JPH02147842A - 多波長発光分析方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、多波長発光分析方法およびその装置に関す
るものである。さらに詳しくは、この発明は、液体クロ
マトグラフィーまたはフローインジェクション分析のフ
ローセル内の試料を化学発光させ、その発光光をフーリ
エ実時間分光装置により多波長同時に検出して分析する
多波長発光分析方法およびその装置に関するものである
。

（背景技術） 従来より測定試料の分離分析には高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬ、Ｃ）等の液体クロマトグラフィーやフ
ローインジェクション分析（ＦＩＡ）が広く利用されて
おり、その検出系では単一波長の分析だけでなく多波長
同時の分析ら行われるようになっている。

高速液体クロマトグラフィーの検出系で多波長同時分析
を行う場合に使用する検出装置としては、反射回折格子
を用いて多波長吸光分析を行うものがある（特開昭５９
−５６１２５号公報等）。

しかしながら、このように反射回折格子を用いた検出装
置では、光エネルギーを特定次数の回折光に集中するこ
とはできるもののＦ数が大きいので微弱光の検出が困難
であり、また装置の大型化も余儀なくされる。さらにこ
のように吸光分析を行う検出装置においては吸光度測定
用の光源を必要とするので、光源のゆらぎ等に由来する
ノイズの混入を避けることができず、検出器の信号／ノ
イズ比を向上させ、検出感度を高くするのに限界がある
。

これに対して、近年、臨床化学、生化学、環境化学等の
領域において、化学発光分析法が注目されている。この
化学発光分析法では試料自体を化学的に発光させてその
発光光を検出するので、試料を透過させる検出用の光源
を必要としない、そのため光源に由来するノイズが存在
せず、試料の発光が微弱であっても検出が可能となり、
高感度微量分析が可能となる。

この化学発光分析法は液体クロマトグラフィーの検出系
にも利用されるようになっている。そのシステムは利用
する化学発光の種類等に応じて異なるが、たとえば第６
図に示すように、液体クロマトグラフィーの本体部（Ｈ
ＰＬＣ）が、溶出溶剤（１）を送出する液送用ポンプ（
２）、送出された溶出溶剤（１）に試料（３）を注入す
るインジェクター＋４）、およびインジェクター（４）
より注入された試料（３）を分離展開するカラム（５）
からなり、検出系が、カラム（５）の溶出部に設けた紫
外吸収検出器（６）とその下流の化学発光検出系からな
る。

この化学発光検出系においては、紫外吸収検出器（６）
を通過した試料成分に液送出ポンプ（７）によって発光
試薬（８）を注入し、フローセル内で化学発光させ、そ
れを発光光検出用のフローセル（９）に導入し、そこで
単一光電子計数方式等による微弱光検出器（１０°）に
より発光光を分光分析することなく発光総量として検出
するようなっている。

また、紫外吸収検出器（６）と微弱光検出器（１０°）
による検出結果は、ペンレコーダ等からなる記録器（１
１）に記録されるようになっている。

しかしながら、このように化学発光を利用したシステム
においては極微弱な発光光を検出しなくてはならないの
で、その検出器としては、従来のＦ数が大きい反射型回
折格子からなる検出器は使用することができず、多波長
同時分析を行うことは容易でない。そこで、上記第６図
の例でも示したように、これまでのシステムでは、その
発光光の検出を分光分析することなく、全波長の総発光
量を測定することにより行っている。

なお、分光分析に間しては、近年ダイオードアレイを用
いたフーリエ分光の利用が種々の分野で試みられている
。しかしダイオードの雑音が大きいため、その利用は分
光分析する光が比教的強い場合に限られており、ＩＬＩ
ａ弱光の検出を要する化学発光の分析には利用されてい
ない。

また、化学発光のような極微弱光の分析方法として、二
次元売計数装置を検出器として用いた空間的インターフ
ェロクラムタイプのフーリエ分光検出を使用する方法も
提案されている。しかし、この装置ではコンビ１−夕に
よる画像処理やフーリエ変換等の演算に相当の時間を必
要とするので、実時間の分析をすることが困難となる。

これに対して、実時間で画＠情報だけを蓄積し、後から
演算処理するという方法も考えられるが、蓄積する情報
量が大きくなるので通常のパソコンでは処理することが
できない。

そのため化学発光の利用により微量成分の高感度分析が
可能になったとはいっても、容易には実時間で多面的な
分析情報を得ることができないのが実状であった。

（発明の目的） この発明は、以上の通りの事情を踏まえてなされたもの
であり、液体クロマトグラフィーまたはフローインジェ
クション分析の検出系に化学発光分析を利用し、さらに
その発光光の多波長同時検出を実時間で容易に行えるよ
うにして、その瞬間に起こりつつある現象の多面的な分
析情報が得られるようにすることを目的としている。

（発明の開示） この発明は、上記の目的を実現する方法として、試料を
液体クロマトグラフィーによって分層し、フローセル内
の分離した試料成分に発光試薬を混入して化学発光させ
、その発光光を検出する発光分析方法において、発光光
の検出装置として、発光光を二光束に分割して干渉縞を
結像させる二光束分割干渉光学系と、その干渉縞のイン
コヒーシンｌ−像である空間的インターフェログラムを
コヒーレント像に変換するインコヒーレント像・コヒー
レント像変換装置と、コヒーレント像に変換した空間的
インターフエロダラムを実時間でフーリエ変換してその
空間周波数分布を二次元光量分布に変換するフーリエ変
換光学系と、二次元光量分布を読取る読取り手段とを有
してなるフーリエ実時間分光装置を使用することを特徴
とする多波長発光分析方法を提供する。

また、フローインジェクション分析のフローセル内で試
料成分と発光試薬を混合して化学発光させ、その発光光
を検出する発光分析方法において、発光光の検出装置と
して、上記のフーリエ実時間分光装置を使用する多波長
発光分析方法を提供するや さらにこれらの方法を好適に実施する装置として、試料
を成分に分Ｍする液体クロマ）・グラフィーと、フロー
セル内の分離した試料成分に発光試薬を混入する試薬混
入手段と、試料成分と発光試薬から生じる化学発光光を
検出する検出装置からなる発光分析装置において、検出
装置が上記のフーリエ実時間分光装置からなることを特
徴とする多波長発光分析装置を提供する。

また、試料成分と発光試薬とを混合する試薬混合手段を
有するフローインジェクション分析器と、試料成分と発
光試薬から生じる化学発光光を検出する検出装置からな
る発光分析装置において、検出装置が上記のフーリエ実
時間分光装置からなる多波長発光分析装置を提供する。

この発明は、液体クロマトグラフィーまたはフローイン
ジェクション分析の検出系に化学発光分析を利用するに
あたり、その化学発光光の検出装置として、この発明者
らが開発したフーリエ実時間分光装置（特願昭６３〜１
７９１６１号［フーリエ実時間分光装置」参照）を応用
するものであり、それにより実時間での高感度の多波長
同時分析を可能にするものである。

この発明においては、液体クロマトグラフィーまたはフ
ローインジェクション分析の流路構成白木、およびその
検出系で発生させる化学発光に関しては従来の方法ある
いは装置を利用することができる。

たとえば、高速液体クロマトグラフィーに関する装置の
全体構成としては、第１図に示すように、前記第６図の
構成においてその微弱光検出器（ｉｏ’）をこの発明で
使用するフーリエ実時間分光装置（１０）に置き換えた
ものとすることかで゛きる。

この場合、第１図には図示していないが、発光試薬とし
て複数の試薬を用いる場合には、それらの試薬をそれぞ
れ別個の液送出ポンプによりフローセルに送入し、それ
らをミキシングコイルに通して十分に混合した後、カラ
ム（５）から溶出してきた試料成分に混入するようにし
てもよく、また、複数の試薬を混合したものが安定な場
合には、予めそれらを混合しておき一台の液送出ポンプ
でその混合液を送出し、試料成分に混入するようにして
もよい、また、発光試薬が混入した試料成分を発光光検
出用のフローセル（９）に導入するに際しては、予め試
料成分と発光試薬とを渦巻型等の反応コイルに通してそ
れらを十分に混合することが好ましい。

フローインジェクション分析に関する装置についても、
そのシステムの全体構成は第２図に示すように、従来の
構成の検出器をこの発明のフーリエ実時間分光装置（１
０）に置き換えたものとすればよい、すなわち、発光試
薬（８，，８，）をそれぞれポンプ（ｐ、　、ｐ、　）
によりフローセルに流し、その混合流れの中に試料（３
）をインジェクター（４）から注入して混合し、化学発
光させ、その発光光をフーリエ実時間分光装置（１０）
により多波長同時に検出するようにする。

このような液体クロマトグラフィーあるいはフローイン
ジェクション分析の検出系に利用することのできる化学
発光の種類としては、（：）励起エネルギー産生反応に
関与する物質自身がそのエネルギーにより励起され発光
するもの（例えば、励起された一重項励起分子　０２　
の発光、ピロガロールの強アルカリ性下の発光、過酸化
ベンゾイルの自動酸化発光、ジメドンの自動酸化発光等
）、（ｉｉ）反応の中間体としてヒドロキシルペルオキ
シドが生成し、これがアルカリ性下ジオキセタン型ペル
オキシドを経て分解するときに反応分子が励起状態とな
り発光すると考えられるもの（例えば、テトラキス（ジ
メチｌレアミノンエチレンと酸素との発光、キサンチン
系色素と過酸化水素との発光、ルミノールの発光、ルシ
ゲンの発光、ロフィンの発光、インドールの発光等）　
、（ｉｉｉ）化学反応により生じたエネルギーにより反
応系外の物質が励起され発光するもの（例えば、シュウ
酸エステル・過酸化水素による螢光物質の発光、ジフェ
ノイル過酸化物による螢光物質の発光、エチルベンゼン
の自動酸化の系にアントラセン等の螢光物質を添加した
ときの発光、励起−主項酸素から螢光物質にエネルギー
が転移することによる螢光物質の発光、ゲテンまたはア
セタールと一重項酸素と螢光物質による発光等）をあげ
ることができる、実際に個々の分析で利用する化学発光
は、これらのうちから分析する試料に応じて適宜選択す
る。また、化学発光させるに際して使用する反応試薬、
増感剤、促進剤、抑制剤、酸化剤等種々の発光試薬、お
よびそれらの使用濃度も分析する試料に応じて適宜選択
する。

この発明においては、このような化学発光の検出器とし
てフーリエ実時間分光装置（１０）を使用し、それによ
り微弱な発光光に対する実時間での高感度多波長分析を
可能にしている。

このフーリエ実時間分光装置（１０）の例を第３図に示
す、このフーリエ実時間分光装置（１０）は、四角光路
コモンパス干渉計からなる二光束分割干渉光学系（■）
、空間光変調管（ＭＳＬＨ）等からなるインコヒーレン
ト像・コヒーレント像変換装置＜■）、フーリエ変換レ
ンズＢ３）等の光学系からなるフーリエ変換光学系（Ｉ
［［）および光電検出器からなる読取り手段（ＩＶ　）
からなっている。

この四角光路コモンパス干渉計からなる二光束分割干渉
光学系（Ｉ）は、コリメートレンズ（、！１．）、ビー
ムスプリッタ−（ＢＳ＋）、ミラー（ｌ（、、Ｈ，、Ｈ
，）　、結像レンズ（１２）から梢成しである。このよ
うな光学系においては、発光光検出用のフローセル（９
）からの発光光は、集光光学系（１２）を介してコリメ
ートレンズ（、Ｉ！、）を通過後ビームスプリッタ−（
ＢＳ、　）により二光束となり、その二光束がミラー（
Ｈ，、Ｈ，、Ｈｏ）で構成される四角光路を逆回し、再
度ビームスプリッタ−（ＢＳ、）により合わさり、結像
レンズ（，１！２）により干渉縞がインコヒーレント像
・コヒーレント像変換装置（ＩＩ）の受光面に結像する
。

二光束分割干渉光学系（Ｉ）としては、このような四角
光路コモンパス干渉計からなるものの他、第４図に示す
ように、コリメートレンズ（ｊ　＋　’）、開光子（Ｐ
゛）、ウォラストンプリズム（１４）　、検光子（八°
）および結像レンズ（１２°）からなり、インコヒーレ
ント像・コヒーレント像変換装置（ＩＩ）の受光面（光
電面ＰＣ）に干渉縞を結像するようにしたものも使用す
ることができる。さらに、三角光路コモンパス干渉計や
マイケルソン干渉計も使用することができるが、光学系
が明るく、干渉縞が振動等の外部杉響を受は敷く安定的
に得られるという点から、上記の四角光路コモンパス干
渉計を使用するのが好ましい。

なお、発光光検出用のフローセル（９）からの発光光を
入射させる二光束分割干渉光学系＜Ｉ）は、回折格子分
光に比較して測定試料の面積を大きくとれるため、スリ
ットを必要としないことを特徴とするが、回折格子分光
に使用可能な集光光学系を利用することにより、干渉縞
のコントラストをあげることができる。このような光学
系に入射させる際に使用する集光光学系（１２）として
は、フローセル（９）からの発光光を点状または線状に
集光するものを使用する。たとえば発光光検出用のフロ
ーセル（９）上にピンホールまたはスリットを設けてそ
のフローセル（９）からの発光光を絞ることにより点状
光源または線状光源とするものでもよいし、あるいはフ
ローセル（９）の形状に適合した集光窓をもち射出端が
点状または線状になっているライトコネクターをフロー
セル（９）上に設置するというものでもよい、ただし、
高感度検出を必要とする場合には発光光を効率高く集光
できるようにするものが好ましい、そのような集光光学
系（１２）の例としては、たとえば第５図（ａ）に示す
ように、楕円面鏡（Ｈ＋　）の一方の焦点（Ｆ、）に直
線状のフローセル（９）を配し、他方の焦点（［２）に
スリット（Ｓ）を配して発光光を線状光源とするもの、
あるいは第５図（ｂ）に示すように、凹面鏡（Ｈ２）の
５Ａ面に平行に蛇行状のフローセル（９）を配し、その
結像位置にスリット（Ｓ）を配して発光光を線状光源と
するものなどをあげることができる。もちろん、結像位
置におけるスリット（Ｓ）の幅は、回折格子分光に比較
して幅を広げても分解が悪くならないため、フーリエ分
光検出装置で決まる限界まで広げることが可能であり、
−ｆｆｉ微弱な光の分光に適している。

この発明のフーリエ実時間分光装置（１０）において、
二光束分割干渉光学系（Ｉ）により結像した干渉縞をイ
ンコヒーレント像からコヒーレント像に変換するインコ
ヒーレント像・コヒーレント像変換装置（ｎ）としては
、前記第３図に示したように空間光変調管（１４３１８
）等からなる光学系を使用することができる。

この空間光変調管（Ｈ８Ｌ）ｌ）は、光電面（ｐｃ）、
加速・集束電極系（図示せず）およびマイクロチャンネ
ルプレート（ＮＰＣ）を通常のイメージインテンシファ
イヤーと同様に構成し、通常のイメージインテンシファ
イヤーの螢光面にかえてＬ＋ＮｂＯ５等の電気光学結晶
板（ＥＯＣ）を取り付けたものである。このマインロチ
ャンネルフ゛レート（ＮＰＣ）と電気光学結晶板（ＥＯ
Ｃ）との間には、結晶表面電荷を制御するためのメツシ
ュ状の二次電子捕集ｔｊｆ！（図示せず）が設けてあり
、また電気光学結晶板（ＥＯＣ）の電荷蓄積面には、読
出し光の反射効率を上げるために、誘電体ミラーかコー
ティングしである。

このような空間光変調管（８３１１４）においては、そ
功光電面（ＰＣ）が二光束分割干渉計（Ｉ）から干渉縞
（空間インターフェログラムのインコヒーレント像）を
受光すると、そのインコし−レント像は光電子像に変換
され、さらにマイクロチャンネルプレート（ＮＰＣ）に
より数千倍から数万倍に増倍されて電気光学結晶板（Ｅ
ＯＣ）の表面に電荷パターンを形成する。この電荷パタ
ーンは電気光学結晶板［ＥＯＣ）を横切る電界を変化さ
せるので、電気光学効果により電気光学結晶板（ＦＯＣ
）の屈折率が変化する（複屈折性）。

インコヒーレント像・コヒーレント像変換装置（ｎ）に
おいては、このように屈折率が変化した電気光学結晶板
（ＥＱＣ）にレーザの直線偏光を照射し、その反射光の
偏光状態の変化を利用してコヒーレント像を形成する。

すなわち、レーザー光源（ＬＡ）からのレーザ光をビー
ムエクスパンダ−（ＢＥ）によりビーム径を拡大し、開
光器（Ｐ）により直線漏光にして電気光学結晶板（ＦＯ
Ｃ）に照射する。するとこの直線偏光は、電気光学結晶
板（ＥＯＣ）の表面の誘電体ミラーにて、電気光学結晶
板（ＥＯＣ）の屈折率の変化に応じた偏光状態となって
反射する。

そこで、その反射光をビームスプリッタ−（ＢＳ。

）により第３図中下方へ反射させ、検光子（Ａ）を透過
させてコヒーレント像を形成する。

なお、インコヒーレント像・コヒーレント像変換装置（
ＩＩ）としては、上記のように空間光変調管（ＭＳＬＨ
）等からなる光学系を使用する他、電気光学結晶板の二
光束分割干渉計（Ｉ）側に誘電体ミラーコーティングを
介して光導電性半導体膜を積層し、その積層体の両側に
透明電極を張り付けたもの等も使用することができる。

この発明のフーリエ実時間分光装置（１０）のフーリエ
変換光学系（Ｉ［＞は、インコヒーレント像・コヒーレ
ント像変換装置（ｎ）により得たコヒーレント像をフー
リエ変換して二次元光量分布にする。

このフーリエ変換光学系（ＩＩ［）は、第３図に示した
ようにフーリエ変換レンズ（Ｊ　、　）等から構成する
ことができる。この場合、フーリエ変換レンズ（ｊ、）
に係る光学配置は常法に従うことができ、その前焦点に
は電気光学結晶板（ＥＯＣ）がくるようにすることか好
ましい。

このようなフーリエ変換レンズ（１，）にインコヒーレ
ント像・コヒーレント像変換装置（ＩＩ）からのコヒー
レント１象を入射させると、そのフーリエ変換レンズ（
１３）の後焦点面に空間的インターフェログラムの空間
周波数分布に応じた二次元光量分布が形成する。

読取り手段（１ｖ）は、上記のようにしてフーリエ変換
光学系（Ｉ［［）で形成した二次元光量分布を検出し、
その空間的インターフェログラムの空間周波数分布を求
めるものであり、フーリエ変換レンズ（１ｓ）の後焦点
面にフォトダイオード、ＣＯＤ等からなる光電検出器を
設置することにより構成することができる。

以上のようなこの発明のフーリエ実時間分光装置（１０
）は次のような優れた作用を実現する。すなわち、二光
束分割干渉光学系（Ｉ）では発光光から干渉縞を形成し
、インコヒーレント像・コヒーレント像変換装置（ｆｆ
）およびフーリエ変換光学系（ＩＩＩ）では、コンピュ
ータ等によるフーリエ変換演算や画像処理によることな
く、その比較的簡単な光学的手段によって干渉縞を検出
して空間周波数分布を分析し、実時間での多波長同時分
析を可能とする。

（発明の効果） 以上、詳しく説明したように、この発明によれば、液体
クロマトグラフィーまたはフローインジェクション分析
の検出系に高感度Ｒ量分析法として優れている化学発光
分析を利用し、さらにその化学発光光の検出装置として
実時間で極微弱光の多波長同時分析が可能なフーリエ実
時間分光装置を用いるので、液体クロマトグラフィーま
たはフローインジェクションによる分析において高感度
の実時間多波長同時分析が可能となる。また、蓄積時間
を長くして、干渉信号を得な場合でも、そのフーリエ変
換を瞬時に光学的に得ることができる上、干渉信号が刻
々と得られる場合には、その瞬間に起こりつつある現象
の多面的な分析情報が容易に得られるようになる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の高速液体クロマトグラフィーに関
する多波長発光分析装置の配置図である。 第２図は、この発明のフローインジェクション分析に関
する多波長発光分析装置の配置図である。 第３図は、フーリエ実時間分光装置の光学配置図である
。 第４図は、二光束分割干渉光学系（Ｉ）の光学配置図で
ある。 第５図（ａ）、　（ｂ）は、それぞれこの発明の多波長
発光分析装置における集光光学系の斜視図である。 第６図は、従来の高速液体クロマトグラフィーに関する
発光分析装置の配置図である。 （ＨＰ　１．　Ｃ）高速液体クロマｌルブラフィー１溶
出溶剤 ２）液送用ポンプ ３試　料 ４　インジェクター ５　　カ　　　　ラ　　　　ム ロ　紫外吸収検出器 ７　液送用ポンプ ８発光試薬 ８、　）、（８ｂ）試薬 ９）フローセル １０）フーリエ実時間分光装置 １０°）微弱光検出器 １１）記　　録　　器 １２）集光光学系 （Ｉ）二光束分割干渉光学系 （ＩＩ）インコヒーレント像・コヒーレント像変換装置 ＜Ｉ［［）フーリエ変換光学系 （１■）読取り手段 （＾）、（＾゛）検　光　子 ＋ＢＥ）ビームエクスパンダ− （［ＳＳ＋　　、　＜Ｂ５２）ビームスプリッタ−Ｆ、
　）、（Ｆ２）焦点 Ｊ、、（Ｊ、’）コリメートレンズ Ｍ、、（１２°）結像レンズ １１　フーリエ変換レンズ ［＾）レーザ光源 Ｓ、　）楕円面鏡 Ｈ，）　　凹　　　面　　　鏡 Ｈ，）、（Ｈｂ　）、（Ｈゆ）ミラー Ｈ３ＬＨ）空間光変調管 ＰＣ）光　電　面 ＮＰＣ）マイクロチャンネルプレート ＥＯＣ）電気光学結晶板 Ｐ）渭　　光　　器 Ｐ’）偏　　光　　子 Ｓ）　ス　　　リ　　　ッ　　　ト （尋）ウォラス１−ンプリズム 第　　１ 図

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料を液体クロマトグラフィーによって分離し、
   フローセル内の分離した試料成分に発光試薬を混入して
   化学発光させ、その発光光を検出する発光分析方法にお
   いて、発光光の検出装置として、発光光を二光束に分割
   して干渉縞を結像させる二光束分割干渉光学系と、その
   干渉縞のインコヒーレント像である空間的インターフェ
   ログラムをコヒーレント像に変換するインコヒーレント
   像・コヒーレント像変換装置と、コヒーレント像に変換
   した空間的インターフェログラムを実時間でフーリエ変
   換してその空間周波数分布を二次元光量分布に変換する
   フーリエ変換光学系と、二次元光量分布を読取る読取り
   手段を有してなるフーリエ実時間分光装置を使用するこ
   とを特徴とする多波長発光分析方法。
2. （２）フーリエ実時間分光装置の二光束分割干渉光学系
   が、四角光路コモンパス干渉計からなる請求項（１）記
   載の多波長発光分析方法。
3. （３）フーリエ実時間分光装置のフーリエ変換光学系が
   、フーリエ変換レンズ系からなる請求項（１）記載の多
   波長発光分析方法。
4. （４）フーリエ実時間分光装置のインコヒーレント像・
   コヒーレント像変換装置が、空間光変調管を有してなる
   請求項（１）記載の多波長発光分析方法。
5. （５）フローインジェクション分析のフローセル内で試
   料成分と発光試薬を混合して化学発光させ、その発光光
   を検出する発光分析方法において、発光光の検出装置と
   して、請求項（１）〜（４）のいずれかに記載のフーリ
   エ実時間分光装置を使用する多波長発光分析方法。
6. （６）試料を成分に分離する液体クロマトグラフィーと
   、フローセル内の分離した試料成分に発光試薬を混入す
   る試薬混入手段と、試料成分と発光試薬から生じる化学
   発光光を検出する検出装置からなる発光分析装置におい
   て、検出装置が請求項（１）ないし（４）のいずれかに
   記載のフーリエ実時間分光装置からなることを特徴とす
   る多波長発光分析装置。
7. （７）試料成分と発光試薬とを混合する試薬混合手段を
   有するフローインジェクション分析器と、試料成分と発
   光試薬から生じる化学発光光を検出する検出装置からな
   る発光分析装置において、検出装置が請求項（１）ない
   し（４）のいずれかに記載のフーリエ実時間分光装置か
   らなる多波長発光分析装置。