JPH02174799A

JPH02174799A - 魚類成長ホルモン

Info

Publication number: JPH02174799A
Application number: JP63264928A
Authority: JP
Inventors: Shusaku Sakata; 修作坂田; Takashi Kiyota; 隆清田
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1988-10-20
Publication date: 1990-07-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は魚類の成長ホルモンに関し、詳しくは、カレイ
ロ、サケ目等の魚類にを効な成長ホルモンポリペプチド
に関する。

従来の技術及び発明が解決しようとする課題成長ホルモンはを推動物の脳下垂体から分泌されるポリ
ペプチドホルモンでその主たる生理作用は成長促進効果
であることが知られている。哺乳類ではヒトをはじめウ
シ、ウマ、ヒツジ、ブタ、クジラなどが、また鳥類では
ニワトリより成長ホルモンポリペプチドが単離され構造
が決定されている。

一方、下等を推動物である魚類についてもテイラピア、
チョウザメ、コイ、シロサケ、ウナギ、カツオ、ブリ等
で成長ホルモンポリペプチドが単離され構造が明らかに
されている。このうちシロサケ、ウナギ、ブリ等では遺
伝子の構造も明らかになっている＠これらの知見では魚種によって成長ホルモンのアミノ酸
配列が異なることが示されている。たとえばブリとサケ
の成長ホルモンの相同率を見ると６６％と同じ魚類のう
ちでも互いにかなり異なることが判明している。またそ
の生物活性すなわち成長促進効果においても種特異性が
報告されている。これらのことから、有効な促進効果を
得るためには、特定の魚類にその魚類由来の成長ホルモ
ンを投与することが良いと考えられる。

今日、ヒラメの養殖は日本各地で行われ、ヒラメの養殖
産業における位置は非常に重要なものとなってきている
。

本発明者らは、ヒラメ脳下垂体から成長ホルモンを抽出
しそれがポリペプタイドであることを同定し、分子量、
アミノ酸組成からこれが他の魚類のそれと類似し、さら
にヒラメ、ニジマスの稚魚等に投与することにより著し
い成長促進効果を得ることができることを見い出し本発
明を達成した。

課題を解決するための手段すなわち、本発明は、カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体
より抽出して得られる魚類の成長ホルモンに関するもの
である。また本発明は下記の理化学的性質を有するポリ
ペプタイドである硬骨魚類の成長ホルモンに関するもの
である。

（ｉ）アミノ酸組成・・・第１表記載のとおり（ｉ１）
分子量　約２２，０００（ｉｌｌ）等重点　約７．１（ｉｖ）リシルエンドベブチターゼによって消化し、得
られたペプチドフラグメントが下記アミノ酸配列を有す
る。

フラグメント■ Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｇ、ｇｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓフラグメン
ト■ Ｖａ、５−Ｇ、ｇｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｖａ、５−Ａ、５ａ−Ｌｙｓまた、これらのフラグメントに加え、フラグメント■と
して下記のアミノ酸配列を有するものが良い。

フラグメント■ Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｔｕ−Ａ
、（ａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕさらにまた、ブロムシアンによって分解し、得られたＣ
末端フラグメントが下記アミノ酸配列を有するものが良
い。

Ｃ末端フラグメントＨｉｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙ　ｒ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｔ−Ａｔａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｈａ−Ａｓ
ｎ−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ−Ｌｅｕに関するものである。

また、本発明は、カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体より
抽出して得られる魚類、特に硬骨魚類の成長ホルモンに
関するものである。

さらに本発明は、その成長ホルモンを魚類に投与し、該
魚類の成長を促進する方法に関するものである。

実施例以下に、具体的実験を記載し、本発明をさらに詳細に説
明する。

実験１：ヒラメ成長ホルモンの抽出と精製１年齢のヒラ
メより脳下垂体を摘出しただちに液体窒素で凍結後便用
時まで一８０℃保存した。

ヒラメ４６０匹より摘出した脳下垂体３．３ｇを水冷中
で磨砕後１００ａ１２の水冷アセトンで脱脂し、遠心分
離後沈澱を５ｍＭＥＤＴＡに懸濁し、懸濁液を水酸化カ
ルシウムでｐＨを９〜１０に調整し、４℃で１時間アル
カリ抽出を行った。抽出液は遠心分離しその上清を蒸溜
水で透析した。透析物は凍結乾燥し、４８３　ｍｇの粉
末を得た。

実験２：ヒラメ成長ホルモンの精製上記で得た粉末を１０艷の０．０５Ｍ酢酸アンモニウム
水溶液（ｐＨ９，０）に溶解し、同溶液で平衡化したセ
ファデックスＧ−１００カラムにより分画した。溶出条
件は前流２００−１流速１８−７時とし試験管１本あた
りの分取量を４ｍ１２とし、２　ｇ　０　ｎｓの吸光度
でタンパク含量をＤＩ定し、５つの両分を得た（第１図
）。第１図に示す画分３を凍結乾燥し、２２．２ｍｇの
白色粉末を得た。

さらにこれを０．０５Ｍ３Ｊ７炭酸アンモニウム水溶液
５０ｄ２に溶解し、同溶液で平衡化したＤＥ−５２カラ
ムにより分画した、０．０５Ｍ５０．２Ｍ。

０．４Ｍ、１Ｍの重炭酸アンモニウム水溶液を用いて陰
イオン交換クロマトグラフィーを行い２８０ｎ■の吸光
度でタンパク質量を測定し、６つの画分を得た（第２図
）。第２図に示す画分２を凍結乾燥し、３　ｔａｇの白
色粉末を得た。さらにこれをＯＤＳ　１２ＯＴカラムに
より高速液体クロマトグラフィーにかけ精製した。高速
液体クロマトグラフィーの溶出条件は０．１％トリフル
オロ酢酸、アセトニトリル２０〜８０％直線勾配、カラ
ム温度４０℃、流速１−７分とし、２２０ｎ量の吸光度
でタンパク含量を測定しヒラメ成長ホルモン画分を分取
した。得られた画分６（第３図）０．６ｍｇは下記に示
すような物理化学的性質を示した。

実験３：物理化学的特性の測定ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で上記ホルモン
を展開し、ヒラメ成長ホルモンは約２２゜０００の分子
量を持つことがわかった。また同時に該成長ホルモンは
単一バンドを与えた。またこの成長ホルモンは等電点ゲ
ル電気泳動において等電点が約７．１であることがわか
つた。

実験４ニアミノ酸組成の分析アミノ酸組成の分析方法は成長ホルモンを６Ｎ塩酸で加
水分解したのち、フェニールイソチオシアナート（ＰＩ
ＴＣ）でアミノ酸をフェニールチオカルバミル誘導体に
変換後、逆相高速液体クロマトグラフィーで分離し定量
するＰＴＣ法に従った。

結果を第１表に示した。

第１表アノ　　酸　　組　　成ｙｓｓｐＧｔｕｅｒｉｓＧ名ｙＡｒｇＴｈｒ、Ａ、５ａＰｒ。

ｙｒａｆｅｔＩ　ヱｅＬｅｕＰｈｅｒｐｙｓ４゜１１゜２４゜２３゜４゜１１゜６゜６゜１０゜４゜４゜１０゜１゜７゜２４゜１２゜１　。

１２゜第１表から明らかなように、当該成長ホルモンは、グル
タミン酸、ロイシンを多量に含むことを確認し、他の魚
類の成長ホルモンと同様の傾向を示すことが明らかであ
る。

実験５：リシルエンドペプチターゼ消化によるフラグメ
ントのアミノ酸配列当該成長ホルモン２００μｇを８Ｍ尿素を含む０．１Ｍ
炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，２）に溶解し、３．４
μｓ　（ｆｆｉ量比１／６０）のりシルエンドペブチタ
ーゼを溶かしたＯ、１Ｍ炭酸アンモニウム（ｐＨ８，２
）を加え、３７℃、１２時間反応させる。

反応物を高速液体クロマトグラフィーに付し、そのフラ
グメントを回収した。そのフラグメント■および■につ
いて、マニュアル・エドマン法によりアミノ酸配列を測
定した結果、以下の結果を得た。

フラグメント■ Ｌｅｕ−８ｅ　ｒ−Ｇｔｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓフラグメン
ト■ Ｖａ　ｔ−Ｇｔｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ
−Ｖａ、ｇ−Ａｔａ−Ｌｙｓまたフラグメント■を同様にして得て測定し、以下の結
果を得た。

Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｉｕ−Ａ
ｔａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ実験６：ブロムシアン分解によるＣ末端フラグメントのアミノ酸配列。

当該成長ホルモン２００μｇを７０％ギ酸に溶解し、２
μＭの結晶ブロムシアンを加え、暗所にて室温で２４時
間反応させる。

反応物を凍結乾燥した後、高速液体クロマトグラフィー
に付し、そのフラグメントを回収した。

そのうちＣ末端フラグメントと思われれるものについて
、マニュアル・エドマン法によりアミノ酸配列を測定し
た結果、以下の結果を得た。

Ｃ末端フラグメントＨｉ　５−Ｌｙｓ−Ｖａ、５−Ｇ、５ｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＶａＪ！−ＡＪａ　−Ｌｙｓ−Ｃ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　　−Ｐｒｏ−Ｇ、５ｕ
−Ａ、５ａ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ　　−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ実験７：免疫染色またカツオ成長ホルモンの抗体を用いてウェスタンブロ
ッティングにより免疫染色を行い、得られた精製物が成
長ホルモンであると確認された。

実験８：生理活性の測定岬化後６ケ月齢（ｉ６〜２０ｇ）のニジマス−群１０匹
を個体識別し、それぞれの腹腔内に前記のヒラメより単
離された成長ホルモン、比較として生理食塩水のみをそ
れぞれ４日おきに４回、魚体重ｇ当り０．０１μｇ、０
．１μｇ投与した。

なお、飼育は１５℃条件でニジマス体重の１゜５％量の
餌量を朝夕２回に分けて与えて行なった。

第１回の投与から１７日後の体重増加を第２表に示した
。

また同様に、体重１０〜１５ｇのヒラメの幼魚を同様に
２０℃で飼育し、投与から１７日後の体重増加を測定し
てその結果を第２表に併せて記載した。

以上の結果から明らかなように、本願で言う成長ホルモ
ンはヒラメ、ニジマス等の成長促進に有効であることが
判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は脳下垂体をセファデックスＧ−１００カラムで
分画したときの溶出パターンを示す図、第２図は、第１
図の画分３をＤＥ−５２カラムで分画したときの溶出パ
ターンを示す図、第３図は、第２図の画分２を０ＤＳ−
１２０Ｔカラムで分画したときの溶出パターンを示す図
である。特許出願人　　　日本石油株式会社第２表第３鯖６で工円間（労）

Claims

【特許請求の範囲】〔１〕カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体より抽出して得
られる硬骨魚類の成長ホルモン。〔２〕下記の理化学的性質を有するポリペプタイドであ
る硬骨魚類の成長ホルモン；（ｉ）アミノ酸組成・・・第１表記載のとおり（ｉｉ）
分子量約２２，０００（ｉｉｉ）等電点約７．１（ｉｖ）リシルエンドペプチターゼによって消化し、得
られたペプチドフラグメントが下記アミノ酸配列を有す
る。フラグメント［１］【遺伝子配列があります】フラグメント［２］【遺伝子配列があります】〔３〕下記の理化学的性質を有するポリペプタイドであ
る硬骨魚類の成長ホルモン；（ｉ）アミノ酸組成・・・第１表記載のとおり（ｉｉ）
分子量約２２，０００（ｉｉｉ）等電点約７．１（ｉｖ）リシルエンドペプチターゼによって消化し、得
られたペプチドフラグメントが下記アミノ酸配列を有す
る。フラグメント［１］【遺伝子配列があります】フラグメント［２］【遺伝子配列があります】フラグメント［３］【遺伝子配列があります】（ｖ）ブロムシアンによって分解し、得られたＣ末端フ
ラグメントが下記アミノ酸配列を有する。Ｃ末端フラグメント【遺伝子配列があります】〔４〕カレイ目ヒラメ科魚類の脳下垂体より抽出して得
られる請求項３または４に記載の魚類成長ホルモン。〔５〕請求項３または４に記載の成長ホルモンを魚類に
投与し、該魚類の成長を促進する方法。〔６〕魚類がサケ目魚類またはカレイ目魚類であること
を特徴とする請求項５に記載の方法。