JPH01291792A - 植物細胞の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 固定化は２次代謝産物の生産のために植物細胞の浮遊培
養において興味ある選択肢となっている。

この技術の利点は繰り返えし強調され、下記のものを含
む。

従来の技術 １、　バイオマスの均質性と形態的レストとなる植物細
胞の天然組織形成傾向の促進（Ｍ、　Ｌｃｕｒｔｍｌｎ
　、　　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１　ｔ　　６４
９　（１９８３）　；Ｍ、　Ｌ、　５ｈｕｌｅｒ　、　
Ｊ、　Ｗ、　Ｐｙｎｅ　、とＧ、　Ａ。

Ｈａｌｌｓｂｙ、　　Ｊ、　Ａｍｅｒ＋Ｏ１ｌ　Ｃｈｅ
ｍ＋Ｓｏｃ、　６１　。

１７２４（１９８４）。

２、流体力学的応力に対するもろい植物細胞の保護（（
：：ｕｒｔｉｎ前記；　５ｈｕｌｅｒら前記）。。

５、培養系において流体力学および物質移動（ｍａｓｓ
　ｔｒａｎｓｆｅｒ　）について改稗された状態で培地
からバイオマスの分離（５ｈｕｌｅｒら、前掲：Ｑ、３
ａｈａｉとＭ、　Ｋｎｕｔｈ、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
’ｉ、Ｆｒｏｇ、１゜１　（１９８５）　；　Ａ、　Ｒ
ｏｓｅｖｓａｒとＣ−Ａ、　Ｌａｍｔ）Ｑ　。

「Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　ｐｅｒ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏ１ｏｇ７　、　Ａ、　
Ｗｉｓｅｍａｎ　ｅ−ａ、）（ｏｒｗｏｏｄ　、　Ｗｅ
ｓｔ３ｕｓｓｅｘ、　Ｕ、　Ｋ、、　　１９８３．　’
ＶＯ１，Ｌ　　ｐ−３）。

４、培１系の容積効率の改１１　（ｃｕｒｔｌｎ　ｔ　
前掲；８ｈｕ１ｅｒら、前掲；　３ａｈａｉとＫｎｕｔ
ｈ前掲；ＲｏｓａｖｅａｒとＬａｍｂｓ前４　；　ｐ、
１３ｒｏａｅｌｉｕｓ　。

Ｉｍｍｏｂｒｌｌｚｅａ　Ｃｅ１１ｅ　　ａｎａ　Ｑｒ
ｇａｎｅｌｌＱＢ　、　　Ｂ。

Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ　ｅｄ、　、　　ＣＲＣ出版、　
　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ。

１　９８３、　　Ｖｏｌ、１．　　ｐ、７）。

しかし、このアプローチは培地における生育限界（Ｂｒ
ｏｄｅｌｉｕｓ　　１９８３前掲；　ｐ、Ｂｒｏａｅｌ
ｌｕｓ　。

Ａｎ、Ｎ、ｙ、Ａｃａ＋ｉ、８Ｃ１，４３４，３８２（
１９８２）および生成分泌物（Ｃｕｒｔｉｎ前掲；　Ｈ
ｏ５ｅｖｅａｒとＬａｍｂｓ前掲）がその成功に重大で
ある点で問題なしとしない。

植物細胞を固定化するのにこれまで開発された技術は主
にバイオマス包理法である。架橋剤の毒性（ゲルタール
アルデヒド）　（Ｐ、　Ｂｒ０ａｒ１１ｕＢおよびに、
　Ｍｏ５ｂａｃｈ、　　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｔｅａｈｎ
ｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

３２．３！１０（１９８２））又は培地のイオンによる
キレート化（カルシウムやリン酸塩）（Ｐ。

１３ｒｏｄｅｌｉｕｓおよびに、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　
ＦＥＢＳ　Ｉ、ｅｔｔ。

１２２．３１２（１９８０））、機械的安定性の限界（
３ｒｏａｅｌｉｕｓ　１９８３前掲：　ｐ、　Ｂｒｏｄ
ｅｌｉｕｓおよびに０Ｍｏｓｂａｃｈ　、　Ａｄ、　Ａ
ｐｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＋２１３　。

１（１９８２）；およびｐ、Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ　、　
Ａｎ、　Ｎ。

ｙ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、’４１３．３８３　（１９８
３）　）およびバイオマス付加量値（ｐ、　Ｍｏｒｒｌ
ｅ　、　　Ｎ、　Ｊ。

Ｂｍａ　ｒ　ｔおよびＭ、　Ｗ、　Ｆｏｗｌｅｒ　、　
Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ、ｓｅｕｅＱｒｇａｎ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　２　＊　２０７　（１９８３）　）およ
び利用上の固有の離間がデル包埋技術の有用性を制限し
ている。植物細胞の固定化について研究した中空繊維カ
ートリッジも高価でありかつコンタミの原因たる培地再
循環系を必要とする（　Ｗ、　Ｊｏｅｅ　。

ＨｏｐｅａｏｒｓｅｎおよびＣ，Ｃｈｉｎ、　Ａｎ、　
Ｎ、　Ｙ、　ＡＣａｄ＋ＳＣ１，４１３，４（１９）（
１９８！ｌ））。

ポリウレタンフォーム粒子による包理法はＫ。

Ｌｉ、ｎｄｅｅｙ、　Ｍ、　Ｍ、　Ｙｅｏｍａｎ、　Ｇ
、　Ｍ＋Ｂ１ａｃｌｃおよびＦ８Ｍａｖｔｔｕｎａ　（
ＦｇＢｓ　１ｓｔｔ、　　１５３．　１４５により公表
された。この担体を使って、植物細胞粒子は連続開孔ネ
ットワークに物理的に取込まれるようになりついでその
粒子は育ちそしてまた互いに付着しフオーム内の利用空
間のレストを満たすことになる。この包理法は次の欠点
を有する。

すなわち、ウレタンフオーム粒子が大きく、物質移動や
生存性の問題を引きおこし、系の自由粒子性はスケール
アップ上の困難を伴なう（Ｋ、　ＬｉｎｄａｅｙとＭ、
　Ｍ、　Ｙｅｏｍａｎ、　　Ｐｌａｎｔ＆　　１６２．
　４９５（１９８４）；Ｆ、　Ｍａｖｉｔｕｎａ　、　
　Ｊ、　Ｍ＋Ｐａｒｋ　、　　Ａ、　Ｋ、　Ｗｉｌｋｉ
ｎｓｏｎとＰ、　Ｄ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　、　［物組
織と細ＪＪｉｌｌｉＫ関−ｊる第■国際会議、ミネソタ
大、１９８６年８月、ポスター＄２２９））。

米国特許第４，３７８，４３５号および第４，６０５．
６２２号明細書には酵素又は微生物を固形担体に固定す
る方法が開示されている。これらの両方法において、酵
素又は微生物は担体く化学的に結合されている。使用薬
剤は植物細胞に有毒である場合があるから、この２つの
特許に開示される方法は植物細胞の固定化には不適当で
ある。

発明が解決しようとする問題点 本発明者は植物細胞に特に適した簡易な方法とする天然
付着にのみ基づく表面固定化技術を開発することに努め
ている。物質移動は担体構造と培地の流体力学の一数で
あり、この２つの変数は操作容易である。培地中のゆる
い植物細胞の出現、細胞保持の効率を左右するこの技術
の最も自明な潜在的問題は適当な担体物質と混合程度を
選択することにより調節することができる。

ここに記述する植物細胞の表面固形化はＯｆル）包理法
による従来の固定化技術以上にある利点を有する・ １−技術は簡明であり、もろい植物細胞に力が加わらな
い。また植物細胞に使われる正常の生育条件下で行なわ
れる。

２−すべての接種物は容易にかつ強く付着するようにな
る。生育バイオマスは流出せずに常に付着したず１であ
る。

６−付着性を改善するために、特別の化学添加剤は必要
としない。

４−細胞担体物質は培地と共に殺菌可能であり、各種構
造体に容易に成形できる。

５−起泡（細胞の不変の塊りおよび通気下培地レベル上
に分泌、巨大分子の形成）は浮遊培債と比較してかなり
減少する。

６−包埋技術とは反対に、担体マトリックスを破壊せず
に生育しかつバイオフィルムの拡散以外に、物質移動に
対する付加的バリアーはこの方法では課されない。

７−この最後の点は、真菌誘導揖物細胞から２次代謝産
物の生産にとって特に魅力あるものとしている。この方
法は米国特許出願第０６７８８９．２４７号、１９８６
年７月２５日出願に記載される。植物細胞と誘導に使う
真菌抽出物の巨大分子および／又は根毛種間の急速かつ
直接的接触の要件を満足するものである。

またこの方法はバイオマスの流出なく、Ｊ＠養中度々の
培地の取換えを可能にする（　３１１ｅｒｔＵ、　、　
ＫｕｒＺ　Ｘ、　Ｇ、　Ｗ＋およびＣｏｎ５ｔａｂｅｌ
　Ｆ＋、　７植物組織と細胞培養の■国際会議、ｉ　Ｒ
。

Ｌ１日８社、　　Ｎ、Ｙ、、　　１９８６）および８−
表１に示すように、この技術の処理能力は他のすべての
固定化技術より優り、また植物細胞のＯしい浮遊培養よ
りも優る。最新の従来技術はバイオマスの摩損なく流体
力学的に扱いが困難な泡粒子によるアプローチである。

この開発は担体の表面に植物細胞を固定化するのに適当
な担体物質の選択、表面付着方法の機作、フラスコにて
培養した表面固定化植物細胞（ＳＮＰＣ）の付加量特性
、および植物細胞の培養と固定化のために実験室サイズ
のバイオリアクターの開発にある。

本発明は植物細胞の固定化方法に関し、ａ）ポリエステ
ル繊維やセルロース繊維から選んだ無数の互いにゆるく
結合した繊維の形で担体物質を供し、 ｂ）この選択された物質を適当な培養槽におき、ｃ＞　
　４１１物細胞生育培地を培養槽に存在させかつ種内容
物を無菌にし、 ｄ）工程Ｃ）の無菌培地を植物細胞の適当なサスベンジ
ョｙに接種し、 リ　細胞を繊維担体物質に固定化するように選んだ条件
下、十分時間植物細胞を循環し、セしてｆ）適当なバイ
オマス濃度になるまで選択された条件下、十分な時間固
定化細胞を生育するものである。

本発明の宅ましい態様において、固定化する植物細胞は
（’ａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓとｐａｐａ
ｖｅｒｓｏｍｎｉｆａｒｕ＋ｎから選ぶ。

本発明の望ましい態様において、線維担体物質は約０．
５Ｈの最小厚さをもつ繊維ポリエステルジオテキスタイ
ルであり、垂直のラセン構造体に成形される。

本発明によれば、固定化する植物細胞は生育又は静止サ
スペンジョン由来のものであり、少なくとも５　％　（
Ｖ／Ｖ　）の割合で接種し、約１〜２日間繊維と接触す
るように循環させる。

更に、本発明によれば、固定化植物細胞は約６〜１４日
間生育させ、適当なバイオマス濃度にする。

本発明のある態様において、植物細胞を約１００〜６０
０　ｒｐｍの機械的撹拌子生育させ、無菌空気は０．０
１〜０，２０　ｖｖｍの割合で培地に供する。

更に本発明により供されるものは、ポリエステルジオテ
キスタイル型物質と接着性樹脂によりゆるく結合したセ
ルロース繊維から選んだ繊維担体物質と、Ｃ０ｒｏｓｅ
ｕｓおよびｐ＋ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍから選んだ結合植
物細胞の組合わせ体である。

ここに記載の方法は適当な固形担体の表面に植物細胞を
固定化することおよび植物細胞の培養と固定化用のバイ
オリアクターの開発を記述する。

表面固定化植物細胞由来の２次代謝産物を生産するのに
有効な培養系のデザインには多くの基準を満足せねばな
らない。すなわち、代謝転換産物の最大生産性；生成物
の有効回収；調整され、十分適応した均質培養環境；バ
イオマス／培地の相互反応およびバイオマスを再使用さ
せる、固定化バイオマスの安定性。

バイオリアクターとマトリックス構造は培養したもろい
植物細胞と生産方法の需要を満足するように一’ｒ”？
インする。このデザインに影響を与える因子は次の通り
である。

１−マ）　ＩＪラックス造の機能は、十分湿めらしたバ
イオマスの付加量、細胞／培地の密接かつ急速な接触、
有効かつ均質な初期バイオマスの沈着および生活力のあ
る固定化植物細胞の有効保持でバイオリアクター系の望
ましい流体力学を可能にする植物細胞のための固定化す
る表面積を洪することにある。

２−系の基本的流体力学の機能は、固体マトリックス配
列中およびマトリックス構造内で低剪断、効率的、均質
かつ調節可能なボンピングや培地の混合中最初に懸濁し
た植物細胞のもろいバイオマス接種物を液流均質分布で
ある。

３−系がこの方法で成就せねばならない機能は：バイオ
マスを生存するだめの培養物の通２；長期間操作と度々
取換える完全培地の高度信頼性。

１−マトリックス構造 多くの各種型の固形担体物質を植物細胞の毒性、生育お
よび付着性から試験した。細胞付着性の第１要件は高度
に多孔性かつ繊維面であることであろう。また評価した
生成物の範囲内で固定化物質の基本的な化学的性質は余
り重要ではないようである。しかし、これらの物質の化
学組成は付着機構および／又は２次代謝産物又は転換生
成物の生産において若干の役割を演じるであろう。

大概の非金属担体は無毒で、生育可能である。

植物細胞は４つの型の物質：ａ）接着樹脂例えばフェノ
ールやメラミン樹脂によりゆるく結合したセルロース繊
維製の硬質多孔性マトリックス、ｂ）多孔性セラミック
物質、Ｃ）ガラスファイバーおヨヒｄ）繊維ポリエステ
ルジオテキスタイル物質に付着することが分った。

望ましい物質は二次成形適性が容易となるために、０．
５關の最小厚さをもつ繊維ポリエステルジオテキスタイ
ル型であることが分った。これらの物質は他の試験物質
と比較して、最良の生育、付加率、植物細胞の代謝に影
響を与えずに培地の殺菌性および容易な二次成形適性を
示す。

この技術の固定化効率、すなわち培養物容量における全
生産バイオマス以上に保持されたバイオマス量は振盪フ
ラスコにおいて比較的低かった（５〜６５俤）。この効
率は固形担体の垂直ラセン構造を使って、マグネットス
ターラー付きフラスコにて撹拌した培養系を使う場合、
８０〜９９チまで非常に改善された。

この技術の丁ぐれた固定化効率は実験室バイオリアクタ
ーをスケールアップすることによりその後確認された。

殆んど完全な固定化（≧９５係）はこれらの大きな槽で
一致して観察された。培地はマグネットスターラー系で
は２日以内又はバイオリアクターでは５分〜１７時間懸
濁植物細胞を全体的に含まなかった。若干の非固定化バ
イオマスは培地フオーム層で主に蓄積した。この効率お
よび初期付着率を改善した主なファクターは、表面固定
化のためにポリエステルジオテキスタイル７６１２と７
６０７の使用；より大きな固定化面積の利用性およびマ
）ＩＪラックス造（垂直ラセン屈曲マトリックス）と初
期懸濁混合パターン（機械的撹拌）であった。

垂直ラセン屈曲構造は望ましいことが分ったが、他の構
造も可能である。

接種物の固定化に続いて、植物細胞は固形担体マトリッ
クスの両側面に生育し、適当なバイオマス濃度になる。

布地表面ｃｒｒＬ２当り約２０Ｉｎ９ｄ、Ｗ。

までのバイオマスの付加が達成された。高レベルのノぐ
イオマス付加が可能でおるが、バイオマスの付加と物質
移動間に妥協が必要である。

このバイオマスの高保持効率は特別の細胞付着促進添加
剤を使わずに標準生育培地を使う通常の培養条件下で達
成された。

光がなくても固定化方法に影響しない。接種物の日令、
必ずしもその容量でなく、は少なくとも振盪フラスコ培
養において表面−固定化植物細胞の事大付加の決定因子
である。最良結果は静止細胞を使って得られた。この結
果は固定化に含まれる老令禰胞の粘着性と関連がある。

接種物の日令は使用する植物細胞培追物に依存し、すべ
てのタイプの植物細胞は同じ割合では生育しないからで
ある。

植物細胞は少なくとも５チの容量／容着比で接種するこ
とができるが、高接地割合で使用してもよい。

下記の実施例で使用するマトリックス担体（表面積）対
培地（容量）比は約０．３備−１〜約１．２α−１であ
る。しかし、Ａ／ｖ比が高い程よいが、固定面積とバイ
オリアクター内の詰め込み間に妥協がなされなければな
らなりことが認められた。また、固定物質の２ＷＩ間の
空間は約１ｃ！！ｉでなければならない。

２−基本的流動力学 バイオリアクター系の基本的流動力学は担体マトリック
スを通じて、液体の望ましい均一ポンプ輸送、分布およ
び混合について供されねばならない、低剪断で固定化バ
イオマスにおよび低剪断で固定化バイオマスから物質移
動を良好にするために液相を十分撹拌せねばならない。

流動パターンはデッドボリューム、ブリッジング又はチ
ャネリングをおこさずに全体の負荷マトリックスを均一
に浸透させねばならないしまた特に物質誘導技術を使う
場合、急速に液体を循環させかつ・ぐイオマスと接触さ
せねばならない。

これに関連して、例えばエアリフトバイオリアクター又
は機械撹拌バイオリアクターのような適当なバイオリア
クターに設置した垂直ラセン屈曲マトリックス固定配置
は有効な系であろう。バイオマス、固定化技術および方
法の基本的要件を満足する以外に、長期間無＠有効容器
、操作の高信頼性と融通性およびスケールアップ能を供
する。

６−系を遂行せねばならない機能 マトリックス構造内の有効混合は均質なバイオフィルム
の生長を確実にしかつ起泡を最小にするために必要であ
る。適当な混合はエアリフトバイオリアクターにて機械
的撹拌または空気を送って行なうことができる。固形担
体のラセン屈曲構造はマトリックス構造内の有効混合に
も寄与しているＯ ＠接物への通気は構造体に十分０２を供給するのに必要
であるが、起泡又は有毒Ｏ２Ｖベルになるのを回避する
ためにコントロールする必要がある。このコントロール
は機械撹拌リアクターにおける混合又はエアリフトバイ
オリアクターの所定構造内で空慨流の調整により通気を
バランスして行なうことができる。

この表面固定化技術はインドールアルカロイド（代謝産
物）の生産のためにＣ，ｒＯθθｕｓ　随物細胞を固定
化するのに有効であることが分った。他のタイプの植物
細胞を使用することもできる。例えば、ｐ、ｓｏｍｎｉ
ｆｅｒｕｍ植物細胞系もうまく表面固定化できた。固定
化したｐ、ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ　Ｍｒ３胞はコデイン
、テバインおよびサンヤナリンのような２次代謝産物の
生産に使用される。

この技術に他の分野にも連用可能である。例えば、 １−バイオ形質転換（添加物質を例えばファインケミカ
ルの製造用に転換）および吸収系例えば金４の除去用に
植物細胞を使用すること。

２−バイオセンサー用に植物細胞を固定化すること。

５−生理学研究の道具として表面固定化すること。

実施例１　表面−固定化植物細胞に適当な担体材料の選
択 固定化担体として考えられる平らに切断した材料試料を
７０１４エチルアルコール溶液に３０分役菌した。これ
を無菌生育培地ｌｌ３５（Ｂ５゜ＧａｍｂＯｒｇ　Ｏ，
Ｌ、、　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｒ，Ａ、およびＱｊｉｍａ　Ｋ
、。

Ｅｘｐｅｒ、Ｃｅ１１Ｈｅａ、５　Ｑ　　：　　１　５
　１　　Ｎ１　５９ｖ１９６８、成長ホルモン２．４−
ジクロロフェノキシ酢酸’ｌ　ｍＭ金含有で洗いついで
この生育培地１０−２０耐含有のべ）ＩＪ皿に移した。

これらにＧｌｙｃｉｎｅ　ｍａｗ、　Ｎ１ａｏｔｉａｎ
ａ　ｔａｂａｃｕｍ又はＣ，ｒｏｓｅｕｓ植物細胞の生
長培養物２ｄを接種した。これら細胞系の浮遊培養物を
カルスから得た。この浮遊培養物を成長ホルモン２，４
−ジクロロフェノキシ酢酸２ｍＭとスクロース２０ｊｉ
／ｌ補給の液体培地Ｂ５　２００ｄを含有する５　００
　ｍｌ　　Ｄ８１０ｎｇ７ラスコにて培養した。この培
地の−を殺菌（１２０℃、１５　ｐｓｉ、１ｈ）前５．
５に調整した。

この植物細胞系を毎週継代培養（接種物１０俤ｖ／ｖ　
）　［、た。細胞浮遊物は連続照明下２７℃で維持し、
１５０ｒｐｍの回転振盪機で撹拌した。接種した〈）１
７皿は５０　ｒｐｍで作動する振盪機に設置し、２７°
Ｃで３〜７日間保持した。

多くの各種材料は６つの細胞培蓋物の与件、生育および
付着性について試験した。それらには下記のものを含む
。

１、　ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンお
よびポリ弗化ビニリデンのビーズ。

２、　多孔性ポリエチレンシート。

６、　ポリエステルジオテキスタイル型シート。

４、　樹脂結合繊維製の多孔性マトリックス。

５、　ポリエステル−イミド表面。

６、　正負荷電のゼータ電位膜。

Ｚ　ハニカム構造の被覆アルミ部分。

８、水耕栽培担体部位（セラミック、油頁岩、バーミキ
ュライトン。

９　シリケートと活性炭の粒子。

１０、各徨多孔度のケイソウ士固体。

１１、セラミック物質。

１２、ガラスファイバー。

選択基準には植物細胞培養物の生育の肉眼的評価ならび
に酷しｂ水洗後に担体に付着している残存バイオマスの
定性的評価がある。

大概の非金属性担体は無毒で、生育可能である。

植物細胞は試験した４つの型の物質に結合することが分
った。ａ）フェノール又はメラミン接着樹脂（ｗＢとＱ
　８−　ＡＭＦ　Ｃｕｍｏ　　より提供）によりゆるく
結合したセルロース繊維製の５０〜１２５１ｕｎ孔度を
有する硬質・多孔性マトリックス；ｂ）多孔性セラミッ
ク物質；Ｃ）ガラスファイバーおよびｄ）一連の繊維ポ
リエステルジオテキスタイル物質（７６０７，７６（１
９）および７６１２−　Ｔｅｌｅｃ社製）はうまく植物
細胞を付着することが分った。

ジオテキスタイル型の物質は２．６〜６．５属冨の厚さ
で、各々は６０〜８０μ眉の孔度であった。ジオテキス
タイル型フォーマットの繊維ポリエステルは最も望まし
いものであり、他の試験物質と比較して、植物細胞の代
謝や二次成形適性の容易性に影響せずに培地中の最高の
生育、付加譬率、殺（■性を供するからである。

表面固定化植物細胞（５ＩＰＣ）はフルオレラセンジア
セテート染色（Ｊ、　Ｍ、　Ｗｉｄｈｏｌｍ　、　　５
ｔａｉｎＴｅｃｈｎｏ１．４７．　１８９．　１９７２
）により測定して、十分生存していた。細胞の連続生存
性は非常に重要であることが分った。というのは生存性
のロスは担体物質からの脱着となることが測定されたか
らである。

表面固定化植物細胞はゲルタールアルデヒドで固定し、
テトラオキサイド、クエン酸鉛および酢酸ウラニルで染
色しついで透過電子顕微鏡（Ｔｍ）でみるために標準法
によりエポキシ樹脂に包埋した。選択した物質の表面に
固定した植物細胞はＴＥＭを担体表面に非常に近く接触
させかつその形状をこの表面の微小構造に部分的に適応
させて観察した。細胞壁と担体物質間の接触面積で、電
子密度層の観察の結果、ギャップフィラーおよび／又は
接着剤として作用すると思われる化合物が細胞により分
泌されることを示した。

実施例２ 振盪フラスコ中の（’、ｒｏｓｅｕｓ植物細胞の表面固
定生 選択した担体物質（Ｎ８、Ｑ８．７６０７．７６（１９
）および７６１２）を８Ｘ３０＃１１の片に切断した。

それらを５００ｒｎｌ　Ｄｅｌｏｎｇ”フラスコ中ステ
ンレススチールワイアで６つの群に懇濁させ、培地１Ｂ
５（２７５ｍｊ）と共にあるいはなしで殺菌（１２０℃
、１５ｐθ１．１ｈ）し、後者の場合にはその後に培地
を加えた。ついで植物細胞の生育サスペンジョンを接種
した（５々１０　％　Ｖ／Ｖ　）。

これらのフラスコは回転振盪機で１３０又ニ１５Ｏｒｐ
ｍの混合速度で連続照射下２７℃７２〜１４日保持した
。

固定化し又は懸濁植物細胞を蒸留水で洗い、空気循環オ
ープン中６０℃７１８〜２４時間乾燥し、担体物質又は
残存乾燥懸濁バイオマスのバイオマス付加蓋を評価した
。

培地の炭水化物組成はＲｓｆｒａｃｔｉｖｅ　工ｎｄｅ
ｘＤｅｌｏｃｔｏｒを装着したＷａｔｅｒｓ　３ｃｉｅ
ｎ、ｔｉｆｉｃ　ＨＰＬクロマトグラフモデル６００　
ＯＡ　−Ｕ　６　Ｋ　−Ｒ４０１で分析した。使用した
分離カラムはＢｉｏｒａｄＡｍｉｎｅｘ”　ＨＰＸ　−
８７Ｃであった。ＨＰＬＣグレード水は液相であった。

カラムは８０℃、０．９１ｒｌｌ１分の流速、８００ｐ
８１ｇの指圧で操作した。

振盪フラスコ中で培養した生育植物細胞サスペンジョン
を表面固定化して、試験した担体物質は比較的均質なバ
イオマス付加量となった。

バイオマスの付加量を最大化するために各種パラメータ
を評価した。結果は表２に示す。担体表面に植物細胞を
付加するのは主に固定化用物質、接種物の日令（ａｇｅ
　）および混合速度によった。

温和な混合と、その厚さ（７６０７Ｍ２．６１１　；７
６（１９）−３．０１ｍ；７６１２　ν３．５１１）だ
けが異なる７６０７．７６（１９）および７６１２の組
合わせの結果、物質Ｗ８とＱ８で観察されたものより高
いバイオマスの付加（２００〜４００％）となった。ジ
オテキスタイル物質は植物細胞のその後の生育を阻止せ
ずに培地中で殺菌することもできる。

接種物の日令はバイオマスの付加を増丁因子であること
も分った。８〜１４日令培養物由来の接種物は最高の結
果を示した。このことは−層加令の植物細胞サスペンジ
ョンの分泌ポリサッカライド高含量およびその付着性に
帰因するといえる。

混合速度が１６０から１５　ＯＲＰＭに増加すると、Ｑ
８物質についてわずか（２０％）バイオマスの付加を改
善したが、７６０７．７６（１９）および７６１２物質
については実質的に減少した。

実験を通して、自由浮遊担体について植物細胞を表面固
定するのは有効でないことが分った。光は細胞の表面付
着に影響しなかった。しかし、５ＩＰＣ培麿物の生育は
苔千の制限を受けたに違いない。と言うのは、炭水化物
の不完全消費は、混合速度が１３　ＯＲＰＭの時、３　
ｍ９　ａｌｗ、　／　ｃｍ２以上のバイオマス付加で観
察された。同一条件下で培便した植物細胞サスペンジョ
ンは培養１２日巨魁μ〜０．２４　（Ｌ−１）で炭水化
物は完全に消費した。

得られた遺制の付加は２０．７　ｍ９　　ｄ、ｗ、７ｃ
ｍ２７６１２物質であった。このバイオマス層の厚さは
５關であり、植物細胞９５チ水和レベルに一致する湿Ｉ
Ａ／乾燥バイオマス比２５を示した。

担体物質に対するバイオマス沈着の効率は振盪フラスコ
系で２５〜５０４に達し、この場合固定化面積は３００
ｆｆ＋／のサスインジョン容積に対シ３３ｆｆｉ”（Ａ
、、”Ｖ（面積／容積）　−０，１１ｃｍ−’　）であ
った。生産されたが担体に付着しない多量の植物細胞は
フラスコ５ＮＰＣの他の特長をマスクした、例えば付着
と生育方法の間の違い。

振盪フラスコで培養したバイオマス付加量は定期的にフ
ラスコを変えて評価し、固定化バイオマスｊをみた。結
果は２つの混合速度で物質７６１２とＱ８について表６
に示１７た。振盪フラスコ系における固定化植物細胞バ
イオマス量は、栄譬がなくならない限り、経時的に有意
な関係を示した。

各物質について固定化細胞の生育速度に及ぼす撹拌度の
影響は前記した。混合速度が増すと、物質７６１２に対
する５ＩＰＣ生育率は最初の値の７４壬に減じた。同じ
く混合速度が増した場合、物質０８に対する５ＩＰＣ生
育率は有意に１００係改善した。生育率はマグネットス
ターラー系（実１ｍ例６に記述）について表４に記した
結果と同一であった。

灸 担体物質（７６１２）のス）　ＩＪツブを全表面積１０
０ｃｒｎ２、外直径４．０ｃＩｎの垂直ラセン形に成形
した。この屈曲担体束を培地ＩＢ５　３０Ｑｍｊ含有広
ロエルレンマイヤーフラスコ（５０ＣＩＩ１１／）に懸
濁させた。この培養槽を殺菌し、接種しそして実施例２
のように、２７℃に維持した。撹拌はマグネットバー（
１傭×５ｍ）により１１０シロ０ＯＲＰＭで行なった。

ある場合に、無菌空気を０．０２ｖｖｍ　（空気の容量
／培地の容量７分）の割合で深部培養シンターがラスス
パージャ−に通した。培４１巨魁に、植物細胞が有効に
付着するために低混合を行なった（１１０醸１２５　Ｒ
ＰＭ　）。ついで、混合速度を目的のレベルに増した。

別法として、約２０　ＯＲＰＭでコンスタントに保つこ
ともできる。

更に大きい付着効率（８０−９０係）は０．３２−１の
ＡＺｖ比（面積／容量）でフラスコ中マグネットバー撹
拌を使って５ＩＰＣ培養系にて達成した。接種物の完全
な固定化は培養の初日又は２日目に一般に生じた。この
培地は回収するまで細胞を完全に含まず、生成した少な
いフリーのバイオマスはフラスコに付着するかあるいは
空気を散布した系にて小さいフオーム層に蓄積している
。

この系における培養実験の結果は表４に示す。

担体物質の高い付加と均質な細胞の被覆がみられた。最
終の培地−は通常の植物細胞浮遊培養（−４５，６〜５
．８）および振盪フラスコにて培養した８ＩＰＣより低
かった。双ＰＣの生育が制限されかつ代謝の遅れに低生
育率とバイオマスの収率および浮遊培養と比較して（μ
０．２４　ａ−１および５（１９）６０％）、不完全な
炭水°化物の消費値より示される。実際この低収率と連
続生育のために強制通気の要求は浮遊培養細胞より５Ｉ
ＰＣの高い呼吸率を示唆している。

撹拌率１２５〜２０　Ｑ　ＲＰＭ　（インにラーレイノ
ルズ数５２００〜８３００またはチップ速度６３−５２
０／秒）は、物質移動が最大の生育速度を確実にするに
十分な限界混合レベルを示すようである。植物細胞は混
合速度６００　ＲＰＭ　（インペラーレイノルズ数２５
０００またチップ速度１５７ｃｍ／秒）でも担体物質に
しっかりと付着したままであった。

実施例２のように、５ＩＰＣの生育速度はマグネットス
ターラー系で測定した。栄養が豊富である限り、同じよ
うな直線的生育挙動がみられた（表３）。生育率の値は
振盪フラスコにみられたものに匹敵していた（表３）６ 実施例４　機械的に撹拌したバイオリアクター（ＩＰ） 試験に使用する機械的に撹拌したバイオリアクターは三
角底の２１がラス容器であった。通気はシンターがラス
パーシャーおよびマグネットバーにより行なった。その
主な特性は表５に要約しである。

表　　５ 固形担体は実施例６に記述するように、ラセン形に成形
した。バイオリアクターは標準法（１２１℃、１５ｐ８
１．１時間）により培地と共に殺菌した。

ついでＣ，ｒｏｓｅｕｓ　”＜５３胞の８〜９日令のフ
ラスコ培養サスペンジョンを接種した（　１０１　ｖ／
ｖ　）。

３００　ＲＰＭの混合率（インペラーレイノルズ数２９
．６００又はチップ速度１２１ｃｉ／秒）および通気率
Ｑ、２ｖｖｍはこのバイオリアクターでは最適と分った
。フラスコ系にみられるように、植物細胞の完全固定化
は接種後２４〜４８時間以内に入られた。マトリックス
表面の均質なバイオマス被覆は、支持マトリックスの低
高さ／直径（０，７７）ラセン構造内の層重プロスに対
し混合パーによる渦巻き状の動きに伴なって達成された
。ＩＰバイオリアクター中の発泡は、殆んどの細胞が固
定マトリックスに容易かつ強く付着する時、小さい（≦
１　ｃｍ　）層に限定された。

２つの代表的実験結果は表６に示す。

これらの結果は、植物細胞高保持率（≧９０チ）が得ら
れたことを示す。

実施例５　固定化植物細胞由来の２次代謝固形担体の表
面にＣ０ｒ０８ｅｕ８細胞系９５３を固定化しかつ生育
させてから、細胞−被覆担体をアルカロイド−生成培地
（ＡＰＭ　）　（Ｚｅｎｋ　Ｍ、　Ｈ，。

ｐｌ　−３ｈａｇｉ肌ｒ　Ａｒｅｎｓ、　Ｈ，、ＳｔＢ
ｃｋｉｇｔ　、　Ｊ、。

Ｗｅｉｌｅｒ、　　Ｅ、　ｗｅ、およびＤｅｕｓ　、　
　Ｂ、、　植物組織培ｉ’Ｊ　−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　、　　Ｂａｒ
Ｚ　。

Ｗ、Ｒｅ１ｎｈａｒｄ、　Ｆ２．、　Ｚｅｎｌｃ、　Ｍ
、　Ｌｌ　ｐ、２７−４３＊１９７５？　　Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　　ニューヨーク）に移し、３週
間維持させた。トリプタミンは固定化細胞に存在しかつ
トリプタミンとアジマリシンは培地に存在することが予
備的評価は示した。したがって、これらの結果は、固形
担体の存在は固定化植物細胞由来の２次代謝物の竜生に
影響を与えなかったことを証明している。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物細胞の固定化方法であつて、 ａ）ポリエステル繊維およびセルロース繊維から選ばれ
   た無数の繊維が共にゆるく結合した状態で担体物質を供
   し、 ｂ）選択された担体物質を適当な培養槽に配置し、 ｃ）植物細胞生育培地をこの槽におきかつ槽と内容物は
   無菌にし、 ｄ）ｃ）工程の無菌培地に植物細胞の適当なサスペンジ
   ョンを接種し、 ｅ）植物細胞を循環させて、細胞が繊維担体物質に固定
   化状態になる様に選んだ状態下十分な時間繊維と接触さ
   せ、ついで ｆ）この固定化細胞を適当なバイオマス濃度になる選択
   条件下十分な時間生育させることを特徴とする、上記固
   定化方法。
2. （２）固定化させる植物細胞はＣａｔｈａｒａｎｔｈｕ
   ｓｒｏｓｅｕｓ又はＰａｐａｖｅｒ　ｓｏｍｎｉｆｅｒ
   ｕｍである、請求項１記載の方法。
3. （３）工程ａ）の担体物質の繊維は少なくとも１つの布
   地配列および接着手段により結合している、請求項１記
   載の方法。
4. （４）工程ａ）の担体物質は約０．５ｍｍの最小厚さを
   有する、請求項１記載の方法。
5. （５）工程ａ）の繊維担体物質は繊維ポリエステルジオ
   テキスタイル物質である、請求項１記載の方法。
6. （６）工程ａ）の繊維担体物質は垂直ラセン構造に成形
   される、請求項１記載の方法。
7. （７）培地容量（Ａ／Ｖ）に対する固定化面積は約０．
   ３〜約１．２ｃｍ＾−＾１である、請求項１記載の方法
   。
8. （８）工程ｄ）の植物細胞は生育又は静止サスペンジョ
   ン由来のものである、請求項１記載の方法。
9. （９）工程ｄ）の植物細胞は少なくとも約５％（ｖ／ｖ
   ）の比で接種する、請求項１記載の方法。
10. （１０）工程ｅ）において、植物細胞を約１〜２日間循
    環させて、細胞を繊維担体物質に固定化させる、請求項
    １記載の方法。
11. （１１）工程ｆ）において、植物細胞を約６〜１４日間
    生育させ、適当なバイオマス濃度にする、請求項１記載
    の方法。
12. （１２）工程ｅ）とｆ）において、植物細胞を約１００
    〜６００ｒｐｍの機械的撹拌下に維持し、無菌空気を約
    ０．０１〜０．２０ｖｖｍの割合で供する、請求項１記
    載の方法。
13. （１３）工程ｅ）とｆ）において、植物細胞を約２００
    ｒｐｍの機械的撹拌下および（約８３００のインペラー
    レイノルズ数又は約５２ｃｍ／秒のチップ速度）に維持
    し、無菌空気は約０．０２ｖｖｍの速度で供する、請求
    項１記載の方法。
14. （１４）工程ｅ）とｆ）において、植物細胞を約３００
    ｒｐｍの機械的攪拌下および（約２９６００のインペラ
    ーレイノルズ数又は１２１ｃｍ／秒のチップ速度）に維
    持し、無菌空気は約０．２ｖｖｍの速度で供する、請求
    項１記載の方法。
15. （１５）セルロース又はポリエステルジオテキスタイル
    型物質および接着手段によりゆるく結合したセルロース
    又はポリエステル繊維から選んだ繊維担体物質とそれに
    固定させた植物細胞との組合わせ体。
16. （１６）植物細胞をＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓ
    ｅｕｓ又はＰａｐａｖｅｒｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍから選
    ぶ、請求項１５記載の組合わせ体。
17. （１７）バイオマス付加量は、物質移動問題がおこらな
    いものである、請求項１５記載の組合わせ体。
18. （１８）バイオマス付加量は１〜２０ｍｇｄ．ｗ．／布
    地表面ｃｍ＾２の範囲が望ましい、請求項１７記載の組
    合わせ体。
19. （１９）組合わせ体を適当な培養槽におく、請求項１５
    記載の組合わせ体。