
解決出来ることを見出したものである。

本発明で用いる強酸性陽イオン交換樹脂とは官能基とし
てスルホン酸基を有するものである。スルホン酸基は遊
離スルホン酸基−ＳＱ．−Ｈ”となっている必要がある
が、−１ｉ１Ｂに塩型のものを含んでいてもよい。

本発明で用いる陽イオン交換樹脂の交換容量は０．０５
　〜１．１０ｅｑ／１−Ｒ，好ましくは０２〜０．８ｅ
ｑ／β−Ｒである。この範囲より交換容量が小さいと分
離能が失われ、一方交換容量がこの範囲より大きいと上
述した通常の樹脂を使用した場合の欠点が生じる。

本発明で用いる陽イオン交換樹脂の製法は特に制限され
ないが、一般には、ビニル基を有する単量体と　　　　
　　　　　　　架橋性単指体を共重合させて得られた架
橋高分子を反応条件の制御により交換容量が０．０５　
〜１．１０ｅｑ／ＩｌＲとなるようにスルホン化するこ
とにより得られる。

ここでビニル基を有する単ｌ体としては、スチレン、メ
チルスチレン、エチルスチレン、ビニルナフタリン、３
，４．６−｝リメチルスチレン、クロルスチレン、メト
キシスチレン、Ｎ．Ｎ−シメチルアミノスチレン、ニト
ロスチレン、クロルメチルスチレン、トリフルオルスチ
レン、トリフルオルメチルスチレン、アミノスチレン等
のスチレン誘導体、 ブタジエン、アクリロニトリル誘導体、アクリル酸、メ
タクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸クロロメチ
ル等のアクリル酸エステル、メタクリル酸シクロヘキシ
ル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリル酸
グリシジル、メタクリル酸メチル等のメタクリル酸エス
テルマレイン酸ジエチル、フマル酸ジエチル、メチルビ
ニルケトン、エチルイソブロピルケトン等のビニルケト
ン類、ビニリデン化合物、アクリルアミド誘導体、酢酸
ビニル、酪酸ビニル、カブリン酸ビニル等の脂肪酸ビニ
ルエステル、 エボキシブタジエン、スチレンスルホン酸、スチレンス
ルホン酸塩、スチレンスルホン酸ブチルエステル、メチ
ルビニルスルフイド等が挙げられる。

又、　　　　　　　　　　　架橋性単量体としては、ジ
ピニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタリ
ン、ジピニルエチルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジ
ビニルジフェニルメタン、ジビニルペンジル、ジビニル
スルホン、ジピニルケトン、ビス（ビニルビリジノエチ
ル）エチレンジアミン、フタル酸ジアリル、トリアリル
アミン、Ｎ，Ｎ’　一エチレンジアクリルアミド、エチ
レングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコ
ールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメ
タクリレート、トリメチルブロバントリアクリレート、
トリアルイソシアヌレート、ジアリルメラミン等が挙げ
られる。

好ましい陽イオン交換樹脂としては、 スチレン、ビニルトルエン、エチルビニルベンゼンとジ
ビニルベンゼンを主要成分として共重合して得られた架
橋高分子をスルホン化したもの、スチレンスルホン酸塩
、スチレンスルホン酸フチルエステル、メチルビニルス
ルフイド等の交換基になり得る基を有する単量体を主成
分とし、必要に応じ架橋性単量体と共重合したもの、フ
ェノールスルホン酸とホルムアルデビドとの縮重合体、 等の陽イオン交換樹脂が挙げられる。　本発明で用いら
れる強酸性陽イオン交換樹脂の架橋度は１〜２０％であ
る。架橋度が１％未満になると、機械的強度が低下し耐
圧性を失う。すなわち圧力により、変形し易くなり、カ
ラム内の圧力損失が増大する。また、樹脂からの溶出物
《ポリスチレンポリスルホネート》が増加する。逆に２
０％を越速 えると樹脂内の拡敗榛度が低下し、溶出ピークのブロー
ド化が生じ好ましくない。

強酸性陽イオン交換樹脂の粒径は特に限定されないが、
工業的には５０μｍ乃至６００μｍが好ましい。５０μ
ｍ未満になると圧力損失が大きくなる。また６００μｍ
を越えると圧力損失は小さくなるものの段数を確保する
為に長いカラムを用いる必要がある。また粒径の均一性
も高い方が好ましい。

本発明の対象となるモノヌクレオチドは、アデニル酸、
グアニル酸、シチジル酸、ウリジル酸、イノシン酸、キ
サンチル酸、プソイドウリジル酸、デオキシアデニル酸
、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸、デオヰシ
チミジル酸の異性体、および環状構造のリン酸を持つモ
ノヌクレオチド等である。

本発明は公知のいかなる分離工程によっても実施するこ
とが可能である。たとえば、単一のカラムを用い上部よ
り被分離液を注入し純水等の展開液を通液する、そして
カラム出口からの溶出液を適宜分画して、目的成分を回
収する方法がある。

また擬似移動床の様な連続工程を用いる方法もある。た
だし、クロマト分離操作はヌクレオチドの安定性を考慮
すると、１〜３０℃の範囲で行うことが好ましい。

（実施例） 次に実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に示す。

実施例−１ 架橋度４％、粒径１００〜２００μｍ１交換容量０．２
１ｅｑ／１−ＲのＨ型強酸性陽イオン交換樹脂２００ｍ
ｌを内径８止φのウォータージャケット付きガラス力ラ
ムへ充填した。ついで５′ＡＭＰ，５゜−ＣＭＰ．５゜
一ＧＭＰ，５゜−ＵＭＰの４種のヌクレチオドを各々約
１ｍｇ／ｍｊ＋の濃度で含む混合水溶液を２．０−カラ
ム上部よりフィードさせた後、流速１　６　０　ｒｎｌ
！／ｈｒすなわち線速度約３．５　ｍ／ｈｒの速さで純
水を展開液として通液した。この時のカラムジャケット
は循環水により５℃に保った。カラム下部より溶出する
液を５一毎に分画回収し、高速液体クロマトグラフィー
で分析を行い、第１図に示す溶出曲線を得た。

実施例−２ 架橋度ｌＯ％、粒径２００　〜３　０　０　μｍ’，交
換容量０．３９ｅｑ／ｌ−ＲのＨ型強酸性陽イオン交換
樹脂２０．０ｍｌ！を用い、実施例−１と全く同様の操
作及び分析を行い、第２図に示す溶出曲線が得られた。

実施例−３ 架橋度８％、粒径１５０〜２５０μｍ、交換容量０．６
２ｅｑ／ｌ−ＲのＨ型強酸性陽イオン交換樹脂２０．０
−を用い、実施例−１と全く同様の操作及び分析を行う
と、第３図に示す溶出曲線が得られた。

比較例−４ 架橋度８％、粒径２５０〜３００μｍ１交換容Ｉｔ．９
ｅｑ／ｌ−ＲのＨ型強酸性陽イオン交換樹脂２０．０ｍ
ｊ！を用い、実施例−１と同様の操作及び分析を行うと
、第４図に示す溶出曲線が得られた。

（発明の効果） 実施例および比較例から明白なように、低交換容量樹脂
はヌクレチオドの溶出に必要な溶離液の通液倍率が大幅
に少なくなる。またピークのブロード化も小さくなるな
どの効果がある。その他樹脂再生薬剤量も減らすことが
可能になるなどの経済的な利点を有している。

【図面の簡単な説明】

（１）第１図は実施例１で得られた溶出曲線である。 （２）第２図は実施例２で得られた溶出曲線である。 （３）第３図は実施例３で得られた溶出曲線である。 （４〕　　第４図は実施例４で得られた溶出曲線である
。 （以下余白） 濃度（Ｃノ／Ｃｏ） 濃度（Ｃ／Ｃｏ） 濃度（　Ｃ／Ｃｏ　） 濃度（Ｃ／Ｃｏ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 交換容量が、０．０５〜１．１０ｅｑ／ｌ−Ｒの強酸性
   陽イオン交換樹脂を用いることを特徴とするモノヌクレ
   オチドの分離方法。