JPH02190767A - グロビンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産栗上例利朋分駅 本発明は、血清中の、ハプトグロビンに結合しているノ
ンヘム−グロビン（下記に定義する）を定量する方法に
関するものである。

従来外技拵 ヘモグロビンは、グロビンとヘムより成る。成人ヘモグ
ロビンは、α鎖とβ鎖と呼ばれる２対のポリペプチドか
ら成る４量体である。高等動物のヘモグロビンは赤血球
中に高濃度に存在するが、一部はハプトグロビンと結合
して、血清中にも存在する。遊離のヘモグロビン分子と
しては、血清中にはほとんど存在しない。

しかしながら、血清を採取する場合、溶血が起きる可能
性功１あり、人為的操作の結果として、得られた血清試
料に、ハプトグロビンに結合していない、遊離のヘモグ
ロビン分子が混在する場合がある。したがって、生体内
の血清中におけるヘモグロビン分子の性状を知るために
は、血清試料より、ハプトグロビンに結合していない、
遊離のヘモグロビン分子を除去し、同時に、ハプトグロ
ビンに結合している全グロビン画分を採取する必要があ
る。

また、血清中の、ハプトグロビンに結合するグロビンは
、通常ヘムの　ムしこグロビン（ヘモグロビン）として
存在するが、本発明者らは、アルツハイマー型痴呆や脳
血管性痴呆等の痴呆性疾患の患者血清中に、ハプトグロ
ビンに結合する。きムの　八していないグロビン（以下
、「ノンヘム−グロビン」という。）が存在することを
初めて見出した。したがって、これらの血清中の、ハプ
トグロビンに結合しているノンヘム−グロビンだけを定
量する方法も、現在まで見出されていない。

・【■を　２−　る； 本発明オらは、上記の各点を克服し、血清中の、ハプト
グロビンに結合しているノンヘム−グロビンを定量する
方法を見出し、本発明を完成させた。

本発明を利用することにより、ヒ１〜及び動物の上記痴
呆性疾患を診断することが期待される。

舌−゛　　るこめの− 本発明は、血清中の、ハプトグロビンに結合しているノ
ンヘム−グロビンを定量する方法に関するものであり、
さらに詳しくは、血清試料より、ハプトグロビンに結合
していないヘモグロビン分子を除去し、同時に、ハプト
グロビンに結合している全グロビン画分を採取し、次に
、残存画分中の、■ハプトグロビンに結合している全グ
ロビンの濃度を測定し、次いで、■ハプトグロビンに結
合しているヘモグロビン濃度を測定し、［１］と［２］
の差を求めることにより、もとの血清試料中の、ハプト
グロビンに結合しているノンヘム−グロビン濃度を定量
する方法に関するものである。

血清試料より、ハプトグロビンに結合していないヘモグ
ロビン分子を除去し、同時に、ハプトグロビンに結合し
ている全グロビン画分を採取することは、例えば、ゲル
濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニテ
ィクロマトグラフィー法、及び、限外濾過法の、いずれ
か一つ又は二つ以上を組み合わせて用いることにより、
行なうことができる。ゲル濾過法、イオン交換クロマト
グラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法を用
いるときは、高速液体クロマトグラフィー法によっても
よい。

ゲル濾過法を行なう場合には、セファデックス、セファ
ロース、セファクリル（ファルマシア社製）等の担体を
充填したカラムを使用しての液体クロマトグラフィー法
、Ｔ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌカラム（東ソー（株）製）等を使
用しての高速液体クロマトグラフィー法などが用いられ
得るが、好適には高速液体クロマトグラフィー法が用い
られる。

イオン交換クロマトグラフィー法を行なう場合には、Ｄ
ＥＡＥセルロース、ＤＥＡＥセファセル（ファルマシア
社製）等の陰イオン交換体、又は、０Ｍセルロース、Ｃ
Ｍセファロース（ファルマシア社製）等の陽イオン交換
体を充填したカラムによる液体クロマトグラフィー法、
ＴＳＫｇｅｌカラム（東ソー（株）製）等を使用しての
高速液体クロマトグラフィー法、ＭＯＮＯＱカラム（フ
ァルマシア社製）等の陰イオン交換カラム、又は、ＭＯ
ＮＯＳカラム（ファルマシア社製）等の陽イオン交換カ
ラムによるＦＰＬＣ法（商品名：　ＦＰＬＣ：ファルマ
シア社製を使用）などが用いられ得るが、好適にはＦＰ
ＬＣ法が用いられる。

アフィニティクロマトグラフィー法を行なう場合には、
アルブミン等の蛋白質を特異的に吸着させるブルーセフ
ァロース（ファルマシア社製）、γ−グロブリン等の蛋
白質を特異的に吸着させるプロティンＡセファロース（
ファルマシア社製）等の担体を使用しての、カラム法又
はバッチ法などが、除去すべき夾雑蛋白質の種類に応じ
て用いられ得る。

限外濾過法を行なう場合には、通常用いられている限外
濾過膜を使用しての、遠心操作による方法、圧力をかけ
る方法などが用いられ得る。

ハプトグロビンに結合している全グロビン画分中の、ハ
プトグロビンに結合している全グロビンの濃度を測定す
ることは、例えば、電気泳動法、免疫測定法、及び、高
速液体クロマトグラフィー法のいずれか一つ又は二つ以
上を組み合わせて用いることにより、行なうことができ
る。

電気泳動法を用いる場・合には、ハプトグロビンに結合
している全グロビン画分について、レムリ（Ｌａｅｍｎ
ｉｌｉ）の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　
　ｐｐ、６８０−６８５、　（１９７０））にしたがっ
て、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない
、グロビンのα鎖及びβ鎖に相当する、１４及び１５キ
ロダルトンの位置のバンドを比色定量することにより、
全グロビンの濃度の測定が可能である。

免疫測定法を用いる場合には、グロビンのα鎖及びβ鎖
に対する抗体を使用し、ハプトグロビンに結合している
全グロビン画分中の該α鎖及びβ鎖の容量を、酵素免疫
測定法又はラジオイムノアッセイにより測定し、この総
和を求めることにより、該画分中の、全り七ビンの濃度
の測定が可能である。

高速液体クロマトグラフィー法を行なう場合には、前述
した、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、
又は、アフィニティクロマトグラフィー法や、あるいは
、ＹＭＣパック・カラム（（株）山村化学研究所製）等
の逆相方ラムを利用しての逆相クロマトグラフィー法な
どが用いられ得るが、好適には逆相クロマトグラフィー
が用いられる。

ハプトグロビンに結合している全グロビン画分中の、ハ
プトグロビンに結合しているヘモグロビン量を測定する
ことは１分光光学測定法を用いることにより、行なうこ
とができる。

すなわち、ヘモグロビン蛋白質は、４１２　ｎｍの波長
において光吸収のピークがある（蛋白質・核酸・酵素、
第８巻、６０９頁、（１９６３））ことを利用して、残
存画分の４１２　ｎｍの吸光度を測定し、次式にしたが
って該両分のヘモグロビンの濃度を算定することができ
る。

求めるヘモグロビンの濃度をＳ　μｇ／ｍｌとして（た
だし、Ａ　１　ｃ　、、は、該画分の４１２　ｎｍの吸
光度であり、８２．５は、Ａ４ｃ、＝１．ＯＯＯのとき
の標準ヘモグロビン濃度を表わす。）である。

このように、ハプトグロビンに結合している全グロビン
画分中の、■ハプトグロビンに結合している全グロビン
の濃度を測定し、次いで、■ハプトグロビンに結合して
いるヘモグロビン濃度を測定し、［１］と［２］の差を
求めることにより、該画分中の、ハプトグロビンに結合
しているノンヘム−グロビン濃度を定量することが可能
になる。さらに、この濃度を、もとの血清中のハプトグ
ロビンに結合しているノンヘム−グロビンの濃度に換算
することができる。

以下、実施例において本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されない。

実施桝 （１）血清試料よりのハプトグロビンに結合していない
ヘモグロビン分子の除去及びハプトグロビンに結合して
いる全グロビン画分の採取。

５＝Ａｉｃ、、Ｉｘ８２．５ （、）アフィニティクロマトグラフィー法及びイオン交
換クロマトグラフィー法 正常人、アルツハイマー型老年痴呆患者及び脳血管性痴
呆患者よりの各血清０．５　ｍｌを、１００　ｍｌのト
リス塩酸緩衝液（２０１１Ｍ、　ｐＨ７，４：以下調製
緩衝液と呼ぶ。）で４℃にて一晩透析した。この溶液を
１４．０００　ｒ、ｐ、ｎ＋、で１０分間遠心し、不溶
性蛋白質を除いた。上清画分のうち０．４　ｍｌを、調
製緩衝液で平衡化した１２倍量（４，８ｎ１１）のブル
ーセファ０−スＣＬ６Ｂ（ファルマシア社製）カラムに
４℃にて供与し、非吸着画分を採取した。

すなわち、初めに流出される液（上清両分の２倍量：　
０．８　ｍｌ）は棄却し、次に流出される液（上清画分
の１０倍量：　４　！ｌ１ｌ）を採取した。

この非吸着画分のうち２　ｍｌを調製緩衝液で平衡化し
たＭＯＮＯＱ　ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社製）
に４℃にて供与し、同緩衝液を用いて、流速１ｍ１７分
、の条件下でＯ−０，５Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度
勾配により溶出した。塩化ナトリウム濃度０．１８８−
０．２０１　Ｍの範囲の溶出画分（８００μｌ）を採取
した。例として、アルツハイマー型老年痴呆患者血清よ
り該両分を得たときの溶出パターンを第１図に示す。縦
軸は２８００ｎにおける吸収、横軸は保持時間を表わす
。図の斜線で示される両分を採取し、これを各血清より
のハプトグロビンに結合している全グロビン画分（ａ）
とした。

（ｂ）ゲル濾過法 実施例（１）の（ａ）に記載した各血清０．５ｆｆ１１
を４℃にて１４．０００　ｒ、ｐ、ｒａ、で１０分間遠
心し、不溶性蛋白質を除いた。上滑両分を孔径０．４５
μｍのエキクロディスク１３（ゲルマンサイエンスジャ
パン（株）製）にて濾過し、この溶液のう？）　２００
μｍを、０．２　Ｍの塩化ナトリウムを含有する調製緩
衝液で平衡化したＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷカラ
ム（７，５ｍｒｓ　ＩＤ　ｘ　６００　ｍｍ　：東ソー
（株）製）に供与した。流速０．５　ｍｌ／分の条件下
で、室温にて溶出し、保持時間２１−３０分の画分（４
，５ｎｉ１）を採取した。例として、アルツハイマー型
老年痴呆患者血清より該両分を得たときの溶出パターン
を第２図に示す。縦軸は２８０　ｎｍにおける吸収、横
軸は保持時間を表わす。図の斜線で示される両分を採取
し、これを各血清よりのハプトグロビンに結合している
全グロビン画分（ｂ）とした。

（２）■ハプトグロビンに結合している全グロビン画分
中の、ハプトグロビンに結合する全グロビンの濃度の測
定 （、）電気泳動法 正常人の血液に３．２％クエン酸ナトリウムを９＝１の
割合で混和させ、３．０００　ｒ、ｐ、ｍ、で、１０分
間遠心した。遠心後、沈降した赤血球を採取した６次い
で、酸化ヘモグロビン法（臨床検査法概要（金原出版）
　ｐｐ、２３７）により、赤血球を蒸留水と混和させ、
溶血させた。１４．０００　ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠
心後、上清画分を採取し、ヘモグロビン溶液とした。こ
の標品中の蛋白質はほとんどヘモグロビンである（上記
臨床検査法概要（金原出版）ｐｐ、２３７）ことより、
通常のアミノ酸分析法により蛋白質量を測定し、上記標
品中のヘモグロビン量を決定した。

次に、０．２Ｍの塩化ナトリウムを含有する調製緩衝液
を用いて、Ｏ〜５０μｇ／ｍｌの各濃度のヘモグロビン
溶液を作成し、各溶液について、レムリの方法（前記Ｎ
ａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　ｐｐ、６８０−６８
５゜（１９７０））に従って、５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なった。すなわち、各溶液１０μ
ｍを、１０μｍの還元剤を含まない５ＤＳ−サンプルバ
ッファー（前記Ｎａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　ｐ
ｐ、６８０−６８５．　（１９７０））と混和して、５
分間煮沸した。この試料（２０μｍ）を１５％アクリル
アミドゲルに供与し、泳動した。

泳動後、銀染色法（商品名：電気泳動用銀染色キットワ
コー：和光純薬（株）製を使用）でゲルを染色した。次
いで、２波長クロマトスキャナＣ８−９３０（（株）島
津製作所製）を用いて、ヘモグロビンのα鎖及びβ鎖に
相当する、１４及び１５キロダルトンの位置の二つのバ
ンドの５３０　ｎｕにおけるデンシティ−をまとめて測
定した。この結果を第３図に示す。図中、縦軸は、５３
０　ｎｍにおける二つのバンドを合計したデンシティ−
１横軸は、各溶液のヘモグロビン濃度（α鎖及びβ鎖の
総量）を表わす。この図で示されるように、ヘモグロビ
ン濃度Ｏ〜３０μｇの範囲においては、吸光度はヘモグ
ロビンの濃度に比例した。この吸光度の測定法では、ヘ
モグロビンもノンヘム−グロビンも同一のものとして測
定される。したがって、未知の試料について吸光度より
全グロビン（ヘモグロビン及びノンヘム−グロビン）濃
度を求めることが可能である。

この測定系を用いて、ハプトグロビンに結合している全
グロビン画分中の全グロビン（ヘモグロビン及びノンヘ
ム−グロビンの二種が含まれる。）の濃度を測定した。

例として、実施例（１）の、ハプトグロビンに結合して
いる全グロビン画分（ｂ）について測定した結果を次に
記載する。この両分について、上記の方法で電気泳動を
行なった。対照として上記のヘモグロビン標品、分子量
の指標として分子量マーカー蛋白質標品（バイオラット
社（株）製）を同時に泳動した。泳動後、ゲルを上記銀
染色法で染色した。この結果を、第４図に示す。

図中、レーン１は分子量マーカー、レーン２及び３はア
ルツハイマー型老年痴呆患者血清よりの、ハブ１〜グロ
ビンに結合している全グロビン画分（ｂ）、レーン４及
び５は脳血管性痴呆患者血清よりの、ハプトグロビンに
結合している全グロビン画分（ｂ）、レーン６及び７は
正常人血清よりの、ハプトグロビンに結合している全グ
ロビン画分（ｂ）、レーン８はヘモグロビン標品をそれ
ぞれ泳動した結果である。図中の矢印は、グロビンのα
鎖及びβ鎖に相当する、１４及び１５キロダルトンのバ
ンドを示している。

予め濃度の確定しているヘモグロビンの上記の二つのバ
ンドを対照として、各画分中の上記の二つのバンドを比
色定量することにより、各画分中のグロビン濃度（α鎖
及びβ鎖の総量）を測定することができた。

（ｂ）グロビンの精製及び同定 実施例（２）■（、）に記載した電気泳動法で示される
１４及び１５キロダルトンの位置のバンド（第４図矢印
参照）を指標にして、実施例（１）の（ａ）に記載した
各血清より、ハプトグロビンに結合している全グロビン
（ヘモグロビン及びノンヘム−グロビンの二種が含まれ
る。）を精製した。次いで、通常のクロマトグラフィー
の操作法を用いてα鎖及びβ鎖を分離し、各々のＮ末端
のアミノ酸配列の解析をした。正常人、アルツハイマー
型老年痴呆患者及び脳血管性痴呆患者のいずれの血清に
存在する上記グロビンも、すべて公知のヒトヘモグロビ
ンのＮ末端アミノ酸配列と同一の配列をもつことが同定
された。例として、正常人血清中の、ハプトグロビンに
結合している全グロビンの精製及び同定について次に記
載する。以下、すべて上記の電気泳動法で１４及び１５
キロダルトンの位置のバンドを示す両分を分画、採取す
る方法で精製操作を進めた。

正常人血清５　ｍｌを４℃で、１４，０００　ｒ、ｐ、
ｍ、、１０分間遠心した。上清画分をミリポアメンブレ
ンフィルター（０，４５μｍ　二日本ミリポア工業（株
）製）にて濾過し、この濾液のうち３　ｍｌを、０．２
Ｍの塩化ナトリウムを含有する調製緩衝液で平衡化した
ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ３０００ＳＷカラム（２１，５ｍｍ
　ＩＤｘ　６００　ｍｎ５）に供与した。室温にて、２
ｍ１７分の流速にて溶出し、保持時間４０−６５分の画
分（５０ｍｌ）を採取した。この両分は、分子量約２０
００−１５０キロダルトンに相当する範囲に含まれ、し
たがって、このゲル濾過の操作により、ハプトグロビン
に結合していない、遊離のヘモグロビンは除去されたこ
とになり、同時にハプトグロビンに結合している全グロ
ビン画分が採取されたことになる。この両分を、４℃の
条件下で、ｚｌの調製緩衝液に対して２回、それぞれ５
時間ずつ透析した。

この試料を、調製緩衝液で平衡化したＭＯＮＯＱＨＲ１
０／１０カラム（ファルマシア社製）に４℃にて供与し
、同緩衝液を用いて、流速１ｍ１ノ分の条件下で、０−
０．３　Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配によ・り溶
出した。０．２２　Ｍ　−０，２７Ｍの範囲の塩化ナト
リウム濃度に相当する両分（５，５ｍｌ）を採取した。

この両分を、４℃にて、ＩＪＬの蒸留水で透析し、その
後凍結乾燥した。

この凍結乾燥粉末を、２％ＳＤＳ及び０．２Ｍの食塩を
含有する１　ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ
、　ｐＨ７，０）に溶解し、５分間煮沸した。

この試料のうち０．５　ｍｌを、０．１％ＳＤＳ及び（
７，５ｍｍ　ＩＤ　ｘ　６００　ｍｍ）に、室温にて供
与した。

０．５　ｍｌ／分の流速で溶出し、保持時間２８〜３０
分の画分（画分Ａ：２ｍ１）、及び、３０〜３２分の画
分（画分Ｂ：２ｍ１）をそれぞれ採取した。

次に、この二つの両分それぞれについて、逆相高速液体
クロマトグラフィーを行なった。

各両分を、８ｘのアセトニトリルを含有する、０．１％
　トリフルオ酢酸で平衡化したしたＹＭＣパック・カラ
ムＡＰ−８０２３００Ａ　Ｃ４（４，６ｍｍ　ＩＤ　ｘ
　１５０ｍｍ：（株）山村化学研究新製）に、室温にて
全量供与した。溶出は、すべて０．５ｍｌ／分の流速で
行なった。初めの３分間で、邸のアセトニトリルを含有
する、０．１％トリフルオ酢酸を用いて非吸着画分を溶
出させ、次に、保持時間３〜３３分において、８〜４８
％の直線勾配でアセトニトリルの濃度を上昇させ、保持
時間３３〜４０分において、４８％のアセトニトリルの
濃度が保たれるように溶出した。

各両分について、それぞれ上記クロマトグラフィー操作
を行ない、画分Ａについては保持時間３２．５〜３４分
の画分（０，７５ｍｌ　：画分Ａ′）、画分Ｂについて
は保持時間３４．５〜３６．５分の画分（１ｍｌ＝画分
Ｂ’　）をそれぞれ採取した。

両分へ′及び両分Ｂ′の一部について、前述した電気泳
動法を行ない、両分へ′は１５キロダルトンの、両分Ｂ
′は１４キロダルトンの単一のバンドを示した。

さらに、両分Ａ′及び両分Ｂ′について、４７０Ａプロ
テイン・シークエンサー及び１２０Ａ　　ＰＴＨアナラ
イザー（アプライドバイオシステムス社（株）製）を用
いての通常の方法によるＮ末端アミノ酸配列の解析を行
ない、両分へ′の蛋白質はグロビンβ鎖の、両分Ｂ′の
蛋白質はグロビンα鎖の、すでに公知のＮ末端アミノ酸
配列（生化学データブック［日本生化学会編、東京化学
同人］、■、２３１〜２３５頁）を有することが見出さ
れた。

アルツハイマー型老年痴呆患者及び脳血管性痴呆患者の
血清に存在する上記グロビンについても同様の結果が得
られた。

■ハプトグロビンに結合している全グロビン画分中の、
ハプトグロビンに結合しているヘモグロビン濃度の測定 実施例（２）■（、）に記載した方法に従って、正常人
の血液よりヘモグロビンを分離した。０．２にの塩化ナ
トリウムを含有する調製緩衝液を用いて、０〜２００μ
ｇ／ｍｌの各濃度のヘモグロビン溶液を作成した。各溶
液について、室温にて、ハプトグロビン（ミドリ十字（
株）製）を過剰量加え、ヘモグロビンとハプトグロビン
を試験管内にて人為的に結合させた。最終的に、θ〜１
００μｇ／ｍｌの各ヘモグロビン濃度の、ヘモグロビン
−ハプトグロビン結合体溶液を得た。

ヘモグロビンは、試験管内ではほとんどが酸素結合型で
、４１２　ｎｍにおいて光吸収のピークがある（蛋白質
・核酸・酵素、第８巻、６０９頁、（１９６３））こと
を利用して、各ヘモグロビン濃度の、上記ヘモグロビン
−ハプトグロビン結合体溶液の４１２　ｎｍの吸光度を
測定した。この結果を第５図に示す。図中、横軸は各溶
液のヘモグロビンの濃度、縦軸は４１２　ｎｍの吸収を
表わす。この図で示されるように、ヘモグロビン濃度０
〜１００μｇの範囲においては、吸光度はヘモグロビン
の濃度に比例し、したがって、未知の試料について吸光
度よりヘモグロビン濃度を求めることが可能である。

すなわち、試料のヘモグロビン濃度を Ｓ　Ｐｇ／ｍｌとして、 Ｓ　　”　　ＡｓＣ−ｘ　　８２．５ （ただし、Ａ　Ｉ　ＣＢは、試料の４１２止の吸光度で
あり、８２．５は、Ａｔｃｔ＊＝１．０００のときの標
準ヘモグロビン濃度を表わす。）である。

この測定系を用いて、ハプトグロビンに結合している全
グロビン画分のヘモグロビンの濃度を測定した。

（３）ヒト血清中の、ハプトグロビンに結合しているノ
ンヘム−グロビン濃度の算定 実施例（２）■（ａ）の方法により、ハプトグロビンに
結合している全グロビン画分中の全グロビン濃度を測定
し、実施例（２）［２］の方法により、該画分中のヘモ
グロビン濃度を測定した。

該画分中の、ハプトグロビンに結合しているノンヘム−
グロビンの濃度は、次式によって求められる。

ノンヘム−グロビン濃度を　Ｎ　μｇ／ｍｌ　　として
、 Ｎ＝Ｄ−５ （ただし、Ｄ　、ｃｚｇ／ｍｌは全グロビン濃度、　Ｓ
μｇ／ｍｌはヘモグロビン濃度を示す。）である。

例として、正常人血清１８検体、アルツハイマー型老年
痴呆血清２０検体、脳血管性痴呆１７検体より得た、実
施例（１）の（ｂ）に記載の、ハプトグロビンに結合し
ている全グロビン画分（ｂ）について、上記式に従って
ハプトグロビンに結合しているノンヘム−グロビン濃度
を算定し、もとの血清中の濃度に換算した値を第６図に
示す。

図中、縦軸は各検体の、血清中のハプトグロビンに結合
しているノンヘムーグ狛ビン濃度を示し、Ａ群は正常人
血清、Ｂ群はアルツハイマー型老年痴呆患者血清、０群
は脳血管性痴呆患者血清を示す。

アルツハイマー型老年痴呆患者血清及び脳血管性痴呆患
者血清中の、ハプトグロビンに結合しているノンヘム−
グロビン濃度は、正常人血清中の該濃度に比べて、１％
以下の危険率で有意に高値第１図は、ヒト血清試料のア
フィニティクロマトクロマトグラフィー非吸着画分につ
いてイオン交換クロマトグラフィー法を行なったものの
溶出パターンを示す。第２図は、ヒト血清試料について
ゲル濾過法を行なったものの溶出パターンを示す。第３
図は、電気泳動法により、ヘモグロビン標品のグロビン
量を測定した結果を示す。

第４図は、各種血清よりの、ハプトグロビンに結合して
いる全グロビン画分の電気泳動のパターンを示す。第５
図は、分光光学測定法により、ヘモグロビン標品のヘモ
グロビン量を測定した結果を示す。第６図は、各検体の
血清中のハプトグロビンに結合しているノンヘム−グロ
ビン濃度を示す。

第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清中の、ハプトグロビンに結合しているノンヘム
   −グロビンを定量する方法。 ２、請求項１記載の、血清中の、ハプトグロビンに結合
   するノンヘム−グロビンを定量する方法において、 （１）血清試料より、ハプトグロビンに結合していない
   ヘモグロビン分子を除去し、ハプトグロビンに結合して
   いる全グロビン画分を採取し、次に、 （２）該画分中の、 ［１］ハプトグロビンに結合している全グロビンの濃度
   を測定し、 次いで、 ［２］ハプトグロビンに結合しているヘモグロビンの濃
   度を測定し、 ［１］と［２］の差を求めることにより、もとの血清試
   料中の、ハプトグロビンに結合しているノンヘム−グロ
   ビン濃度を算定する、請求項１記載の定量する方法。 ３、請求項２記載の方法のうち、血清試料より、ハプト
   グロビンに結合していないヘモグロビン分子を除去し、
   同時に、ハプトグロビンに結合している全グロビン画分
   を採取する方法において、ゲル濾過法、イオン交換クロ
   マトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法
   、及び、限外濾過法の、いずれか一つ又は二つ以上を組
   み合わせて用いる、請求項２記載の定量する方法。 ４、請求項２又は３記載の方法のうち、ハプトグロビン
   に結合している全グロビン画分中の、［１］ハプトグロ
   ビンに結合している全グロビンの濃度を測定し、 次いで、 ［２］ハプトグロビンに結合しているヘモグロビンの濃
   度を測定する方法において、 ［１］の測定法においては、電気泳動法、免疫測定法、
   及び、高速液体クロマトグラフィー法のいずれか一つ又
   は二つ以上を組み合わせて用い、 ［２］の測定法においては、分光光学測定法を用いる。 請求項２又は３記載の定量する方法。