JPH01233362A - マルトオリゴ糖計測用酵素電極 - Google Patents
マルトオリゴ糖計測用酵素電極Info
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- JPH01233362A JPH01233362A JP63061322A JP6132288A JPH01233362A JP H01233362 A JPH01233362 A JP H01233362A JP 63061322 A JP63061322 A JP 63061322A JP 6132288 A JP6132288 A JP 6132288A JP H01233362 A JPH01233362 A JP H01233362A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は固定化酵素電極（以下酵素電極と略す）に関し
、特に重合度の異るマルトオリゴ糖について、各重合度
のマルトオリゴ糖の重量％濃度当たりの応答が等しいマ
ルトオリゴ糖計測用酵素電極に関するものである。
、特に重合度の異るマルトオリゴ糖について、各重合度
のマルトオリゴ糖の重量％濃度当たりの応答が等しいマ
ルトオリゴ糖計測用酵素電極に関するものである。
（従来の技術）
マルトオリゴ糖はデンプンの酸加水分解、酵素分解等に
より製造され、その用途も甘味料、増粘剤といった食品
分野や、医薬品原料、臨床検査におけるα−アミラーゼ
活性測定用基質等として広（利用されている。このため
、その濃度計測法の開発は重要な課題であると言える。
より製造され、その用途も甘味料、増粘剤といった食品
分野や、医薬品原料、臨床検査におけるα−アミラーゼ
活性測定用基質等として広（利用されている。このため
、その濃度計測法の開発は重要な課題であると言える。
この分析法はマルトオリゴ糖が水溶性、難揮発性化合物
であるということから、従来高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）による定量法が有力なものとされてきた
。しかし、ＨＰＬＣにおいては試料の前処理が繁雑で、
かつ分析に要する時間が長いという問題点があった。そ
こで酵素を利用した分析法、中でも分光光度計等の機器
を必要とせず、前処理が殆んど不要で迅速なバイオセン
サーによる分析方法が注目されている。 バイオセンサ
ーを用いる分析方法において現在最も良（利用されてお
り、信頼性が高い方法は、基質を酵素的に酸化還元し、
その時の酸素、過酸化水素等の減少もしくは生成を電流
値としてとらえる酵素電極法である。
であるということから、従来高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）による定量法が有力なものとされてきた
。しかし、ＨＰＬＣにおいては試料の前処理が繁雑で、
かつ分析に要する時間が長いという問題点があった。そ
こで酵素を利用した分析法、中でも分光光度計等の機器
を必要とせず、前処理が殆んど不要で迅速なバイオセン
サーによる分析方法が注目されている。 バイオセンサ
ーを用いる分析方法において現在最も良（利用されてお
り、信頼性が高い方法は、基質を酵素的に酸化還元し、
その時の酸素、過酸化水素等の減少もしくは生成を電流
値としてとらえる酵素電極法である。
ただし現状ではマルトオリゴ糖を一段階で酸化還元でき
る酵素は実用的には利用できず、主にマルトオリゴ糖を
加水分解しグルコースに導いて、生成するグルコースを
グルコースオキシダーゼにより酸化し、その反応による
酸素の減少、または過酸化水素の生成を電気化学的に検
知する方法がとられている。
る酵素は実用的には利用できず、主にマルトオリゴ糖を
加水分解しグルコースに導いて、生成するグルコースを
グルコースオキシダーゼにより酸化し、その反応による
酸素の減少、または過酸化水素の生成を電気化学的に検
知する方法がとられている。
グルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼを用いてマ
ルトースを計測する試みは比較的古（からあり、例えば
Ｉ ｎｍａｎら（Ｄ、Ｊ、Ｉｎｍａｎ、Ｗ、Ｅ、Ｈｏｒ
ｎｂｙ：Ｂｉｏｃｈｅｍ。
ルトースを計測する試みは比較的古（からあり、例えば
Ｉ ｎｍａｎら（Ｄ、Ｊ、Ｉｎｍａｎ、Ｗ、Ｅ、Ｈｏｒ
ｎｂｙ：Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｊ、、１３７．２５−３２ （１９７４））はナイロン
チューブ中にグルコアミラーゼとグルコースオキシダー
ゼを固定化し、連続したチューブ中にマルトースを含む
試料を流し定量を行っている。
チューブ中にグルコアミラーゼとグルコースオキシダー
ゼを固定化し、連続したチューブ中にマルトースを含む
試料を流し定量を行っている。
この酵素電極法の原理は次のようなものである。酵素電
極の酵素固定層内に試料溶液からマルトオリゴ糖の分子
が拡散して来てグルコアミラーゼにより分解されてグル
コースが生成され、生成されたグルコースがグルコース
オキシダーゼにより酸化され、過酸化水素が生成せられ
る。
極の酵素固定層内に試料溶液からマルトオリゴ糖の分子
が拡散して来てグルコアミラーゼにより分解されてグル
コースが生成され、生成されたグルコースがグルコース
オキシダーゼにより酸化され、過酸化水素が生成せられ
る。
発生した過酸化水素が白金電極で電気分解され、そのと
きの電気分解電流が検出信号となるのであるが、酵素固
定層内では基気質濃度に比し、酵素濃度が充分高いので
過酸化水素の発生速度は基質であるグルコースの生成速
度によって決定されており、グルコースの生成速度は酵
素固定層におけるマルトオリゴ糖の拡散速度によって規
制され、拡散速度は試料中のマルトオリゴ糖の濃度によ
り規制されているので、結局もとのマルトオリゴ糖の濃
度が電流信号に変換されて検出されることになる。
きの電気分解電流が検出信号となるのであるが、酵素固
定層内では基気質濃度に比し、酵素濃度が充分高いので
過酸化水素の発生速度は基質であるグルコースの生成速
度によって決定されており、グルコースの生成速度は酵
素固定層におけるマルトオリゴ糖の拡散速度によって規
制され、拡散速度は試料中のマルトオリゴ糖の濃度によ
り規制されているので、結局もとのマルトオリゴ糖の濃
度が電流信号に変換されて検出されることになる。
もう少し詳細に云うと酵素電極における酵素固定層への
基質の拡散速度は試料溶液中の基質濃度と共に酵素固定
層内における酵素反応による基質消費速度によって左右
され、拡散速度と基質消費速度とがバランスするように
拡散速度が決まる。
基質の拡散速度は試料溶液中の基質濃度と共に酵素固定
層内における酵素反応による基質消費速度によって左右
され、拡散速度と基質消費速度とがバランスするように
拡散速度が決まる。
従って酵素固定層内において基質の単位濃度に対する酵
素反応速度が一定である場合には酵素固定層内で生成さ
れる酵素反応生成物の生成速度が試料溶液中の基質濃度
に比例するのである。臨床分野において、α−アミラー
ゼ活性を計測する上でマルトースセンサーは種々検討を
加えられている。従来、膵炎、肝炎等の検査において、
血中α−アミラーゼ活性の増大が調べられているが、こ
のような検査では、でんぷんをα−アミラーゼが分解し
て生成するマルトオリゴ糖のおおよその値が分れば良い
のであって、重合度の興なるマルトオリゴ糖を正確に計
測する試みはなされていなかった。所が実際の使用面に
おいてはマルトオリゴ糖と呼ばれる物質はグルコースの
単一重合度の物質ではなく、マルトース、マルトトリオ
ース。
素反応速度が一定である場合には酵素固定層内で生成さ
れる酵素反応生成物の生成速度が試料溶液中の基質濃度
に比例するのである。臨床分野において、α−アミラー
ゼ活性を計測する上でマルトースセンサーは種々検討を
加えられている。従来、膵炎、肝炎等の検査において、
血中α−アミラーゼ活性の増大が調べられているが、こ
のような検査では、でんぷんをα−アミラーゼが分解し
て生成するマルトオリゴ糖のおおよその値が分れば良い
のであって、重合度の興なるマルトオリゴ糖を正確に計
測する試みはなされていなかった。所が実際の使用面に
おいてはマルトオリゴ糖と呼ばれる物質はグルコースの
単一重合度の物質ではなく、マルトース、マルトトリオ
ース。
マルトテトラオース等の種々の重合度のものの混合物で
あり、定量ではそれらの物質のグルコース換’ｓａ度或
は重量％濃度が知りたいのである。所がこれら各種重合
度のマルトオリゴ糖は重合度によってグルコアミラーゼ
による酵素反応速度が異っており、このためマルトオリ
ゴ糖の見かけ上のグルコース換算濃度は試料における各
種重合度のマルトオリゴ糖の組成によって異ったものと
なる。即ちグルコアミラーゼの速度論は各種アミラーゼ
の中でも良（研究されている（中村道徳監修：アミラー
ゼ、学会出版センター（１９８６））が、マルトオリゴ
糖の鎖長が変化すると、ミノ＼エリス定数９分子活性共
に変化する。この理由は酵素活性中心と基質の相互作用
の観点からサブサイト理論により説明されている。実際
にグルコアミラーゼにより各鎖長を有するマルトオリゴ
ｗ（例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテト
ラオース）を加水分解すると各マルトオリゴ糖に対する
加水分解速度は各々異なる。このような酵素とグルコー
スオキシダーゼを同一固定層内に共存せしめ、計測を行
う場合、一種類の鎖長しか有さない単分散オリゴ糖を定
量することは可能であるが、混合物においては検量線を
作成することが困難であり、従来有効な対策は提示され
ていなかった。
あり、定量ではそれらの物質のグルコース換’ｓａ度或
は重量％濃度が知りたいのである。所がこれら各種重合
度のマルトオリゴ糖は重合度によってグルコアミラーゼ
による酵素反応速度が異っており、このためマルトオリ
ゴ糖の見かけ上のグルコース換算濃度は試料における各
種重合度のマルトオリゴ糖の組成によって異ったものと
なる。即ちグルコアミラーゼの速度論は各種アミラーゼ
の中でも良（研究されている（中村道徳監修：アミラー
ゼ、学会出版センター（１９８６））が、マルトオリゴ
糖の鎖長が変化すると、ミノ＼エリス定数９分子活性共
に変化する。この理由は酵素活性中心と基質の相互作用
の観点からサブサイト理論により説明されている。実際
にグルコアミラーゼにより各鎖長を有するマルトオリゴ
ｗ（例えばマルトース、マルトトリオース、マルトテト
ラオース）を加水分解すると各マルトオリゴ糖に対する
加水分解速度は各々異なる。このような酵素とグルコー
スオキシダーゼを同一固定層内に共存せしめ、計測を行
う場合、一種類の鎖長しか有さない単分散オリゴ糖を定
量することは可能であるが、混合物においては検量線を
作成することが困難であり、従来有効な対策は提示され
ていなかった。
（発明が解決しようとする課題）
本発明はグルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼを
固定化した酵素電極を用いるマルトオリゴ糖定量法に関
し、重合度の異なるマルトオリゴ糖に対して、単位モル
数に対する応答値を重合度に比例して増大させるか、も
しくは単位重量パーセントに対する応答値を各重合度の
マルトオリゴ糖に関して等しくなるようにしようとする
ものである。即ちマルトオリゴ糖はグルコースの重合体
であるから、重量％が同じであれば重合度の異なるマル
トオリゴ糖の混合物であっても、重合度の異なる分子の
組成比の如何にか＼わらず、グルコース換算濃度は同じ
になる。
固定化した酵素電極を用いるマルトオリゴ糖定量法に関
し、重合度の異なるマルトオリゴ糖に対して、単位モル
数に対する応答値を重合度に比例して増大させるか、も
しくは単位重量パーセントに対する応答値を各重合度の
マルトオリゴ糖に関して等しくなるようにしようとする
ものである。即ちマルトオリゴ糖はグルコースの重合体
であるから、重量％が同じであれば重合度の異なるマル
トオリゴ糖の混合物であっても、重合度の異なる分子の
組成比の如何にか＼わらず、グルコース換算濃度は同じ
になる。
（課題を解決するための手段）
少なくともグルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼ
を含有する酵素電極において、グルコアミラーゼのマル
トースに対するグルコース生成速度で表わした最大反応
速度が、グルコースオキシダーゼのグルコースに対する
過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度の０．４倍
以上になる酵素量比で両酵素を混合し、固定化すること
により問題を解決できる。
を含有する酵素電極において、グルコアミラーゼのマル
トースに対するグルコース生成速度で表わした最大反応
速度が、グルコースオキシダーゼのグルコースに対する
過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度の０．４倍
以上になる酵素量比で両酵素を混合し、固定化すること
により問題を解決できる。
（作 用）
酵素電極におけるグルコアミラーゼとグルコースオキシ
ダーゼの濃度比を変えてマルトースからマルトヘプタオ
ースまでの各種マルトオリゴ糖水溶液を接触させ、各マ
ルトオリゴ糖の濃度に対する電流値のグラフから、単位
濃度あたり＜’ｒｘｍパーセントあたり）の電流値を求
めると第１表のようになる。なお出力値を規格化するた
め各電極のマルトースに関する値を１００としである。
ダーゼの濃度比を変えてマルトースからマルトヘプタオ
ースまでの各種マルトオリゴ糖水溶液を接触させ、各マ
ルトオリゴ糖の濃度に対する電流値のグラフから、単位
濃度あたり＜’ｒｘｍパーセントあたり）の電流値を求
めると第１表のようになる。なお出力値を規格化するた
め各電極のマルトースに関する値を１００としである。
第１表
グルコアミラーゼ／グルコースオキシダーゼ比８．１５
０，３００．４００．８０ ＬＯＯ２Ｄ０４，００６β
０１０，００マルトース １００１００１００１
００１００１００１００１００１００マルトトリオース
１６０１５０１１０１０６１０３１０３１０２１０１
１０２マルトテトラオース２００１７０１１５１１２１
０４１０２１０３１０１ ９８マルトペンタオース２０
０１８０１２０１１２ ９９１００１００ ９９ ９８
マルトヘキサオース１９０１８５１１７１０６１０３１
０１１００１００ ９９マルトヘプタオース１７０１８
０１１５１００ ９９ ９９１００１００ ９９第１表
に示すようにグルコアミラーゼのマルトースに対するグ
ルコース生成の最大反応速度がグルコースオキシダーゼ
のグルコースに対する過酸化水素生成の最大反応速度の
０．４倍未満では、単位重量パーセント当たりの出力値
が各マルトオリゴ糖について最大２倍程度異なり、単独
のマルトオリゴ糖を計測する場合でも各々検量線を作成
しなければいけない。ところが０．４倍以上になるとマ
ルトースを基準にして、各マルトオリゴ糖に対する応答
が非常に近くなる。特に１．０倍以上の比率では応答は
ほぼ完全に等しくなり、マルトースで電極を較正すれば
、他のマルトオリゴ糖も重量パーセント濃度を容易に算
出することができる。また混合物であってもその重量パ
ーセントを算出できる。なお１２倍を越える比率とした
場合、グルコースオキシダーゼの絶対量が減少しすぎて
、著しく感度が低下するため実際上用いられる２種の酵
素の最大反応速度比は０．４倍から１２倍の範囲、より
好ましくは１倍から１０倍の範囲である。
０，３００．４００．８０ ＬＯＯ２Ｄ０４，００６β
０１０，００マルトース １００１００１００１
００１００１００１００１００１００マルトトリオース
１６０１５０１１０１０６１０３１０３１０２１０１
１０２マルトテトラオース２００１７０１１５１１２１
０４１０２１０３１０１ ９８マルトペンタオース２０
０１８０１２０１１２ ９９１００１００ ９９ ９８
マルトヘキサオース１９０１８５１１７１０６１０３１
０１１００１００ ９９マルトヘプタオース１７０１８
０１１５１００ ９９ ９９１００１００ ９９第１表
に示すようにグルコアミラーゼのマルトースに対するグ
ルコース生成の最大反応速度がグルコースオキシダーゼ
のグルコースに対する過酸化水素生成の最大反応速度の
０．４倍未満では、単位重量パーセント当たりの出力値
が各マルトオリゴ糖について最大２倍程度異なり、単独
のマルトオリゴ糖を計測する場合でも各々検量線を作成
しなければいけない。ところが０．４倍以上になるとマ
ルトースを基準にして、各マルトオリゴ糖に対する応答
が非常に近くなる。特に１．０倍以上の比率では応答は
ほぼ完全に等しくなり、マルトースで電極を較正すれば
、他のマルトオリゴ糖も重量パーセント濃度を容易に算
出することができる。また混合物であってもその重量パ
ーセントを算出できる。なお１２倍を越える比率とした
場合、グルコースオキシダーゼの絶対量が減少しすぎて
、著しく感度が低下するため実際上用いられる２種の酵
素の最大反応速度比は０．４倍から１２倍の範囲、より
好ましくは１倍から１０倍の範囲である。
このような特性が得られる理由は明瞭ではないが、次の
ように推定できる。一般にミバエリス−メンテン型の反
応速度曲線に従う酵素を固定した酵素電極では、ミバエ
リス定数（Ｋｍ）に比べて膜内基質濃度が充分に低い場
合に基質濃度と速度が直線関係を示す。つまり基質濃度
と出力値が正確に比例する。同じくマルトオリゴ糖を固
定化されたグルコアミラーゼで加水分解する場合にも基
質濃度が充分Ｋｍより低い場合にグルコースの生成速度
は膜内マルトオリゴ糖濃度に比例する。ただしグルコア
ミラーゼは、マルトオリゴ糖の重合度に応じてＫｍと分
子活性（ｋｃ）が変化する（中村道徳監修：アミラーゼ
、学会出版センター（１９８６））。この値を用いて溶
液中において酵素濃度が低い場合の各マルトオリゴ糖の
モル濃度に対する加水分解速度（グルコースの生成速度
）を計算すると基質濃度が比較的高い場合にはマルトー
スからマルトペンタオースまで速度が７倍程度上昇し、
マルトヘキサオースで一度減少し、マルトヘプタオース
で再度上昇するという不規則な変化を示す。ところが固
定化酵素膜内においては相対的な酵素量はきわめて高く
、一方基質は拡散がおさえられているために相対的に基
質量は低くなるので、基質はきわめて高速で最初の分解
を受け、グルコースと鎖長が一つ短いマルトオリゴ糖に
なる。この条件下で前記と同様な計算を行うとマルトー
スからマルトヘプタオースまでやや湾曲傾向はあっても
グルコース生成の速度は鎖長にほぼ比例して上昇する。
ように推定できる。一般にミバエリス−メンテン型の反
応速度曲線に従う酵素を固定した酵素電極では、ミバエ
リス定数（Ｋｍ）に比べて膜内基質濃度が充分に低い場
合に基質濃度と速度が直線関係を示す。つまり基質濃度
と出力値が正確に比例する。同じくマルトオリゴ糖を固
定化されたグルコアミラーゼで加水分解する場合にも基
質濃度が充分Ｋｍより低い場合にグルコースの生成速度
は膜内マルトオリゴ糖濃度に比例する。ただしグルコア
ミラーゼは、マルトオリゴ糖の重合度に応じてＫｍと分
子活性（ｋｃ）が変化する（中村道徳監修：アミラーゼ
、学会出版センター（１９８６））。この値を用いて溶
液中において酵素濃度が低い場合の各マルトオリゴ糖の
モル濃度に対する加水分解速度（グルコースの生成速度
）を計算すると基質濃度が比較的高い場合にはマルトー
スからマルトペンタオースまで速度が７倍程度上昇し、
マルトヘキサオースで一度減少し、マルトヘプタオース
で再度上昇するという不規則な変化を示す。ところが固
定化酵素膜内においては相対的な酵素量はきわめて高く
、一方基質は拡散がおさえられているために相対的に基
質量は低くなるので、基質はきわめて高速で最初の分解
を受け、グルコースと鎖長が一つ短いマルトオリゴ糖に
なる。この条件下で前記と同様な計算を行うとマルトー
スからマルトヘプタオースまでやや湾曲傾向はあっても
グルコース生成の速度は鎖長にほぼ比例して上昇する。
固定化酵素膜内では生成したグルコ−又は速やかにグル
コースオキシダーゼにより酸化を受は過酸化水素となっ
て検知される。もしグルコアミラーゼの反応速度がグル
コースオキシダーゼに比べて充分速ければ全体の系の律
速段階はグルコースオキシダーゼによる反応段階となり
さらにグルコースオキシダーゼのＫ ｍはグルコアミラ
ーゼのＫｍに対して一般に１０倍程度となるため、マル
トオリゴ糖の鎖長に比例してグルコースが生成されれば
、グルコースオキシダーゼにより、グルコース量に比例
した過酸化水素が生成される。逆にグルコースオキシダ
ーゼの活性が非常に高い場合、律速段階はグルコアミラ
ーゼ反応となり、全体の電極出力値はグルコアミラーゼ
固有の鎖長に対して複雑な挙動を示すと考えられる。
コースオキシダーゼにより酸化を受は過酸化水素となっ
て検知される。もしグルコアミラーゼの反応速度がグル
コースオキシダーゼに比べて充分速ければ全体の系の律
速段階はグルコースオキシダーゼによる反応段階となり
さらにグルコースオキシダーゼのＫ ｍはグルコアミラ
ーゼのＫｍに対して一般に１０倍程度となるため、マル
トオリゴ糖の鎖長に比例してグルコースが生成されれば
、グルコースオキシダーゼにより、グルコース量に比例
した過酸化水素が生成される。逆にグルコースオキシダ
ーゼの活性が非常に高い場合、律速段階はグルコアミラ
ーゼ反応となり、全体の電極出力値はグルコアミラーゼ
固有の鎖長に対して複雑な挙動を示すと考えられる。
ところでグルコースは溶液中では約６０％のβアノマー
と約４０％のαアノマーの混合物として存在している。
と約４０％のαアノマーの混合物として存在している。
グルコースオキシダーゼはこの中でβアノマーのみを酸
化する。一方グルコアミラーゼはマルトオリゴ糖からβ
アノマーの形でグルコースを遊離する。固定化酵素膜内
では遊離されたβアノマーは変旋光現象によってα、β
混合物になるよりも早く酸化されてしまう。グルコアミ
ラーゼの活性をマルトースを基準にして溶液系で測定す
ると、充分変旋光が進行しているためα。
化する。一方グルコアミラーゼはマルトオリゴ糖からβ
アノマーの形でグルコースを遊離する。固定化酵素膜内
では遊離されたβアノマーは変旋光現象によってα、β
混合物になるよりも早く酸化されてしまう。グルコアミ
ラーゼの活性をマルトースを基準にして溶液系で測定す
ると、充分変旋光が進行しているためα。
βアノマーの混合したグルコースの生成速度が得られる
。従ってグルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼの
溶液中における最大反応速度の比を０．４として固定化
すると固定化酵素電極においてマルトースが加水分解さ
れた場合、グルコースオキシダーゼの基質は０．４Ｘ２
の速度で生成されるのでではなく、マルトースの還元末
端の６０％がβアノマーであるため、０．４＋（０，４
１０，６）の速度、つまりグルコースオキシダーゼノク
ルコース消費速度の約１．１倍のβ−グルコース生成速
度が得られグルコースオキシダーゼによる反応が全体の
律速段階になると考えられる。
。従ってグルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼの
溶液中における最大反応速度の比を０．４として固定化
すると固定化酵素電極においてマルトースが加水分解さ
れた場合、グルコースオキシダーゼの基質は０．４Ｘ２
の速度で生成されるのでではなく、マルトースの還元末
端の６０％がβアノマーであるため、０．４＋（０，４
１０，６）の速度、つまりグルコースオキシダーゼノク
ルコース消費速度の約１．１倍のβ−グルコース生成速
度が得られグルコースオキシダーゼによる反応が全体の
律速段階になると考えられる。
より鎖長の長いマルトオリゴ糖でもグルコースオキシダ
ーゼによる反応が律速段階となり見がけ上マルトオリゴ
糖に対する単位モル数当たりの出力値は鎖長に比例し、
換算すると単位重量％濃度あたりの出力値が等しくなる
ものと考えられる。
ーゼによる反応が律速段階となり見がけ上マルトオリゴ
糖に対する単位モル数当たりの出力値は鎖長に比例し、
換算すると単位重量％濃度あたりの出力値が等しくなる
ものと考えられる。
そしてグルコースオキシダーゼによる反応を律速段階反
応とするためには上述したように、グルコアミラーゼに
よる反応速度をグルコースオキシダーゼによる反応速度
の０．４倍以上とすればよいのである。
応とするためには上述したように、グルコアミラーゼに
よる反応速度をグルコースオキシダーゼによる反応速度
の０．４倍以上とすればよいのである。
尚グルコアミラーゼの活性がグルコースオキシダーゼの
活性に比べて極端に大きい場合は、グルコアミラーゼ蛋
白量が一定のときはグルコースオキシダーゼ量が減るこ
とによって出力値が減少すること、またグルコースオキ
シダーゼ量を一定にするとグルコアミラーゼの蛋白量が
ふえて膜が厚（なり応答速度が遅くなるという欠点が生
じる。
活性に比べて極端に大きい場合は、グルコアミラーゼ蛋
白量が一定のときはグルコースオキシダーゼ量が減るこ
とによって出力値が減少すること、またグルコースオキ
シダーゼ量を一定にするとグルコアミラーゼの蛋白量が
ふえて膜が厚（なり応答速度が遅くなるという欠点が生
じる。
よって、最大反応速度比が極端に大きくなるのも好まし
くない。
くない。
実施例
（実施例１）
グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、Ｔｙｐｅｌ
ｌＬｏｔ、７５７５−９５９５）１．グルコアミラーゼ
（Ｓｉｇｍａ社製、Ｌｏｔ、４６Ｆ−０５５７２）を１
６．７ｔ、ｔｅ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製
、Ｆｒａｃ ｔ １−ｏｎＶ、Ｌｏｔ、４５Ｆ−００６
４）５ｍｇを０．２重量％グルタルアルデヒドを含むｐ
Ｈ６，０の１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ全量を１
０００μｅとした。この混合酵素溶液は、グルコースオ
キシダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速
度で、１６μｍｏｌ／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素
量を含んでいる。またグルコアミラーゼをマルトースに
対するグルコース生成速度で表わした最大反応速度で、
１０μｍｏｌ／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素量を含
んでいるので、グルコアミラーゼのグルコースオキシダ
ーゼに対する最大反応速度比は０．６２となる。
ｌＬｏｔ、７５７５−９５９５）１．グルコアミラーゼ
（Ｓｉｇｍａ社製、Ｌｏｔ、４６Ｆ−０５５７２）を１
６．７ｔ、ｔｅ、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製
、Ｆｒａｃ ｔ １−ｏｎＶ、Ｌｏｔ、４５Ｆ−００６
４）５ｍｇを０．２重量％グルタルアルデヒドを含むｐ
Ｈ６，０の１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ全量を１
０００μｅとした。この混合酵素溶液は、グルコースオ
キシダーゼを過酸化水素生成速度で表わした最大反応速
度で、１６μｍｏｌ／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素
量を含んでいる。またグルコアミラーゼをマルトースに
対するグルコース生成速度で表わした最大反応速度で、
１０μｍｏｌ／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素量を含
んでいるので、グルコアミラーゼのグルコースオキシダ
ーゼに対する最大反応速度比は０．６２となる。
この混合酵素溶液を、直径２ｍｍの白金電極表面に５μ
ｅ滴下展開させ４０″Ｃで３０分間処理して固定化を行
い酵素電極とした。測定装置（第１図）はμｅオーダー
の試料注入が可能な高速液クロ用インジェクター１と、
酵素電極を取り付けた測定セル２を内径０．５ｍｍのテ
フロン管で結合した装置を用いた。
ｅ滴下展開させ４０″Ｃで３０分間処理して固定化を行
い酵素電極とした。測定装置（第１図）はμｅオーダー
の試料注入が可能な高速液クロ用インジェクター１と、
酵素電極を取り付けた測定セル２を内径０．５ｍｍのテ
フロン管で結合した装置を用いた。
測定セル２の内容積は４０μｅで酵素電極に対向してＡ
ｇ／ＡｇＣ１参照電極を配置し、対Ａｇ／ＡｇＣｌ参照
電極＋〇、４５Ｖの電圧を酵素電極に印加し、その電流
値を測定した。送液は高速液クロ用ポンプ３を用い、ｐ
Ｈ６，０の１００ｍＭリン酸緩衝液を１．０ｍｅ／ｍｉ
ｎの流速で送液した。
ｇ／ＡｇＣ１参照電極を配置し、対Ａｇ／ＡｇＣｌ参照
電極＋〇、４５Ｖの電圧を酵素電極に印加し、その電流
値を測定した。送液は高速液クロ用ポンプ３を用い、ｐ
Ｈ６，０の１００ｍＭリン酸緩衝液を１．０ｍｅ／ｍｉ
ｎの流速で送液した。
マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオースの各水溶液で濃度系列を作り各物質についての
検量線を作成した。その検量線の傾きすなわち各物質に
ついての単位モル濃度あたりの出力値とマルトオリゴ糖
の糖鎖の鎖長数（重合度）との関係を図示すると第２図
の様に糖鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物質に
ついての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオリゴ
糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第３図のように
マルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず一定であった。
マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプ
タオースの各水溶液で濃度系列を作り各物質についての
検量線を作成した。その検量線の傾きすなわち各物質に
ついての単位モル濃度あたりの出力値とマルトオリゴ糖
の糖鎖の鎖長数（重合度）との関係を図示すると第２図
の様に糖鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物質に
ついての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオリゴ
糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第３図のように
マルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず一定であった。
（実施例２）
グルコースオキシダーゼｌ ｍ ｇ 、グルコアミラー
ゼ８３．４μｅ、ウシ血清アルブミン５ｍｇを０．２ｆ
ｆｉ量％グルタルアルデヒドを含むｐＨ６゜０の１００
ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ全量を１０００μｅとした
。この混合酵素溶液は、グルコースオキシダーゼを過酸
化水素生成速度で表わした最大反応速度で、１６μｍｏ
１７ｍ ｉ ｎの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で５ｏμｍｏｌ
／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので
、グルコアミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する
最大反応速度比は３．１となる。この混合酵素溶液を用
い、実施例１と同様の方法で酵素電極とした。実施例１
と同様の装置を用いてマルトース、マルトトリオース、
マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキ
サオース。
ゼ８３．４μｅ、ウシ血清アルブミン５ｍｇを０．２ｆ
ｆｉ量％グルタルアルデヒドを含むｐＨ６゜０の１００
ｍＭリン酸緩衝液に溶解させ全量を１０００μｅとした
。この混合酵素溶液は、グルコースオキシダーゼを過酸
化水素生成速度で表わした最大反応速度で、１６μｍｏ
１７ｍ ｉ ｎの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で５ｏμｍｏｌ
／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素量を含んでいるので
、グルコアミラーゼのグルコースオキシダーゼに対する
最大反応速度比は３．１となる。この混合酵素溶液を用
い、実施例１と同様の方法で酵素電極とした。実施例１
と同様の装置を用いてマルトース、マルトトリオース、
マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキ
サオース。
マルトヘプタオースの各水溶液で濃度系列を作り各物質
についての検量線を作成した。その検量線の傾きすなわ
ち各物質についての単位モル濃度あたりの出力値とマル
トオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第４図
の様にＷ鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物質に
ついての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオリゴ
糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第５図の様にマ
ルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず完全に一定であっ
た。
についての検量線を作成した。その検量線の傾きすなわ
ち各物質についての単位モル濃度あたりの出力値とマル
トオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第４図
の様にＷ鎖の鎖長数と比例関係があった。また各物質に
ついての単位重量％濃度あたりの出力値とマルトオリゴ
糖の糖鎖の鎖長数との関係を図示すると第５図の様にマ
ルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数によらず完全に一定であっ
た。
（比較例）
グルコースオキシダーゼ１ ｍ ｇ 、グルコアミラー
ゼ４．ＯＨ２，ウシ血清アルブミン５ｍｇを０．２重量
％グルタルアルデヒドを含むｐＨ６゜０の１００ｍＭリ
ン酸緩衝液に溶解させ全量を１０００μｅとした。この
混合酵素溶液は、グルコースオキシダーゼを過酸化水素
生成速度で表わした最大反応速度で、１６μｍ ｏ ｌ
／ ｍ ｉ ｎの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で２．４μｍｏ
ｌ／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素量を含んでいるの
モ、グルコアミラーゼのグルコースオキシダーゼに対す
る最大反応速度比は０．１５となる。この混合酵素溶液
を用い、実施例１と同様の方法で酵素電極とした。実施
例１と同様の装置を用いて、マルトース、マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース、マルトヘプタオースの各水溶液で濃度
系列を作り各物質についての検量線を作成した。その検
量線の傾きすなわち各物質についての単位モル濃度あた
りの出力値とマルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を
図示すると第６図の様に鎖長数に比例した関係は見られ
なかった。また各物質についての単位重量％濃度あたり
の出力値は第７図の様に各々の鎖長のマルトオリゴ糖に
ついて各々異なる出力値を示した。
ゼ４．ＯＨ２，ウシ血清アルブミン５ｍｇを０．２重量
％グルタルアルデヒドを含むｐＨ６゜０の１００ｍＭリ
ン酸緩衝液に溶解させ全量を１０００μｅとした。この
混合酵素溶液は、グルコースオキシダーゼを過酸化水素
生成速度で表わした最大反応速度で、１６μｍ ｏ ｌ
／ ｍ ｉ ｎの最大反応速度を示す酵素量を含んで
いる。またグルコアミラーゼをマルトースに対するグル
コース生成速度で表わした最大反応速度で２．４μｍｏ
ｌ／ｍｉｎの最大反応速度を示す酵素量を含んでいるの
モ、グルコアミラーゼのグルコースオキシダーゼに対す
る最大反応速度比は０．１５となる。この混合酵素溶液
を用い、実施例１と同様の方法で酵素電極とした。実施
例１と同様の装置を用いて、マルトース、マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオース、マルトヘプタオースの各水溶液で濃度
系列を作り各物質についての検量線を作成した。その検
量線の傾きすなわち各物質についての単位モル濃度あた
りの出力値とマルトオリゴ糖の糖鎖の鎖長数との関係を
図示すると第６図の様に鎖長数に比例した関係は見られ
なかった。また各物質についての単位重量％濃度あたり
の出力値は第７図の様に各々の鎖長のマルトオリゴ糖に
ついて各々異なる出力値を示した。
以上の実施例ではウシ血清アルブミンとグルタルアルデ
ヒドを用いる例を示したが、これ以外の公知の固定化法
、例えば包括法・イオン交換体結合法、他の共有結合法
等を用いることも可能である。また実試料を分析する際
に問題となる電気化学的妨害物、例えば過酸化水素を検
出する場合のアスコルビン酸、尿酸、還元型グルタチオ
ンを除去するために、固定化酵素層と電極の間に各種選
択透過膜を設けることが可能である。
ヒドを用いる例を示したが、これ以外の公知の固定化法
、例えば包括法・イオン交換体結合法、他の共有結合法
等を用いることも可能である。また実試料を分析する際
に問題となる電気化学的妨害物、例えば過酸化水素を検
出する場合のアスコルビン酸、尿酸、還元型グルタチオ
ンを除去するために、固定化酵素層と電極の間に各種選
択透過膜を設けることが可能である。
（発明の効果）
マルトオリゴ糖はグルコースの種々な重合度の多糖類の
混合物として供給されており、これに対して実用上要求
される濃度表示はグルコース換算濃度或は重量％である
が、従来の酵素電極法では各種マルトオリゴ糖の組成比
によって出力が異なるため、組成比が異なる毎に一々検
量線を作り直さなければならず、大へん面倒であったが
、本発明によれば例えばマルトースについて検量線を作
っておけば、後はどのような組成比のマルトオリゴ糖で
も測定でき、測定能率を著しく向上させることができる
。
混合物として供給されており、これに対して実用上要求
される濃度表示はグルコース換算濃度或は重量％である
が、従来の酵素電極法では各種マルトオリゴ糖の組成比
によって出力が異なるため、組成比が異なる毎に一々検
量線を作り直さなければならず、大へん面倒であったが
、本発明によれば例えばマルトースについて検量線を作
っておけば、後はどのような組成比のマルトオリゴ糖で
も測定でき、測定能率を著しく向上させることができる
。
第１図は本発明酵素電極を用いた測定装置の側面図、第
２図は本発明の第１実施例電極による測定結果のグラフ
、第３図は上記結果の鎖長数と相対出力値との関係グラ
フ、第４図は本発明の第２実施例電極による測定結果の
グラフ、第５図は上記結果の鎖長数と相対出力との関係
グラフ、第６図は比較例による測定結果のグラフ、第７
図は上記結果の鎖長数と相対出力との関係グラフである
。 １・・・インジェクター、２・・・測定セル、３・・・
ポンプ、４・・・緩衝液槽、５・・・排液槽。 代理人 弁理士 縣 浩 介 １７ 図 賞料例１／）図 第３図 ｆ浄ｆ列２９図 第４図 第５図 オ８対出カイ直 ｒ仁較Ｙ列／）図 ｔＩＩｋ６図 ｍ ％＃ ｔ 、ｌ Ｋ 第７図
２図は本発明の第１実施例電極による測定結果のグラフ
、第３図は上記結果の鎖長数と相対出力値との関係グラ
フ、第４図は本発明の第２実施例電極による測定結果の
グラフ、第５図は上記結果の鎖長数と相対出力との関係
グラフ、第６図は比較例による測定結果のグラフ、第７
図は上記結果の鎖長数と相対出力との関係グラフである
。 １・・・インジェクター、２・・・測定セル、３・・・
ポンプ、４・・・緩衝液槽、５・・・排液槽。 代理人 弁理士 縣 浩 介 １７ 図 賞料例１／）図 第３図 ｆ浄ｆ列２９図 第４図 第５図 オ８対出カイ直 ｒ仁較Ｙ列／）図 ｔＩＩｋ６図 ｍ ％＃ ｔ 、ｌ Ｋ 第７図
Claims (1)
- 少なくともグルコアミラーゼとグルコースオキシダーゼ
を含有する酵素電極において、グルコアミラーゼのマル
トースに対するグルコース生成速度で表わした最大反応
速度が、グルコースオキシダーゼのグルコースに対する
過酸化水素生成速度で表わした最大反応速度の０．４倍
以上になる酵素量比で両酵素を混合し、固定することを
特徴とするマルトオリゴ糖計測用酵素電極。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63061322A JPH083479B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | マルトオリゴ糖計測用酵素電極 |
| US07/321,165 US5081037A (en) | 1988-03-15 | 1989-03-09 | Enzyme electrode for measuring malto-oligosaccharide |
| EP89104556A EP0335167B1 (en) | 1988-03-15 | 1989-03-15 | Enzyme electrode for measuring malto-oligosaccharide and measuring apparatus using the same |
| DE68919426T DE68919426T2 (de) | 1988-03-15 | 1989-03-15 | Enzymelektrode zur Messung von Malto-Oligosacchariden und Messapparat dafür. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63061322A JPH083479B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | マルトオリゴ糖計測用酵素電極 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01233362A true JPH01233362A (ja) | 1989-09-19 |
| JPH083479B2 JPH083479B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=13167786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63061322A Expired - Fee Related JPH083479B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | マルトオリゴ糖計測用酵素電極 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5081037A (ja) |
| EP (1) | EP0335167B1 (ja) |
| JP (1) | JPH083479B2 (ja) |
| DE (1) | DE68919426T2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200051A (en) * | 1988-11-14 | 1993-04-06 | I-Stat Corporation | Wholly microfabricated biosensors and process for the manufacture and use thereof |
| JPH04218394A (ja) * | 1990-04-10 | 1992-08-07 | Kanzaki Paper Mfg Co Ltd | デンプンまたはその関連糖質分析方法及び分析装置 |
| EP0587568A1 (en) * | 1991-03-09 | 1994-03-23 | FISONS plc | Analytical methods and devices |
| US5651869A (en) * | 1995-02-28 | 1997-07-29 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Biosensor |
| AU2011258173B2 (en) | 2010-05-26 | 2014-07-03 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Personal glucose meters for detection and quantification of a broad range of analytes |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4172765A (en) * | 1977-09-14 | 1979-10-30 | Technicon Instruments Corporation | Method for the quantitative determination of alpha-amylase |
| US4340448A (en) * | 1978-08-28 | 1982-07-20 | University Of Pittsburgh | Potentiometric detection of hydrogen peroxide and apparatus therefor |
| JPS60114760A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-21 | Hitachi Ltd | マルト−スセンサ |
| JPS62296A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Kyowa Medetsukusu Kk | 過酸化水素の定量方法 |
-
1988
- 1988-03-15 JP JP63061322A patent/JPH083479B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-03-09 US US07/321,165 patent/US5081037A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-15 EP EP89104556A patent/EP0335167B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-15 DE DE68919426T patent/DE68919426T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0335167A1 (en) | 1989-10-04 |
| JPH083479B2 (ja) | 1996-01-17 |
| US5081037A (en) | 1992-01-14 |
| DE68919426T2 (de) | 1995-06-29 |
| DE68919426D1 (de) | 1995-01-05 |
| EP0335167B1 (en) | 1994-11-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |