JPH02264794A - Ｇｓａ―２結合性蛋白質の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、悪性腫瘍、特に消化器系癌の診断及び治療に
用いることができるＧ　Ｓ　Ａ　−２（Ｇｒｉｆｆ−ｏ
ｎｉａ　ｓｉｍｐＨｆｏｌｉａ　ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉ
ｎ−２）結合性蛋白質の調製方法に関するものである。

【従来の技術】

細胞の悪性化に伴い、細胞表層に存在する糖蛋白質や糖
脂質の糖鎖構造に変化を生じることが、モノクローナル
抗体を用いた研究によって明らかになってきている。こ
れら糖鎖の変化した腫瘍関連糖鎖抗原を検出することに
よって癌の組織学的診断及び血清学的診断が可能となり
、ＣＡ（Ｃａｒｂｏｎｈｙｄｒａｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ
）　ｌ　９−９やシアリル５ＳＥＡ−１等い（つかの腫
瘍関連糖鎖抗原が診断に利用されている。これらの腫瘍
関連糖鎖抗原はガラクトース（ＧａｌｌとＮ−アセチル
グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる基幹構造を有し
、これがフコース（Ｆｕｃ）やシアル酸（ＮｅｕＡｃｌ
によって修飾されたものが多い、ＣＡ１９−９＋シアリ
ルＳＳＥＡ−ｌもこのような構造を有している。これら
の腫瘍関連糖鎖抗原をマウス、ラット、兎、山羊あるい
は羊などの哺乳動物に免疫してこれらの抗原に対する特
異抗体を作成し、これを用いて組織学的あるいは血清学
的にこれらの抗原を検出することにより癌の診断を行な
っている。また、腫瘍関連抗原に対する特異抗体、特に
モノクローナル抗体をもちいて癌を治療する研究が行な
われている。

【発明が解決しようとする課題】

しかしながら、癌の診断に用いられる腫瘍関連糖鎖抗原
の癌性変化は発生した癌の部位、組織型及び分化度等に
よって極めて多様性を有している。そのため一つの腫瘍
関連糖鎖抗原で、全ての癌を診断することは回能である
。この欠点を補う方法として複数種の腫瘍関連抗原が開
発されており、それらをの組み合わせて癌の診断効率を
高めようとする試みなどがなされている。しかし、いず
れも未だ十分とは言い難いのが現状である。また、ある
種の腫瘍関連抗原に特異的に反応性を有する抗体を毒素
或は抗癌剤と結合させた複合体を用いて癌を治療する試
しみがなされているが、腫瘍特異性が充分とは言えず、
臨床的には満足すべき効果が得られるには至っていない
。

【課題を解決するための手段】

そこで本発明者らは、かかる課題に鑑みて、新規な腫瘍
関連糖鎖抗原を見出し、癌の診断効率を更に高めるべく
鋭意検討した。その結果、糖鎖の非還元末端Ｎ−アセチ
ルグルコサミン構造に特異的に反応するレクチンである
Ｇ　Ｓ　Ａ　−２（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａｓｉ＋ｍｐｌｉ
ｆｏｌｉａ　ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ−２）とに結合性
を有する糖蛋白質（Ｇ　Ｂ　Ｐ　：　Ｇ　Ｓ　Ａ　−２
Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｇｌｙｃｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）が高頻
度で癌細胞表層に存在することを見出した。そして癌の
治療及び診断に用いられる可能性を有する腫瘍関連抗原
であるＧＢＰを分離精製した。 本発明におけるＧＢＰは、癌患者から摘出した癌新鮮組
織より分離、採取することができる。即ち、癌患者から
摘出した癌組織を破砕し、有機溶媒を用いて脂質類等を
除去した後、界面活性剤を用いて糖蛋白質を可溶化して
抽出する。次いでその抽出液を濃縮した後、カラムクロ
マトグラフィにかけて分画しＧＳＡ−２との反応性を有
する画分を採取し、さらにその画分を集めてゲル濾過、
逆相高速液体クロマトグラフィ及び／又はアフイニティ
クロマトグラフィなどによってＧＳＡ−２結合性蛋白質
（ＧＢＰ）を得ることができる。 上記で用いられる有機溶媒は、例えばクロロホルム−メ
タノール混合液（容量比２：ｌ）やヘキサン−イソプロ
パン混合液（容量比３：２）等が好適である。界面活性
剤は、例えば３−［（３−フロラミドプロビル）−ジメ
チル−アンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（Ｃ
ＩＡＰＳ）、３−（（３−フロラミドプロビル）−ジメ
チルーアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンス
ルフォネート（ＣＩＡＰＳＯ）　、オフチルトグリコシ
ド、オクチルチオトグリコシドなどがある。 糖蛋白質の抽出は、脂質類の除去等の前処理を施した癌
組織の破砕物を界面活性剤含有緩衝溶液中に懸濁させ、
抽出を行なうのに充分な時間をかけて撹拌しながら行な
うのが好ましい、抽出用緩衝液中の界面活性剤濃度は限
界ミセル濃度以上から限界ミセル濃度の５倍濃度、好ま
しくは３倍濃度で行ない、液量は前処理を施した癌組織
破砕物の湿潤重量の５０倍重量程度まで、好ましくは２
０倍重量程度である。抽出条件は４℃程度、２４時間程
度で行なう。 糖蛋白質を抽出して精製し純度の高いＧＢＰを得るため
には、糖蛋白質をゲル濾過、逆相高速液体クロマトグラ
フィ及び／又はアフィニテイクロマトグラフィを用いる
。すなわち糖蛋白質の抽出液を透析等の処理をした後、
直接、ＧＳＡ−２固定化坦体を用いるアフィニティクロ
マトグラフイにかけることによってＧＢＰを分離・精製
することもできる。透析後の抽出液をゲル濾過及び／又
は逆相高速液体クロマトグラフィにかけて画分した後、
ＧＳＡ−２との反応性を有する画分を採取してからＧＳ
Ａ−２固定化坦体カラムを用いるアフィニティクロマト
グラフィにかけることにより高純度のＧＢＰを分離・精
製することもできる。 ゲル濾過及び／又は逆相高速液体クロマトグラフィによ
る各画分からＧＳＡ−２陽性画分を採取するには、各画
分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｅｙｌｓｕｌｆａｔ
ｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：５ＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた
後、ペルオキシダーゼ標識ＧＳＡ−２を用いたウェスタ
ン・プロツチング法により行なうことができる。

【発明の作用、効果】

上記本発明により調製されるＧＢＰを咄乳動物に投与す
ると抗体が造られる。その抗体を用いると、患者の血清
中に存在するＧＢＰを高い感度で正確且つ迅速に測定す
ることが可能となる。その結果、消化器癌等の診断に役
立つことになる。また、その抗体な制癌剤等と複合化す
ることにより、癌の治療に役立つことになる。

【実施例】

以下、実施例により本発明を詳述する。なお実施例中の
％は重量基準である。 実施例１ ヒト大腸癌新鮮組織９．５ｇをクロロホルム−メタノー
ル混合液（容量比２：１１５０（ｌｎｊ中でホモジナイ
ズし、室温で１時間撹拌した後、濾紙にて濾過した。そ
の残渣をクロロホルム−メタノール混合液（容量比１：
ｌ）　ｌｏＯｍｇで洗浄してからエタノール２００ｍｊ
で三回洗浄した後、蒸溜水に懸濁させて凍結乾燥して乾
燥重量１．２５ｇの試料が得られた。 この試料１．０ｇをＰＨ７，４の０．０１Ｍｏｌリン酸
緩衝生理食塩水に加えて、４℃で２４時間撹拌し３０Ｑ
Ｏｒｐｍ。 ６０分間の遠心分離による沈殿の後、残渣部分に０．０
１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水５０ａ＋１を加えて４℃
で２４時間撹拌し、上溝を前記の沈殿で得られた上清と
合わせて２２，０００ｒｐｍ　、３時間の遠心分離によ
る沈殿を行ない、得られた残渣部分を前の残渣部分と合
わせた。この残渣部分をＩ　ｍＭｏ１のジチオスレイト
ール及び２５ｍＭｏｌの３−［（３−フロラミドプロビ
ル）−ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルフォ
ネート（ＣＩ（ＡＰＳ）を含有する０、０１Ｍｏｌリン
酸緩衝生理食塩水５０ａｉｊを用いて、４℃、２４時間
で可溶化を行なった後、３０，０００ｒｐｍ　、　２時
間の遠心分離による沈殿を行なう。残渣部分を、１　ｍ
ｅａｌのジチオスレイトール及び１６＋＋＋ＭｏｌのＣ
ＨＡＰＳを含有する０、０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩
水５０ｍｇに加えて４℃、２４時間の撹拌を行なってか
ら３０，０００ｒｐＩｍ、　２時間の遠心分離処理する
。両方の上清を合わせて０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理
食塩水に対して透析を行なった。これを濃縮した後、８
　ｍＭｏ１のＣＨＡ　Ｐ　Ｓを含む０．０１Ｍｏｌ’Ｊ
ン酸緩衝生理食塩水を用いて、セファクリルＳ−４００
（ファルマシア社）カラムによりゲル濾過し、各画分か
らｌＯ＃１ずつを取ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた。その電気泳動が
終了後、２５Ｖで１．５時間の通電によりスラブゲルか
らニトロセルロース膜へ蛋白類を移した。 このニトロセルロース膜を３％牛血清アルブミンを含有
する　０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水でブロッキ
ングした後、ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標
ｊｌｉＧｓＡ−２溶液を加えて室温で１１１４間反応さ
せた。次に充分洗浄し、０．０４％の３．３°−シアミ
ノヘンジジン及び０．００３４％　（７）　ｕｘｏｔを
含む０．０１Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水からなる基質
溶液を加えて発色させた後、ＧＳＡ−２陽性画分を集め
て０．ＯＩＭｏｌリン酸緩衝生理食塩水に対して透析し
粗ＧＢＰ溶液を得た。 この粗ＧＢＰ溶液を、ＧＳＡ−２固定化セフアロース６
Ｂを充填したカラムに通してＧＢＰを吸着させた後、８
　ｍＭｏ１のＣＨＡＰＳを含むＰ）１３．５の０、ｌＭ
ｏ１酢酸緩衝液により吸着物を溶出させる。 この溶出後のＧＢＰを含む画分は、予めＰＨ８，５のｌ
Ｍｏ１トリス−塩酸緩衝液を入れておいた試験管に採取
して溶出に用いた酢酸緩衝液を直ちに中和する。溶出液
を濃縮した後、　　０．０ＩＭｏｌリン酸緩衝生理食塩
水に対して透析してから凍結乾燥することにより、４．
５　ＢのＧＢＰを得た。 実施例２ ヒト大腸癌新鮮組織９．５ｇをクロロホルム°−メタノ
ール混合液（容量比２：ｌ）　５０Ｏｓａｊ中でホモジ
ナイズし、室温で１時間撹拌した後、濾紙にて濾過した
。その残渣をクロロホルム−メタノール混合液（容量比
１：ｌ）　１００ｍ１で洗浄してからエタノール２００
１で三回洗浄した後５蒸溜水に懸濁させて凍結乾燥して
乾燥型ｆｉ　１．２５ｇの試料が得られた。 この試料１．０ｇをＰＨ７，４の０．ＯＩＭｏｌ’Ｊン
酸緩衝生理食塩水に加えて、４℃で２４時間撹拌し３０
（１０ｒｐＩｌ。 ６０分間の遠心分離による沈殿の後、残渣部分に０．０
１Ｍａｌリン酸緩衝生理食塩水５０１を加えて４℃で２
４時間撹拌し、上清を前記の沈殿で得られた上溝と合わ
せて２２，０ＱＯｒｐｍ　、　３時間の遠心分離による
沈殿を行ない、得られた残渣部分を前の残渣部分と合わ
せた。この残渣部分を１　ｍＭｏ１のジチオスレイトー
ル及び２５ｍＭｏｌの３−（（３−クロラミドブロピル
）−ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルフォネ
ート（ＣＩＡＰＳ）を含有する０、０１Ｍｏｌリン酸緩
衝生理食塩水５０＋ａｌを用いて、４℃、２４時間で可
溶化を行なった後、３Ｇ、０ＱＯｒｐ−、２時間の遠心
分離による沈殿を行なう、残渣部分を、ｌ　ａ＋Ｍｏｌ
のジチオスレイトール及び１６園ＭｏｌのＣＨＡＰＳを
含有する０、０℃Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水５０霧１
に加えて４℃、２４時間の撹拌を行なってから３０，０
ＱＯｒｐ−、２時間の遠心分離処理する０両方の上清な
合わせて０．０℃Ｍｏｌリン酸緩衝生理食塩水に対して
透析を行なった。透析した抽出液を濃縮した後、ＧＳＡ
−２固定化セフアロース６Ｂを充填したカラムに通して
ＧＢＰを吸着させた後、８　ｍＭｏ１のＣＨＡＰＳを含
むＰＨ３，５のＯ，ｌＭｏ１酢酸緩衝液により吸着物を
溶出させる。この溶出後のＧＢＰを含む画分は、予めＰ
Ｈ８，５のｌＭｏ１トリス−塩酸緩衝液を入れておいた
試験管に採取して溶出に用いた酢酸緩衝液を直ちに中和
する。溶出液を濃縮した後、　　０．０１Ｍｏｌリン酸
緩衝生理食塩水に対して透析してから凍結乾燥すること
により、３．４ＢのＧＢＰを得た。 特許出願人　　信越化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、癌新鮮組織から細胞膜に存在する糖蛋白質類を分離
   し、次いで該糖蛋白質類を分画した後、ＧＳＡ−２との
   反応性を有する画分を採取することを特徴とする癌組織
   中に存在するＧＳＡ−２結合性蛋白質の調製方法。 ２、癌新鮮組織から細胞膜に存在する糖蛋白質類を分離
   する際に、癌組織を破砕し脂質類等を除去した後、界面
   活性剤を用いて該糖蛋白質を可溶化して分離することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載のＧＳＡ−２結合
   性蛋白質の調製方法。 ３、癌新鮮組織から分離した糖蛋白質類を分画する際に
   、ゲル濾過、逆相高速液体クロマトグラフィ及びアフィ
   ニティクロマトグラフィのうちの１または複数の分画手
   段によりなされることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載のＧＳＡ−２結合性蛋白質の調製方法。