JPH0216977A - システインプロテイナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、／ステインプロテイナーゼ、そのラフ造、並
びにその使用方法に関し、さらに詳しくは、本明細書中
で、「アナナイン（ａｎａｎａｉｎ）ｊおよび「コモサ
イ７　（ｃｏｍｏｓａｉｎ）Ｊと呼ぶ’　２　ＴｊＦ！
頽の酵素、；１ｆ２びに分離、精製を含むその８＋２造
方法、特に、パイナツプルの茎（ステム）の抽出物から
の該酵素の分離、精ラフ、および該酵素を含有する、Ｏ
Ｑ傷の焼伽組織における抄成壊死組織除去（辺縁切除）
に１Φ用される医薬組成物に関するものである。

［従来技術とその課題］ 様々なシステインプロテイナーゼが、幾つかの熱帯植物
の乳液および樹液中に見出されている。

良く知られた例に、カリ力　パパヤ（Ｃａｒｉｃａ　ｐ
ａｐａｙａ）乳８１からのパパイン（ＥＣ３，４，２２
，２）かある。その他、パイナツプル植物（Ａ　ｎａｎ
ａｓ　　ｃ。

ｍｏｓｕｓ）の１３および茎から発見されたステム・ブ
ロメライン（ｓｔｅｍ　ｂｒｏｍｅｌａｉｎＸＥｃ　　
３．　４．　２２゜／Ｉ）かある。

タンパク質分解酵素の応用範囲は広範囲に及ぶが、その
内、かなりＬ１三目されている分野は、火傷、じょ＜ｒ
ｉ性潰瘍、圧壊死、および床ずれ等による焼癲ｉ１１織
の「１！期における抄成壊死組織除去処置（消化および
分離）への適用である。例えば、火傷や床ずれにおける
失活組織は日和見感染性病原菌にとって好適な培地であ
り、多くの重篤な火傷患者における高頻度で、致死的な
敗血症の原因となっていた早期に抄成壊死組織を除去す
るために、ピルビン酸、タンニン酸、サリチル酸、スト
レプトキリー−セ、トリブ／ンおよびパパイン等の様々
な物ＩＣ１の（小用が試みられてきた。しかしなから、
そのような試みは、許容し得ない程の副作用や、活およ
びじょく痢性潰瘍等、様々な原因による焼癲組織の除去
過程を促進するのに用い得る。そのような用途に、酵素
製剤を特異的に適用することができる。本発明は、この
ことにも関するものである。さらに詳しくは、本発明は
、少なくとも１種類の本発明のシステインプロテイナー
ゼと、少なくとも１種類の共学的に許容し得る担体とを
含有する医弐け１１成物を提供するものである。

上記の如く、アナナインは、生化学的に他と区別される
ンステインブロテイナーゼである。これは、２　Ｃ３、
０００に対して約２５，０００と、プロメラインと比較
して分量計がやや低く（後述）、より塩Ｊ、Ｉ：　（Ｉ
＋の強いタンパク質てあって、ｐｉは８．０以１．であ
り、陰極電気泳動における移動速度が速い（後述）。ア
ナナインのフィブリンに対するタンパク質分解活性はプ
ロメラインの２倍であり、また、アナナインは、合成基
質に対して異なった特異Ｐ１を示す（後述）。アナナイ
ンは、重複免疫拡散（タプル・イムノティフュージョン
）プレート分析により、プロメラインと免疫学的に異な
ることが性の低さの故に不成功に終っている。

［課題を解決するだめの手段］ 本発明は、免疫学的に区別される、分子１１；、約２５
．０００の、異なった正味電イ：：Ｉ（終電イ：：ｌ、
　１１０１　Ｃｈａｒｇｅ）を有することを特徴とする
システインプロテイナーゼを提供するものである。

本発明の好ましい１実施態様は、プロメラインや他の既
知のプロテイナーゼと全く穴なるＪ、１（’７’ｉ特異
性および特性を持った、パイナツプル植物原料から単離
され（ｒ￥るアナナインに関連する。他の好ましい実施
態様は、同様の原料から１１？ることか′Ｃきる別のシ
ステインブロテイナーセであって、これもまた、パイナ
ツプル・ステム（茎）に（ｊ存するとされている他の２
種のプロテイリーーセ七は５′・：なる性質を有するコ
モサイノに関連する。

また、本発明は、それらの製）；ｙ方法であ・〕で、パ
イナツプル植物原料、好ましくは、粉末化された茎から
分離し、１１′ｊ製する上程を含む方法を提供するもの
である。

これらのタンパク質分解酵素は、火傷、床ずれ分かった
（後述）。アナナインがンステインブロテイナーセ類に
属しているのは、その全活性を発揮する上でチオール化
合物を必要とすると共に、その種類に特異的な阻害物質
であるＥ−６／Ｉ［Ｌ３−カルボキ／−２，３−ｔｒａ
ｎｓ−エポキシプロピオニル−ロイシルアミド（４−グ
アニジノ）フタン］およびニワトリのンスタチンにより
阻害されるからである（後述）。

さらに詳しくは、パイナツプル由来の主たるブロテイナ
ーゼであるブロメラインに比べてアナナインのハイド・
パウダー・アズール（皮粉末アズール）およびフィブリ
ン基質に対する活性は高いが、アゾカゼイン基質に対す
る活性は低い。またアナナインは、合成基質である、α
−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１７−フＪ、ニルア
ラニル−Ｌアルキニル７−（４−メチル）クマリルアミ
ド（ＺＰ　ｈｃ−Ａ　ｒｇ　−Ｎ　ＨＭｅｃ）をも加水
分解するか、この基質はプロメラインによっては極めて
わずかしか加水分解されない。そのＪλ質特５°シ性お
よび免疫学的反応性における相界に鑑み、アナナインは
おそらくプロメラインとは別の、特有の遺伝子からｉＩ
Ｊられる産物であると考えられる。

コモ→Ｊインについて言えば、その物理化学的な性″Ｃ
１の大部分、；１ｒ２ひに、分子量および電荷はアナナ
インと共ノ勇するか、合成基質に対する特異性が５＋４
　、、ている（後述）。他のシステインプロテイナーゼ
同様、全活性の発現にチオール化合物を必要とし、その
縮性はＥ−６４によって阻害される。

本発明の酵素は、一般に、通常の調製用高速液体クロマ
トグラフィー（ＦＰＬＣ）、陽イオン交換クロマトグラ
フィー（ｐｉ−１５、０）等、該酵素か既知のプロメラ
イン画分よりもはるかに遅く溶離するようなＪｊｌノ、
を用いて得ることかできる。現在では、通常、山肌の１
■パイナ、プルエキス粉末を本発明のプロテイナーセの
９％給源として用いている。しかしなから、生のパイナ
ツプルの茎や該植物の他の部分を用いて調製したものも
適する。さらに詳しく述へると、Ｉ）ｈａｒｍａｃｉａ
（ファルマシア）ＦＰＩ−Ｃノステムと０．０５→１，
０Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０のグラ７エント溶離と
を用いる陽イオン交換樹脂（Ｍｏｎｏ　Ｓ）により、抽
出物をクロマトグラフ処理する。様々な基質を用いて両
分のンステインブロテイナーセ活性を分析し、その様々
な基質特異性に基いてＳ′＋２なるブロテイナーゼを同
定する。

本発明のンステインブロテイナーセは、薬学的に許容し
得る担体と混合して患者に投′Ｕすることができる。一
般に好ましい投与経路は、火傷または潰瘍部位への局所
投与である。医薬製剤は、ガーセバソドのような非活性
な包帯製品に適用される滅菌溶液の形や、直接、傷に適
用されるゲルや軟膏の形であってよい。完全な創面除去
に至るまでに数回適用する必要があるだろう。滅菌溶７
１ｋ、好ましくは水溶液または水性懸、濁液には、活性
成分（類）以外にアーサー・オーツル（Ａｒｔｈｕｒ　
０ｓｏｌ）編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐ　ｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｃａｌ　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅｓ。

第１６版、Ｍａｃｋ出版、ＥａｓＬｏｎ、、ＰＡ、　Ｕ
ＳＡ等の一般的な薬学試験書に記載されているように、
バッファー塩類または担体を含有させてよい。ゲルまた
は軟膏製剤はさらに、薬学的に許容し得るポリエチレン
グリコール、ヒアルロン酸、カルバポルまたはグリセロ
ールのような増量剤を含有すてあろう。

それらの医Ｐａ２剤は、システィンブロテイナーゼを活
性形で含有していてもよいか、活性部位である／スティ
ン残基がジスルフィド架橋の半分を形成している、不活
性形であることが好ましい。

残る半分は、例えばアミノ酸システィンのような共学的
に許容し得るチオール化合物からなる。本発明の製剤は
、システィンブロティナーゼの凍結乾燥製剤と水溶液と
を使用直前に混合して調製することができる。酵素が不
活性形であるときにはンステイン等の活性化物質を加え
て遊離のプロテイナーセ活性部位チオールを再生させる
必要かある。

本発明のシステインプロテイナーゼおよび組成物は焼痴
尉１織の抄成壊死！（］織除去に有用である。

添イ・１図面は、以下のとおりである。

第１図は溶出液量に対してＡ　ｔｏｏをプロットしたグ
ラフであって、ＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｓ　　ＨＲ］０／Ｉ
　０（ｐＨ５，０）により分画した租ステムブロメライ
ンの基質加水分解と勾配組成を表す。

第２図は溶出ｔＩｋＨ士に対してＡ　７１１０をプロノ
トシたグラフであって、Ｆ　ＰＬＣＭｏｎｏ　Ｓ　　Ｉ
−ＩＲ５１５（ｐ＋−１９，０）により分画したアナナ
インの基質加水分解と勾配組成を表す。

第３図は溶出液量に対してＡ　、ｅｎをプｌ’　、ｔ・
したグラフであって、Ｆ　Ｐ　Ｌ　ＣＭｏｎｏ　Ｓ　　
ｌ−Ｉ　Ｒ５１５（ｐ＋−１９，０）により分画したコ
モサインのＪ、（質加水分解と勾配組成を表す。

第４図はプロメラインおよびアナナインのＳＤＳゲル電
気泳動の結果を示す図である。

第５図はプロメラインおよびアナナインのマルチゾーン
の陰極ゲル電気泳動の結果を示す図である。

第６図はプロテイナーゼ阻害物質Ｅ−６４によるアナナ
イン定量のデーターをプロットシたグラフである。

第７図はプロメラインおよびアナナインを重複イムノテ
ィフュージョン（免疫拡散）法に１１；けた結果を示す
図である。

第８図はりん酸緩衝化食塩水（Ａ）、コモサイン（Ｂ）
４３よびアナナイン（Ｃ）による火傷ラットの抄成壊死
組織除去効果を表すグラフである。

以）゛に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

夫１７ｆｆｌ惰１↓　パイナツプル・ステム（茎）粗抽
出物からのアナナインの精製 パイナツプル・ステム粗抽出物を、シグマ（Ｓｉｇｍａ
）（１３ｒｏｍｅｌａｉｎ、　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ、
　　Ｂ　２２５２）から購入し、５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液、１ｍＭＥ　Ｄ　ＴΔ、０．０１％すｌ・リウ
ム・アジド、ｐＨ５０に溶かした。これを２．２μｍフ
ィルターに通し、Ａ＋、、、（１％）＝２０．Ｉ［ムラ
チ（Ｍｕｒａｃｈｉ、　Ｔ、）およびヤスイ（Ｙ　ａｓ
ｕｉ、　Ｍ、　）　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４．
２２７５−２２８２１を用い、２８０ｎｍの吸収に基い
てタンパク質含有里を測定した。次いて、得られた製品
を、実質−ヒ、キモパパインについて記載された方法［
バドル（Ｂｕｔｔｌｅ、　Ｄ、　Ｊ、）およびバレ。

１・（Ｂａｒｒ（！Ｌｔ、　Ａ、　Ｊ、）Ｂ　：ｏｃｈ
ｅｍ、　Ｊ　、　　２２３．８１８８．１９８４］に従
い、ＦＰＬＣシステム（Ｆａｒｍａｃｉａ）のＭｏｎｏ
　Ｓ　　ＨＲ］　Ｏ／　Ｉ　Ｏカラムを用い、流速２．
０ｆｆρ／分で、酢酸ナトリウム（ｐｌ−１５。

０）の０．０５→１．ＯＭによるグラデイエンド溶離を
行うことにより、クロマトグラフ処理した。

カラムにタンパク質８０ｙｇを適用し、終濃度が２ｍＭ
となるのに十分な量の］００ｍＭヒドロヒドロキシエチ
ルジスルフィドた試験管に、４ｍ夕のフラクションを採
取した。Ａ　、ａｏのプロットおよび勾配組成は、自動
的に得られた。各フラクションを緊密に密封し、分析し
て次工程に使用するまで４°Ｃで保存した。Ｎａ”が０
．３３〜０．３９Ｍの間、および０．４１−０．４４Ｍ
の間で溶出するピークをとり、夫々「プロメラインピー
ク１−１および［ブロメラインピーク２」と命名した。

ナトリウムイオン濃度０．６０〜０．７０Ｍで溶離する
アナナインおよびコモサインに富んだフラクション（ピ
ーク３、添付の第１図参照）を濃縮し、Δｍ１ｃｏｎ濃
縮／透析容器中で、５０ｍＭりん酸ナトリウム；エチレ
ングリコール（２：］）、］ｍＭＥＤＴΔ、００１％ナ
トリウムアジド、ｐＨ６，８に対し、４°Ｃで濃縮し、
透析した。このピークをコモサインノ精製に用いた（実
施例２）。タンパク質約１０ｘｇを含有するこの物質の
一部にジチオスレイトールまたはンステインを、夫々、
終濃度が２ｍＭまたは４ｍＭとなるように加え、４°Ｃ
で２０分間活性化した。

次いで、これを、”Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ−アミノヘキ
サノイル−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｙ−セミカ
ルバジド［リッチら（Ｒｉｃｈ、　Ｄ、　Ｈ，）Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、　　２３５．７３１−７３／Ｉ、
１９８６］のＩｊｌＣカラムにかけ、次いで、−１ユ記
緩衝液ｔＯＷりを適用した。次いで、ジスルフィド、即
ち、ヒドロキシエチルジスルフィド（５０ｍＭ）、２，
２“−ジピリジルジスルフィド（１，５ｍＭ）またはン
ステインの飽和濾液（１ｊ！ののいずれかを含有する５
０ｍＭギ酸すＩ・リウムエチレンノグリコール（２：ｌ
）、１ｍＭＥＤＴＡ、００１％ナトリウムアンド、ｐｉ
（４，０を適用し、カラムをこの緩衝液中に２０℃で一
夜放置し、その後、同緩衝液２ｚＱで溶離した。次いで
、りん酸すトリウム緩衝液でカラムを再平衡化した。次
いで、ジスルフィド中に溶出した物質を１００ｍＭ塩化
ナトリウム、２５ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、］ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．０１％すトリウムアジド、ｐｔ１９゜０で平
衡化したＭｏｎｏ　Ｓ　　ＨＲ５／　５カラムに適用し
た。次いで、このカラムを同緩衝液中、３００ｍＭ　　
ＮａＣ１までの線状グラジェント（ＩＯｍＭＮａ’／１
１のにより流速０．５ｄ／分で溶離した。

フラクション（０，２＋のをヒドロキンエチルジスルフ
ィドが２ｍＭとなるように含有する試験管に採取した。

このクロマトグラフィーにおける主ピーク（０，１８−
０，２］Ｍ　　ＮａＣｌで溶出）即ら、Ｚ−Ｐｈｅ−Δ
ｒｇ−ＮＨＭｃｃには活性であるが、２Ａ　ｒｇ　−Ａ
　ｒｇ　−Ｎ　ＨＭｅｃには低活性のピークを分取して
等量の２５ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｊｍＭＥＤＴＡ、
０．０１％ナトリウムアンド、ｐｉ−１９０で希釈し、
上記のＭｏｎｏ　Ｓ　　Ｉ−ＩＲ５１５カラムに適用し
、同様に溶離した（添付の第２図参照）。

Ｚ　−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｒｇ　−Ｎ　ＨＭｅｃに対して活
性な両分を分取し、１０容■の］ｍＭＥＩ）ＴΔに対し
て３回透析した後、凍結乾燥した。

実施例２　コモサインの精製 実施例１記載のごとく、パイナツプル・ステムのｌ’ｌ
　ｌ抽出物をクロマトグラフィー処理し、酢酸ナトリウ
ｌ−０，６０−０，７０Ｍの間に溶出するアナナインお
よびコモサインに富むピーク（第１図）を濃縮し、透析
した。次いで、Ｇ　Ｉｙ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｙセミ
ノノルハジド含有ゲルではな（、”　Ｓ　ｅｐｈａｒｏ
ｓｅアミノヘキサノイル−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−セミカルバ
ジドしリッチら（Ｒｉｃｈ、　Ｄ、　Ｈ，）前掲］を用
いる他は実施例１記載のごとくにしてアフィニティーク
ロマトグラフィーを行った。次いで、ジスルフィド中に
溶出した物質を１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ四
ホウ酸すトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、００１％ナトリウ
ムアジド、ｐＨ９，０で平衡化したＭｏｎｏ　Ｓ　　ｌ
−Ｉ　Ｒ５／　５カラムに適用した。次いで、このカラ
ムを同緩衝液中、３００ｍＭ　ＮａＣｌまでの線状グラ
ジエン）（Ｉ　ＯｍＭ　Ｎａ’／ｉので流速０５Ｒ０／
分で溶離した。フラクション（０，２ＲＩ２）をヒドロ
キシエチルジスルフィドを２ｍＭとなるように３打する
試験管に採取した。０．１１０．１５ＭＮａ’で溶出し
、Ｚ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ｎ　Ｔ−Ｉ　Ｍｅｃ
アズール３３１ｇを含有する懸濁液３００μＱを加えた
。回転ラック（ｒｏｌｌｉｎｇ　ｒａｃｋ）中で（２ｒ
ｅｖ／ｍ１ｎ）／１０°Ｃで２０分間、試験管をインキ
ュベートした。Ｏ，］Ｍモノクロロ酢酸ナトリウム、０
．２Ｍｍ酸−Ｊ−Ｉ−’Ｊ　’／　Ａ緩衝液、ｐＨ４，
３ノ１．０ｘ（ｌを加えて反応を終了させた。遠心（１
２００ｘｇ、５分間ルた後、上清のＡ、８５を測定した
（表１参照）。

（３）フィブリンアッセイ・ このアッセイはハイド・パウダー・アズールおよびアゾ
カゼインに関するプロトコールを応用して行った。フィ
ブリンは、シグマがら購入した。

被検試料を上記のｐ＋（６，８緩衝液２５０μａに入れ
、／ＩＯ℃で５分間、活性化した後、予め暖めておいた
０、０１％ブリジ３５を加えて７００μρとし、６％の
水中フィブリン（ｗ／　ｖ）　２５０μａを加えた。回
転ラック中（２ｒｅｖ／　ｍ１ｎ）、４０’Ｃて６゜分
間、試験管をインキュベートした。０．１Ｍモノクロロ
酢酸すトリウム、０．２Ｍ酢酸ナトリウムｔｒｉ　ｆｉ
ｔ液、ｐ＋（／１．３の５ｘｌ！を加えて反応を終了さ
せた。未消化のフィブリンをろ去し、可溶化されに対し
て活性なピークを分取し、実施例１記載のごと（にして
同様のＭｏｎｏ　Ｓ　　ＨＲ５／　５カラムに適用した
（添付の第３図参照）。Ｚ−Ａｒｇ−ＡｒｇＮＨＭｅｃ
に対して活性な両分を分取し、実施例１のごとくにして
透析し、凍結乾燥した。

実施例３　タンパク質基質の分析 （１）アゾカゼインア、セイ。

ＢｕｔｔｌｅおよびＢ　ａｒｒｅｔＬの記載に従ってタ
ンパク質分解活性を分析した（前掲）。

（２）ハイド・パウダー・アズール・アッセイこのアッ
セイはＢ　ａｒｒｅｔｔらの方法（Ｂ　ｉｏｃｂｅｍ、
　Ｊ１８１．４０１−／１０８．１９７９）をシステイ
ンプロテイナーゼに応用して行った。

ハイド・パウダー・アズールは、シグマか’Ｊ１７人し
た。被検試料を０．／ＩＭりん酸ナトリウム、４ｍＭＥ
ＤＴＡ、８ｍＭジチオスレイｌ−−ル、ｐ　ｌ−１６，
８（７）２５０μ（！＋＝入れ、４０′Ｃで５分間、活
性化した後、予め暖めておいた０、０１％ブリジ（Ｂｒ
ｉｊ）３５を加えて７００μａとし、基質懸濁液、即ち
、Ｑ　、　５　Ｍ　／ヨ糖］ｆＱ中にハイド・パウダー
・たフィブリンの量を２８０ｎｍで測定した（表１参照
）。

（４）アゾフールアッセイ：アゾコールは、シグマから
購入した。被検試料を」二記のｐＨ６，８緩衝液１２５
μρに入れ、４０”Ｃで５分間、活性化した後、予め暖
めておいた０、０１％ブリジ３５を加えて４００μＱと
し、０．６Ｍショ糖に懸澗した３％アゾコール（ｗ／Ｖ
）　］　ＯＯμρを加えた。回転ラック中（２ｒｅｖ／
　ｍ　＋　ｎ）、４０°Ｃで２０分間、試験管をインキ
ュベートした。２０％（Ｗ／　Ｖ）　ｌ・リクロロ酢酸
５００μρを加えて反応を終了させた。遠心した後、上
清のＡ　５２０を測定した。

人−↓　タンパク質基質に対するシグマ゛°ブロメライ
ンパの３つの主ピークの相対的酵素活性相対的酵素活性 （アゾカゼインに対して 規格化した任意の単位） ピーク１　　ピーク２　ピーク３ アゾカゼイン　１０００ アゾコール　　２０７８ フ′ルーハイド０７６５ パウダー １０００　　　１．０００ ２．０＋４　　　１．７０８ １．０００　　　４．４０１ ビーク１（プロメライン）は、添付の第１図において０
３３〜０．３９ＭＮａ”で溶出した物質である。

ビーク２（プロメライン）は、添付の第１図において０
４１〜０．４４ＭＮａ”で溶出した物質である。

ビーク３（アナナインおよびコモサイン）は、添付の第
１図において０．６０〜０．７０Ｍ　Ｎａ”で溶出した
物質であり、これをアナナインおよびコモサインの精製
に用いた。

実施例４一連のアミノメチルクマリルアミド含有基質に
対する、精製プロメライン、アナナインおよびコモサイ
ンの相対活性 用いた酵素は、精製されたアナナインおよびコモサイン
（実施例Ｉおよび２）およびブロメライン、即ち、セフ
ァロース（Ｓ６ｐＨａｒｏｓｅ）−アミノヘキサノイル
−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｙ−セミカルバジドの
カラムに、上るアフィニティークロマトグラフィー（こ
かけ、次いで、１ｍＭＥｌ）ＴＡ中で透析し、凍結乾燥
したものである、クロマトグラフィー精製シグマグロメ
ライン（カタログ番号Ｂ５］７１４）を用いた。プロテ
イナーセを、実施例８に記・ドアしたように、Ｅ−６４
滴定によって標定した。

Ｚ−Ｐ　ｈｅ　−Ｃ１ｔ−Ｎ　ＨＭｅｃおよびＢｏｃ−
ＧｌｙＮｌ−ＩＭｅｃは、ケンブリ、ジ・リサーチ・バ
イオケミカルスに注文して合成させた。Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐ
ＩＩＧＣｉｔ−ＮＨＭｅｃは、グレイ博士（Ｄｒ、Ｃ，
Ｊ、Ｇｒａｙ）（ＤｅｐｓｒｔｍｅｎＬ　ｏｒ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｊｓＬｒｙ、　　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ　Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ、　　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　　Ｕ
、に、）から提供された。他の基質は全てＢ　ａｃｈｅ
ｍ（スイス）から購入した。

酵素試料をｐＨ６，８の活性化緩衝液（実施例３）２５
０μρ中で５分間活性化し、予ｆｆｆｉｉ加温したＯＯ
１％ブリジ３５を加えて７５０ｔｔ（ｌとした。水中に
入れた基質（２０μＭ）２５０μρを加えて反応を開始
した。４０℃で１０分子ｔｊｌ　）ＩＩＩ温した後、０
１０Ｍモノクロロ酢酸、０．２０Ｍ酢酸すトリウム緩衝
液、ｐＨ４、３を１奸加えて反応を終了さゼた。遊離さ
れた７−アミ７〜４−メチルクマリンによる蛍光を蛍光
々度肝で測定（励起３６０ｎｍ、発光（蛍光）４６０ｎ
ｍ）Ｌ、０．５μＭのクマリンの測定値が１０００単位
となるように標準化した（即し、せいぜい１０％の基質
が加水分解している）。

結果は、ｊｐ離されたクマリンｎＭ／分／活性な酵素ｎ
Ｍ（表２参照）で表されている。

表　２　種々の合成りマリルアミド基質に対するアナナ
イン、プロメラインおよびコモサインの活性 ノ汝１准クマリン（ｒ＋Ｍ）／分／活性酵素（ｎＭ））
に　ｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ア
ナナイン　　　フ゛ロメライン　　　］］モ号インＺ−
Ｐｌ＋ｃ−Ａｒｇ−１２，１２゜２　　　　８７Ｚ−＾
ｒｇ−＾ｒｇ−０，３２１６，７２６３ＪＺ−Ｐｈｃ−
Ｃｉｔ−２４，Ｑ　　　　　　０　　　　　　１９　３
Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｃ−Ｃｉｔ−１５３，００６３，３１
１ｚ−１’ｂｃ−１’ａｌ−Ａｒｇ−Ｈ６，０３，９１
＋８．０Ｚ−１’ｈｃ−ＭｃＬ−２，５０，６４０Ｇｌ
ｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈａ−０，１１，１０１１ｏｃ
−Ｇｌｙ−００，６０ Ｚ　　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ−０，２０Ｑｌｌｏｃ−
Ｖａｌｌ”ｒｏ−Ａｒｇ−Ｄ、＋　　　　　　　０　　
　　　　　　　　０Ｇｌｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−０００ Ｓｕｃ−（八１ａ）ｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−０００（１３
ｏｃ、Ｌ−ブチルオキシノノルボニル、Ｂｚ、ベンゾイ
ル、Ｃｉｔ、シトルリン、Ｇｌｔ、グルタリル、Ｓ　ｕ
ｃ、サクシニル） 実施例５　アナナインおよびプロメラインによる２種の
蛍光性（フルオリメトリック）基質の加水分解の動力学 本実施例で用いたアナナインは、実施例１記載の方法で
得られたものであり、プロメラインは、実施例４記載の
ものと同様であって、コモサインは実施例２と同様にし
て得られたものである。

Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃおよびＺ−Δｒｇ−Ａ
ｒｇ−ＮＨＭｅｃの加水分解における速度定数Ｋｍ＜ミ
ハエル定数）およびＫｃａｔ（ターンオーバー救）を求
める為に、Ｏ，ＩＭりん酸ナトリウム、ＩｍＭＥＤＴＡ
、２ｍＭジチオスレイトールおよび０．００７％ブリジ
３５中、４°Ｃで反応の１）Ｊ速度を測定した。

酵素（活性部位滴定により決定される、活性化し得るプ
ロメラインおよびアナナインの終濃度はＩＸ　ｌ　０−
１１Ｍ〜ｌ　Ｘ　］　０−９Ｍとする）または１００倍
希釈したコモサイア５０μρを、蛍光測定用のセル内で
、４倍ａ度の緩衝液０　、７５　ｘ（！！、イＯ°Ｃで
２分間、活性化し、予め加温した０、０１％１％プリ加
えた後、基質を加えて終容量を３．０ＭＱとした。撹拌
下、温度Ｊ、１整したセルを用い、基′ｔ１の加水分解
が１０％以下になるような条件下で、蛍光々瓜１）１に
よって連続的に速度を測定した（３６０ｎｍ励起、’１
６０ｎｍ１０００基質濃度は０．５〜１００７１Ｍの範
囲であった。直接的な、フロノドの線状化およびＳに対
するｓ／ｖ値（Ｖは生産物の生成速度）をプロットする
ことでチーターを図式化した［ヘンダーソン（１−１ｅ
ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｐ、　Ｊ　、　Ｆ、）Ｔｅｃｈｎｉ
ｃｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅ　
Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１３　＋　１３．１−４３、＋９７８］。Ｋｍ値および
ＫｍａＸ値（特定の酵素濃度において最大の生産物生成
速度表す）を、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、
　Ｇ、　Ｎ）の方法［Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、、８
０．３２４．−３３２．１９６１　］で算出した。

速度定ｊ７　Ｋ　ｍおよびＫ　ｃａＬを表３に示す。

１−Ｉ　ＣＩンステムを採用した。標準タンパク質、ホ
スポリラーゼａ、１００，０００．　　トランスフェリ
ン、７８，０００、ウソ血清アルブミン、６８，０００
、ＩｇＧ重鎖、５０．　ＯＯＯ、カルボン酸脱水酵素、
２９，０００、ＩｇＧ軽鎖、２５，０００、大豆トリプ
シン阻害物質、２１，０００、チトクロームｃ、１２，
７５０を適用して、ゲルを相対分子ｉ＋ｔについてカリ
プレートした。１％ギ酸中で保存する前に、メタノール
／酢酸／水（５０：２０３０、ｖ／ｖ／ｖ）中で１％ブ
リリアントブルーＧによりゲルを染色した。

特定のパイナツプル抽出物５μｇを含有する１部をとり
、等量の２５％（ｗ／　ｖ）　トリクロロ酢酸を加えた
。これを混合し、遠心した。上清を除去し、ペレットを
アセトン中で２回洗浄し、室温で３０分間放置して乾燥
させた。次いで、各々をメルカプトエタノールを含有す
るドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）試料緩衝液５０μ
σに再懸濁し、３分間沸騰させた後、１２．５％ポリア
クリルアミドＳ　Ｄ　Ｓゲルにかけた（添付の第４図参
照、レーン８表−斉　２種類の蛍光性基質のアナナイン
およびプロメラインによる加水分解における速度定数ア
ナナイン Ｚ−Ｐｈｅ−４部ｇ−ＮＩＩＭｃｃ　　　４８．３（±
４８） Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＩＩＭｅｃ　　　４４．５（±
９．０） ７．０７　　　０゜１４６ （±０．３）　　ｃＸ！−０，０２） （±０．０３）　（±０．００２） プロメライン Ｚ−Ｐｈｃ−Ａｒｇ−ＮＩＩＭｅｃ　　　８３．　Ｉ　
　　　Ｏ，１４０，００１６（±１４．１）（±０旧）
（±０．０００３）Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＭｅｃ　
　　　１５．４　　　２７．３　　　　１．７７（±２
８）（±１．９）　　（±０３７）コモサイン Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＩＩＭｅｃ　　　１．３９（±
０．１４） （）内の数字は平均値からの標桑偏差を表す）実施例６
　　ＳＤＳゲル電気泳動 バリー（Ｂｕｒｙ、Ａ、）の記載した方法（Ｊ　、　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇ、２」」、４９］−５００，１９８＋
）に従い、１２．５％の全アクリルアミドを含有するス
ラブゲル中で非連続的な２−アミノ−２−メチルプロパ
ン−１，３−ジオール（Ａ　ｍｍｅｄｉａｌ）／グリシ
ン／：７グマブ口メライン、レーンＣアフィニティー精
製したプロメライン、レーンＣアフィニティー精製した
アナナイン、レーン６１分子ｍマーカー）。

実施例７　マルチゾーン陰極電気泳動 ッソカーら（Ｚ　ｕｃｋｅｒ、　Ｓ　、　）の方法（Ｂ
　ｉｏｃｈｃｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａ
ｃｔａＳ３λ８　１９６−２０／Ｉ、１９８５）に従い
、電気泳動によってングマブロメラインの固有の成分を
分離した。（添（−１の第５図参照、レーンａおよびレ
ーンｄ・ングマブロメライン（１０μｇ）、レーンＣ：
アフィニティー精製シたアナナイン（１０μｇ）、レー
ンＣ：アフィニティー精製したプロメライン）。

火旌燃ｌ　酵素の力価検定 パイナツプル・ステムから得た主たる３つのプロテイナ
ーセを非可逆的なンステインブロテイナーゼ阻害物質、
Ｅ−６４によって滴定した（Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａ、Ｊ、
、　　Ｂｉｏｃｈｅ叱Ｊ、、−２０１、１８９９８，１
９８２）。

酵素タンパク質の量は、ξ３．．（１％）−５２゜５０
０［３酵素について、相対分子ｆ７ｔ２５．００Ｏと仮
定腰実施例１把載の公知のＡ、、、（１％）２０．１を
採用］を用いて決定した。フロメラインについては、酵
素タンパク質０８μＭ（終濃度）を、１１本の試験管に
入れた。これらの試験管に４倍に１３度の緩衝液（０，
４Ｍりん酸ナトリウム、４ｍＭＥＤＴΔ、８ｍＭＤＴＴ
ＳｐＨ６，８）２５０μρを加えた後、Ｏ〜０８μＭ（
終濃度）のＥ−６４増加分（０，０８μＭ）を加えた。

試験管を４０°Ｃで１５分間放置し、予め加温しておい
た０、０１％のブリシ３５を７５０μθ加えた。次いて
、６％アゾカゼイン２５０μａを加え、混合物を４０℃
で１時間インキュベートした。３％（Ｗ／ν）トリクロ
ロ酢酸５．ＯｘＣを加えて反応を終了させ、濾液の△ｆ
ｆ１ｌｌＢを測定した。

アナナインおよびコモサインについては、終濃度２１１
Ｍの酵素と、０〜２μＭのＥ−６４増加分（０，２）１
Ｍ）とを用いた。Ｅ−６４濃度に対して八、。をプロッ
トすると、Ｘ軸との交点が活性な酵素の濃度であった（
第６図祭照）。

フ準輿且　免疫学的研究 シグマのパイナツプル・ステムｍ抽出ｍに非ｌ？異的な
抗血清を、りん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）およびフロイ
ントのアジュバントに入れたろ屑物１゜０＋ｇを１箇月
ごとに筋肉内注射するこ七で、ウサギ内で惹起させた。

周期的に血を取り、３７°Ｃで１時間凝血させた後、４
°Ｃで一夜放置し、血餅を退縮させた。次いで、遊離さ
れた血清をピッベトで取り除き、−２０°Ｃで保存した
。最終血液を心臓穿刺によって得、同様にして血清を得
た。

アナナイン（実施例Ｉ記載の方法で得た）を抗原とし、
上記の方法と同様にして抗血清を得た。

重複免疫拡散プレートには、添付の第１図に記載のブロ
メラインビーク１および実施例４に記載の方法で得られ
たアナナインに対して惹起されたこれらの抗血清を用い
た。

プレートに、ＰＢＳＳｐＨ７，２中１％アガロースを注
加した。テンプレートを用いて穴をあけ、中央の穴に適
切な抗血清２０μσを入れた。室温で２４時間放置して
展開させた後、１％ＮａＣｌ１ｌ］で４８時間洗浄した
。次いで、プレートを乾燥させ、２％ギ酸ナトリウム、
３．５％ギ酸、３３％エタノール中でクーマン−・ブリ
リアント・ブルーＧ（シグマ）Ｉｘｇ／ｘρによって３
０分間染色した。

染料不含の上記の緩衝液中、約５分間で脱染色した（第
７図委照、図中、ウェルミニアナナイン、ウェルｂ・プ
ロメラインビーク１、ウェルＣニアナナインおよびプロ
メライン混合物、ウェル１抗（パイナツプル抽出物）血
清、ウェル２．抗（アナナイン）血清）。

宋−１Ｍ−ｊ＠Ｉ　Ｉ　Ｏニワトリシスタチンによるア
ナナインおよびブロメラインの阻害における動力学ニワ
トりのシスタチンは、アフィニティークロマトグラフィ
ーで精製したフオーム１およびフオーム２の混合物であ
る［アナスタンら（ＡｎａｓｔｓｉＡ、）Ｂ　ｉｏｃｈ
ｃｍ、　Ｊ　、　２１１．１２９−１３８．１９８３］
。予めＥ−６４滴定（Ｚ　ｕｃｋｅｒら、前掲）によっ
て標定しておいたパパインを用いて活性なシスタチンの
濃度を求めた。ニワトリシスタチンとアナナインとの反
応におけるＫ　ｉ　（ａｐｐ）　（基質存在下での見掛
けの解離定数）を求めるためにサーモスタット付きの蛍
光々度計用セル内で、／ＩＯ°Ｃにおいて、蛍光々度肝
で連続的な速度実験を行った。

酵素（活性化し得るアナナインの終濃Ｕ２ｘ＋０−”Ｍ
）を、ｉＩｍＭＥＩ）ＴＡ、８ｍＭジチオスレイト−ル
および０．０２％ブリジ３５を含有する０、４０Ｍドデ
シル硫酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，８中で２分間活性
化した。次いで、予め加温した水を加えた後、基質Ｚ　
−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｒｇ　−Ｎ　ＨＭｅｃ（終濃度５μ
Ｍ）を加え、終容皿を３峠とした。阻害物質不存在下で
の反応速度（ν。）を記録した後、無視し得る量の阻害
物質（活性なニワトリシスタチン、終濃度５ＸＩＯ−Ｉ
０〜４Ｘ］Ｏ−’Ｍの範囲となるよう）を、撹拌下に加
えた。阻害物質の存在下、初速度を新しい定常状態にさ
せた（νｉ）データーを、■（阻害物質の濃度）に対し
てプロットしくν。

／ν１）−Ｌ原点を通る傾きＩ　／　Ｋ　ｉ　（ａｐｐ
）の直線を得た［ニックリン（Ｎ　１ｃｋｌｉｎ、　Ｍ
、　Ｊ　、　Ｈ，）およびバラレット（ＢａｒｒｅＬｔ
、　Ａ、　Ｊ　、）Ｂ　ｉｏｃｈｃｍ、　Ｊ　、　　２
３３．２４５−２５３．１９８／Ｉ］。

以下の条件を用いる他は上記反応条件によって、ニワト
リ／スタチンとブロメラインとの反応のＫ　Ｉ　（，１
１，ｌ’ｌを測定した。活性化し得るプロメラインの濃
度は５ＸＩＣ１１１Ｍであり、使用した活性なニワトリ
／スタチン濃度はｌＸｌ０−’〜５Ｘ１．０−’Ｍてあ
り、用いた基質は、終濃度５μＭのＺΔｒｇ　−Ａ　ｒ
ｇ　−Ｎ　ＨＭｅｃである。

二「１トリンスクチンによるアナナインの阻害における
Ｋ　１ｆａｐｐｌは１．２Ｘ１０−９Ｍであることか分
かった。プロメラインとニワトリシスタチンとの反応に
おけるＫ　＋（ａｐｒｌは４．８Ｘ１０−５Ｍであるこ
とが分かった。

実施例１１　ラットモデルにおける火傷の掃滅壊死組織
除去 若年の雄性°ｒルビ／ラット（チャールス・リバー）に
麻酔をかけ、背をそり、１００°Ｃの熱湯、１５秒間で
やけどを負わせた。２４時間の回復期間の後、各う、１
−を再び麻酔し、火傷部位に皮膚のにかわ成分でシリコ
ンラバーダムを４個取り付けた。りん酸緩衝化食塩水を
タムの境界にいれたガーゼパッドに飽和されるまで適用
した。各動物の身体の回りをプラスチックフィルムでラ
ップしてΦ部を湿った状態に保持した。１時間後、ラッ
プおよびガーゼパッドを取り除き、ダムの間に新しいガ
ーゼを入れた。部分精製したアナナインおよびコモサイ
ンをＥ−６４で滴定した（実施例８参照）。ジチオスレ
イトールで活性化したアナナイン（活性な酵素４ｙｇ）
、コモサイン（活性な酵素４　ｚｇ）またはジチオスレ
イトールを含んだりん酸緩衝液（対照）を含有する溶液
１１をガーゼパッドに飽和するまで加えた。１時間後に
患部を露出させ、刃先か鈍い小刃で静かにかきとり、消
化された焼癲を取り、抄成壊死組織除去効果を評価した
。

次いで、各ガーゼバッドに追加の０．５ｘＱ（活性酵素
２ｍｇまたは、ジチオスレイトールを含有するりん酸緩
衝化食塩水）を適用し、さらに１時間挫滅組織除去を行
った。この時間の経過後（２時間）、再び患部を露出さ
せ、すりむいて評価した。さらに溶液０．５１１１Ｒを
適用し、掃滅壊死組織除去を行った。もう１時間を経過
した後、患部をかきとり、最終の評価を行った。以下の
基準に従って肉眼検査により抄成壊死組織除去効果を採
点した。

０−肉眼６１での変化を認めず。

１−全体ではないが、部分的に肥厚化した挫滅壊死組織
除去状態。

２−下方の組織がピンク色を示す挫滅壊死組織除去状態
。

３−下方の１ＩｆＩ織が点状出血を伴い、ピンクから赤
色を？している４−出血を伴う、肉眼視される焼癲の挫
滅壊死組織除去状態。

添付の第８図に示したように、両酵素溶液は、火傷部位
の掃滅壊死組織除去に有用である。

表　４　火傷うｙｈにおける抄成組織除去処置時間　抄
成組織除去指数 実験１（ｒ（時間）（平均値±Ｓ、　Ｄｅｖ、　ｎ＝１
２）Ａ、対照 （りん酸緩衝 化食塩水） Ｂ、コモサイン Ｃアナナイン ０３７５±０７３ １０６８±０４９５ １、０８１±０．６６６ １２０８±０８１９ ２９４３±０．４１６ ３、３８８±０．４７４ １、０６９±０．７５６ ２、６９４±０．５５３

【図面の簡単な説明】

第１図はＦ　Ｐ　ＬＣＭｏｎｏ　Ｓ　ｌ−Ｉ　ＲＩ　Ｏ
／　Ｉ　０（ｐＨ５，０）により分画した１■ステムブ
ロメラインの基質加水分解と勾配組成を表し、溶出液量
に対してＡ　９８０をプロットしたグラフであり、第２
図はＦ　ＰＬＣＭｏｎｏ　Ｓ　　ＨＲ５１５（ｐＨ９，
０）により分画したアナナインの基質加水分解と勾配組
成を表し、溶出液量に対してＡ　２＠Ｏをブロノトシた
グラフであり、第３図はＦ　Ｐ　Ｌ　ＣＭｏｎｏ　Ｓ　
　ＨＲ５１５（ｐＨ９，０）により分画したコモサイン
の基質加水分解と勾配組成を表し、溶出液量に対してＡ
　２１１０をプロットしたグラフであり、第４図はブロ
メラインおよびアナナインのＳＤＳケル電気泳動図の写
真の模写図であり、第５図はプロメラインおよびアナナ
インのマルチゾーンの陰極ケル電気泳動図の写真の模写
図であり、第６図はプロテイナーゼ阻害物質Ｅ−６４に
よるアナナイン定量実験のデーターをプロットしたグラ
フであり、第７図はブロメラインおよびアナナインのｆ
ｆ１ＫＪイムノデイフユージヨン（免疫拡散）を表す模
式図てあり、第８図はりん酸緩衝化食塩水（Ａ）、コモ
サイン（Ｂ）およびアナナイン（Ｃ）による火傷ラット
の抄成壊死組織除去効果を表すグラフである。 特許比Ｉｎ　人　　ンエンザイム　コーポレーション代
理人弁理士青山　葆（外２名） Ｏ 図面の浄書（内容に変更なし） 第 図 図面の浄書（内容に変更なし） 第 図 図面の浄書（内容に変更なし） 第 ア 図 第８図 Ｐ工時Ｍ （ｇ粘り 手続補正書　　　　灸 昭和　６３年　１１月　２８日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫学的に区別され、分子量約２５，０００であっ
   て、異なった正味電荷を有することを特徴とするシステ
   インプロテイナーゼ。 ２、アナナインである請求項１記載のシステインプロテ
   イナーゼ。 ３、コモサインである請求項１記載のシステインプロテ
   イナーゼ。 ４、パイナップル植物原料から分離、精製することを特
   徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のシステインプ
   ロテイナーゼの製造方法。 ５、植物原料が粉末化した茎である請求項４記載の方法
   。 ６、製造に、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび／
   またはアフィニティークロマトグラフイーおよび／また
   は高分解能陽イオン交換クロマトグラフィーを用いるこ
   とを特徴とする請求項４または５記載の方法。 ７、請求項１〜３のいずれかに記載のシステインプロテ
   イナーゼと薬学的に許容される担体とを含有することを
   特徴とする医薬組成物。 ８、請求項１〜３のいずれかに記載のシステインプロテ
   イナーゼを含有する、焼痂組織の挫滅壊死組織除去用医
   薬組成物。