JP7846989B2 - 細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法、細菌計数装置及びその方法 - Google Patents

Description

本発明は、バイオ医薬分野に関し、具体的には、細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法、細菌計数装置及びその方法に関する。

今や細菌の薬剤耐性問題が深刻化の一途をたどり、しかも速いスピードで世界中に広がり、各国の政府はこれを重視している。我が国でも管理上は多くの規定が打ち出され、抗生物質の合理的な使用は、細菌の薬剤耐性に応じる上で最も重要な作業であり、中でも抗生物質の迅速感受性試験がとりわけ大切である。

質量分析技術及び核酸技術の発展により、細菌の迅速同定がほぼ実現している（１～２時間で完了し、当日中に結果が出る）ため、新規な抗生物質の迅速感受性試験の研究及び開発が急務となり現実的な意義がある。経験的な広域抗生物質療法をできるだけ早く標的療法に切り替えることが抗生物質を管理する上での基本であるが、従来の薬剤感受性試験では報告時間が臨床診療の足かせになる。従来の人力的な方法では報告時間があまりに長いため、現在臨床上は全自動薬剤感受性試験方法が用いられる。中でも仏ビオメリュー社のＶＩＴＥＫシステム及び米ＢＤ社のＰｈｏｅｎｉｘシステムが最速の検出システムで、２つのシステムの信頼性及び正確さが既に認められているものの、平均時間にかけてはＰｈｏｅｎｉｘが１２．１時間で、Ｖｉｔｅｋ２が９．８時間であった。医師の日常的な作業の流れや勤務時間に鑑みて、このくらいの報告時間であると、翌日までは的確な薬を選択することができない。

従来、薬剤感受性試験の報告時間の短縮に向けて、国内外では多くの研究がなされている。質量分析法、フローサイトメトリー法、カンチレバー振動による微生物細胞重量計量法、微量等温熱産生法、磁気ビーズ回転法、微小液滴検出法、リアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法、導電率法、表面プラズモン共鳴法、ＲＮＡシーケンシング法、ファージ法、リアルタイム顕微鏡法、マイクロソニック法など様々な方法が開発されている。しかし、これらの技術は、研究の段階にとどまり、小量サンプルのみが分析され、且つ専門の技術者が操作する必要があり、装置が高価で、しかも非伝統的専用装置であって、操作が複雑で、性能が安定的でなく、コストが高く、使用が便利ではなく、実用化の見通しは不明である。

迅速薬剤感受性試験は表現型法、非表現型法の２種類に大別される。非表現型法は主に核酸に基づく分子生物学的手法で、例えば、リアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ＲＮＡシーケンシング法、トランスクリプトーム及び全ゲノムシーケンシングなどである。利点は次のとおりである。１．所要時間が少ない。陽性血液培養物の様な直接的マルチプレックスＰＣＲは様々な薬剤耐性遺伝子を検出できる。２．デジタルＰＣＲで定量的分析を実現できる。３．薬剤耐性メカニズムに明確に対応している。欠点は次のとおりである。１．細菌の薬剤耐性メカニズムは様々で複雑であるため、全面的に臨床に用いると、作業負荷が大きいため経済性と所要時間に影響がある。２．薬剤耐性遺伝子の検出では、遺伝的異質性により、遺伝子検出結果と表現型との一致性の課題には多くの検証作業が必要である。３．新規な薬剤耐性メカニズムは検出できない。新規な薬剤耐性メカニズムを鋭く発見することが臨床上の切迫したニーズである。４．臨床上においてはまだ応用されず、成長していないため、これから臨床的知見が必要である。そして、臨床上の実際的な適用には、世界中の専門家の承認と標準化が必要である。

表現型法による薬剤感受性試験では、インビトロで薬物に対する細菌の応答を直接的に観察する。抗生物質に対する細菌の感受性と耐性を直接的に観察することができ、従来の表現型法薬剤感受性試験は既に充分な開発、試験、検証を経て臨床診療から充分に裏付けられ、ＡＳＴ方法の参照基準になっている。遺伝子ベースの非表現型法による薬剤感受性試験が整備されず成長していない限りは、このような「中間的な技術」、即ち従来の培養法から生まれた技術は一段と早く実施することができ、しかも実現可能性が高いため、大いに期待されている。

また、薬剤感受性試験では殆どの場合、細胞計数装置を用いる。細胞計数装置とは一般に血小板、白血球、赤血球などの個数を測定する装置を指す。全自動細胞計数装置は幅広く用いられ、コールター原理分析法による技術的解決手段は世界中に認められる細胞及び粒子サイズの測定の標準的な方法であり、血液学分析で重要な位置を占めている。

従来の技術による細菌用計数装置及び方法には、まだ次の問題がある。１．現在、市場では電気抵抗計数法を用いる細菌個数測定装置がまだ見当たらなかった。２．従来の細胞計数装置では宝石製小孔の孔径が赤血球、白血球などの大サイズの測定に適し、細胞が１つずつ宝石製小孔を通過することは保証できる。細菌のサイズが小さいため、１つずつ宝石製小孔を通過できず、同じ時間で宝石製小孔を同時に通過できる被測定細菌の個数が２つ以上であるため、計数が不正確になる。３．赤血球、白血球などを測定する場合に、宝石製小孔が５０ｕｍ未満であると、従来の計数装置では宝石製小孔が詰まった現象が起こるため、従来の技術では宝石製小孔の孔径が５０ｕｍ以上に制限されている。４．人力的操作が必要である。従来の技術で細菌個数の判定には顕微鏡を用いると容易かつ正確に個数の測定ができ、あるいは染色法、投影法又は撮影で画像を得て、拡大倍率から計算する。従って、人力と資源が無駄になり、時間がかかる。そのためこれらの計数方法は臨床上いずれも幅広い適用と普及が実現しなかった。５．人力的操作では、細菌の大きさや形態が分枝状、糸状、紡錘状、鎖状などのように、種類によって変わるもので、上記のいくつかの方法では、従来の技術を用いる場合に、多くの細菌が折り重なっていると個数の判定が難しい。

そのため、経済的でかつ迅速な薬剤感受性試験を提供することはとりわけ重要で、迅速で正確かつ便利な細菌用の自動化細菌計数装置を設計することが重要である。

本発明は細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法、細菌計数装置及びその方法を提供し、少なくとも、従来技術による細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法では結果が出るのに時間がかかり、翌日までは医師が的確な薬の選択ができないという技術的課題を解決することを目的とする。

本発明の一態様では、細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法が提供される。当該阻害の検出方法は、被検出細菌に所定濃度の抗菌薬を加えたものを細菌薬物混合物とし、前記抗菌薬が加わらない被検出細菌を陰性対照とするステップと、前記抗菌薬を加えた時点との間隔が第１の所定期間になる時に、前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量を取得するステップと、前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値に基づいて前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌に対して阻害又は部分的な阻害又は阻害なしと決定するステップとを含む。

任意選択で、前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値が第１の所定閾値に等しい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を阻害すると決定する。

任意選択で、前記第１の所定閾値は０から０．６の任意の値である。

任意選択で、前記第１の所定閾値は０から０．４の任意の値である。

任意選択で、前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値が第２の所定閾値に等しい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を部分的に阻害するが、阻害には至らないと決定し、
前記抗菌薬を加えた時点との間隔が第２の所定期間になる時に、前記細菌薬物混合物の前記細菌の第２の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の第２の現在の数量を取得し、ただし、前記第２の所定期間は前記第１の所定期間より長く、
前記細菌薬物混合物の前記細菌の第２の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の第２の現在の数量との比の値が前記第１の所定閾値に等しい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を阻害すると決定する。

任意選択で、前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値が第２の所定閾値より大きい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を阻害しないと決定する。

任意選択で、前記第１の所定期間は０から１．５時間の任意の値であり、且つ前記第１の所定期間は０時間に等しくない。

任意選択で、前記第２の所定閾値は０．４から０．８の任意の値である。

任意選択で、電気抵抗計数法で前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量を取得する。

任意選択で、前記細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法は、検出ステップとして、
ａ．前記細菌菌種の用意：前記細菌菌株を培地に接種し、２０摂氏度（℃）から４０摂氏度（℃）の温度下で１５時間から２４時間インキュベートして、保管しておくステップ、
ｂ．前記細菌薬物混合物及び前記陰性対照を調製し、２０℃から４０℃の温度下でインキュベートするステップ、
ｃ．前記第１の所定期間又は前記第２の所定期間が経つと前記電気抵抗計数法で前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量又は第２の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量又は第２の現在の数量を取得するステップ、
ｄ．前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量又は第２の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量又は第２の現在の数量との比の値が０から０．４の任意の値に等しい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を阻害すると決定するステップを含む。

任意選択で、前記ステップａで、前記細菌菌株を血液寒天培地に接種し、３７摂氏度（℃）の温度下で１８時間インキュベートし、且つ／又は、
前記ステップｂで、前記細菌薬物混合物及び前記陰性対照を調製し、３７℃の温度下でインキュベートし、且つ／又は、
前記ステップｃで、前記第１の所定期間が０．５時間又は１時間又は１．５時間であり、前記第２の所定期間が２時間又は２．５時間又は３時間である。

任意選択で、フローサイトメトリー細菌計数法又は顕微鏡細菌計数方法又はカウンター測定法又は電子カウンター計数法又は生細胞計数法又は細胞重量測定法で前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量を取得する。

本発明の別の態様では、細菌計数装置が提供される。当該細菌計数装置は前記細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法で細菌薬物混合物の細菌の現在の数量及び陰性対照の細菌の現在の数量を取得するために用いられる。当該細菌計数装置は、被計数細菌サンプルを取得するためのサンプル採取コンポーネントと、宝石製小孔とフロントプールとリアプールと電極とを含む計数プールコンポーネントであって、前記フロントプールと前記リアプールは前記宝石製小孔を介して連通し、前記宝石製小孔の両側にはそれぞれ１つの前記電極を有し、前記フロントプールと前記リアプールとの間の液体圧力は負圧であり、前記負圧により前記被計数細菌サンプルが前記フロントプールから前記宝石製小孔を経て前記リアプールに入る計数プールコンポーネントと、前記宝石製小孔の両側に生成したパルス信号を検出した場合に、前記パルス信号に基づいて前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を決定するための回路制御システムであって、前記パルス信号は前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記宝石製小孔を通過したことを表す回路制御システムとを含む。

任意選択で、前記回路制御システムは、前記パルス信号を検出し、前記パルス信号を処理装置に伝送し、前記処理装置から送信された前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得するための第１のプロセッサであって、前記被計数細菌サンプル中の細菌数量は前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて決定される第１のプロセッサ、又は
前記パルス信号を検出し、前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を決定するための第２のプロセッサを含む。

任意選択で、前記回路制御システムは、前記電極によって前記宝石製小孔に一定の電流を提供するための第１の電源回路であって、前記パルス信号は前記宝石製小孔に前記一定の電流が提供される場合に１つ又は複数の前記細菌が前記宝石製小孔を通過することでトリガーして生成されたパルス信号である第１の電源回路、又は、
前記電極によって前記宝石製小孔に一定の電圧を提供するための第２の電源回路であって、前記パルス信号は前記宝石製小孔に前記一定の電圧が提供される場合に１つ又は複数の前記細菌が前記宝石製小孔を通過することでトリガーして生成されたパルス信号である第２の電源回路を含む。

任意選択で、前記宝石製小孔の直径は第１の目的直径範囲内の直径であり、ただし、前記第１の目的直径範囲では前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記宝石製小孔を通過する時に１回で１つの細菌だけが前記宝石製小孔を通過し、又は、
前記宝石製小孔の直径は第２の目的直径範囲内の直径であり、ただし、前記第２の目的直径範囲では前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記宝石製小孔を通過する時に１回で複数の細菌が前記宝石製小孔を通過する。

任意選択で、前記宝石製小孔の直径が第１の目的直径範囲内の直径である場合に、前記宝石製小孔の直径は３０μｍから７０μｍであり、且つ／又は、前記宝石製小孔の長さは３０μｍから１００μｍである。

任意選択で、前記宝石製小孔の直径が第１の目的直径範囲内の直径である場合に、前記宝石製小孔の直径は４０μｍから６０μｍであり、且つ／又は、前記宝石製小孔の長さは４０μｍから７０μｍである。

任意選択で、前記宝石製小孔の直径が第１の目的直径範囲内の直径である場合に、前記宝石製小孔の直径は５０μｍであり、且つ／又は、前記宝石製小孔の長さは５０μｍである。

本発明の更なる態様では、細菌計数方法が提供される。当該細菌計数方法は前記細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法で細菌薬物混合物の細菌の現在の数量及び陰性対照の細菌の現在の数量を取得するために用いられる。当該細菌計数方法は、被計数細菌サンプルを計数プールコンポーネントに加えるステップであって、前記計数プールコンポーネントが宝石製小孔と、フロントプールと、リアプールと、電極とを含み、前記フロントプールと前記リアプールが前記宝石製小孔を介して連通し、前記フロントプールと前記リアプールとの間の液体圧力は負圧であり、前記負圧により前記被計数細菌サンプルが前記フロントプールから前記宝石製小孔を経て前記リアプールに入り、前記宝石製小孔の両側にはそれぞれ１つの前記電極を有し、前記電極がオンされる場合に、前記宝石製小孔の両側の間に所定の電気抵抗を有するステップと、
前記宝石製小孔の両側には前記宝石製小孔の両側間の電気抵抗の変化で生成されたパルス信号があるかどうかを検出するステップであって、前記パルス信号は前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記宝石製小孔を通過したことを表すステップと、
前記宝石製小孔の両側に生成したパルス信号が検出された場合に、前記パルス信号に基づいて決定される前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得するステップとを含む。

任意選択で、前記パルス信号に基づいて決定される前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得する前記ステップは、
前記パルス信号を処理装置に伝送し、前記処理装置から送信された前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得するステップであって、前記被計数細菌サンプル中の細菌数量は前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて決定されるステップ、又は、
前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を決定するステップを含む。

任意選択で、前記宝石製小孔の直径は第１の目的直径範囲内の直径であり、ただし、前記第１の目的直径範囲では前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記宝石製小孔を通過する時に１回で１つの細菌だけが前記宝石製小孔を通過し、又は、
前記宝石製小孔の直径は第２の目的直径範囲内の直径であり、ただし、前記第２の目的直径範囲では前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記宝石製小孔を通過する時に１回で複数の細菌が前記宝石製小孔を通過する。

前記宝石製小孔の両側にはそれぞれ１つの前記電極を有し、宝石製小孔の両側の前記電極によって定電流源が形成され、かつ前記細菌が非導電性であるため、前記細菌が前記宝石製小孔を通過する時に電圧パルス信号が生成され、そのため前記技術案により前記パルス信号に基づいて前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を決定することができ、選択可能で「パルス信号」とは「電圧パルス信号」である。

前記パルス信号で表される細菌特徴データは、調整回路によって前記パルス信号を増幅し、強化させ、ローパスフィルタリングによってノイズを除去し、バッファリング振幅制限によって制限超過振幅値を除去し、パルス認識、傾き認識、ピーク検出、トラフ検出、広帯域検出などのアルゴリズムによって認識した前記パルス信号中の前記細菌特徴データを有する信号を含む。

前記宝石製小孔が詰まった現象（孔詰まり）は、完全的な孔詰まり、部分的な孔詰まりに分かれる。つまり前記宝石製小孔には完全的に詰まった現象、又は前記宝石製小孔には部分的に詰まった現象が起こる。

完全的な孔詰まりが起こる場合には、計数量が異常で、計数しても正しい結果は得られないため、前記逆洗コンポーネント又は前記焼灼コンポーネントを利用して孔詰まり現象を解消する。部分的な孔詰まりが起こる場合には、データが表示され、試験結果に直接的な影響があり、観察計数時間から部分的な孔詰まり現象が起こったかどうかを判断できる。つまり、観察計数時間には参照値が設定され、前記細菌計数装置が正常に動作し、微細孔が塞がらない場合には、前記被計数細菌サンプルを吸い込む時間は一定である。計数時間が長くなる場合に、前記細菌計数装置の検出器には部分的な孔詰まり現象が起こることが示される。又は、任意選択で、別の技術案として孔詰まりが起こった場合には特定のアルゴリズムで制限超過数量を判断することで、当該データが正しくないと判断されると、孔詰まり現象又は外部干渉を受けたと判定される。

装置が正常に動作する状態では、既に計数時間の固定値が設定され、計数時間が均一である。正常に動作する状態では、小孔の電圧がほぼ特定の範囲内で安定的であり、小孔の電圧の上昇又は計数量の異常が起こった場合に、前記宝石製小孔には孔詰まり又は不純物干渉の現象が起こったことが示される。孔詰まりの原因は様々であるが、多くの場合は様々な細菌が不均一に混合されるか、又は宝石製小孔の洗浄頻度が不十分であるため、計数対象外物質の蓄積で、孔詰まりが起こったことである。

任意選択で、電圧区間によって孔詰まりが起こったかどうかを判断する方法もある。つまり電圧を３つの段階に分け、それぞれが正常、上昇又は異常である。電圧が上昇する場合に、前記細菌計数装置の検出器に孔詰まり現象が起こったことが示される。上昇とは軽微な孔詰まり現象（部分的な孔詰まり現象）、異常とは完全的な孔詰まり、正常とは孔詰まりのない状態である。小孔の電圧の上昇又は計数量の異常が起こった場合に、又はベースライン異常と判断された場合に、前記宝石製小孔には孔詰まり又は不純物もしくは干渉現象があることが示される。

通常の場合には、前記リアプールの中間液体口は負圧で、リアプールは３つのチャンネルを有し、上下２つのチャンネルは弁を介して希釈液に連通し、中で通過するものは非汚染液体と呼ぶ。中間の口は弁に直結してポンプに連通し、その後廃液になって排出される。中間の口の処にも電極が設けられ（当該電極はステンレス鋼材質の外部電極で、フロントプールにある内部電極は白金である）。通常の場合には中間の液体は負圧で、前記被計数細菌サンプル液体が前記フロントプールから前記リアプールに入ることが保証され、前記宝石製小孔を通過する過程で計数が完了し、前記被計数細菌サンプルの計数が完了した後に、液体を前記リアプールの上下端の液体入口に入れ、そして前記リアプールの他端の液体出口から流出させるように前記リアプールを洗浄する。例えば、前記リアプールの給液出液口から液体を入れ、そして流出させるように前記リアプールを洗浄する。例えば、液体が出入りする方式では、リアプールに入るのは希釈液であり、出たのは廃液で、サンプルと希釈液を含んでもよい。上下のチャンネルが互いに接続され、２分割されたもので、１は希釈液に連通するメインチャンネルで、２はリアプールの上下のチャンネルポート、中間のチャンネル即ち電極のあるチャンネルにそれぞれ接続される。

孔が詰まった場合には、前記リアプールの中間液体口で負圧が解消される。選択可能な方式として、最初には加圧ポンプによって正圧を施すことにより、前記リアプールに圧力を生じさせ、前記宝石製小孔を逆洗して、前記宝石製小孔が完全的に詰まった現象又は前記宝石製小孔が部分的に詰まった現象を解消する。別の選択可能な方式として、前記リアプールの上下２つの液体口から給液することにより、前記リアプールに圧力を生じさせ、前記宝石製小孔を逆洗して、前記宝石製小孔が完全的に詰まった現象又は前記宝石製小孔が部分的に詰まった現象を解消する。

さらに、前記計数プールコンポーネントは任意選択で、前記宝石製小孔が詰まった現象がある場合に前記宝石製小孔の詰まりを逆洗で解消するための逆洗コンポーネントをさらに含む。さらに、前記リアプールの液体の負圧を解消させ、前記リアプールの２つの液体口からそれぞれ給液することにより、前記リアプールに圧力を生じさせ、前記宝石製小孔を逆洗して、前記宝石製小孔の詰まりを解消する。又は、加圧ポンプによって正圧を施すことにより、前記リアプールに圧力を生じさせ、前記宝石製小孔を逆洗して、前記宝石製小孔の詰まりを解消する。

さらに、前記計数プールコンポーネントは任意選択で、前記宝石製小孔が詰まった現象がある場合に前記宝石製小孔の詰まりを焼灼で解消するための焼灼コンポーネントをさらに含む。

さらに、前記焼灼コンポーネントは前記宝石製小孔が詰まった現象がある場合に前記電極によって前記宝石製小孔に所定の電圧値より高い電圧を提供することにより、前記宝石製小孔に詰まった物質を溶融するために用いられる。

前記細菌計数装置に接続されたコンピュータが孔詰まり、即ちコンピュータのアラーム又は注意メッセージを検出すると、手動で高圧焼灼を実行して孔詰まりを解消することができ、即ち手動でコンピュータ（ＰＣ側）上の操作ボタンをクリックして、高圧焼灼回路をオンする。つまり通常計数の時は直流電圧（相対的に低圧の部分）で、焼灼の時は直流高圧である。焼灼とは高圧と低圧の速やかな切り替えで、高圧焼灼の過程で高周波が生成され、オンオフの瞬間に、宝石製小孔の両側にアーク放電が起こり、生成した電気火花で宝石製小孔に詰まった物質が焼灼される。孔詰まりの焼灼解消に係る別の任意選択な方式は、通常計数ではスイッチ回路によって安定的な低圧成分を提供し、焼灼では直流高圧を用いる。焼灼の時は、高圧で被検液が加熱されて沸騰し、タンパク質成分を溶融させて解消することで孔詰まりの焼灼解消の効果を得る。

さらに、前記所定電圧値の電圧は９０Ｖから１１０Ｖの電圧である。
さらに、前記所定電圧値の電圧は１１０Ｖの電圧である。
さらに、前記フロントプールはプラスチック材料である。
さらに、前記フロントプールはポリオキシメチレン材料である。
さらに、前記リアプールはプラスチック材料である。
さらに、前記リアプールはポリオキシメチレン材料である。
プラスチック材料、特にポリオキシメチレン材料は加工性能に優れ、前記フロントプール及び前記リアプールのサイズが確保しやすく、構造が一層安定的である。

本発明の実施例に係る細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法の最も顕著な有益な効果は次のとおりである。
（１）報告時間の改善である。純粋な培養物を得た後に、１～２時間で報告書が得られる。
（２）実用性の改善である。最も顕著な利点は、日常的な作業の流れや勤務時間に鑑みて、細菌の迅速同定（１～２時間以内で完了）と組み合わせれば、純粋な細菌培養物を得る当日に抗生物質による標的治療を実現できることである。これは患者の死亡率と診療費用の低減だけでなく、細菌の薬剤耐性増強の低減にもつながる。
（３）技術が成長しており、安定的で、結果に信頼性がある。
（４）原理的には国際的な標準化方法（ブロス（ｂｒｏｔｈ）希釈法による薬剤感受性試験）に近く、臨床上の実用性が高い。
（５）コストが安い。
（６）自動化しやすい。

本発明の実施例の技術的解決手段に係る細菌計数装置及び方法は以下の有益な効果を有する。

本発明の実施例は電気抵抗計数法を用いた細菌個数測定装置の使用上の自動化を実現しており、従来の細菌計数では時間がかかり、非効率的であるという問題を解決しており、迅速で正確な細菌計数を実現している。

本発明の実施例で改良した宝石製小孔により、細菌が１つずつ微細孔を通過することが保証され、折り重なる現象で細菌の個数計測に影響を与えることが避けられ、電気抵抗計数法を用いた細菌個数測定が実現され、正確で効率的である。高圧逆洗と焼灼機能の追加で孔詰まりが防がれる。孔詰まり現象がある場合には、リアプールの部分で、前記宝石製小孔が完全的に詰まった現象又は前記宝石製小孔が部分的に詰まった現象を解消するための高圧逆洗設計が追加される。高圧逆洗が効かない場合には、焼灼機能を選んで孔詰まりを解消することもでき、つまり孔径が小さくなる場合に、前記宝石製小孔が完全的に詰まった現象又は前記宝石製小孔が部分的に詰まった現象が起こりにくいようにする。

細菌計数信号調整回路を的確に設計し、信号調整回路の追加で非細菌信号をフィルタリングで除去して、細菌特徴信号を正確に認識することにより、誤判定が減っている。

本願の一部になる明細書図面は本発明の更なる理解に供されるもので、本発明の模式的な実施例及びその説明は本発明を解釈するためのもので、本発明の不適切な限定にはならない。図面では、
図１は本発明の実施形態に係る細菌計数装置全体の概略図を模式的に示す。 図１－１は本発明の実施形態に係る細菌計数装置全体が運動してサンプルを吸い取る過程の概略図を模式的に示す。 図１－２は本発明の実施形態に係る細菌計数装置全体が吸い取った被検サンプルを計数プールコンポーネントに加えることの概略図を模式的に示す。 図２は本発明の実施形態に係る計数プールコンポーネントの概略構造図を模式的に示す。 図２－１は本発明の実施形態に係る図２の一部の対称な断面概略構造図を模式的に示す。 図２－２は本発明の実施形態に係る宝石製小孔の断面概略構造図を模式的に示す。 図３は本発明の実施形態に係るサンプル採取コンポーネントの概略構造図を模式的に示す。 図３－１は本発明の実施形態に係るサンプル採取針と綿棒（ｓｗａｂ）の組み合わせの概略断面構造図を模式的に示す。 図３－２は本発明の実施形態に係る試薬プレートの概略構造図を模式的に示す。 図４は本発明の実施形態に係る電気抵抗計数の動作原理概略図を模式的に示す。 図４－１は本発明の実施形態に係る細菌計数装置の流路で表す動作原理概略図を模式的に示す。 図５は本発明の実施形態に係る信号調整回路に係るプロセスの概略図を模式的に示す。 図６は本発明の実施例に係る任意選択な異なる時間でブロス培養した大腸菌における細菌量変化の概略図である。 図７は本発明の実施例に係る任意選択な異なる時間でブロス培養した大腸菌における濁度変化の概略図である。 図８は本発明の実施例に係る任意選択なブロス細菌培養における濁度と細菌数変化観察の結果概略図である。 図９は本発明の実施例３に係る増殖実験の結果概略図である。 図１０は本発明の実施例３に係る２時間と２４時間の比較の結果概略図である。 図１１は本発明の実施例３に係る感受性一致率の結果概略図である。

なお、矛盾がない限りは、本願の実施例又は実施例に係る特徴を互いに組み合わせることができる。以下、図面を参照し実施例と結び付けて本発明を詳細に説明する。

本発明の薬剤感受性試験（細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法）とは、実質的に細菌の増殖、新陳代謝及び生殖に対する抗生物質の影響を観察し、インビトロ試験で観察された細菌増殖、新陳代謝及び生殖に対する薬物の影響状況（細菌に対する阻害状況）に基づいて、臨床データ及び薬物動態学データと結び付けて薬物の有効性を見込むことである。従来の方法は、液体又は固体培地中の細菌数量の変化によって細菌に対する抗生物質の殺傷作用を監視し、観察するのは細菌集団であった。細菌集団における総数量の変化傾向の検出ではなく、個々の細菌の正確な数量監視ができれば、細菌に対する薬物の影響を早期にかつ迅速に検出することができ、薬剤感受性試験の所要時間も大きく改善されるであろう。しかし、従来の技術においては、正確で、実用性があり、自動化が可能な細菌個体の微視的検出技術が整っていない。このため、本発明の技術的解決手段は、別の角度から、細菌計数により細菌の薬物感受性を迅速に検出するという方法を新規に発明している。

具体的には、本発明の１つの技術的解決手段は、ヒト血液細胞計数で最も成長しており、最も信頼性があり、最も迅速で、最も経済的である電気抵抗計数法（コールター原理）を、細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法に新規に用いることにより、抗生物質の迅速感受性試験による検出を実現しており、細菌の増殖時に異なる濃度の抗菌薬を加えたところ、特定の濃度以上の抗菌薬は細菌の増殖と生殖を阻害していることが判明し、最小発育阻止濃度を測定できる。従来の方法では、細菌増殖後のブロスの濁度変化で最小発育阻止濃度を測定し、これは通常１８時間とかなりの時間を要する。近年、メーカー何社かが、感度のより高い濁度計で又は酸化還元指示薬を加えることで細菌の増殖又は阻害を早期に発見するよう、最適化を試みたが、これらの方法でも報告書を得るまでは１０時間を要していた。抗菌薬が細菌と接触したら短時間で影響が現われるため、細菌に対する薬物の作用と影響を最も早く判明する方法又は技術案を探ることは極めて実際的な意義があり、非常に短時間で薬物に対する細菌の感受性を測定できる。本発明では、電気抵抗計数法を用いて短時間内で細菌細胞を定量的に計数できるため、抗菌薬への感受性を迅速に測定でき、細菌の数量変化に対する分析及び比較で、細菌に対する抗生物質の阻害作用を判断し、抗菌薬への感受性を迅速に測定する。当該方法は、特に迅速薬剤感受性試験に適し、結果が安定的で信頼性がある。

本発明の具体的な一実施形態では、細菌計数装置が提供される。当該細菌計数装置は、前記細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法で、細菌薬物混合物の細菌の現在の数量及び陰性対照の細菌の現在の数量を取得するために用いられる。これは電気抵抗計数法で細菌個数を測定する細菌計数装置であり、まずは電気抵抗計数法で細菌個数を測定する細菌計数装置を発明する必要がある。つまり、サンプル採取コンポーネント、計数プールコンポーネント及び回路制御システムを設計して、電気抵抗計数法で細菌個数を測定する細菌計数装置全体を得るようこれらを組み合わせる。さらに、従来の細菌計数装置の宝石製小孔の孔径は、赤血球、白血球などのサイズが大きな細胞の測定に適する。このため、本発明の技術的解決手段は、細菌サイズに応じるよう宝石製小孔の孔径を改良するものであり、宝石製小孔の孔径を調整し、被計数細菌サンプル中の細菌が宝石製小孔を通過する時は１回で１つの細菌又は複数の細菌が宝石製小孔を通過し、宝石製小孔が詰まった非常の現象がある場合には、前記宝石製小孔が詰まった現象がある場合に前記宝石製小孔の詰まりを逆洗で解消するために逆洗コンポーネントを用い、又は前記宝石製小孔が詰まった現象がある場合に前記宝石製小孔の詰まりを焼灼で解消するために焼灼コンポーネントを用いる。

例示的な装置：
図１の前記細菌計数装置全体の概略図に示すように、前記細菌計数装置は、計数プールコンポーネント１と、サンプル採取コンポーネント２と、信号調整回路３と、ハウジング４とを含む。前記計数プールコンポーネント１は、前記サンプル採取コンポーネント２に固定して接続される。前記信号調整回路３は図５に示すとおりで、前記信号調整回路３が図１－２に示すレール４１の下に設置され、即ち前記細菌計数装置内に設置される。前記信号調整回路３は、前記計数プールコンポーネント１内の内部電極１４１及び外部電極１４２に接続される。前記信号調整回路３は、信号収集ボード、主制御ボードなどを含む。前記ハウジング４は、前記計数プールコンポーネント１、前記サンプル採取コンポーネント２及び前記信号調整回路３の外側に位置する。前記サンプル採取コンポーネント２は運動機構を含み、前記サンプル採取コンポーネント２が前記運動機構によって細菌被検液を採取して前記計数プールコンポーネント１に入れる。前記計数プールコンポーネント１は、前記サンプル採取コンポーネント２に連れられて前記レール４１において摺動する。

図２の前記計数プールコンポーネント１の概略構造図に示すように、図２－１の前記計数プールコンポーネント１の一部の断面概略構造図に示すように、前記計数プールコンポーネント１は、宝石製小孔１１と、フロントプール１２と、リアプール１３と、フロントプールとリアプールを連通させる内部電極１４１及び外部電極１４２とを含む。前記宝石製小孔１１は、前記フロントプール１２と前記リアプール１３との間に位置する。前記内部電極１４１及び前記外部電極１４２は、前記フロントプール１２と前記リアプール１３との間に接続される。

図２－１に示すように、前記リアプール１３は、上液体口１３１と、中間液体口１３２と、下液体口１３３とを含む。前記リアプール１３の液体は負圧である。これで前記フロントプール１２に入る前記細菌被検液の全てが、前記宝石製小孔１１を流れて完全的に前記リアプール１３に入る。前記リアプール１３の前記中間液体口１３２が負圧である場合に、効果が最も顕著である。前記リアプール１３における前記上液体口１３１及び下液体口１３３は、２つの洗流口である。前記外部電極１４２の導線が、前記中間液体口１３２の外壁金属にねじられる。任意選択で、前記内部電極１４１は白金で、被計数細菌サンプル中の細菌を計数するために用いられる。検出時は、被検液サンプルが宝石製小孔の微細孔を通過し、フロントプールとリアプールの電極が電気抵抗変化を検知することで、回路においてパルス信号が生成され、パルスの個数に基づいて細菌の個数を計測する。

前記内部電極１４１及び前記外部電極１４２の測定信号の強度は、細菌を計数するセンサーになる。希釈液が導電性を有するため、２つの電極の間に特定の電圧が印加された場合に、前記宝石製小孔１１の微細孔の間に一定の電気抵抗を有する。細胞が非導電性であるため、細胞が小孔に入った時に、小孔間の電気抵抗が変わったことで、回路においてパルス信号が生成される。パルス信号を処理しＰＣ側に伝送して分析させ、パルスの個数及びパルス振幅などの特性から、細胞の数量、大きさなどのパラメータを得て、統計を行うことができる。図４の動作原理図に示すように、細菌計数装置による電気抵抗計数で、前記細菌被検液の細菌数量を得て、ＰＣ（パソコン）側に伝送する。

図３は、前記サンプル採取コンポーネント２の概略構造図である。図１、図１－１及び図３に示すように、前記サンプル採取コンポーネント２は、三次元的に運動可能な機械アーム、サンプル採取針２２、綿棒２３、試薬プレート２４、プランジャーポンプ２５などを含む。前記サンプル採取コンポーネント２における運動機構とは、前記機械アーム及び前記サンプル採取針２２を含む。前記機械アームは、Ｘ軸に運動する機械アーム２１－１と、Ｙ軸に運動する機械アーム２１－２と、Ｚ軸に運動する機械アーム２１－３とを含む。前記サンプル採取針２２の片端が、前記綿棒２３を通過する。図３－１は、前記サンプル採取針２２と前記綿棒２３の組み合わせの概略構造図に係る一部の断面図である。洗浄する時は、給水管２３１から水が入り、そして出水管２３２から水が出る。前記サンプル採取針２２の他端は、前記機械アーム２１－２に固定して接続される。前記機械アーム２１－２の運動に従って運動することで、目的のサンプル採取機能、即ち前記サンプル採取針２２が、前記試薬プレート２４から前記細菌被検液を採取することを実現する。図１－１に示すように、前記プランジャーポンプ２５が前記サンプル採取針２２に接続され、前記プランジャーポンプ２５は、前記サンプル採取針２２による前記細菌被検液の吸吐を制御する。２つの前記サンプル採取針２２は三次元的に運動する機械アームのサポートフレームに固定され、各前記サンプル採取針２２にはそれぞれ１つの前記綿棒２３を有し、４つの前記サンプル採取針２２としてもよい。

且つ、複数のプローブは、相対的に静止することも、個別で運動することもできる。

図５の前記信号調整回路３の概略構造図に示すように、信号処理ボード上の信号調整回路であり、微小信号を収集し、その後、増幅フィルタリング、信号収集などを経て細菌個数をアップロードする。

図１、図１－１及び図１－２の前記細菌計数装置のサンプル採取コンポーネントの動作過程の概略図に示すように、前記細菌計数装置が動作する時は、前記サンプル採取コンポーネント２が、迅速に所定の位置に移動する。また、前記プランジャーポンプ２５が、前記サンプル採取針２２による、前記試薬プレート２４中の前記細菌被検液の初歩的な均一混合及び前記細菌被検液サンプルの吸い取りを、制御する。その後、前記細菌被検液を、前記サンプル採取コンポーネント２に従って運動する前記計数プールコンポーネント１の前記フロントプール１２に吐き出す。

任意選択で、図２－２の前記宝石製小孔１１の概略構造図に示すように、細菌の試験信号強度と計数時間の両方に配慮がなされるよう、前記宝石製小孔１１における宝石製小孔の孔径１１１（宝石製小孔の直径）は、３０μｍから７０μｍの範囲内に、好ましくは４０μｍから６０μｍに設定される。また、前記宝石製小孔１１の長さ１１２は、３０μｍから１００μｍ、好ましくは４０μｍから７０μｍに設定される。前記宝石製小孔の孔径１１１が５０μｍで、且つ前記宝石製小孔の長さ１１２が５０μｍである場合に、細菌の測定に最適である。前記宝石製小孔１１の孔が詰まった場合、前記リアプール１３に追加した高圧逆洗設計で、孔詰まり現象を解消することができる。

同じ被検基準菌液（標準的な細菌数は約２５００個／ｍＬ）に対し、本設計を用いて、異なる宝石製小孔の孔径で抵抗計数を行った試験効果データは、以下のとおりである。

１）宝石製小孔の長さが５０μｍと設定された場合に、異なる孔径の大きさで測定した１ｍＬ当たりの細菌個数（換算後）データの比較は、表１に示すとおりである。

分析して明らかになるように、宝石製小孔の孔径があまりに小さいと、孔詰まり現象が起こり、測定粒子数が低減していた。また、宝石製小孔の孔径が大きいほど、同じ時間で通過する粒子数が増加し、計数が不正確になり、測定粒子数も低減していた。上記の表１から分かるように、前記宝石製小孔の孔径１１１は、５０μｍであるのが最適で、電気抵抗計数の試験効果データが最良である。

２）宝石製小孔の孔径が５０μｍと設定された場合に、異なる宝石製小孔の長さで測定した、１ｍＬ当たりの細菌個数（換算後）データの比較は、表２に示すとおりである。

分析して明らかになるように、宝石製小孔の孔径が変わらない場合に、宝石製小孔が長いほど、同じ時間で通過する粒子数が増加し、計数が不正確になり、測定粒子数が低減していた。宝石製小孔の長さが短すぎると、流速が極めて早いため、多くの粒子が検出されないことで、測定粒子数が低減していた。上記の表２から分かるように、前記宝石製小孔の長さは、５０μｍであるのが最良で、電気抵抗計数の試験効果データが最良である。

上記の表２から分かるように、前記宝石製小孔の孔径１１１が５０μｍで、且つ前記宝石製小孔の長さ１１２が５０μｍであるのが最良で、電気抵抗計数の試験効果データが最良である。宝石製小孔の孔径及び宝石製小孔の長さが他の範囲であると、計数効果は５０μｍのより劣っているものの、計数は可能である。計数が不正確になるとは、相対的なものである。つまり、同じ計数基準は、異なる被検菌液に対しては、被検菌液の細菌数の傾向判断が正しい。このため、宝石製小孔の長さ及び孔径が他の仕様でも、細菌計数の単位レベルは測定できる。

高圧逆洗設計とは、具体的には、前記リアプール１３の中間液体口１３２の負圧を解消して、前記リアプール１３の上液体口１３１及び下液体口１３３から給液することにより、前記リアプール１３に圧力を生じさせ、前記宝石製小孔１１を逆洗して、前記宝石製小孔１１が完全的に詰まった現象又は前記宝石製小孔１１が部分的に詰まった現象を解消する。高圧逆洗が効かない場合には、焼灼機能を選んで孔詰まりを解消することもできる。つまり、孔径が小さくなる場合に、前記宝石製小孔が完全的に詰まった現象又は前記宝石製小孔が部分的に詰まった現象が、起こりにくいようにする。

任意選択で、図２に示すように、前記フロントプール１２は４つのチャンネルを一体的にした構造であり、ポリオキシメチレン材料又は他のプラスチック材料が用いられ、前記フロントプール１２の２つのフロントプールチャンネルポート１２１の間隔は１８ｍｍであり、前記フロントプール１２の内部の液体容積は２．５ｍＬより大きい。ポリオキシメチレン材料又は他のプラスチック材料を用いることで、前記フロントプール１２及び前記リアプール１３のサイズの正確さが確保しやすく、構造が一層安定的である。

一例として、細菌が宝石製小孔を通過する過程で、宝石製小孔が詰まったことで、細菌の計数が不正確になる可能性がある。宝石製小孔が詰まって細菌の計数が不正確になるという問題を解決するために、本発明の実施例では、宝石製小孔の詰まりの検出及び解消に関する技術案がさらに提供される。図１－１の任意選択な全体図に示すように、前記細菌計数装置の側方には、高圧逆洗で孔詰まりを解消するためのプランジャーポンプが設けられ、又は／且つ小孔の両端の電極に高圧焼灼で孔詰まりを解消するための高周波計数電圧が印加される。操作の詳細は、例示的な方法を参照する。

例示的な方法：
任意選択で、レーザーによって成形された宝石製小孔の両側に、それぞれ１つの白金電極を有する。希釈液が導電性を有するため、２つの電極の間に特定の電圧が印加された場合に、微細孔の間に一定の電気抵抗を有する。細胞が非導電性であるため、細胞が小孔に入った時に、小孔間の電気抵抗が変わったことで、回路においてパルス信号が生成される。パルス信号を処理しＰＣ側に伝送して分析させ、パルスの個数及びパルス振幅などの特性から、細胞の数量、大きさなどのパラメータを得て、統計を行うことができる。

細菌計数信号調整回路及び収集アルゴリズムを的確に設計し、信号増幅により、有効信号を完全に保持させ、利得調整により有効信号をアルゴリズム認識に最も適合する拡大倍率に調整する。ローパスフィルタリングにより高周波ノイズを除去し、バッファリング振幅制限により制限超過の振幅値を除去する。パルス認識、傾き認識、ピーク検出、トラフ検出、広帯域検出などのアルゴリズムにより細菌特徴信号を正確に認識することにより、パルス信号から細菌数量を得る。

前記パルス信号が第１のタイプのいくつかのパルス信号を含む場合に、前記回路制御システム又は処理装置は、前記第１のタイプのいくつかのパルス信号の個数を、第１の数量と決定する。前記第１のタイプのいくつかのパルス信号における各パルス信号は、１つの前記細菌が前記宝石製小孔を通過することでトリガーして生成されたパルス信号である。前記パルス信号が第２のタイプのいくつかのパルス信号を含む場合に、前記回路制御システム又は処理装置は、前記第２のタイプのいくつかのパルス信号の個数と所定数量との積を、第２の数量と決定する。前記第２のタイプのいくつかのパルス信号における各パルス信号は、前記所定数量の前記細菌が同時に前記宝石製小孔を通過することでトリガーして生成されたパルス信号である。

前記パルス信号が前記第１のタイプのいくつかのパルス信号だけを含む場合に、前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を、前記第１の数量と決定する。前記パルス信号が前記第２のタイプのいくつかのパルス信号だけを含む場合に、前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を、前記第２の数量と決定する。前記パルス信号が前記第１のタイプのいくつかのパルス信号及び前記第２のタイプのいくつかのパルス信号を含む場合に、前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を、前記第１の数量と前記第２の数量の和と決定する。

一例として、本発明の実施例に係る前記回路制御システム又は処理装置は、以下のステップで、前記パルス信号が第２のタイプのいくつかのパルス信号を含むかどうかを、決定することができる。

１つの細菌しか通過できない場合は、計数が正確である。２つの細菌又は３つの細菌が同時に宝石製小孔を通過して第２のタイプのパルス信号が生成され、前記第２のタイプのパルス信号が前記第１のタイプのパルス信号との誤差範囲内にある場合に、有効計数として記録し、そうでなければエラーを報告して再計数し又は誤差値から計数結果を換算する。

一例として、細菌が宝石製小孔を通過する過程で、宝石製小孔が詰まったことで、細菌の計数が不正確になる可能性がある。宝石製小孔が詰まって細菌の計数が不正確になるという問題を解決するために、本発明の実施例では、宝石製小孔の詰まりの検出及び解消に関する技術案がさらに提供される。

宝石製小孔の詰まりの検出の例示的な技術案として、本発明の実施例は、次のことをさらに含む。前記フロントプールと前記リアプールとの間の電圧が所定閾値を超えたことを検出した場合に、前記宝石製小孔が詰まったと決定する。前記フロントプールが陽極であり、前記リアプールが陰極である。前記宝石製小孔が詰まれば詰まるほど、前記宝石製小孔の両側間の電気抵抗が大きくなり、前記フロントプールと前記リアプールとの間の電圧が大きくなる。前記所定閾値は、細菌数量の異なる測定要件（例えば、異なる測定精度）に基づいて設定してもよい。

孔詰まりの逆洗解消の技術案に関しては、宝石製小孔の詰まり解消の例示的な技術案として、本発明の実施例は、次のことをさらに含む。

孔詰まりの焼灼解消の技術案に関しては、宝石製小孔の詰まり解消の例示的な技術案として、本発明の実施例は、高圧逆洗及び高圧焼灼をさらに含む。

孔詰まりが起こった場合に、中間の部分が宝石製小孔の位置に向き合うと、正圧で中間の洗流口に逆洗液体を入れ、上下２つの洗流口から排出される。プランジャーポンプと弁の組み合わせで制御し、上下の液体口によりリアプールに正圧を施し、廃液がフロントプールの廃液口から排出される。廃液は、電磁弁と廃液ポンプの組み合わせによって抽出される。

焼灼過程では、１１０Ｖの電圧下で、小孔の両端の電極に高周波計数電圧を印加する。通常計数の場合は、計数電圧は、持続的に提供される直流電圧である。高圧焼灼の場合は、短時間の間隔でのオンオフとして設計することで、高周波が生成し、オンオフの瞬間に、２つの電極の間にアーク放電が生成し、電気火花が小孔から放出される。このようにして、タンパク質、破片が容易に除去される。また単独で交流給電が行われるよう設計された装置もあり、電極ラインのフロントエンドでリレー又はシリコン制御整流器によって制御する。任意選択で、高圧沸騰でタンパク質を加熱溶融させて、焼灼による孔詰まり現象の解消を実現することもできる。

任意選択で、マルチプローブを設置する。新規なプローブ構造であり、２つのプローブが同時に運動して、４つのプローブがあるような効果が得られ、コストが減る。図３に示すように、２つの前記サンプル採取針２２の間隔は１８ｍｍである。本設計を細菌の計数に用いる場合に、三次元的に運動する機械アームが、２つのステンレス鋼製サンプル採取プローブを連れ、ターゲットプレートに行ってサンプルを吸い取り、被検液体を４つの計数プールのうちの２つの計数プールに吐き出す。この時に、２つの計数プールチャンネルが動作を開始する。その後、三次元的に運動する機械アームが、２つのステンレス鋼製サンプル採取プローブを連れてまたターゲットプレートに行ってサンプルを吸い取り、被検液体を他の２つの計数プールに吐き出し、この時に当該２つの計数プールチャンネルが動作を開始する。チャンネルでの検出が完了したら、またサンプルを吸い取り、前記同じ動作を繰り返す。２つのプローブ（前記サンプル採取針２２）が同時に運動し、マルチチャンネルで検出することにより、待ち時間が短縮されるとともに、プローブコンポーネントの追加に伴うコストが節約される。

任意選択で、三次元アームが計数プールと一緒に運動することにより、サンプルの吸い取りからサンプルを届けるまでの時間が短縮される。

三次元アームが、計数プールと一緒に運動し、相対的に静止する。検出の時は、サンプルを吸い取った後に、そのまま三次元アームがＸ、Ｙ、Ｚ軸での移動でサンプルを計数プールに注入し、それ以上の三次元的な動作が不要である。

任意選択で、図３に示すように、前記サンプル採取針２２の間隔は１８ｍｍである。図３－２は、試薬プレート２４の概略構造図である。前記試薬プレート２４の２つの試験ウェル２４１の間隔は９ｍｍである。２つの前記サンプル採取針２２の間隔が、ちょうど前記試薬プレートの試験ウェルの間隔の２倍になるため、行程が短く、時間が節約される。間隔が長いと、運動行程が長くなり動作時間が増えることで、効率が低下することが避けられる。

任意選択で、図４に示すように、サンプル注入針が液体をフロントプールに注入した後、負圧によりフロントプールの液体がリアプールに運ばれ、宝石製小孔を通過する。細菌が宝石製小孔を通過したことで電圧が生成した場合に、パルス信号が生成し（提供されるのは定電流源で、細菌が通過すると電気抵抗が変化し、そして電圧が変化する）、回路によるフィルタリング、信号増幅の後に、再びフィルタリングを経て、信号がワンチップマイクロコンピュータに届く。ワンチップマイクロコンピュータが、ＡＤサンプル採取プロセスを行い、ワンチップマイクロコンピュータのプログラムにはパルス認識アルゴリズムが設定され、処理が済んだ後に、ＰＣソフトウェアに伝送する。処理信号プロセスは次のとおりである。ＡＤサンプル採取では約１０Ｍの単位レベルでサンプルを採取し、その後アルゴリズム処理で若干のＫにさせる。当該若干のＫとは、総数、ヒストグラム情報である。その後、ＰＣにアップロードする。

任意選択で、前記細菌計数装置が動作する過程で、液体の流れで表す概略動作図として図４－１の流路図に示すように、前記細菌計数装置は、４チャンネルの計数流路による細菌計数装置である。各チャンネルの流路が同じであるため、そのうちの２つのチャンネル１及びチャンネル２（ＣＨ１及びＣＨ２）を例として、動作原理を説明する。図４－１の流路図に示すように、サンプル注入及び計数の前に、計数のたびに、前記計数プールコンポーネント１の洗浄が行われる。Ｖ１電磁弁と１０ｍＬポンプの組み合わせによって希釈液（被検細菌試薬）が吸い取られ、その後Ｖ１電磁弁、Ｖ２電磁弁、Ｖ３電磁弁、Ｖ４電磁弁とポンプの組み合わせによって液体が前記フロントプール１２に注入され、その後１０ｍＬポンプとＶ１電磁弁、Ｖ２電磁弁及びＶ３電磁弁の組み合わせによって、流路に正圧が施されて前記宝石製小孔１１が洗い流され、その後Ｖ８電磁弁、Ｖ９電磁弁とＰ１ポンプによって前記フロントプール１２の廃液が完全に排出され、Ｐ３ポンプとＶ６電磁弁、Ｖ７電磁弁によって前記リアプール１３の廃液が排出される。サンプル注入計数のプロセスは次のとおりである。液体を前記フロントプール１２に加え、その後電磁弁とポンプの組み合わせによって希釈液を加えて希釈し、前記綿棒２３が立ち上がる。前記綿棒２３による洗浄の過程は次のとおりである。前記サンプル採取針２２が立ち上がり、前記サンプル採取針２２の下面が前記綿棒２３によって包み込まれ、Ｖ５電磁弁とＰ１ポンプの組み合わせによって、Ｖ４電磁弁チャンネルからの前記サンプル採取針２２の外壁を洗い流した希釈液が廃液プールに排出され、その後Ｖ５電磁弁とＰ１ポンプの組み合わせによって、Ｖ４電磁弁チャンネルからの前記サンプル採取針２２の内壁を洗い流した希釈液が廃液プールに排出される。Ｖ４電磁弁は３方であり、１つの入口と２つの出口であり、２つの出口（１及び２とする）のうち、同じ時間で少なくとも１つの出口が入口に連通するため、希釈液による前記サンプル採取針２２の内壁及び外壁の洗浄を制御することができ、洗浄が完了すると、被検液を吸い取る。先にサンプルを注入された２つのチャンネルでは、Ｖ６電磁弁とＰ３ポンプの負圧により一定時間の計数が開始され、所定の時間になると、次回のサンプル取り込みに備え、それぞれの電磁弁とポンプの組み合わせによって前記フロントプール１２及び前記リアプール１３が洗浄される。

なお、上記で装置のいくつかのユニット／モジュール又はサブユニット／モジュールが詳細に説明されるが、このような構成は限定的ではなく例示的なものに過ぎない。実際には、本発明の実施形態を踏まえて、上記で説明した２つの又はそれ以上のユニット／モジュールの特徴及び機能が１つのユニット／モジュールにおいて実現されてもよい。また、上記で説明した１つのユニット／モジュールの特徴及び機能は複数のユニット／モジュールに分けて実現されてもよい。

なお、図面では特定の順番で本発明の方法に係る操作が説明されるが、これらの操作が必ず当該特定の順番に従って実行されなければならず、又は前記操作の全てを実行しないことには所望の結果が得られないことを示唆するものではない。さらに又は任意選択で、一部のステップを省略して、複数のステップをワンステップにまとめて実行してもよいし、且つ／又は、１つのステップを複数のステップに分けて実行してもよい。

以下、具体的な実施例と結び付けて、本発明に係る細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法の有益な効果について、更なる説明を行う。

（実施例１）
目的：細菌のブロス培養時に、細菌の変化に感度の高い指標を見つけ、迅速薬剤感受性試験に理論的な根拠を提供して、細菌薬物感受性検出方法を確立する。

材料と方法：
１．菌種調製
３種の標準菌株（ＡＴＣＣ２５９２２大腸菌、ＡＴＣＣ２５９２３黄色ブドウ球菌、ＡＴＣＣ２７８５３緑膿菌）を継代させて保管しておき、３７℃の温度下で１８時間インキュベートした。

２．ブロス調製
ＡＳＴ（抗生物質薬剤感受性試験）ブロスを入れた瓶の壁部において、事前に用意していた菌株を研き、均一に混合し、蓋をして濁度計（ＢＤ社製ＰｈｏｅｎｉｘＳｐｅｃ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｔｅｒ）で濁度を測定し保管しておいた。濁度は０．５マクファーランド単位である。ＣＬＳＩ（米国臨床検査標準協会）によるブロス希釈法薬剤感受性試験に記載の接種濃度で被検細菌を接種し、３７℃（摂氏度）の温度下で静置して、インキュベータでインキュベートした。

３．細菌計数
３７℃下でインキュベータにおいてインキュベートし、０分間、１０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間の時に、電気抵抗計数法（ＲＣ－３０００型抵抗法（コールター）粒子カウンター、珠海欧美克社製）で細胞計数を行った。２回の測定で平均値を算出し、データを記録した。

４．濁度測定
３７℃下でインキュベータにおいてインキュベートし、０分間、１０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間の時に、濁度計（ＢＤ社製ＰｈｏｅｎｉｘＳｐｅｃ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｔｅｒ）で濁度を２回測定して、平均値を算出し、データを記録した。結果は表３に示すとおりである。

異なる時間での大腸菌ブロス培養における細菌量変化は、図６に示すとおりである。

異なる時間での大腸菌ブロス培養における濁度変化は、図７に示すとおりである。

結論：
１．細菌ブロス培養の時は、異なる方法で観察した細菌変化には大きな差異があり、現在よく利用された集団細菌増殖濁度比較法は感度が劣り、１２０分間でも差異が測定できない。
２．細菌計数法は３０分間のブロス培養で顕著な差異が測定できるため、細菌薬物感受性検出方法の実現可能性が裏付けられる。

（実施例２）
ＡＴＣＣ２５９２２大腸菌に対するアンピシリンの阻害の検出方法（電気抵抗計数法）：

材料と方法：
１．菌種調製
標準菌株としてＡＴＣＣ２５９２２大腸菌を継代させて保管しておき、３７℃下で１８時間インキュベートした。

２．ブロス調製
薬剤感受性試験管（又はビーカー）のうち１０本は２倍濃度希釈（各薬物の濃度は米ＣＬＳＩ基準を参照）の所定の抗生物質を含んでいた。１１本目は抗生物質を含まず、陰性対照（ＮＣ）とした。細菌懸濁液のない１２本目は陽性対照（ＰＣ）とした。

ＭＨ（抗生物質薬剤感受性）ブロスを入れた瓶の壁部において、用意していた菌株を研き、均一に混合し、蓋をして濁度計（ＢＤ社製ＰｈｏｅｎｉｘＳｐｅｃ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｔｅｒ）で濁度を測定し保管しておいた。濁度は０．５マクファーランド単位である。

ＣＬＳＩ（米国臨床検査標準協会）によるブロス希釈法薬剤感受性試験に記載の接種濃度で被検細菌を接種し、３７℃下で静置してインキュベータでインキュベートした。

菌液調製：保管しておいたコロニーをピッキングして細菌懸濁液を調製した。細菌懸濁液の濃度は０．５マクファーランド単位であった。様々な、異なる濃度の抗生物質を含んでいた（ＭＨ）ブロスにコロニー懸濁液を加え、各管に接種した後に、細菌含有量は１×１０＾４ｃｆｕ／ｍｌ乃至５×１０＾７ｃｆｕ／ｍｌであり、５×１０＾６ｃｆｕ／ｍｌ（コロニー形成単位／ｍＬ）が最適で、即ち最適なのが１ｍＬ当たり５×１０＾６個のコロニー形成単位であった。

３．電気抵抗計数法（コールター原理）
３７℃の温度下で、インキュベータでインキュベートし、０分間、１０分間、３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間の時に、それぞれ電気抵抗計数法（ＲＣ－３０００型抵抗法（コールター）粒子カウンター、珠海欧美克社製）を用いて細胞計数を行った。２回の測定で平均値を算出し、データを記録した。

ＡＴＣＣ２５９２２大腸菌に対するアンピシリン迅速薬剤感受性試験における細菌数量変化は、表４に示すとおりである。

ブロス細菌培養における濁度と細菌数変化の観察結果を図８に示しており、横軸は抗生物質薬物の濃度値で、表４の１行目の数値に対応し、単位はμｇ／ｍｌ（１ｍＬ当たりのμｇ数）であり、縦軸は細菌数量値で、単位は個／μｌ（１μｌ当たりの個数）であった。

合計で１２本の管で試験を行い、１１本目は陰性対照（ＮＣ）とし、１２本目は陽性対照（ＰＣ）とし、他の１０本は試験管とし、各検出時刻では１２本全てに対して測定した。

電気抵抗法薬剤感受性試験の結果を図８に示しており、即ち本実施例の細菌ＡＴＣＣ２５９２２大腸菌に対するアンピシリンの阻害を検出し、検出結果では最小発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌであった。

なお、本実施例ではさらに他の３種の方法で細菌の薬剤感受性試験を行った。仏ビオメリュー社ＶＩＴＥＫ微生物同定薬剤感受性システムの操作マニュアルに従って本実施例の細菌ＡＴＣＣ２５９２２大腸菌に対するアンピシリンの阻害を検出し、検出結果では最小発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌ（１ｍＬ当たりのμｇ数）であった。Ｅｔｅｓｔ法を利用して、詳細な手順は米サーモフィッシャーサイエンティフィック社Ｅｔｅｓｔ薬剤感受性キットの操作マニュアルに従って本実施例の細菌ＡＴＣＣ２５９２２大腸菌に対するアンピシリンの阻害を検出し、検出結果では最小発育阻止濃度が２μｇ／ｍｌであった。ブロス希釈法薬剤感受性試験を利用して、詳細な手順は米国臨床検査標準協会によるブロス希釈法薬剤感受性試験基準を参照し、本実施例の細菌ＡＴＣＣ２５９２２大腸菌に対するアンピシリンの阻害を検出し、検出結果では最小発育阻止濃度が４μｇ／ｍｌであった。いずれも一致する結果で、しかも感度の高い結果であった。

結論：
１． ６０分間以内でＭＩＣ（最小発育阻止濃度）が測定された。
２．本発明の実施例では６０分間以内でＭＩＣ（最小発育阻止濃度）が測定され、ＶＩＴＥＫ法（ビオメリュー社薬剤感受性試験法）、Ｅｔｅｓｔ法及びブロス希釈法薬剤感受性試験と結果が一致する。このため、本発明の細菌薬物感受性検出方法の実現可能性が改めて裏付けられ、しかも細菌の薬物感受性結果を速やかに得られるという顕著な有益な効果がある。

実施例１と実施例２から分かるように、本発明の細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法の阻害結果と通常方法の結果を比較及び分析した。ＶＩＴＥＫ（ビオメリュー社薬剤感受性試験法）、Ｅｔｅｓｔ及びＢＭＤ（ブロス希釈法）と結果を比較し、比較基準はＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）の規定に基づいて決定した。

陰性対照に比べて、観察細胞計数が２０％、４０％、６０％又は８０％低減した時を薬剤感受性結果の判断点とし、従来の方法と一致性の比較を行った。結論は、細胞計数が４０％から６０％以上低減した時に、正確率が１００％であった。しかも細胞計数が６０％以上低減した時は最良で、細菌によって細胞計数が４０％から６０％低減したまでの時間が異なり、臨床上よく見られる細菌はいずれも９０から１２０分間以内で完了し、臨床上よく見られる細菌の殆どは９０分間以内で完了する。

（実施例３）
１．増殖実験
１．１ 実験目的
ＣＬＳＩ基準の規程に従って臨床上よく見られる６種の細菌株（ＡＴＣＣ２９２１２、ＡＴＣＣ２９２１３、ＡＴＣＣ２７８５３、ＡＴＣＣ２５９２２、クレブシエラ・ニューモニエＡＴＣＣ７００６０３及びアシネトバクター・バウマニ）を接種し、増殖傾向の記録で、２時間でその増殖を見込めるかどうかを判断する。

１．２ 実験方法
１．２．１ 陽性対照：未接種培地に対して検出し、電気抵抗細菌計数器で検出し、粒子数を記録した。

１．２．２ 菌株用意：ＣＬＳＩ基準の規程に従って、０．５マクファーランドの２４時間以内の新鮮な菌株をピッキングして、１００ｕｌを１０ｍｌの培地に加えた。

１．２．３ それぞれ０時間、０．５時間、１時間、１．５時間で結果を記録し、陽性のバックグラウンドを除去して、結果を分析した。

２．３ 実験結果を図９に示す。増殖実験結果から分かるように、２時間で細菌には既に明らかな変化があり、電気抵抗計数の方法でこのような変化を明確にとらえることができた。これにより、観察と検出で電気抵抗計数の実現可能性が裏付けられる。

２． ２時間と２４時間の薬剤感受性結果を比較する（２つの期間での薬剤感受性結果の比較で、電気抵抗法細菌薬剤感受性試験の実現可能性を判断する）。

２．１ 実験目的
臨床上よく用いられる標準菌株について、それぞれいくつかのＡクラス薬物を選んで結果比較を行い、２時間と２４時間の結果の一致性を検討した。菌株と対応の抗生物質は、表５に示すとおりである。

２．２ 実験方法
２．２．１ 菌株用意：ＣＬＳＩ基準の規程に従って、表５記載の菌株名称の２４時間以内の新鮮な菌株を、それぞれ０．５マクファーランドピッキングした。

２．２．２ 接種：１００ｕｌの０．５マクファーランド細菌懸濁液をそれぞれ、予め用意していた勾配抗生物質４８ウェルプレートに加え、各ウェルに５００ｕｌを加えた。

２．２．３ インキュベートと検出：３７℃下で２時間インキュベートして電気抵抗細菌計数器で検出を行い、感度の最も高い状態に装置を調整し、細菌を計数し、２４時間での通常薬剤感受性結果を記録し、比較及び分析を行った。

２．３ 実験結果分析

図１０と表６の結果から分かるように、臨床上よく見られる５種の菌株に対し、ＣＬＳＩ規程に記載の第一選択薬について抗生物質薬剤感受性試験を行い、電気抵抗計数法で得たＭＩＣ（２時間での陰性計数値の６０％を境界点として、ＭＩＣを決定した）と、通常薬剤感受性試験方法で目視観察２４時間での薬剤感受性結果を比較したところ、差異が許容範囲内にあった。このため、細菌薬剤感受性試験における電気抵抗計数法の実現可能性が、裏付けられる。

３．感受性一致率
臨床上よく見られる１１種の腸内細菌（大腸菌２株、モルガネラ・モルガニー、赤痢菌、エンテロバクター・アエロゲネス、シトロバクター・フレウンディー、クレブシエラ・ニューモニエ２株、プロテウス・ミラビリス、エンテロバクター・クロアカ、サルモネラ属）を選択し、ＣＬＳＩ規程に従って山東▲シン▼科社製９６ウェル腸内細菌薬剤感受性試薬プレートに接種し、３７℃下で２時間インキュベートし、２つの試薬プレートに接種した。一方の試薬プレートは、２時間で細菌計数結果を解析し、陰性対照との結果比較を行い、いったん結果値が６０％以上の陰性結果値を陰性値として、結果の記録を行った。他方の試薬プレートでは、２４時間での実験結果を記録し、２時間と２４時間での感受性一致率を判断した。図１１に示す結果から、臨床上よく用いられる抗生物質は、臨床上よく見られる１１種の腸内細菌に対し、電気抵抗計数法による薬物感受性試験と従来のＣＬＳＩ法結果との比較で一致率が高いことが分かった。

（実施例４）
生細菌の薬剤感受性試験結果と従来の方法との一致性についての検討：

１．１実験目的
臨床上よく用いられる標準菌株に対し、それぞれいくつかのＡクラス薬物を選んで結果比較を行い、２時間と２４時間での結果一致性を検討した。増殖傾向の記録で、２時間でその増殖を見込めるかどうかを判断した。菌株と対応の抗生物質は、表７に示すとおりである。

１．２ 実験方法
１．２．１ 菌株用意：ＣＬＳＩ基準の規程に従って、表７記載の菌株名称の２４時間以内の新鮮な菌株を、それぞれ０．５マクファーランドピッキングした。

１．２．２ 接種：１００ｕｌの０．５マクファーランド細菌懸濁液をそれぞれ、予め用意していた勾配抗生物質４８ウェルプレートに加え、各ウェルに５００ｕｌを加えた。

１．２．３ インキュベートと検出：３７℃下で２時間インキュベートして生細菌を計数し、２４時間での通常薬剤感受性結果を記録し、比較及び分析を行った。

１．３ 実験結果分析
１．３．１ 実験結果
セフタジジムに対する緑膿菌の薬剤感受性結果：
生細胞迅速薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝２。従来法薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝２。
生細胞迅速薬剤感受性の詳細なデータは、表８に示すとおりである。

エリスロマイシンに対する黄色ブドウ球菌の薬剤感受性結果：
生細胞迅速薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝０．２５。従来法薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝０．２５。
生細胞迅速薬剤感受性の詳細なデータは、表９に示すとおりである。

ペニシリンに対するエンテロコッカス・フェカリスの薬剤感受性結果：
生細胞迅速薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝１。従来法薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝２。
生細胞迅速薬剤感受性の詳細なデータは、表１０に示すとおりである。

ゲンタマイシンに対するクレブシエラ・ニューモニエの薬剤感受性結果：
生細胞迅速薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝８。従来法薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝８。
生細胞迅速薬剤感受性の詳細なデータは、表１１に示すとおりである。

メロペネムに対するアシネトバクター・バウマニの薬剤感受性結果：
生細胞迅速薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝０．１２。従来法薬剤感受性結果：ＭＩＣ＝０．１２。
生細胞迅速薬剤感受性の詳細なデータは、表１２に示すとおりである。

表７から表１２の結果から分かるように、臨床上よく見られる５種の菌株に対しＣＬＳＩ規程に記載の第一選択薬について抗生物質薬剤感受性試験を行い、生細胞計数法で得たＭＩＣ（２時間での陰性計数値の６０％を境界点として、ＭＩＣを決定した）と、従来の薬剤感受性試験方法で目視観察２４時間での薬剤感受性結果を比較したところ、差異が許容範囲内にあった。このため、細菌薬剤感受性試験における生細胞計数法の実現可能性が裏付けられ、従来の方法と一致性を有する。

上述したのが本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明への限定にならない。当業者にとって、本発明に様々な変更と変化が可能である。本発明の趣旨を逸脱することなく、補正、同等な置き換え、改良などが行われた場合、そのいずれも本発明の保護範囲に含まれる。

Claims (7)

1. 被検出細菌に所定濃度の抗菌薬を加えたものを細菌薬物混合物とし、前記抗菌薬が加わらない被検出細菌を陰性対照とするステップと、
   前記抗菌薬を加えた時点との間隔が第１の所定期間になる時に、前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量を取得するステップと、
   前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値に基づいて前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌に対して阻害又は部分的な阻害又は阻害なしと決定するステップと
   を含み、
   前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値が第１の所定閾値に等しい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を阻害すると決定し、
   前記第１の所定閾値は０から０．６の任意の値であり、
   前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値が第２の所定閾値に等しい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を部分的に阻害すると決定し、
   前記抗菌薬を加えた時点との間隔が第２の所定期間になる時に、前記細菌薬物混合物の前記細菌の第２の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の第２の現在の数量を取得し、ただし、前記第２の所定期間は前記第１の所定期間より長く、
   前記細菌薬物混合物の前記細菌の第２の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の第２の現在の数量との比の値が前記第１の所定閾値に等しい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を阻害すると決定し、
   前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量と前記陰性対照の前記細菌の現在の数量との比の値が第２の所定閾値より大きい場合に、前記所定濃度の前記抗菌薬は前記細菌を阻害しないと決定し、
   前記第２の所定閾値は０．６から０．８の任意の値であり、
   電気抵抗計数法で前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量を取得し、
   前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量は、
   被計数細菌サンプルを取得するためのサンプル採取コンポーネントと、
   微細孔と、フロントプールと、リアプールと、電極とを含む計数プールコンポーネントであって、前記フロントプールと前記リアプールは前記微細孔を介して連通し、前記微細孔の両側にはそれぞれ１つの前記電極を有し、前記フロントプールと前記リアプールとの間の液体圧力は負圧であり、前記負圧により前記被計数細菌サンプルが前記フロントプールから前記微細孔を経て前記リアプールに入る計数プールコンポーネントと、
   前記微細孔の両側に生成したパルス信号を検出した場合に、前記パルス信号に基づいて前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を決定するための回路制御システムであって、前記パルス信号は前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記微細孔を通過したことを表す回路制御システムと、
   を含む細菌計数装置によって取得され、
   前記微細孔の直径は第１の目的直径範囲内の直径であり、ただし、前記第１の目的直径範囲では前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記微細孔を通過する時に１回で１つの細菌だけが前記微細孔を通過し、
   前記微細孔の直径が第１の目的直径範囲内の直径である場合に、前記微細孔の直径は５０μｍであり、前記微細孔の長さは５０μｍであり、
   前記第１の所定期間は１時間以上１．５時間以下の任意の値であることを特徴とする、薬剤感受性試験における細菌に対する抗菌薬の阻害の検出方法。
2. 前記第１の所定閾値は０から０．４の任意の値であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の所定期間が１時間又は１．５時間であり、前記第２の所定期間が２時間又は２．５時間又は３時間であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記回路制御システムは、
   前記パルス信号を検出し、前記パルス信号を処理装置に伝送し、前記処理装置から送信された前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得するための第１のプロセッサであって、前記被計数細菌サンプル中の細菌数量は前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて決定される第１のプロセッサ、又は、
   前記パルス信号を検出し、前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を決定するための第２のプロセッサを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記回路制御システムは、
   前記電極によって前記微細孔に一定の電流を提供するための第１の電源回路であって、前記パルス信号は前記微細孔に前記一定の電流が提供される場合に１つ又は複数の前記細菌が前記微細孔を通過することでトリガーして生成されたパルス信号である第１の電源回路、又は、
   前記電極によって前記微細孔に一定の電圧を提供するための第２の電源回路であって、前記パルス信号は前記微細孔に前記一定の電圧が提供される場合に１つ又は複数の前記細菌が前記微細孔を通過することでトリガーして生成されたパルス信号である第２の電源回路を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記細菌薬物混合物の前記細菌の現在の数量及び前記陰性対照の前記細菌の現在の数量は、
   被計数細菌サンプルを計数プールコンポーネントに加えるステップであって、前記計数プールコンポーネントが微細孔と、フロントプールと、リアプールと、電極とを含み、前記フロントプールと前記リアプールが前記微細孔を介して連通し、前記フロントプールと前記リアプールとの間の液体圧力は負圧であり、前記負圧により前記被計数細菌サンプルが前記フロントプールから前記微細孔を経て前記リアプールに入り、前記微細孔の両側にはそれぞれ１つの前記電極を有し、前記電極がオンされる場合に、前記微細孔の両側の間に所定の電気抵抗を有するステップと、
   前記微細孔の両側には前記微細孔の両側間の電気抵抗の変化で生成されたパルス信号があるかどうかを検出するステップであって、前記パルス信号は前記被計数細菌サンプル中の細菌が前記微細孔を通過したことを表すステップと、
   前記微細孔の両側に生成したパルス信号が検出された場合に、前記パルス信号に基づいて決定される前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得するステップと、
   を含む細菌計数方法によって取得されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記パルス信号に基づいて決定される前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得する前記ステップは、
   前記パルス信号を処理装置に伝送し、前記処理装置から送信された前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を取得するステップであって、前記被計数細菌サンプル中の細菌数量は前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて決定されるステップ、又は、
   前記パルス信号で表される細菌特徴データに基づいて前記被計数細菌サンプル中の細菌数量を決定するステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。