JPH02138868A - 男性不妊症の診断試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は男性不妊症の診断試薬および畜産における精子
の判別試薬に関する。従って本発明は医療分野および畜
産分野において利用される。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕子供の
いない家庭においてその原因が男性側の不妊症、すなわ
ち男性不妊症にあるとされる例が多いことがわかってお
り、これに関連して男性不妊症の正確かつ簡便な診断方
法並びに試薬の提供が重要な課題となっている。

ところで男性不妊症は結果として現象であるから、その
診断は診断の対象である男性側に何か該当すべき原因が
あるかどうかを判定することになる。従来は精子減少、
精子奇形、精子の運動能低下が所見される場合に、これ
が男性不妊症の主要な原因であるとして診断されてきた
。

しかし、現実にはこれらについての精液所見が全て基準
値を満たしているにもかかわらず結果的には不妊とある
事例が非常に多い。射精から受精に至る詳細なメカニズ
ムが解明されるに伴い、男性不妊症については、精子の
受精能力の欠如、すなわち精子における（：ａｐａｃｉ
ｔａｔｉｏｎ。

ａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎの欠如がむしろ重
要な原因とされるべきことが判明してきた。

［：ａｐａｃｉｔａｔｉｏｎとは精子が雌性生殖管内で
受精能力を獲得することであり、この過程の後にａｃｒ
ｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎが起こり、精子光体部に
特異的な形態変化がみられる。ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏ
ｎ。

ａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎを行った精子のみ
が卵子の透明帯を通過し、卵実質内に侵入、雄性前核を
形成して受精に至ることができる。反対の場合には精子
は卵膜に入れないか、たとえ入れたとしても卵子の比較
的厚い卵膜を通過することができず受精は不成功に終わ
る。従ってこの場合の診断は検査すべき精子が、ｃａｐ
ａｃｉｔａｔｉｏｎを完了し、ａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅ
ａｃｔｉｏｎを起す能力を持っているかどうかを判定す
ることになる。

この判定のために従来からＨａｍｓｔｅｒ　ｅｇｇ／ｈ
ｕｍａｎｓｐｅｒｍ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ａｓｓ
ａｙ　　（以下、ハムスターテストと呼ぶ）が開発され
てきた。すなわち、透明帯を除去したハムスターの卵子
には、たとえハムスター以外の異種の哺乳動物の精子で
あっても、それがｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ、　ａｃｒ
ｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎを完了した精子であれば
、侵入可能となることが確認されているので、該ハムス
ターの卵子を他の哺乳動物の卵子に見立てて、該哺乳動
物の精子の受精能力を判定することができるとされてい
るのである。そしてこの方法は現在においては最も信頼
性のある方法として紹介されている。

しかしながら、実際にはこの方法は手間がかかり、また
誤差が生じやすいために、臨床家の間に広く一般に採用
されるに至っていない。すなわち、この方法を実施する
ためには臨床家が実施日に合わせてハムスターを常に飼
育（スペース、管理）している必要があり、もしハムス
ターを飼育しない場合には供されたハムスターの卵子が
ａｓｓａｙに必要な一定条件を満たしているかどうかの
確認が必要となる。また生卵子を使用しなければならな
いので、その保存法、耐用期間がデタミナントな要因と
なり、それによって再現性が失われる問題が生ずる。さ
らには透明帯を除去しなければならないので、除去操作
による卵子のダメージが避けられず、卵子の培養条件や
検査の所要時間などの要因と重なって、測定者の技能に
よる誤差が生じやすい。また判定結果が出るまでの所要
時間が長く、多数の検体を処理するのが困難である。

以上のような理由により、この方法はいまだ広く一般に
採用されておらず、従来技術における問題点として残さ
れたままである。

〔課題を解決するための手段〕

前記した事情に鑑み、本発明者はハムスターテストの生
卵子に代わり、一般に入手容易であり、取扱いも容易で
あり、しかも再現性も十分に保証され得る非生物材料を
用いて精子におけるｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎの完了と
、ａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎの能力を簡便に
かつ特別な熟練技能を要せずに判定することのできる方
法を求めて検討した。

精子におけるａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎを最
も層形的な形で、しかも再現性よく観察しやすい状態で
表現することのできるのはウニの精子である。

そこで精子としてウニ精子を使用し、これがａｃｒｏｓ
ｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎを起こした場合にいかなる非
生物材料に対して反応を示すかを検討した。

種々の非生物材料について検討した結果、意外にもアイ
オノフォアの存在下に疎水性ビーズを材料として使用し
た場合に、ａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎを起こ
した精子は該疎水性ビーズに特異的に付着反応し、反対
の場合には精子は全く付着反応を呈さないことを見出し
、本発明を完成するに至った。

従って本発明は、精子原因による男性不妊症の診断にあ
たり、疎水性ビーズおよびアイオノフォアを使用するこ
とを特徴とする診断方法、並びに疎水性ビーズおよびア
イオノフォアを必須の構成要素とする男性不妊症の診断
試薬、あるいはまた畜産の分野において、受精率の高い
精子を判別するにあたり、疎水性ビーズおよびアイオノ
フォアを使用することを特徴とする特別方法、並びに疎
水性ビーズおよびアイオノフォアを必須構成要素上する
判別試薬を提供するものである。

以下に本発明を更に詳細に説明する。

本発明において疎水性ビーズとはビーズを形成する化学
物質において、その構造式中の遊離基が高度に疎水的で
あるビーズを言い、例えばハイドロフォビックなりロマ
トグラフィー用のビーズ担体をあげることができる。代
表的な物質を具体的に示せば、例えばω−アミノアルキ
ル−アガロース（ω−アミノエチルアガロース、ω−ア
ミノプロピル−アガロース、ω−アミノペンチル−アガ
ロース、ω−アミノへキシルアガロース、ω−アミノデ
シル−アガロース、ω−アミノドデシル−アガロース〉
、アルキルアガロース、シバクｏ　ン（ｃｉｂａｃｒｏ
ｎ）ブ／ｌ、−３ＧＡ−アガロース（タイプ３０００．
３０００−ＣＬ）、トリチル−アガロース、フェニル−
アガロース（以上、Ｓｉｇｍａ社）、オクチルオイパー
キッド■、ペンジルオイパーキッド■（以上、Ｒ６ｈｍ
　Ｇｍｂｌｌ。

Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、Ｃ
Ｍ−ダイオゲル■（フナコシ）、オクチル−セファロー
スＣＬ−４Ｂ　。

フェニル−セファロースＣＬ−４８、フェニル−セファ
ロースＣＬ−６Ｂ、　ブチル−セファロース４Ｂ（以上
、ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等がある。これらのうち、特
にフェニル−アガロースやフェニル−セファロースＣＬ
−４８，ＣＬ−６Ｂのビーズ（単にフェニルビーズと呼
ぶ）は好ましい例である。ａｃｒｏｓｏｍｅｒｅａｃｔ
ｉｏｎを起こした精子にとってはあたかも卵子の如くこ
れらのビーズを感知し、これに結合する。

本発明において用いられるアイオノフォアとしては従来
公知のものが用いられ、具体的にはＡ２３１８７　（Ｓ
ｉｇｍａ社プライスプライスリストリマイシン）、グラ
ミシジン、パリノマイシン、イオノマイシン、ニゲリシ
ン等が挙げられ、特にグラミシジン、イオノマイシンが
好ましい。

アイオフフォアは精子に対して光体反応を誘起する作用
があり、このこと自体はすでに一般に公知である。天然
界においては例えばウニの場合、卵のゼリー中に含まれ
る物質が精子に作用して光体反応を誘起するが、この場
合も精子が疎水性ビーズと結合することが観察される。

医療の分野において上述の精子と疎水性ビーズとの非結
合が観察された場合には、被検精子は男性不妊症の重要
な原因であると診断することができる。

また畜産の分野において、上述の精子と疎水性ビーズと
の結合が観察された場合には、被検精子は増殖のための
良好な精子として選択される。

本発明診断方法または判別方法は疎水性ビーズおよびア
イオノフォアを使用することを特徴とする。従って疎水
性ビーズおよびアイオノフォアを必須の構成要素として
セット中に含む試薬は本発明診断方法または判別方法と
同一の課題を解決するものであり、発明として共に一体
となることができる。

本発明診断試薬または判別試薬に測定者の便宜のために
、例えばＨＢＰＥＳ緩衝液等の他の要素を加えることは
自由であり、これによって本発明が限定されることはな
い。

〔実施例〕

以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ 採取したヒト精液を室温にて液化させる。液化した精液
０．５ｍｌに対して２−の０．３％ヒト血清アルブミン
１３ｐＩ１１１　　（以下ＢＷＷ０．３％ｌｌ５Ａと略
記）を加えて、ＣＯ２インキユベータ（３７℃、５％Ｃ
Ｏ□）中で１時間静置し、運動能良好な精子を採取する
。採取した精子はＣａ”　ｆｒｅｅ　ＢＷＷで洗浄後、
Ｃａ”　Ｔｒｅｅ　３．５％ｌｌ５Ａを加え、ＣＯ２イ
ンキユベータにてＣａｐａｃｉｔａｔｉｏｎを誘起させ
る（４時間）。

ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ後、精子をＢ１１１Ｗ０．３
％Ｈ３八で洗浄し、１０μＭ−八２３１８７を含むＢ１
１１１１１０．３％Ｈ３八をカロえ、Ｃ０２インキユベ
ータ中に３０分間保存する。アイオノフォア処理後、精
子浮遊液５０珂を１０％フェニルヒー：’：１０ｕｌと
Ｂｌ！ＩＷ（０％Ｈ３八）　４４０ｕｆｆの混合液へ加
え、精子のフェニルビーズへの結合の有無を光学顕微鏡
下で観察する。

実施例２ フェニルビーズおよびイオノマイシンを組合せてセット
とし、本発明診断試薬とする。

〔発明の効果〕

以下、実験例により本発明の詳細な説明する。

実験例１ 試料 下記表１のビーズ欄に記載の各種のビーズを試料として
使用した。

方法 各試料を海水で３回洗浄し、海水で５％（Ｖ／Ｖ）サス
ペンションを用意した。採取し、海水で希釈せずに４℃
〜０℃で保存していたウニ精子１０珂を海水９９０度ま
たは酸性処理して調製したつ二卵子のジエｌＪ−を含む
海水９９０庭に加えてサスペンドし、３０秒後にその１
００近を前記ビーズサスペンション５０ｍに加え、光学
顕微鏡で精子がビーズに結合するか否かを観察した。

結果 結果を表１に示す。

表中、−は非結合を、十は結合を表わし、また０印は最
初は結合があったが、１３分後にはほとんどが非結合と
なったことを示す。

表１より本発明に係る疎水性ビーズはシェリーによって
光体反応を誘起された精子を確実に認識することができ
るが、他のビーズにはその機能がないことが判明した。

表 ■ 実験例２ 試料 下記表２のアイオノフォア欄に記載の各種アイオノフォ
アを試料として使用し、疎水性ビーズとしてはフェニル
ビーズを使用した。

方法 フェニルビーズを海水で３回洗浄し、海水で５％（Ｖ／
Ｖ）サスペンションを用意した。採取し、海水で希釈せ
ずに４℃〜０℃で保存していたつ二精子を海水で５　Ｘ
ｌ０−’倍に希釈し、その４９５逆に試料の最終濃度が
表２の濃度欄にそれぞれ記載される濃度となるように各
試料液を加えた。

３０秒後にその１００近をそれぞれ前記フェニルビーズ
のサスペンション５０近に加え、光学顕微鏡で精子がビ
ーズに結合するか否かを観察した。

結果 結果を表２に示す。表中、−は非結合を、＋は結合をそ
れぞれ表わす。

表２より疎水性ビーズであるフェニルビーズはアイオノ
フォアによって光体反応を誘起された精子を確実に認識
することができ、特にグラミシジンあるいはイオノマイ
シンによって誘起された場合に顕著であることが判明し
た。

表 注）本：人工海水

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　疎水性ビーズおよびアイオノフォアを必須の構成要
   素とする男性不妊症の診断試薬。 ２　疎水性ビーズがフェニルビーズである請求項１記載
   の診断試薬。 ３　アイオノフォアがグラミシジンまたはイオノマイシ
   ンである請求項１または２記載の診断試薬。 ４　畜産の分野で受精率の高い精子を判別する試薬にお
   いて、疎水性ビーズおよびアイオノフォアを必須の構成
   要素とする判別試薬。 ５　疎水性ビーズがフェニルビーズである請求項４記載
   の判別試薬。 ６　アイオノフォアがグラミシジンまたはイオノマイシ
   ンである請求項４または５記載の判別試薬。