JPH02169600A - 放射性ヨード標識用剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の放射
性ヨード標識体、より詳しくは免疫検定法等によるイン
ターロイキン−１（ＩＬ−１）の定量等に利用される上
記標識体の作成に利用できる標識用剤に関する。

従来の技術 ＩＬ−１βは、マクロファージ・単球のみならず多くの
細胞から産生きれ、下式（Ａ＞で表わされるアミノ酸配
列の１５３個のアミノ酸からなる、多様な生物活性を示
す物質でおることが知られている（代謝　２３巻　臨時
増刊号；免疫゛８６゜９７−１０４　（１９８４）　：
　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

１２　（６）７５３−７６０　（１９８６）；Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ＋、、　８１　、７９０７−
７９１１（１９８４）　；　Ｎａｔｕｒｅ、　３１５．
６４１（１９３５）　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、上ユ（１６，＞５８６９　（１９８
５）等参照）。

Ａｌ　ａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−八ｒｇ−ｓｅｒ−ｔｅｕ−
Ａｓｎ−ｃｙｓ−丁ｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−３
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−）１ｅｔ−Ｇｌｕ−
ＧＩｎ−Ｇｌｎ−ＶａｌＶａｌ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−）１
ｅｔ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−１
ｌ　ｅ−Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ　−Ａ　ｌ　ａ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＬｅＵ
−ＬｙＳ−ＡＳｐ−ＡＳｐ−ＬｙＳ−ＰｒＯ−Ｔｈｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｖａ　ｌ　
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−ＰｒＯ−
ＬｙＳ−ＬｙＳ−Ｌｌ／Ｓ−Ｍｅｔ−ＧＩＵ−ＬｙＳ−
＾ｒｇ−ｐｔｉｅ−ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｉｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−
Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−１ｙｒ−Ｉ
　１ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｎ−Ｎｅｔ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−丁ｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−丁ｈｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−
Ｔｈｒ−）１ｅｔ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−３ｅｒ−
３ｅｒ　　　　　　　　　　　　　　（Ａ　）上記及び
以下の本明細書におけるアミノ酸及びポリペプチドの表
示は、ＩｔＪＰＡＣ及びＩ　ＵＡＣ−ＩＵＢによる命名
法又は規則における略号乃至当該分野で慣用される略号
による表示法に従う。

またＩＬ−１β誘導体に関するアミノ酸の位置は上記式
（Ａ＞のアミノ酸配列に従って表示する。

上記ＩＬ−１βはその有する生物活性より、各種医薬品
等としての応用が期待でき、現在かかる応用分野を含め
、その生物活性自体、該活性の発現機構、同活性を発現
し得る各種誘導体等の同効物等につき、種々の研究が活
発に行なわれている。

本発明者らも従来から該ＩＬ−１βに関して鋭意研究を
重ねてきており、既にＩＬ−１β及びその同効物として
の各種誘導体を、遺伝子工学的手法により製造、単離す
るに成功している（ヨーロッパ特許公開第２３７９６７
号、特開昭６３−１５２３９Ｅｌ公報等参照）。

一方、ＩＬ−１β及びその同効物を含む各種生理活性物
質を高感度で測定可能な定量法としては、代表的には之
等活性物質の標識体を利用するラジオイムノアッセイ法
（ＲＩＡ）等が既に確立されており、之等生理活性物質
の標識法としても、例えば放射性ヨードによる代表的標
識化法としてクロラミン、Ｔ法（Ｗ、Ｈ，Ｈｕｎｔｅｒ
　ａｎｄ　Ｆ、Ｃ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ。

Ｎａｔｕｒｅ、１９４，４９５　（１９６２）等参照〕
、ポルトン−ハンター法（Ｂｏ！ｔｏｎ、Ａ、Ｅ、ａｎ
ｄ　Ｈｕｎｔｅｒ。

Ｗ、Ｈ，、ＢｉｏｃｈｅｍＪ、、　　１３３．　５２９
−５３８（１９７３）；同１３３，５２９−５３８（１
９７３）等参照）、ヨードケン法 （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１７．４８０７　（１
９７８）等参照〕等がよく知られている。

しかして、ＩＬ−１βは上記クロラミンＴ法、ヨードケ
ン法等の酸化反応を伴う標識法により標識されると、そ
の生物活性が失われ且つその受容体への結合能も失われ
、かくして得られる標識体の利用によっては測定が不能
であり、特にかかる標識体はＩＬ−１βに特異的な受容
体のスクリ一二ン、検索等には実用できない。上記の如
き酸化反応を伴わない標識法としてポルトン−ハンター
法が知られており、この方法によればＩＬ−１β受容体
結合能を有し且つ生物活性を有する所望の標識体を作成
可能でおる。しかしながら、このポルトン−ハンター法
はその操作が非常に繁雑であるという致命的欠点がある
。即ち、上記方法に用いられるポルトン−ハンター試薬
は、ベンゼン溶液であるためその使用前に窒素ガスによ
る溶媒除去操作が必須となる。またＩＬ−１β分子に１
分子のポルトン−ハンター試薬が入るような条件を採用
する場合には、ポルトン−ハンター試薬の入らない非放
射性ＩＬ−１βの残存は避けられず、この残存物の除去
のために、ゲル濾過操作以外に、例えばイオン交換クロ
マトグラフィー等の操作を行なう必要もめった。

従って、ＩＬ−１βの定量、ＩＬ−１受容体の研究、特
にＩＬ−１βに特異的な受容体の検索等を行なうための
、より簡便で且つ安定で感度の高いバイオアッセイ系の
確立には、上記ポルトン−ハンター法以外のより簡便な
標識法により標識でき、しかも生物活性及びＩＬ−１受
容体結合能を保有する新しい標識体の開発が当業界で要
望されている。

発明が解決しようとする問題引 上記に鑑み、本発明者らは斯界の要望に合致する新しい
ＩＬ−１βの標識体、該標識体の作成のための標識用剤
を提供することを目的として、鋭意研究を重ねた。その
結果、ＩＬ−１βの前記アミノ酸配列の特定位置のアミ
ノ酸を特定のアミン酸に置換させた１ｍ−１β誘導体が
上記目的に合致してヨードケン法等の酸化反応を伴う標
識法により標識可能で、しかも該標識化によっても所期
のＩＬ−１βの生物活性及びＩＬ−１受容体結合能を実
質的に失なわないという特有の性質を有することを見出
し、ここに本発明を完成するに至った。

問　１、を解決　るための　− 即ち本発明は酸化反応を伴う方法により放射性ヨードで
標識される標識用剤であって、１５３個のアミノ酸から
なるＩＬ＝１βのアミノ酸配列中の８位Ｃｙｓ及び７１
位Ｃｙｓをそれぞれ他のアミノ酸残基で置換されたポリ
ペプチドからなり、上記標識により生物活性及びＩＬ−
１受容体結合活性を保有することを特徴とする放射性ヨ
ード標識用剤に係わる。

本発明の標識用剤は、上記の通りＩＬ−１βのアミノ酸
配列の特定位置のアミノ酸を置換した新しいアミノ酸配
列を有するポリペプチドの利用に基づいて、操作の非常
に簡便なヨードケン法等に従い、容易に放射性ヨードで
標識することができると共に、該標識化によってもその
生物活性を失なわず、またＩＬ−１受容体への結合能も
実質的に失なわない。

従って、本発明の標識用剤は、その利用により酸化反応
を伴う標識法によって容易に所望の放射性ヨードにより
標識された標識体を提供でき、該標識体は、これを利用
して各種のバイオアッセイ法により所望のＩＬ−１の定
量やＩＬ−１受容体の研究に有効に利用することができ
る。本発明は、かかる放射性ヨードで標識された新しい
ＩＬ−１β誘導体の標識体をも提供するものである。

本発明標識用剤として特に適当なＩＬ−１β誘導体とし
ては、例えば上記式（Ａ）で表わされるＩＬ−１βのア
ミノ酸配列の８位置　ｙｓ＠Ｓ　ｅｒ又はＡｌａで置換
し且つ７１位Ｃｙｓを３ｅｒ、　Ａｌａ又はＶａｔで置
換したものを例示できるが、上記各位置の置換を行ない
得るアミノ酸残塁は特に上記に限定されるものではなく
、Ｃｙｓ以外の人体蛋白質を構成するα−アミノ酸の残
基、特に中性アミノ酸の残塁であればいずれでもよい。

以下、本発明標識用剤とするＩＬ−１β誘導体の製造法
につき詳述する。

上記ＬＬ−”ｌβ誘導体は、例えば遺伝子工学的手法、
即ち前記特定のポリペプチドをコードする遺伝子を利用
し、これを微生物のベクターに組込んで該微生物細胞内
で、複製、転写、翻訳させる方法によって製造できる。

この方法は、特に大量生産が可能でおる点より有利でお
る。

上記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例
えばホスフアイト　トリエステル法（Ｎａｔｕｒｅ、　
３１０．１０５　（１９８４）　）等の常法に従い、核
酸の化学合成により全合成することもできるが、ＩＬ−
１βもしくはその前駆体をコードする遺伝子を利用して
合成するのが簡便であり、例えば該遺伝子より上記化学
合成手段を含む常法に従い、前記特定のアミノ酸配列を
コードする核酸配列に改変する等により容易に製造でき
る。

ＩＬ−１β及びその前駆体をコードする遺伝子は公知で
あり、我々も先の出願（特開昭６２−１７４０２２号公
報）に記載したように、ＩＬ−１３をコードする遺伝子
を得、これを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−１βを収
１ｑするに成功している。

また、上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方法に従
うことができ、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列
に応じて実施される（遺伝子工学釣手法としては、例え
ば、）ＩＯＩｅＣＬＩＩａｒ　ＣＩＯｎｉＣｌｏｎｉｎ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔＯｒｙ
　（１９８２）が参照される〕。上記遺伝子工学的手法
としては、例えばＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を目
的とする制限酵素、ＤＮＡリガーぜ、ポリヌクレオチド
キナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理等の
常套手段等が採用でき、それらに用いられる酵素は市販
品として容易に入手できる。之等各操作における遺伝子
乃至核酸の単離、精製も常法、例えばアガロース電気泳
動法等に従い得る。

得られる遺伝子の複製も、一部後述するように通常のベ
クターを利用する方法に従い得る。所望のアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ断片や合成リンカ−は上記した化学
合成により容易に製造できる。

尚、上記において所望のアミノ酸に対応するコドンはそ
れ自体公知であり、またその選択は任意でよく、例えば
利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従え
ばよい（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、、９　。

４３−７４　（１９８１）等参照〕。また之等の核酸配
列のコドンの一部改変には、例えば常法通り、１５〜３
０マ一程度の、所望の改変をコードする合成オリゴヌク
レオチドからなるプライマーを用いたサイト−スペシフ
ィック　ミュータジエネシス（Ｓｉｔｅ−３ｐｅｃｉｆ
ｉｃ　）ｉｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　８１　、５６６２−５６６６（
１９８４））等の方法を採用できる。

上記方法により得られる所望の遺伝子は、例えばマキサ
ム−ギルバートの化学修飾法（Ｈａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、　６５．４９９−５
６０（１９８０））ヤＭ１３ファージを用いるジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎａ、Ｊ、ａｎｄ
Ｖ＋ｅ＋ｒａ　、Ｊ、、　Ｇｅｎｅ、　　１９．２６９
−２７６（１９８２））等により、その塩基配列の決定
及び確認を行ない得る。

かくして、前記した特定のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子が提供される。

本発明標識用剤とするＩＬ−１β誘導体は、上記遺伝子
を利用して、公知の一般的な遺伝子組換え技術に従い製
造できる。より詳細には上記遺伝子が宿主細胞中で発現
できるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に
導入して形質転換し、該形質転換体を培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用い得る。該真核生物の細胞には、を椎動物、酵
母等の細胞が含まれ、を椎動物細胞には、例えばサルの
細胞であるＣＯ８細胞（Ｙ。

Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１ｌ、２３．１７５−１８２（
１９８１））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジ
ヒドロ葉駿レダクターゼ欠損株（Ｇ。

Ｕｒｌａｕｂ　　ａｎｄ　　Ｌ、Ａ、Ｃｈａｓｉｎ、　
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、７７、　４２１６−４２２０　　（１９８０）
　　）　　等がよく用いられるが、之等に限定されない
。を椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しよ
うとする遺伝子の上流に位置するプロモーターＲＮＡの
スプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列
等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複
製起源を保有していてもよい。該発現ベクターの例とし
ては、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ　Ｖ
　２　ｄｈｆｒ　（Ｓ。

Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｒ，Ｈｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　
Ｐ、Ｂｅｒｇ、　Ｈｏｔ、　ＣｅＢｌｏｔ、　、ユ（９
）、８５４−８６４　（１９８１））等を例示できるが
、これに限定されない。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられ、そ
の中でもサツカロミセス属酊母が有利に用いられる。該
酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸
性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを持つｐ
ＡＭ８２（Ａ。

Ｈ＋ｙａｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ｔＪｓＡ。

１旦、１−５　（１９８３））等を好ましく利用できる
。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられ、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベ
クターを用い、このベクター中に目的遺伝子が発現でき
るように、該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シ
ャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成
開始に必要なＡＴＧを付与した発現プラスミドが使用で
きる。

宿主菌としての大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２
がよく用いられるが、これらに限定されず、公知の各種
の菌株及びベクターをいずれも利用できる。

プロモーターとしては、例えばトリプトファン・プロモ
ーター、Ｐ、プロモーター、ｌａｃプロモーター、１ｐ
ｐプロモーター等を使用でき、いずれの場合にも目的遺
伝子を発現させ得る。

トリプトファン・プロモーターを用いる場合を例にとり
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１　（今本
文男、代謝、Ｖｏｌ、２２゜２８９　（１９８５））を
使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ１ａＩ部
位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリペプチ
ドをコードする遺伝子を連結させればよい。

尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼ
ヤβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白質発現系によ
っても本発明誘導体を得ることができる。

かくして得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及び
これによる形質転換の方法としては、−般に用いられて
いる方法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め
、Ｃａ　ＣＱ　２処理して自然にＤＮＡを取り込みやす
い状態にして、ベクターを取込ませる方法等を採用でき
る。上記方法においては、通常知られているように形質
転換の効率を一層向上させるためにＭ　Ｑ　ＣＱ　２や
ＲｂＣ９を培地に更に共存させることも可能である。ま
た、宿主細胞をスフェロプラスト又はプロトプラスト化
してから形質転換させる方法も採用できる。

かくして得られる所望の形質転換株は、常法に従いこれ
を培養することができ、該培養により、所望のＩＬ−１
β誘導体（ポリペプチド）が生産、蓄積される。該培養
に用いられる培地としては、通常の細胞培養に慣用され
る各種の培地のいずれでもよく、その具体例としては、
例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常知ら
れている各種の炭素源、窒素源、無殿塩、ビタミン類等
を添加した培地を例示できる。尚、上記トリプトファン
・プロモーターを用いた場合には、一般に該プロモータ
ーが働くようにするためにカザミノ酸を添加した、例え
ばＭ９最小培地を用いて培養することができ、該培地中
には培養の適当な時期にインドールアクリル酸等のトリ
プトファン・プロモーターの動きを強めるための薬剤を
添加することもできる。

かくして得られるＩＬ−１β活性物を含有する培養物か
らの所望のＩＬ−１β誘導体、即ち前記特定のアミノ酸
配列を有するポリペプチドの精製、単離は常法に従い行
ない１ｑる。尚、該ポリペプチドを宿主から抽出するに
当っては、例えば浸透圧ショック法等の温和な条件を採
用するのがその高次溝造保持の面からより好ましい。

上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物理、化
学的性質を利用した各種の処理操作に従い実施できる（
例えば「生化学データーブック■」ｐｐ１１７５〜１２
５９、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社
東京化学同人発行参照）。

該方法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤に
よる処理、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル
濾過）、液体クロマトグラフィー遠心分離、電気泳動、
アフィニティクロマトグラフィー、透析法、之等の組合
せ等を採用できる。

より具体的には、上記操作は、例えば以下のごとくして
実施できる。即ち、まず培養上清より予め目的とするポ
リペプチドを部分精製する。この部分精製は、例えばア
セトン、メタノール、エタノール、プロパツール、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や酢酸、過塩
素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸を蚤
白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及
び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外濾
過処理等により行なわれる。

之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそ
れらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾過に付すこと
により目的物質の活性が認められる両分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、
例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ア
ガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、
セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる。

之等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、同Ｌ
Ｈタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ（１
１）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオ−ラド
社）、ウルトロゲル（１３８社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ（
トーン−社）等の市販品を例示できる。

目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過により得られ
る活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを
用いたアフィニティークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ法
、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラフ
ィー、クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマ
トグラフィー等に付すことにより、又は之等各操作の組
合せにより更に精製でき、かくして均質な物質として単
離できる。

上記クロマトフオーカシング法は、公知の各種方法によ
り実施でき、カラムとしてはＰＳＥ９４（ファルマシア
社製）等を、開始緩衝液としてはイミダゾール−塩酸等
を、溶出液としてはポリバッフ７−７４　（ファルマシ
ア社製）−塩酸（ｐＨ４，０）等を使用できる。

上記逆相高速液体クロマトグラフィーは、例えばＣ４ハ
イボア一逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラド社（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）等を用い、
移動剤としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）　、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。

かくして所望のＩＬ−１β誘導体を単離、収得できる。

本発明は、また上記のごとくして得られるｌ−１β誘導
体の新規な標識体をも提供するものでおる。該標識体は
、上記ＩＬ−１β誘導体を利用して、通常の酸化反応を
伴う放射性ヨードによる標識化方法に従い収得できる。

上記方法としては最も代表的にはヨードケン法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

二、４８０７　（１９７８））を例示でき、他にクロラ
ミンＴ法（Ｗ、Ｈ，Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｆ、Ｃ，Ｇ
ｒｅｅｎｗｏｏｄ。

Ｎａｔｕｒｅ、　　１９４．４９５　（１９６２）等参
照）等の酸化剤を用いた方法や酵素法等の直接標識法も
包含される。上記代表的標識法としてのヨードグン法の
詳細は、後記実施例において説明する通りである。

かくして得られる放射性ヨードにより標識された本発明
誘導体は、その本来の生物活性を保持しており、またそ
の受容体への結合能も保持している。従って、該標識体
は、例えばＲＩＡ法等のイムノアッセイに利用して１ｍ
−１βの正確で且つ高感度の定量が可能であり、また１
ｍ−１受容体の研究のためのＩＬ−１βに特異的な受容
体のスクリーニングや、例えばＢａ１ｂ／３Ｔ３細胞の
ような受容体高発現細胞を用いたパインディングアッセ
イ系の確立が可能である。

本発明によれば、操作の簡便なヨードケン法等により容
易に標識可能で、しかも該標識化によってもその本来の
生物活性及びＩＬ−１受容体結合活性を失わないＩＬ−
１βの標識用剤及びこれを標識した標識体が提供され、
これはＩＬ−１βのイムノアッセイによる定量等に有効
利用できる。

実　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例及び比
較例を挙げる。

尚、各例において用いたＩＬ−１β誘導体（仕較のため
のＩＬ−１β及びその誘導体を含む）は、特開昭６３−
１５２３９８号公報記載の方法に従い得られたものであ
り、以下の略号にて表示する。

０ＩＬ−１β・・・式（Ａ）で示される天然型ＩＬ−１
β０　［７１３１ＩＬ−１β−７１位を３ｅｒで置換し
たＩＬ１β誘導体 ０　［８Ｓ７１Ｓ］　ＩＬ−１β・・・８位及び７１位
を３ｅｒで置換したＩＬ−１β誘導体 ０　［８Ａ７１Ａ］　ＩＬ−１β・・・８位及び７１位
をＡｌａで置換したＩＬ−１β誘導体 ０　［８Ａ７１Ｓ］　ＩＬ−１β・・・８位をＡｌａで
、７１位を３ｅｒで置換したＩＬ−１β誘導体 ０　［８Ａ７１Ｖ］　ＩＬ−１β・・・８位をＡｌａで
、７１位をＶａｌで置換したＩＬ−１β誘導体 実施例　１ （１）　Ｂａ１ｂ　／３Ｔ３細胞の培養１３ａｌｂ　／
３Ｔ３クローンＡ３１　［ＣＣＬ−１６３：　ＡＴＣＣ
，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＨＤ］　＠、ＨＦ２ｊｊスイン
キユベーター中で、１０％ＦＣ３，Ｄ−ＭＥＭで培養し
た。

（２）ヨードケン法によるヨード標識法ヨードゲンをク
ロロホルムに溶かした後、■ッペンドルフのチューブ中
で溶ｔｓを乾固して壁面に付着させる。

ＩＬ−１β、その誘導体の各々２．５μＣＪ／５０μＱ
ＰＢｓ（−）と、Ｎａ　　　Ｉの５００μＣ１１５μＱ
とを、上記チューブに添加して反応を開始させる。氷上
で５分間反応後、１ｍ（］／ｍ１２ＢＳＡを含むＰ　Ｂ
　Ｓ　（−）で平衡化されているバイオゲルＰ−３０（
バイオラット社製）に供して、未反応の試薬を分離した
。

（３）ラジオレロプターアッセイ法 １２ウェルプレートで、−面にほぼ均一にまで増殖した
Ｂａ１ｂ／３Ｔ３細胞に、　　　Ｉ−ＩＬ１β又は１２
５１−ＩＬ−１β誘導体と、種々の濃度のＩＬ−１β或
いはαを含んだ１　ｍＱの１０％ＦＣ３，Ｄ−ＭＥＭを
添加し、４°Ｃて２時間反応する。反応後、反応液をパ
スツールピペットにて除去し、ＰＢＳ（−）１ｍＱを加
え静かに洗い上清を捨てる。この操作を更に２回繰返し
た後、１　ｍＱの１％ＳＤＳ、０．２Ｎ　　ＮａＯＨで
細胞を可溶化し、可溶化液及び更にウェルを洗浄した可
溶化液中のカウントをγ−カウンターにて測定する。

（４）標識体の結合能 上記（３）で作成した１２５■−■Ｌ−１β及び１２５
ＨＩＬ　　１β誘導体のＢａ１ｂ　／３Ｔ３１［］胞へ
の結合能を調べた。それぞれの標識体のＢ／Ｔ（結合／
合計カウント）な求めた。

その結果、■［−１β及び［７ｉＳｅｒ］　ＩＬ−１β
のＢ／Ｔは０．０４０であり、［８Ａ７１八］　ＩＬ−
１βのＢ／Ｔは０．２４３であり、　　　Ｉ　−［８Ａ
７１Ａ］　ＩＬ−１βだけがリセプターに結合した。

更に、同様にして結合したヨード標識体の非放射性ＩＬ
−１βによる拮抗阻害を求めた。その結果を第１図に示
す。図において横軸は添加したＩＬ−１ｂ濃度（ｎｏ／
ｍＱ）を、横軸はＢ　／　Ｂ　Ｏを小す。

第１図より、　　　１−ＩＬ−１βではヨード標識体を
大過剰に加えても一定割合以上は阻害せず、従ってこれ
はＩＬ−１βリセプター以外に結合していることが判る
。これに対して１２５Ｉ　−［８Ａ７１Ａ］ＩＬ−１β
［本発明標識用剤をヨード標識体により標識したちのコ
では、はぼ１００％の阻害が認められ、これは特異的な
りセプターへの結合であり、この本発明標識用剤が生物
活性を持ったヨード標識体となり得ることが明らかであ
る。

（５）パインディングアッセイ法 上記（４）と同様に、Ｂａ１ｂ　／３Ｔ３細胞でバイン
ディングアッセイを行ない、　　　Ｉ　−［８Ａ７１Ａ
］ＴＬ−１βの結合の特異性について調べた。反応時間
は２時間、４°Ｃで行なった。

結果を第２図に示す。図において縦軸はＩＬ−１β度（
ｎＣＩ／ｍ２）を、横軸はパインディング活性（％）を
示す。

第２図より５００００Ｃｐｍ　（７）　１２５Ｉ−［８
Ａ７１Ａ］■Ｌ−１βを用い、種々の用量の非標識ＩＬ
−１β（図中曲線（１）として示す）及びＩＬ−１α（
図中曲線（２）として示す）を添加したところ、用量依
存的に１２５７−　［８Ａ７１Ａ］　Ｉｔ−１βの結合
量は減少していき、この条件では非特異的な結合量は総
結合の１０％以下と考えられる。またＩＬ−１αはβと
同等の親和力で１２５　）　−［８Ａ７１Ａ］　ＩＬ−
１βの結合を阻害した。

この結果をスキャッチャード分析してＢａ１ｂ／３Ｔ３
細胞に存在する受容体数を算出した所、７６００個／細
胞、解離定数０．９Ｘ１０−１０Ｍとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図はヨード標識体の非放射性ＩＬ−１βによる拮抗
阻害を求めたグラフであり、第２図はヨード標識体の結
合特異性を調べた結果を示すグラフである。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酸化反応を伴う方法により放射性ヨードで標識さ
   れる標識用剤であつて、１５３個のアミノ酸からなるＩ
   Ｌ−１βのアミノ酸配列中の８位Ｃｙｓ及び７１位Ｃｙ
   ｓをそれぞれ他のアミノ酸残基で置換されたポリペプチ
   ドからなり、上記標識により生物活性及びＩＬ−１受容
   体結合活性を保有することを特徴とする放射性ヨード標
   識用剤。