JPH01500241A - カタラーゼを含まないオキシダーゼおよびカタラーゼを含まないオキシダーゼ含有酵母の製造方法およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カタラーゼを含まないオキシダーゼおよびカタラーゼ乞含まないオキシダーゼ含 有酵母の製造方法およびその使用 本発明は酵母がオキシダーゼを生産する条件下で酵母の好気醗酵によるオキシダ ーゼの生産方法、所望の場合酵母細胞から生産したオキシダーゼを単離する方法 に関する。

オキシダーゼは成る基質の特別の酸化反応乞触媒し、それによってＨ２Ｏ２乞生 収する酵素である。オキシダーゼの１例はハンセヌラ・ポリモルファＨａｎｓｅ ｎｕ１ａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　、カンジダ・ボイジニＣａｎｄｉｄａ　ｂｏｌ ｄｉｎｉｉ、ビチア・バストリス　ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　などのよ うなメチロトローフ酵母がメタノール上で生存できるようにするメタノールオキ シダーゼ（Ｍ○χ〕である。ＭＯＸはメタノールからホルムアルデヒドおよび過 酸化水素への酸化ン触媒し、その間分子状酸素は電子受容体として作用する。形 成ホルムアルデヒドは同化に使用され、その間細胞物質はキシルロースモノホス フェート径路乞経て生産され、又は異化に使用てれ、七の間ホルムアルデヒドは 蟻酸、最終的には二酸化炭素に変換する。これらのそれ以上の工程では他の酵素 がＮ侵な役割を演する二同化工程ではジヒドロキシアセトン合成酵素が重要であ り、異化工程ではホルムアルデヒドデヒドロケ９ナーゼおよびホルミエートデヒ ドロデナーゼが鍵酵素である。オキシダーゼにより形成テれろ過酸化水素はこれ らの微生物に対し強い毒性ン有し、現在の技術の状態によれば別の酵素、すなわ ちカタラーゼによ！ｌ１Ｍちに無害化てれる。

オキシダーゼの他の例は他のアルコールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ 、グリセロールオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、アルデヒドオキシダ ーゼ、アミンオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、ガラクトースオ キシダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼおよびキサンチンオキ シダーゼである。

オキシダーゼは他の目的に対し使用できる。重要な用途は洗滌および漂白組成物 の分野にあり、洗滌又は漂白工程中オキシダーゼの存在は、同時にオキシダーゼ に対し適当な基質が存在する場合、その場所で過酸化水素を形成することができ る。過酸化水素は亦白剤活性を示し、又はＴＡＥＤ　（テトラアセチルエチレン ジアミン〕のような漂白剤前史体と協同して過酸のような低温で活性？有する漂 白剤を形成するＯとができる。

洗滌又は漂白剤自体（−過酸化水素を含有セす、洗滌又は漂白工程中上の場所で 過酸化水素の杉厄乞触媒する酵素のみ乞含む０のシステムの重要な利点は、貯蔵 および輸送中、プロテアーゼ、リパーゼなどのような洗滌組底物成分の不活性化 が防止されることである。オキシダーゼのこの使用は英国特許公報１２２５７１ ３号および２１０１１６７号およびドイツ特許公報２５５７６２３号に記載芒れ る。

オキシダーゼの別の使用は定性および／又は定量分析の分野、例えは醗酵液のよ うな調査すべきシステムのアルコール含量の定量に対する分野にある。分析はパ ーオキシダーゼにより触媒ちれる着色物質の酸化ン経て形成する過酸化水素の測 定に基づく。

オキシダーゼに又化学合成又は基質の酸化を触媒するために廃物のｎ製方法の枠 組内で使用することもできる。

大部分のこれらの使用に対し、セして確実に洗滌又ハ漂白組底物の取分としての 使用および分析助剤としての使用に対し、オキシダーゼが形成する過醒化水素乞 分解するカタラーゼを含まないことに非常に重要なことである。しかし、Ｈ，７ リモルファ　Ｈａｎｓｅｎｕｘａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　、　Ｃ，ボイジニＣａ ｎｄ１ｄａ　ｂｏｉａｉｎｉｉ、Ｐ、バストリス　ｐｉｃｈｉａ…５ｔｏｒｉｓ 　のようなメチロトローフ酵母のメタノールに対する醗酵によりメタノールオキ シダーゼなどの微生物学的に生産芒れるオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１６〕 についての周知の聞逃は、こｎらはほとんど即度に形成する過酸化物を分解する 天然のカタラーゼ酵素乞絶えず随伴し〔ビーンノ１イス・エム、ファン・デイツ ケン・ジエイ・ビー、およびハーダー・ダブリュー（Ｖｅｅｎｈｕｉｓ　、　Ｍ 、　、ＶａｎＤｉｊｋｅｎ、　Ｊ、Ｐ、　ａｎａ　１（ａｒｄ８ｒ　Ｗ、　ン　 （１９８３）。

［アドバンシズ・イン・マイクロバイアル・フイジオロジイ（ＡｄＶａｎＣｅｌ ｉｌ　ｉｎ　ＭｉＣｒＯｂｉａｌ　ｐｈ７ｓｉｏ１ｏｇ７　）　Ｊ　。

Ｒｏｓｅ　、　Ａ＋Ｈ，、（）ａｒｅｔｈ　Ｍｏｒｒｉｓ　、Ｊ、ａｎｄ　Ｔｅ ｍｐｅｓｔ　。

Ｄ、Ｗ、編輯、２４巻、１〜８２頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　。

ＮｅＷＹＯｒｋ］、七の結果有効な漂白剤活性又は基質濃度の正確な分析は不可 能になることである。生成物からカタラーゼを大部分除去し、又は不活性化し、 こうして活性の、実質的にカタラーゼを含まないオキシダーゼを得る方法は既知 （例えは英ｌ特許第２１０１１６７号明細書参照）であることは事実であるが、 工業的適用に対してはこれらの方法（イオン交換クロマトグラフィ又はデルｍ過 によるカタラーゼ除去およびドデシル硫酸ソーダ（ＳＤＳ　）又はアジ化ソーダ 処理などによるカタラーゼの不活性化など）は費用がかかり過ぎ、やっかいで、 多くの場合不適当であり、又はアジ化ソーダの場合には、芒らに毒性物質の導入 がある。

従ってカタラーゼを含まないオキシダーゼ遺伝子的および経済的に正当化しうる 方法で取得しうる方法の要求がある。カタラーゼ趨性の突然変異体乞使用する微 生物学的生産はこの要求ンａたしうるが、これは非実際的であるようにみえる。

七の理由に、文献によれば、オキシダーゼに対する基質乞微生物の艮好な生育お よびオキシダーゼ遺伝子の強い発現の九めに重加した栄養培地で培養した場合、 カタラーゼ乞含まない微生物は死滅する運命にあることが予期できるからである 。

メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ　）の場合、ＭＯＸ、ホルミエートテヒドロデ ナーゼ、ホルムアルデヒドテヒドロデナーゼ、ジヒドロキシアセトン合成酵素お よびカタラーゼの形厄はグルコース抑制および、グリセロールおよびマンニトー ル抑制乞受けることが既知である。ＭＯＸ合成酵素の抑制解除は微生物χ非常に 低濃度のグルコース、グリセロール又はマンニトールで培養する場合起こるが、 その場合ＭＯＸの生産は尚比較的に非常に小さい。

上記および下記文の十分な理解乞得る几めに、いくつかの定義づけが適当である 。インダクターはプロモーターとの相互作用により、有効なリプレッサーの不活 性化により、又はリプレッサー遺伝子音阻止することにより遺伝子の転写乞促進 する化合物である。リプレッサーはプロモーターとの相互作用により、又はリプ レッサータン白遺伝子の活性化により遺伝子の転写χ阻止する化合物である。遺 伝子生成物の合成（遺伝子の転写ンはインデューサの作用（誘導ンにより、又は リプレッサー仲介抑制の除去（抑制解除ンにより行なうことができる。ＭＯＸの 場合、メタノールはバッチおよび連続培養においてインデューサとして作用する 。

グリセロール、ソルビトール、グルコースおよびエタノールにバッチおよび連続 培養における既知リプレッサーである。バッチ培養および低稀釈割合の恒常状態 の連続培養におけるグリセロール、ソルビトール、およびグルコースの低濃度条 件下では、ＭＯＸの抑制解除が起こる。

唯一の炭素源としてメタノール上で、又はメタシールドクルコース、グリセロー ル又ハマンニトールトノ特定混合物上で微生物を培養する場合、ＭＯＸ合成の完 全な誘導のみが起こることは既知である［　Ｅｇｇｌｌｌｌｉｎｇ（１’９８１ ）３６２〜３６５参照〕。これらの著者はその代謝産物ではなく、メタノール自 体はＭＯＸ合成の誘導に対し応答しうることＺ酵母Ｈａｎｓｅｎｕ１ａｐｏ　ｌ ｙｍｏ　ｒｐｈａ　に対する試験から結論している。これらの刊行物から抑制又 は抑制解除状態の発現レベルに誘導状態の発現レベルに比し低い、すなわち完全 なグルコース抑制下で１〜２チ、および連成培養における低生育速度のグルコー ス又はグリセロール抑制下で約１０チの犬＠芒のオーダにあることが推量できる 。実際に、こ６らの刊行物の１つ（，４，ｒｃｈ、　ｙｉｃｒｏｂｉｏＬタラー ゼ陰性突然変異体（グメタノール上で生育できないが、抑！１１　解除条件下で グリセロール上に生育した場合メタノールオキシダーゼ乞生産することが記載て れる。バッチ培養ではカタラーゼ陰性突然変異体のＭＯＸ生産は野生タイプ、す なわちカタラーゼも生産する菌株がグリセロール上で生産する量の約５０チでら った。

メタノール上の野生タイプ菌株のＭＯＸ生産と比較してカタラーゼ陰性突然変異 体のＭＯＸ生産は約１７％に過ぎなかった。カタラーゼを含まないオキシダーゼ 生産のＯのような比較的低い生産性は工業規模で製造するには不適当である。

上記文献の他に、いくつかの他の少ない関連刊行物は記載の価値がある。Ｇ、Ｔ 、　ＭｉＷａら、ＡｒＣｈ、Ｂｌｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、１８７　（１９７８）　４６４〜４７５を引用するＣｈｅｍｉ ｃａｌ　Ａｂｅｔｒａｃｔｓ　３１コ−（１９７８）　１８５１０５Ｗには、チ トクロームｐ−４５０およびＮＡＤＰＨを含有するカタラーゼおよびアルコール デヒドロゲナーゼン含まない再構成システムによるエタノールの直接［Ｅが記載 嘔れる。ＮＡＤＰＨの存在が必要であることからみて、このシステムは分子状酸 素によりアルコール化合物Ｙｌ化することができるＭＯＸのようにオキシダーゼ として作用しない、従ってオキシダーゼ生産酵母のカタラーゼ陰性突然変異体の 使用に対する任意の情報又は方向乞与えない異るシステムが記載ちれる。

ＥＰ−Ａ−ＤＯ１９９３７（フィリップス・ペトロリウム社〕にはアルコールオ キシダーゼの生産方法が記載され、この方法ではメタノール−資化性ｐｉｃｈｉ ａ−タイプの微生物、例えばｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが使用嘔れＲＣＨ ２０Ｈ＋０２−＞　Ｒ，ＣＨＯ＋　Ｈ２Ｏ２（式中、Ｒ＝Ｈ，ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５ 又にＣ３Ｈ７である）を触媒するｐｉＣｈｉａ属のメタノール−資化性徴生物か らの酵素標品も記載δれ、Ｃの記載によればカタラーゼを含まない酵素がいくつ かの精製処理後生産ちれる。この方法に本明細書の初めに記載した不利をかかえ る。

ちらに特許公報自体はいくらかのカタラーゼが精製アルコールオキシダーゼ中に 尚存在することン示唆する。

Ｅ　Ｐ　−Ａ　−００７１９９０（ＰＨＩＬＬＩＰＳ　ＰＥＴＦｔＯＬＥＵＭ（ ：ｏ、）には水性液から環境酸素の除去が記載され、この除去はアルコールの存 在においてアルコールオキシダーゼ、任意にはカタラーゼをも含む酵素による脱 酸素化システムにより触媒δれる。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　％およびｐｉｃｈｉａ 属の酵母乞使用できるが、本発明によるカタラーゼ陰性突然変異体の使用に記載 も示唆も芒れない。

反対にカタラーゼの存在か認められ、従って使用酵素標品の性質および目的は本 発明のものとは異る。

驚くべきことに、カタラーゼ乞食まないメタノールダーゼ遺伝子の発現を誘導す るが、オキシダーゼに対する基質ではない少なくとも１種の化合物の存在で酵母 に適する栄養培地に生育嘔ゼる場合、序言に述べた種類の方法により工業規模で 実現″Ｉｌ″きることがわかった。

しかし、本発明はメタノールオキシダーゼの生産に限定芒れない。遺伝子工学技 術乞使用して、別のオキシダーゼ遺伝子乞含■する酵母、特にＨａｎ８ｅｌｎｕ ｌａおよヒｐｉｃｈｉａ乞、好ましくは強いＭＯＸプロモータの制御下に得るこ とができる。意図的使用により、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼなどのような他のオ キシダーゼの要求に存在できる。

上記カタラーゼ陰性のＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの代りに、他 のカタラーゼ陰性酵母も使用できる。生産するオキシダーゼによりホルムアルデ ヒド又はホルミエート以外の化合物もオキシダーゼ遺伝子の発現乞誘導する化合 物として使用できるか、オキシダーゼに対する基質ではない。例えは、Ｋ、Ｂ、 　ＺｗａｒｔおよびＷ、　Ｈａｒｄｅｒ　、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、　１２９　（１９８３）６１５７〜３１６９によれは、アミンオキシダー ゼの形成ｉｃＤ、３％（Ｗ／Ｖ　）グリセロールおよび５ミリモルの硫酸アンモ ニウムを含有する培地、すなわちアンモニウム制限条件下で（３１６１頁衣２参 照ン誘導される。当然、本発明はメタノールオキシダーゼの生産に限定されない 。

従って、一般的意味で、本発明にオキシダーゼ又はオキシダーゼ含有混合物の製 造方法又は酵母がオキシダーゼを生産する条件下で酵母の好気醗酵による生産、 および所望の場合酵母細胞から生産したオキシダーゼの単離方法を包含し、この 方法ではカタラーゼ陰性の酵母突然変異体乞、オキシダーゼ遺伝子の発現を誘導 するが、オキシダーゼに対する基質でにない少なくとも１種の化合物の存在で酵 母に適する栄養培地で生育させる。

本発明に従ってＨａｎ［！１Ｂｎｕｌａ属又ｉ　ＰｉＣｈｉａ　楓、特にゼ陰性 失然変異体乞使用することは好ましい。しかし本発明はこの突然変異体の使用の みに限定ちれない。

他のカタラーゼ陰性突然変異体は無作為に任意の突然変異乞誘導し、次に得た突 然変異体を選択することにより、又は定方向性突然変異方法、例えば特にヨーロ ッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０１７５５７８号公報に記載のような方法により、又は カタラーゼ遺伝子の欠失により、又にカタラーゼ発現′ＰＩ：阻害するカタラー ゼの修飾によＶ得ることができる。

本発明に便って、オキシダーゼの遺伝情報が強いプロモータの匍」御下にある酵 母を使用し、七の結果として大収量のオキシダーゼ乞得ることができることにδ らに好ましい。Ｏの例にＭＯＸプロモータ、特にＨａｎｓｅｎｕｌａ　匹鉦二■ 匣ＣＢＳ　４７３２のＭＯＸプロモータである。０７シは上記Ｈａｎｓｅｎｕｌ ａ　ｐｏｌｙｚｏｒ　ｈａ　５５　／　１ｉ、ＡＴＣＣ４６０５９酵母に天然に 存在するが、他の酵母ではこれは既知のＤＮＡ組み換え技術により連取できる（ 　Ｅ　Ｐ　−Ａ、　−０１７３３７８参照）。プロモータの強嘔はメタノール上 で培養したＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａの野生タイプの菌株のＭ ＯＸ含量が細胞タン白の６０チの太き芒のオーダーにあるという事実から明らか である。他の強いプロモータの例にメチロトローフ酵母のジヒドロキシアセトン 合成酵素（ＤＡＳ　）プロモータおよびアミンオキシダーゼを生産する酵母のア ミンオキシダーゼプロモータである。

本発明に従って、オキシダーゼ遺伝子として好ましくはメタノールオキシダーゼ 遺伝子、例えはメタノールオキシダーゼに対しＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍ ｏｒｐｈａ　ｃ１３ｓ４７３２の既知ＭＯＸと同じアミノ酸配列又は酵素工学に より得たこの配列の誘導体又は実際に機能性に差のないその修飾体ンコードする メタノールオキシダーゼ遺伝子乞使用することが好ましい。メタノールオキシダ ーゼと組み合せて、メタノールχ誘導基質として使用するのがよい。メタノール に対するのと同様にＭＯＸ酵素は他の各種基質、例えばエタノール、ｎ−プロパ ツール、ｎ−ブタノール、ｎ−アミルアルコールに対し、尚程度に低いが、メチ ルセロソルブ、エチレングリコール、ベンジルアルコール、イングロバノール、 イソアミルアルコールおよびプロピレングリコールのような化合物に対し活性乞 有することがわかる。これらの化合物のうちエタノールのようないくつかのもの はメタノールオキシダーゼ乞洗滌および漂白組成物に使用する場合、比較的安価 であり毒物学的に許容しうるので基質として供するのに特に適する。

本発明に従って、ホルミエート又はホルムアルデヒド又に０れら双方にオキシダ ーゼ遺伝子の発現乞誘導するが、オキシダーゼに対する基質ではない物質として 使用することは好ましい。

ホルミエートとは、蟻酸塩、特にアルカリ金属塩およびアンモニウム塩、および アルカリ土類金属塩、および蟻酸自体の双方を意味する。

文献から予期できるその他の場合として、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属の酵母において にメタノールの代謝産物にＭＯχグロモータの制御下に遺伝子の発現の誘導を与 えることができるらしい。ホルミエートおよびホルムアルデヒドによるメタノー ルオキシダーゼのこのような誘導にＣａｎａｌａａ　ｂｏｌｉｎｉｉ福の酵母の バッチ醗酵に関するもので（Ｅｇｇｅｌｉｎｇら、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ。

１ｅｔｔｅｒ　上（１９７７）、２０５〜２１０）、酵母ＫＩＯｅＣｋθｒａ種 Ｎ’２２０１　のバンチ醗酵でにホルミエートによりメタノールオキシダーゼの 誘導も有する（　３ｈｉｍｉＺｕら、ＡｇｒｉＣ，Ｂ１０１．　Ｃｈｅｍ、　４ １　（１１）、１９７７．２２１５〜２２２０）が、ｇｇｇｅｌｉｎｇおよびｓ ａｈｍ、　Ａｒｃｈ、　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌ、　１２７　（１９８０）、１１９ −１２４によればＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒ　ｈａでａメタノールの み乞誘導できることが実際に以前に鎗められている。

工業規模の製造に関連して、本発明に従って酵母は連続醗酵で培養することが好 ましい。しかし、バッチ醗酵又は「原料供給バッチ」醗酵は除外しない。「原料 供給バッチ」とは、基質乞初めに一度に添加しないが、全醗酵中調整できる基質 濃度乞達成するように除徐に添加する「バッチ」醗酵ン意味する。

醗酵中Ｈａｎｓｅｎｕｌａ又Ｉｔｓ　Ｐｉｃｈｉａのような酵母に適する栄養培 地ン使用する。この培地はこの微生物に適する炭素源乞含有しなけれはならない 。適する炭素源に専門家に既知で、又は試験により決定できる。例えはグルコー スは適するが、ソルボース、キシロース、ソルビトールのような他の糖およびグ リセロール、クエン酸などのような他の物質は炭素源として使用できる。

適当な栄養培地ｐ　Ｅｇｌｉら、Ａｒｃｈ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ　１２４（１ ９８０）１１５〜１２１から既知でおる。

本発明によれば醗酵中炭素湿量とホルミエ−１・又はホルムアルデヒド量間の適 当な比Ｚ確定することが重要である。

本発明の好ましい態様に選択した酵母種に適する炭素源およびホルミエートの存 在で酵母ン培養し、ポルミエート：炭素源のモル比は０．５　：　１〜４．５　 ：　１でろること乞脣似とする。好ましくは２：１〜３．５　：　１のホルミエ ート：炭素源のモル比ｌ使用し、もつとも好ましくに２．５　：　１〜３．２　 ：　１のモル比を使用する。

本発明の別の好ましい態様は選択した酵母種に適する炭素源およびホルムアルデ ヒドの存在で酵母を培養し、ホルムアルデヒド：炭素源のモル比は０．１　：　 １〜６：１であることｔ％徴とする。好ましくは０．５　：　１〜２．５　：　 １のホルムアルデヒド：炭素源のモル比を使用し、もつとも好ましくｆｌｌ：１ 〜２：１のモル比ｌ使用する。

０．０５〜０．１７時間の稀釈割合でカタラーゼ陰性の突然変異体Ｈａｎｓｅｎ ｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒ　ｈａ　５５　／　１１の連続醗酵において、ホルミエ ート／グルコースおよびホルムアルデヒド／グルコース混合物による試験の場合 、メタノール上で培養した野生タイプ菌株のＭＯＸ収量のろ０チ、それぞれ６０ チの大きさのオーダーのＭＯＸ収量乞達成する。こ扛らはカタラーゼが存在しな いことについても工業規模で使用するに適する収量である。

ホルミエート又はホルムアルデヒド使用濃度が高すぎる場合、細胞収量に低くな り、カルチャーに死滅することさえできる。低すぎるホルミエート又はホルムア ルデヒド濃度に不十分な誘導χ与えるので、低収量のオキシダーゼ乞得る結果と なる。ホルミエート又はホルムアルデヒドの存在しない、グルコースのみの場合 の突然変異体の生育では野生タイプ菌株の場合と同じＭＯＸ低活性が得られる。

意図的使用に対し、培養酵母細胞それだけの使用ン望まないか又はできない場合 、酵母細胞特にベルオキシソームに蓄積したオキシダーゼは細胞から単離すべき である。このためにガラス小球を使用する細胞の物理的破壊、いわゆるフレンチ プレス又はマントンガラリンホモジナイザー処理、超音波処理および例えばチモ リアーゼによる酵素的方法のような通例の細胞溶解方法乞適用できる。

本発明によれば、これに関連して酸素を含まない条件下で、例えば窒素雰囲気下 で操作することが得策であることがわかった。細胞は酸素の存在で破壊開口する 場合、細胞原形質又は酵母細胞の室に存在しうるオキシダーゼ酵素の基質がベル オキシソームから遊離したオキシダーゼの存在で酸化し、その後この場合に形成 した過酸化水素に特にオキシダーゼ乞破壊する。

本発明はこのような酵母の製造に対し本発明方法を使用することにより得たオキ シダーゼ含有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体および本発明に従って酵母から オキシダーゼを単離し、次にこうして単離したオキシダーゼを他の成分と共に組 成物に調製することにより得たオキシダーゼ又はオキシダーゼ含有組成物に関す る。

さらに、本発明は本発明によるオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性の酵母突然変 異体の使用又は洗滌又は漂白方法においてその場所で過酸化水素を生産するオキ シダーゼに対する基質と共にそこから単離したオキシダーゼの使用に関する。特 にアルコールオキシダーゼを使用する場合、エタノールはこれらの洗滌方法にお ける基質として使用するのがよい。

本発明によるオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体又はそこから 単離したオキシダーゼ乞含有する洗滌又は漂白剤も本発明の態様である。

δらに本発明は本発明によるオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異 体の使用又は化学合成又は廃物精製方法の枠組み内で、又はオキシダーゼに対す る基質の定性および／又は定量測定に対するオキシダーゼの基質の酸化に対する 触媒としてそこから単離したオキシダーゼの使用に関する。

本発明にさらに次の試験部分で説明する。

醗酵条件および培地 カタラーゼ陰性コロニーとしてペプトンデキストロース寒天からのＨａｎｓｅｎ ｕｌａ　ｐｏ：ｔｙｍｏｒｐｈａ酵母７使用し、唯一の炭素源としてグルコース ２有するＥｇｌｉらによる培地（Ａｒｃｈ、　ＭｉｃｒｏｂｉＯｌ、　１２４　 （１９８０）　１１５〜１２１）に６７℃で１日子備培養した。

培養は２１の培地ビ含有する３１の醗酵容器で連続的に行なった。通気、−およ び撹拌に調整し、溶解酸素圧が２５チ飽和以下に決してならないように注意ン払 った。−および泡の形成に４＝１〜１：１の比のシリコン油（ロンブーランから のＲｈｏａｏｒｓｉｌ　Ｒ４２５）に基づく消泡剤を含有する濃アンモニア溶液 を使用して調整した。Ｐｌ″Ｉは５．０±０．０５ｐ）（単位に調整した。温度 は６７±０．２℃に保持した。流入および流出培地流を測定し、嬬動都ンプ乞使 用して所望流速に調整した。

醗酵の安定状態は呼吸パラメータビ測定することにより（呼吸商、二酸化炭素の 発生割合および吸収酸素割合〕、セして細胞サスペンションおよび細胞溶解物の ＭＯＸ含量を調査することにより試験した。

細胞サスペンションおよび細胞を含まない抽出液のＭＯＸ、活性およびカタラー ゼ活性Ｙ　ｖａｎ　Ｄｉｊｋｅｎら、Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１１ １　（１９７６）　１３７〜１４４に従って測定した。１ユニツトに７．５のＰ Ｈｙｃ有する空気飽和０．１　Ｍ　ＩＪン酸塩中で３７°Ｃで１分当り使用した １μＭメタノールに相当する。

タン白 タン白ａ　Ｌｏｗｒｙら、Ｊ、　Ｂｌｏｘ、　ｃｈｅｍ、　１９３　（１９５１ ン２６５〜２７５の方法によ’）　＋１１１１定した。牛血清アルブミンに標準 として使用した。

バイオマス バイオマスの乾燥ｘｔｕ１ｏｏ℃で恒量まで洗滌細胞サスペンションを乾燥する ことによジ測定した。

グルコース、メタノール、蟻酸およびホルムアルデヒドｉ　ＨＰＬＣおよび標準 酵素分析乞使用して測定した。

細胞溶解物に超音波処理又はチモリアーゼによりインキュベートすることにより 得た。

超音波処理 超音波処理ｑ　５　ｍＡの洗滌細胞サスペンションを含有し、７．５のｐＦ（Ｙ …する０、１　Ｍリン酸カリ溶液馨使用して６１１のガラスピーズ（平均直径１ ００μｒＩＬ）により０℃で行なった。細胞サスペンションｕ　Ｂｒａｎａｏｎ セルプレイカータイプＢ　−１’ｌ　（Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃ　ｐｏｗｅ ｒＣｏ、）により１分間５回処理した。処理間１分の冷却期間を守った。５紅の 溶液につき７０ワツトの出力Ｚ使用し、そのためにミクロチップ乞使用した。

嫌気条件下で、超音波処理前および中に１５分サスペンションに窒素を通した。

溶解処理 ５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　１　ｍＭジチオトレイトルおよびＡｒｔｈｒｏｂａｃ ｔｅｒ　１ｕｔｅｕｓからの１０ｍ９テモリアーゼ１００Ｔ　（Ｓｅｉｋａｇａ ｋｕ　ｘｏｇｙｏ　ｃｏ、　）　Ｙ含有し、８．５のＰｌ″Ｉを有する［］、Ｉ 　Ｍ　ＩＪン酸ソーダ緩衝液中の６１０　ｎｍの０Ｄ１５〜１８の光学密度２有 する２００ｍ１の細胞サスペンションｔサーモスタットで瓶中で６７°Ｃでおだ やかに撹拌した。１０又は１５分の規則的間隔後、試料乞採取し、Ｍｏｘ活性、 タン白含量および６１Ｏｎ＋ｎＴ元学密度乞分析した。

例１ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｆｈａ　ＡＴＣＣ４６０５９’ｆｒ　表Ａ に記載の培地Ｉに生育させた。この培地は各種比の蟻酸対グルコースを含有した 。

第１図および第２図、およびｉｃおよび表りは溶解物のＭＯＸ比活性を示す。０ ．１時間−１の一定稀釈割合で２．９モル蟻酸対１モルグルコースの光学比を見 出した。

１モルグルコースにつ＠　３．６モル蟻酸の比では、０．０５〜０．１５時間− １の光学稀釈割合を見出した（第２図）。光学比（２，９以上）および光学稀釈 割合（０，２以上）では有意の残留蟻酸含量を見出した、すなわちカルチャーに 対しては有毒である。

上記カルチャーから得た細＠溶解物中ではカメラーゼ活性は全く検知できなかっ た。

の稀釈割合で各種ホルムアルデヒド／グルコース混合物を含む培地Ｉ上に生育さ せた。グルコースに対するＭＯＸ比生産およびバイオマス収量の安定状態におけ る値は衣Ｂおよび第６図に示す。

約１．８のモル比でタン白１Ｔｎ９につき６〜７　ＭＯＸユニットのＭＯＸの光 学的比活性を見出した。

上記カルチャーから得た細胞浴解液にはカタラーゼ活性は検出できなかった。

時間−１の稀釈割合で培地１ｔ（］Ａ、）に生育させた。蟻酸対グルコース比は ２．６５であった。細胞密度は３９．９．９バイオマス（乾燥重量）／ｌであっ た。

３７°Ｃで１〜３時間のインキュベーション時間によりチモリアーゼ方法を使用 する攪拌細胞サスペンション中の細胞の溶解はＭＯＸ活性を全く得ることができ なかった。

細胞の超音波処理はＭＯＸ絶対収量の変動および野生タイプ菌株ＣＢＳ　４７３ ２に通常見出される４０〜５０％タン白／乾燥重量の値と比較して低タン白含量 を示した。

篤くべきことに、酸素の存在および好気条件下の未知細胞成分を含むＭＯＸの反 応生成物がＭＯＸ不活性化の主な理由を形成することが確められた。窒素ガスを フラッシュした細胞サスペンションの使用又は超音波処理中の細胞サスペンショ ンに過剰のカメラーゼ（１０ユニツト７５　ｒｎ１以上）を存在させないことに よりＭＯＸの絶対収量の改良を生じた。ｆｉＥ参照。

カタラーゼの添加又は窒素ガスによるフラッシュ効果は蟻酸／グルコース比が６ ．６の場合一層太きい。

細胞を含まない溶解液は１５分、１２０００．９で遠心分離することによシ得た 。

細胞を含まない溶解液のＭＯＸ活性は６５％飽和硫酸アンモニウム溶液により沈 澱させることができた。こうして得た沈澱は室温で安定であった。カタラーゼ活 性は沈澱では検出でき１：かった。

硫酸アンモニウムによシ得た沈澱は上記使用に対し適用できる。

Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｆｈａ　Ａ、ＴＣＣ４６０５９を９１の醗 酵容量培地を有する１　３１Ｖｌｊ、酵容量でＯ’、０７８時間−１の稀釈割合 で培地ｆｆ（ＰＩ−１５，０，３７°Ｃ１２５％飽和より大きいｐ○２）に生育 させた。安定状態で得た細胞密度は３９．９９バイオマス（乾燥Ｍ量）／ｌであ った。

例６記載の方法を使用して単離したＭＯＸの比活性は２．１　ＭＯＸ　、ｓ　、 ＝　７ト／ｍ９１７白又は０．６ＭＯｘユニット／ｍ９バイオマス（乾燥重量基 準）であった。

細胞は減圧下に１５°Ｃで２日間凍結乾燥した。−７，５を有する０、０５　Ｍ 　＋）ン酸カリ緩衝液に凍結乾燥試料をサスペンションに再生し、カタラーゼを 含まない好気条件下で超音波処理後の活性は０．６　ＭＯＸユニット／ｍｇバイ オマス（乾燥重量）であった。？ｙＰ、結乾燥後、細胞は少なくとも１週間室温 で安定であった。

ＭＯＸ活性はガラスピーズを含むミルで細＠を破壊開口することにより凍結乾燥 細胞から単離した。細胞サスペンションは窒素をフラッシュした酸素を言まない ０．０５ＭＩＪン酸カリ緩衝液中に調製し、窒素下に貯蔵した。溶解細胞のサス ペンションは遠心分離した。透明な上澄は６５係飽和濃度に硫酸アンモニウムを 添加することにより沈澱させた。溶液は遠心分離した。得た沈澱はすべてのＭＯ Ｘ活性を含んだ。標品は室温で安定で、カタラーゼ活性を含まなかった。

Ｅｇｌｉ培地に　高細胞密度に 基づく　対する培地 ｇ　１−１ｐ　、ｌ−１ グルコース　９　９０ ボルムアルデヒド又は蟻酸　１〜７　ｒｎｌ　５Ｑ　ｍｔＮＨ，Ｃ２７，６３ に、Ｈ２ＰＯ，２，８１６ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，５９４，５ Ｃａ（Ｊ２　・２Ｈ２００，０５５０，６ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，０３７５− ＭｎＳ○ａ・Ｈ２Ｏ０，０１４０，０１ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，０２２０，０ ２２ＣｕＳ○４・５Ｈ２００，００４０，００４Ｃｏ（Ｊ２−６Ｈ２００，００ ４５ Ｎａ　２Ｍｏ○ａ　・２ＨｚＯＯ，００２６０，００２６Ｈ，３Ｂ○３　’　０ ．００４　０．００４ＫＪ　Ｏ，００２６０，００２６ ＥＤＴＡ、　０．４５　− ビオケア　’　０．００００５　０．００００５チアミンＨＣＪ　Ｏ，００５０ ，００５メソ−イノシトール　０．０４７　０．０４７ピロキシジン　０．０口 １２　０．００１２Ｄ　−ハフ　トｆ　７　ｅ　Ｏ，０２３０，０２３Ｎａ（Ｊ 　Ｏ，３ ＦｅＣＪ３　・６Ｈ２００，０３５ Ｈ２Ｓ○、（濃）　［）、［］３ｍｌ のカルチャーにおけるＭＯＸ生産 モル比　ＭＯＸ活性 ホルムアルデヒド／グルコース　ＭＯＸユニット／■タン白０．０７　１．０ ０．３６　４．０ １．０ １．８　６〜７ に生育したＨ、　ｐｏｌｙｍｏｒｆｈａ　ＡＴＣＣ４６０５９のカルチモル比　 ＭＯＸ活性 蟻酸／グルコース　ＭＯＸユニット／ｍ９タン白０．０　０．０５ ０．５２　０．０２５ ３．６　２．５ 稀釈割合　ＭＯＸ活性 時間−Ｉ　ＭＯＸユニット／ｍ９タン白０．０４７　３．０３ ０．０４９　２．９２ ０．２４　１．１ 表Ｅ 丁窒素によるフラッシングおよびカタラーゼ存在の効果 処理　ＭＯＸ活性　比活性 １　−　＋　２１．５　２．０７ １　＋　−２０，０１，９２ 観察： バツチ１−細胞密度３９．９ｚバイオマス／ｌＤ　＝　０．７８時間−１ 蟻酸／グルコース比＝２．６ バツチ２＝細胞密度５．０８５’バイオマス／１Ｄ＝０．１時間−１ 蟻酸／グルコース比：３．７ 第１〜第６図では、略語ＲＱは呼吸商を表わ丁。

国際調査報告 １ｍｍｔａ＋＋６ＭＩＡｅ内＋１１ＭＭ、ＰＣＴ／ＥＰ［！７７００２９５ＡＮ ＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＦ、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲ，ＣＨＲＥｉ’ ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．酵母がオキシダーゼを生産する条件下で酵母を好気醗酵させ、必要に応じて 、生産したオキシダーゼを酵母細胞から単離することによるオキシダーゼ又はオ キシダーゼ含有混合物又は標品の製造方法において酵母のカタラーゼ陰性突然変 異体をオキシダーゼ遺伝子の発現を誘起するがオキシダーゼに対する基質ではな い少なくとも１種の化合物の存在で酵母に適する栄養培地に生育させることを特 徴とする、上記製造方法。
2. ２．ハンセヌラＨａｎｓｅｎｕｌａ属又はピチアＰｉｃｈｉａ属の酵母、特にハ ンセヌラ・ポリモルフアＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｆｈａ種又はピチア ・パストリスＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ種の酵母のカタラーゼ陰性突然変異 体、さらに特にカタラーゼ陰性突然変異体Ｈ．ポリモルフアＨａｎｓｅｎｕｌａ 　ｐｏｌｙｍｏｒｆｈａ５５／１１ＡＴＣＣ４６０５９を使用する、請求の範囲 第１項記載の方法。
3. ３．ＤＮＡ組み換え技術を使用して修飾する酵母又はそのプロジエニーを使用し 、オキシダーゼに対する遺伝情報はメタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）プロモー ク、特にＨ．ポリモルフアＨａｎｓｅｎｕｌａｒ　ｐｏｌｙｍｏｒｆｈａＣＢＳ ４７３２のＭＯＸプコロモータの制御下にある、請求の範囲第１項又は第２項記 載の方法。
4. ４．メタノールオキシダーゼはオキシダーゼ、特にＨ．ポリモルファＨａｎｓｅ ｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍａｒｆｈａＣＢＳ４７３２の既知メタノールオキシダーゼ と同じアミノ酸配列を有するメタノールオキシダーゼ、又は酵素工学により得た この配列の誘導体として生産する、請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項 に記載の方法。
5. ５．ホルミエート又はホルムアルデヒドはオキシダーゼ遺伝子の発現は誘起する が、オキシダーゼに対する基質ではない化合物として使用する、請求の範囲第１ 項から第４項のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．酵母は連続醗酵で培養する、請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に 記載の方法。
7. ７．酵母は選択した酵母に適する炭素源およびホルミエートの存在で培養し、ホ ルミエート：炭素源のモル比は０．５：１〜４．５：１、好ましくは２：１〜３ ．５：１である、請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項に記載の方法。
8. ８．酵母は選択した酵母に適する炭素源およびホルムアルデヒドの存在で培養し 、ホルムアルデヒド：炭素源のモル比は０．１：１〜３：１、好ましくは０．５ ：１〜２．５：１である、請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項に記載の 方法。
9. ９．酵母は炭素源としてグルコースを含有する栄養培地で培養する、請求の範囲 第１項から第８項のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．生産したオキシダーゼは酸素を含まない条件下で酵母細胞から単離する、 請求の範囲第１項から第９項のいずれか１項に記載の方法。
11. １１．請求の範囲第１項から第９項のいずれか１項に記載の方法により得たオキ シダーゼ含有、カタラーゼ陰性の酵母突然変異体。
12. １２．請求の範囲第１０項に記載の方法により得たオキシダーゼ。
13. １３．請求の範囲第１１項に記載のオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性突然変異 体の使用、又は洗滌又は漂白方法においてその場所で過酸化水素を生産するため のオキシダーゼに対する基質、好ましくは基質としてエタノールを同時に含む請 求の範囲第１２項記載のオキシダーゼの使用。
14. １４．請求の範囲第１１項記載のオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性突然変異体 又は請求の範囲第１２項記載のオキシダーゼを含有する洗滌又は漂白組成物。
15. １５．オキシダーゼに対する基質の定性および／又は定量測定に対し請求の範囲 第１１項に記載のオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性突然変異体又は請求の範囲 第１２項記載のオキシダーゼの使用。
16. １６．化学合成又は廃物精製方法の枠組み円でオキシダーゼの基質の酸化に対す る触媒として請求の範囲第１１項記載のオキシダーゼ含有、カタラーゼ陰性突然 変異体又は請求の範囲第１２項記載のオキシダーゼの使用。