JPH01242941A - 物質パターンの分離検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、物質パターンの分離検出方法に関し、特に
、複数の物質が混在する画像に対し分光情報を利用し各
物質の分布パターンを分離抽出する、医学、薬学、解剖
学、生物学、化学など広範な分野に利用可能な物質パタ
ーンの分離検出方法に関する。

［従来技術とその問題点１ 未知の試料を顕微鏡でのぞいてみると、そこには種々の
物質が空間的に重なり合い、あるいは混りあって分布し
ているであろう、もし、観察される画像に何種類の物質
が含まれていて、それらは何々で、各々どんな比率でど
のように分布しているかを分かる方法があれば、パター
ン解析による現象分析や未知の新しい物体・物質の研究
・発見に大いに貢献できろ。

従来、このような目的に対する画像処理法として、各成
分の空間的特徴すなわち統計量、空間周波数分布、幾何
学的形状等に注目した、パターン認識の各手法が適用さ
れてきた。特に、テクスチャー解析や文字認識等では、
既に多（の成果が得られている。

しかし、この手法では物質情報が空間的特徴として現れ
る場合に限られるため、これを利用した手法の実用的な
応用範囲は非常に制限される欠点がある。

そこで、より一般的には、物質の識別には分光学を応用
し、分光情報を利用すべきである。異なる物質は、適当
なエネルギーの電磁波に対して必ず異なる応答を示すは
ずである。人間の目はその簡単な実例で、３バンドの画
像から物を識別する。

ＲＧＢのカラー画像処理は、人間と同じ識別能力を有す
るが、わずか３バンド程度では、各種の物質の識別は不
可能で（を大３種類まで）、各物質の空間的特徴に頼ら
ざるを得ない。

検出したい物質の吸収（あるいは反射、蛍光）スペクト
ルが予め分かっているなら、その物質が空間的ｖｆ徴を
有していなくとも、観察画像の各点において、スペクト
ル分布を分光測定することにより、物質の濃度分布パタ
ーンを求めることができる。特に多成分が重畳して観測
されるような試料にたいしては有効で、例えば異なるエ
ネルギーバンドでｘｍ”ｒ；真（人体）を２枚撮り、適
当な比率で画像を合成すると、骨部のみの画像や、逆に
骨のみを除いた軟部組織の画像が得られることはよく知
られている。Ｌ　ｅｈｍａｎｎらの提案したこの画像構
成法（Ｍｅｄ、　Ｐｈｙｓ、　８　、　ｐｐ　６５９−
６６７（１９８１））は、各物質を空Ｉ」的に分離する
Ｘ線ＣＴより、場合によってははるかに有用であり、得
られる画像も高品質である。

第１図は、このＬ　ｅｈｍａｎｎらの提案した手法を説
明する数学的モデル図である。これは、Ｍ個の物質から
なる試料を入０．入２．・・・・・・入ＨのＮｍの波長
で観測した様子を示している。得られる多重分光画像ｉ
＋＋ｉｚ＋・・・・・・１ｊＨすなわちｉ（Ｘ＋Ｆ＋Ａ
ｋ）は、各物質のスペクトルＳ・（λ）ｔＪ＝Ｌ２ｔ・
・・・・・、Ｍとその空間分ノ 布パターンｐｊ（ｘ＋ｙＬＪ＝Ｌ２＋・・・・・・、Ｈ
の積和として与えられる。すなわち、 ！（Ｘ＋Ｆ＋λ８）＝Σｓｊ（λｋ）ｐｊ（ｘ＋ｙ）　
　　（１）ｌＩＩ 第１図では、各波長での観測像および各成分物質の空間
分布パターンは、それぞれｉｌ、ｉ２＋・・・・・・＋
ｉｓおよびＩ）！１ｐ２１・・・・・・１９Ｍとベクト
ル表記されており、それらの要素はそれぞれ空間的な画
素の密度である。（１）式を行列表記すると Ｉ＝ＳＰ　　　　　　　　　　　（２）となる。第２図
にこの（２）式の要素を図解して示した。

さて、ここでの課題は、（２）式において分光観測画像
■から、各成分のスペクトルの行列Ｓとその密度分布の
パターン行列Ｐを求めることである。

ここで、存在する成分の個数とそれらの物質がなになに
であると分かっておりかつそのそれぞれのスペクトルが
分かっている場合、（２）式でＳは既知であり、パター
ンＰは■にＳの逆行列を掛けることにより求められる。

すなわち、 Ｓ−’Ｉ＝Ｐ　　　　　　　　　　　（３）しかしなが
ら、この手法において、Ｓ、つまり、すべての成分のス
ペクトルが既知でなければならず、１つでも未知物質が
存在すれば、この方法は全く適用できない。特に、例え
ば生物試料などでは、測定毎の条件・環境によってスペ
クトルが変化するため、予め確定的なスペクトル情報を
得ることは困難である。

本発明は、上記の問題点、即ち試料に１つでも未知物質
が含まれていると、物質の分布パターンＰを求めること
ができない問題点を解決しようとするものである。

さらに、換言すれば、画像内に存在する物質に関する成
分個数やスペクトル情報等の先験情報を必要とせずに、
各成分物質の定性及び定量分析を可能にする手法を提供
することを目的とする。

［問題点を解決するための手段１ 本発明に係る物質パターンの分離検出方法は、少なくと
も１つの未知物質を含みこれらの物質が２次元に分布し
た試料に、第１の電磁波エネルギを与え、放出される電
磁波を分光計測して第１の分光画像セラ［、を得、前記
試料に、前記第１の電磁波エネルギを与えたときとは異
なる第２の電磁波エネルギを与え、放出される電磁波を
分光計測して第２の分光画像セットＩ２を得、得られた
第１の分光画像セット１１に対し、上記第（Ｎ式の特異
値分解の演算操作により前記試料の成分物質の個数を求
め、 １１＝ＵΣ丁■　　　　・・・（１） 次に、前記第（１）式で求められた行列Ｕ、Σ、■と前
記第２の分光画像セラ）Ｉ２とに基づいて上記第（ＩＩ
Ｉ）式の演算操作により行列Ｂを求め、Ｂ＝Σ−１ＵＩ
２Ｖｔ　　　・・・（ＩＩ）求められた前記行列Ｂの転
置行列Ｂの固有値と固有べ、り）ルを演算して求め上記
第（１）式で与えられる行列Ｔと対角行列Ａを求め、そ
して、ＴＢＴ−１＝Ａ　　　　　・・・（Ｉｆｆ）上記
第（ＩＶＪ式により前記行列Ｔに前記行列■をぶ立して
、 Ｐ＝ＴＶ　　　　　　　　・・・（ＩＶ）少なくとも前
記試料に２次元に分布する物質のそれぞれの分布パター
ンＰを求め、人間可読型データ形式としてこれを出力装
置に出力することを特徴とするものである。

［実施例１ 以下、本発明の実施例を、生物試料に係る蛍光顕微画像
計測を一例として具体的に説明する。

生物試料を蛍光色素で染めて蛍光顕微鏡で１１察すると
、物質ごとに異なった色で見える。これは、物質によっ
て色素との結合状態が異なり、従って異なる蛍光スペク
トルを持っためである。医学的臨床、生物学的研究にお
いては、現在このような蛍光画像から各物質の空間的な
定性・定量分析を行っている。しかし、画像内で未知の
物質が互いに重なりあいスペクトルも重畳する場合、干
渉フィルタ等によって１つの物質のみのパターンを抽出
することはできないので、従来ではこのような場合に物
質側々にそのパターンを解析することができなかった。

本発明に係る方法は、これを可能にするもので、まず、
蛍光画像を採取する段階に第一の特徴がある。

一つの蛍光画像に対し、励起光の！ｆＬ氏と蛍光発光波
長をそれぞれ順に変えて観測し、２組の蛍光分光画像セ
ットを採取する。すなわち、励起側の第１のフィルタに
よる第１の励起光（波長λ〒）に対し、観測側の蛍光発
光波長を順に変えてＮ個からなる第１の蛍光分光画像セ
ットを得、次に、第１のフィルタを第２のフィルタに取
り替えてこのフィルタによる第２の励起光（波長λ２）
に対し、先と全く同様に観測側蛍光発光波長を順に変え
てＮ個からなる第２の蛍光分光画像セットを得る。

いま、第１の励起波長λ１で観測した多重分光画像’ｌ
（Ｘ＋Ｙ＋λｋ）を上記（１）式と同様に、と表わす。

ただし、ｓ＋ｊ（λ−は励起波長槽のときの各成分の蛍
光発光スペクトルである。

第２の励起波長λ２で観測するとき、蛍光発光スペクト
ルの波形は物質ごとに変化しないが、波形全体の強度（
高さ）は、励起波長λ１とλ２における吸光度Ａの比ａ
（Ａｊ（λ”ｚ）／Ａｊ（λ’Ｗ）＝ａｊ）だけ変化す
る。つまり、 ＋２（ＸｌＦ＋λｋ）＝：５２ｊ（λＨ）ｐＮｘ＋ｙ）
＝子ａｊｓ・Ｊ（λ−ｐＮ舅）　　　（５）となる。（
４）、（５）式を上記（２）式と同様に行列表記すると
、 Ｉ　、＝Ｓ、Ｐ　　　　　　　　　　　　（６）Ｉ２＝
８２Ｐ＝Ｓ、ＡＰ　　　　　　　（７）となる。ここで
、行列Ａは吸光度の比ａｊを対角要素にもつ対角行列で
、 と表わされる。ａｊの添字Ｘはここでは不定である。

さて、スペクトルの行列Ｓ、、Ｓ２と分布パターンの行
列Ｐを求めるのが目的であり、これを２ｍの画像セラ）
１．、Ｉ２だけから以下の演算操作で求める。ここに本
発明の第２の特徴がある。

まず、行列工、から、画像内に存在する成分物質の個数
Ｍを求める。

第１図で、左冊の観測画像セットから、含まれる成分数
を求めることは比較的に容易である。もし試料がＭ個の
物質から構成されるなら、行列りはいかに高次元であろ
うと、たかだかＭ個のベクトルで表すことができ、ラン
クはＭである。これは、第３図を参照しても明らかであ
る。第３図は第１図の多重分光画像モデルの別の表現で
、図中右側は、各画素のスペクトルを示している。これ
らのスペクトルは、もし試料がＭ個の物質からなるなら
、当然それらＭ個の成分スペクトルの線形結合で与えら
れる。すなわち、１１のランクはＭである。

１１のランクは、共分散行列Ｉ　Ｉ　Ｉｍの固有値（特
異値、なお１字１は伝音行列をあられす）の数に対応す
る。化って、１１を特異値分解する。すなわち、 １１＝ＵｔΣ＋Ｖ（８） 但し、２丁は、Ｉ、１．の零でない固有値の平方根を対
角要素とする対角行列であり、Ｕ、Ｖはそｉす れぞれＩ　、　Ｉ　、、　Ｉ　、　Ｉ　、について、固
有値に対応する固有ベクトルを並べた行列である。ここ
で、２丁の零でない固有値の数が、成分の個数に一致す
る。

原理的にはΣの次数が成分数に対応するが、実際の観測
には誤差を伴うので、誤差の影響により、一般にこの次
数は成分数より大きくなる。そこで、雑音の分散以下の
特異値は雑音によるものとみなし、それらと対応する固
有ベクトルは、Σ、Ｕ、Ｖから除く。上記のことは、多
変量解析にいう主成分分析の利用であり、数値解析にお
いては特異値分解、パターン認識においてはＫ　ａｒｈ
ｕｎｅｎ　−Ｌ　ｏａｖｅ変換である。

次に、パターン行列Ｐとスペクトル行列Ｓ、を先に求め
た固有ベクトルで表現すると、Ｐ＝ＴＶ　　　　　　　
　　　　　　　（９）ｓ、＝ぴΣ＋Ｔ−’　　　　　　
（１０）である、ここで、行列Ｔは数学的には任意のＭ
ＸＭの行列である。

この未知の行列Ｔと、吸光度の比の対角行列Ａを求める
ために、１２の画像セラ）Ｉ２を用いる。

上記（９）式、（１０）式を（２）式に代入すると、ｌ
２＝ＵｔΣ＋Ｔ−’ＡＴＶ　　　　（１１）これを式変
形すると、 ＴＸ−蚕Ｕ　１．ＶｔＴ−’＝Ａ　　　　（１２）とな
る、ここで、 Ｂ＝Σ−ｒＵ　Ｉ　２Ｖｔ（１３） とおく。（１２）式は次のようになる。

ＴＢＴ−’＝Ａ　　　　　　　　　　（１４）この（１
４）式の両辺を転置すると、 （Ｔ　）−’Ｂ　Ｔ　−Ａ　＝Ａ　　　　（１５）とな
る。

Ａが対角行列であることにより、（１５）式において、
ＴｔがＢｔの固有ベクトル行列で与えられ、また、Ａの
対角要素ａｊは、対応する固有値で与えられる。

以上のことから演算のプロセスをまとめると、■画像セ
ット１１を（８）式にしたがって特異値分解し、成分の
個数Ｍを求める。

■■で求まったＵ、Σ丁、■と第２の画像上ッｌＩ２か
ら（１３）式にしたがって行列Ｂを求める。

■■で求まった行列Ｂの転置行列Ｂｔを求めこれの固有
ベクトルから行列Ｔｔを、転置してＴを求め前記固有ベ
クトルに対応する固有値から行列Ａを求める。

■■で求まった行列Ｔを（９）式に代入してＰを求め、
また必要に応じて行列Ｔの逆行列を求めこれを（１０）
式に代入してＳｌを求める。Ｓ２は、求められたＳｌと
■で求まった行列Ａとから、Ｓ、Ａの演算で求められる
。

演算は、メモリに格納された画像セラ）Ｉｔ、Ｉ２のデ
ータを所定のプログラムに基づいてコンピュータにより
行う。

尚、成分物質のパターンＰを求めるのが目的であり、ス
ペクトルＳ、、Ｓ２を求める必要がない場合には、観測
用フィルタとして単一波長を選択するバンドパスフィル
タを用（することな（、任意のフィルタ、例えばバイパ
スフィルタ、ロウノ（スフイルタ等々の組合わせを用い
てもよく、また、演算により微分（差分）フィルタ等を
構成してもより１゜その場合、Ｓｌ、Ｓ２として求めら
れるのは、各成分を対応するフィルタで個々に観測した
ときの蛍光強度に対応する。

また、励起用のフィルタについても同様に、任意のフィ
ルタを用いることができる６ 観測データは、上記実施例の場合、励起波長。

発光波長、空間座標の３次元データである（空間座標は
２次元であるが、数学的表現上ユニでは１次元と考える
）、励起波長の座標は２．αだけでよく、残りの２次元
座標は、それぞれ成分数よりも多ければよい、成分数が
未知のときには予想より少し多口にとればよい。なお、
本発明に係る手法は、上記の座ｒｆＪ、次元に限られず
、基本的に、３つの独立なパラメータをもつデータであ
れば座標１次元、軸に何を適用してもより１゜例えば、
ｘｙ座標の代わりに反応時間軸をとり、反応時間ととも
に成分量が変化する物質のスペクトルを観測するとか、
スペクトル（波長軸）の代わりに蛍光滅貸渡形等も用い
ることが可能である。これらのことは、本発明の応用・
発展に属する。

以下には、本発明に係る一実施例を示し、上記手法をよ
り具体的に説明する。

試料として、アクリノンオレンノ（ａｃｒｉｄｉｎｅ　
ｏｒ−ａｎｇｅ）で染色したう７ト肝細胞標本を用いた
。アクリノンオレンノは染色に伴ない単量体と二量体を
形成し、単量体は細胞内の二重鎖ＤＮＡに、又、二量体
は単ｆＡＲＮＡに特異的に結合する。本具体例では、ア
クリノンオレンノの単量体と二量体の空間分布パターン
を分離検出することにより、細胞内におけるＤＮＡとＲ
ＮＡの定量的空間分布解析を行う。

第４図は、本具体例を実施するための測定システムのブ
ロック構成を示している。光源（４１）から出た光は、
励起側分光装置（４２）を通った後、蛍光顕微鏡（４３
）の光学系により試料（４４）上に照射される。試料（
４４）からの蛍光は、顕微鏡（４３）の結像系、及び、
観測側分光装置（４５）を通り、ＴＶ左カメラ４６）上
に結像される。ＴＶ左カメラ４６）で計測された画像は
、画像入出力装置（４７）によりディジタル化されコン
ビエータ（４８）に取り込まれる。演算はこのコンピュ
ータ（４８）で実行され、その結果は、画像入出力装置
（４７）を介して例えばモニタ（４９）上に映出される
。

具体的には、蛍光類１１１（４３）として（株）オリン
パス製・落射蛍光顕微鏡ＢＨ３−ＲＦＫを、光源（４１
）には１００Ｗｆｆｉ高圧水銀灯を用いた。励起側分光
装置（４２）としては、グイクロイックミラーと励起フ
ィルタの組合わせにより、２種類のバンドパスフィルタ
（Ｅｘ７４ルタ１　：４５５−４９Ｏｎ＋ａ、ＥＸ７（
ルタ２　：４７５−４９０ｎｍ）を用い、観測側分光装
置（４５）＋１４種ｆｆのバイパスフィルタ（ＥＩ１１
フィルタ１：＞５１５ｎＩＩＩ、ＥＩ１１７　（ルタ２
　：　＞　５３Ｏｎ＋６＋　Ｅ　ｍ　７　イルタ３：〉
５〕Ｏｎｍ＋　Ｅｖ７　イルタ４　：　＞　５９Ｏｒ＋
ｍ）で構成した。ＴＶ左カメラ４６）は、日本電気（株
）！＋！・ＣＣＤカメラＴｌ−２２Ａを、画像入出力装
置（４７）には、（株）シバツク製・画像メモリＶＭ２
１ｂ１（１画像＝２５６　ｘ　２５６画素、１画素＝８
ビット）を、コンピュータ（４８）は（株）ＤＥＣ！１
！・スーパーマイクロフンピユータＭｉｃｒｏ　Ｖ　Ａ
　Ｘ　Ｕを用いた。

第５図は、励起側フィルタと観測側フィルタの組合わせ
を変えて観測した８枚（＝［励起側２種Ｕ］×［観測側
４種類１）の画像写真を示している。これら８枚の画像
に対し、前述の手段に従い、物質パターンの分離検出を
行った。

第６図は、固有値をプロントしたグラフであり、量子化
による誤差の分散値を雑音のパワーとして図中に破線で
示した。これを超える固有値の数は２であることにより
、成分数は２であることが分かった。

第７図は、最終的に検出された２成分Ａ、Ｂの空間分布
パターンをそれぞれ写真により示している。第８図は、
対応する各成分Ａ、Ｂのスペクトル（この場合は、各フ
ィルタで観測したときの蛍光強度）の検出結果を示して
いる。ただし、スペクトルは、Ｅｍフィルタ１の蛍光強
度で規格化して示しである。

第８図に示した結果から、成分ＡはＤＮＡに結合したア
クリジンオレンジの単量体で、成分ＢはＲＮＡに結合し
た二量体と考えられ、成分Ａに対応する第７図（Ａ）で
は、核に分布したＤＮＡの定量的な空間分布が、成分Ｂ
に対応する第７図（Ｂ）では細胞質と核の両方に存在す
るＲＮＡの定量的な空間分布がそれぞれ明確に検出され
ていることが分かる。

［発明の効果１ 以上から明らかなように、本発明によれば、複数の物質
が混在し重なりあっている画像内の当該物質に関する先
験情報を全く必要とせずに、画像内に含まれる成分物質
の個数を検出できるとともに、各成分物質の空間分布及
び／又は各成分物質のスペクトル分布を検出することが
できる。従って、スペクトル分布を検出したときはこれ
から物質の同定が可能となり、またその同定された物質
の分布パターンも明確に把握可能となる。

本発明によれば、各成分物質の空間分布及び各成分物質
のスペクトル分布が解析的に求まるので、これによる検
出精度は非常に高く、得られる画像も高品質であるので
、その認識・分析をきわめて精度よく正確に行うことが
できる。

本発明に係る手法は、計ｎ　量としては、上述のＬｅｈ
ｍａｎｎらの画像構成法と同程度のオーグーで少なく、
従ってミニコン等を用いても数秒程度しかかからないの
で、単に静的な試料に限らず動的な試料（例えばパター
ンが時間と共に変化する等）にも適用でき、例えばこれ
をモニタにリアルタイムで映出できるなどの優れた効果
も期待できる。

また、本発明は、例えば、化学反応過程に於ける中間生
成物の発見や、未知混合物試料における予期できない物
質や新物質の発見など、さらには混合状態でしか存在し
ない物質を分析する手法としても極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は多重分光画像の数学的モデルの説明図、第２図
は（２）式を図解した説明図、第３図は多点スペクトル
データを図解して示した説明図、＠４図は本発明の一実
施例を実施するためのシステム構成の概略ブロック図、
ｆｐＪ５図（ａｌ）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）、
（ｂｌ）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ４）のそれぞれは
アクリジンオレンジで染色したラット肝細胞の蛍光原＠
鏡による画像を示す写真、第６図は多重分光画像データ
の固有値をプロットしたグラフ、第７図（Ａ）、（Ｂ）
はそれぞれ演算処理の結果得られた異なる成分物質Ａ、
Ｂの空間分布を示す写真、第８図はその対応する物質の
スペクトル分布を示すグラフである。 ４１・・・光源、４２・・・励起側分光装置、４３・・
・蛍光顕微鏡、４４・・・試料、４５・・・観測側分光
装置、４６・・・ＴＶカメラ、４７・・・画像入出力装
置、４８・・・フンピユータ、４９・・・モニタ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１つの未知物質を含みこれらの物質が
   ２次元に分布した試料に、第１の電磁波エネルギを与え
   、放出される電磁波を分光計測して第１の分光画像セッ
   トＩ＿１を得、 前記試料に、前記第１の電磁波エネルギを与えたときと
   は異なる第２の電磁波エネルギを与え、放出される電磁
   波を分光計測して第２の分光画像セットＩ＿２を得、 得られた第１の分光画像セットＩ＿１に対し、下記第（
   I ）式の特異値分解の演算操作により前記試料の成分
   物質の個数を求め、 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・（ I ） 次に、前記第（ I ）式で求められた行列Ｕ、Σ、Ｖと
   前記第２の分光画像セットＩ＿２とに基づいて下記第（
   II）式の演算操作により行列Ｂを求め、▲数式、化学式
   、表等があります▼・・・（II） 求められた前記行列Ｂの転置行列Ｂ＾ｔの固有値と固有
   ベクトルを演算し、下記第（III）式で与えられる行列
   Ｔと対角行列Ａを求め、そして、 ＴＢＴ＾−＾１＝Ａ・・・（III） 下記第（IV）式により前記行列Ｔに前記行列Ｖを乗算し
   て、 Ｐ＝ＴＶ・・・（IV） 少なくとも前記試料に２次元に分布する物質のそれぞれ
   の分布パターンＰを求め、人間可読型データ形式として
   これを出力装置に出力する、物質パターンの分離検出方
   法。