JP7846668B2 - リガンド－受容体対及び生物学的に機能的なタンパク質を含む融合タンパク質 - Google Patents

リガンド－受容体対及び生物学的に機能的なタンパク質を含む融合タンパク質

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Description

背景
モノクローナル抗体及び他の生物学的製剤の薬物としての開発により、高度に特異的で標的指向化された治療剤を設計することが可能である。しかしながら、これらの薬剤の使用は、がんなどの疾患細胞の目印となり得る分子標的のほとんどが、ある程度の発現差があるにせよ、患者の体内の非疾患（正常）細胞にも見られるという事実によってしばし妨げられる。その結果、活性な標的指向化生体分子は、治療剤として使用されると、治療上の利益が期待される場所以外で意図しない活性を示すことがあり、潜在的な毒性及び望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。これは、オンターゲット（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）／オフ腫瘍（ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）（オンターゲット／オフ組織（ｏｆｆ－ｔｉｓｓｕｅ）としても知られる）作用とも呼ばれ、薬物の有効性と毒性のバランスだけでなく、投与レジメンにも影響する。オンターゲット／オフ腫瘍作用は、非疾患細胞による治療剤の意図しない取り込み及びクリアランスの加速を引き起こすことがあり、その結果、標的媒介薬物消失（ＴＭＤＤ）とも呼ばれる治療薬の好ましくない薬物動態プロファイルが生じ得る。よって、これらの課題により、分子標的に対する高い特異性だけでなく、治療剤を疾患細胞／組織に対して条件付きで局所的に作用させるのと同時に、腫瘍以外の組織で発現している同標的に対する薬物作用を回避することができる治療設計上の機能が求められている。
免疫チェックポイント経路を標的とすることで、正または負のいずれかの共刺激性分子を介して、患者の免疫系の積極的な関与により、持続的な治療反応を提供することができる。残念ながら、チェックポイント経路を標的とした治療法もまた、標的を媒介にした薬物毒性の問題及びクリアランスの課題に難点がある。これらのチェックポイント及び／または共刺激性経路の複数を同時に標的とする場合、あるいはこれらのチェックポイント標的を他の非免疫関連標的及び治療法と組み合わせる場合、より効果的な免疫応答の再活性化が可能であるという認識も高まっている。したがって、チェックポイントを標的にすることに関する治療戦略には大きな関心が寄せられているが、免疫関連の有害事象（ｉｒＡＥ）、すなわち、毒性及びクリアランスに関する課題は依然として残っている。治療剤の条件付きの関与をもたらす設計は、免疫調節性分子を標的とすることに対して、毒性が低く、より効果的な解決策を提供する可能性がある。
生物学的に機能的なタンパク質、リガンド－受容体対、第１のペプチドリンカー及び第２のペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、生物学的に機能的なタンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、リガンド－受容体対は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含み、リガンドは、第１のポリペプチドの末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のポリペプチドの各々同様の末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されており、第１及び第２のペプチドリンカーは、リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さである、融合タンパク質が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、第１及び第２のペプチドリンカーの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、第１のポリペプチドのＮ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のポリペプチドのＮ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されている。
ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、抗体または抗原結合抗体断片を含む。ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、ポリペプチド骨格からなる。ある特定の実施形態では、ポリペプチド骨格は、二量体Ｆｃ領域であり、第１のポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドからなり、第２のポリペプチドは、第２のＦｃポリペプチドからなり、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、二量体Ｆｃ領域を形成する。ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、ポリペプチド骨格を含む。
ある特定の実施形態では、ポリペプチド骨格は、二量体Ｆｃ領域を含む。ある特定の実施形態では、二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体Ｆｃである。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対のリガンドまたは受容体の少なくとも１つは、免疫調節性標的に結合することが可能である。
いくつかの実施形態では、リガンド受容体対は、免疫チェックポイントの調節、免疫細胞活性の調節、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の調節、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）の調節、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の調節及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の調節からなる群から選択される細胞応答に関与する。いくつかの実施形態では、受容体は、その同族リガンドに対する受容体の結合親和性を野生型受容体と比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む。
いくつかの実施形態では、リガンドは、リガンドのその同族受容体に対する結合親和性を野生型リガンドと比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＰＤ１－ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８６、ＰＤＬ１－ＣＤ８０、ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ、ＮＣＲＳＲＬＧ１－ＮＫｐ３０及びＣＤ４７－ＳＩＲＰａからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＰＤ１－ＰＤＬ１である。ある特定の実施形態では、リガンドＰＤＬ１は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、受容体ＰＤ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０である。ある特定の実施形態では、リガンドＣＤ８０は、配列番号２５、配列番号１８５、配列番号１８７または配列番号１８９に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、受容体ＣＴＬＡ４は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、受容体及びリガンドは、第１及び第２のポリペプチドの各Ｎ末端に融合されている。ある特定の実施形態では、第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つは、複数のプロテアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、リガンドまたは受容体と融合しているペプチドリンカーのうちの１つは、１つ以上の追加のプロテアーゼ切断部位を含むように操作されており、かつリガンドまたは受容体の１つ以上のプロテアーゼ切断部位と、第１または第２のペプチドリンカーのプロテアーゼ切断部位とが、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼによって切断可能である。
ある特定の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４）、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、アダマリシン、セラリシン、アスタシン、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ（ＧＢ）、ヘプシン、エラスターゼ、レグマイン、マトリプターゼ、マトリプターゼ２、メプリン、ニューロシン、ＭＴ－ＳＰ１、ネプリライシン、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＴＡＣＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ｕＰＡ、カルパイン、ＦＡＰ及びＫＬＫからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロテアーゼは、ｕＰＡまたはマトリプターゼである。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、３～５０または５～２０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つは、プロテアーゼ切断部位を有さない。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧｌｙｎＳｅｒ）リンカーであり、ここで、（ＧｌｙｎＳｅｒ）リンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１～５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｎリンカー（式中、ｎは、１～５の整数である）である。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３８）を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリプロリンリンカーであり、任意で、ＰＰＰまたはＰＰＰＰである。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列と比較して、最大３０パーセントまでのアミノ酸配列同一性の差を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリンヒンジ領域配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号２８）を含むプロテアーゼ切断部位を含む。
また、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域を含む融合タンパク質であって、Ｆａｂ領域は、抗原結合ドメインを形成するＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドと、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含むリガンド－受容体対とを含み、リガンドは、ＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方のＮ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、他方のＶＨまたはＶＬポリペプチドのＮ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されており、第１及び第２のペプチドリンカーは、リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、第１及び第２のペプチドリンカーのうちの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含み、リガンド－受容体対は、抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する、融合タンパク質も本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの少なくとも１つは、第１のＶＨポリペプチド及び第１のＶＬポリペプチドを含み、第１のＶＨ及びＶＬポリペプチドは、抗体の第１の抗原結合ドメインを形成し、リガンドは、第１のＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第１のＶＨまたはＶＬポリペプチドの他方に第２のペプチドリンカーを介して融合されており、リガンド－受容体対は、第１の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する。ある特定の実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、二量体Ｆｃをさらに含む。ある特定の実施形態では、二量体Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体Ｆｃである。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー－ＶＬ、受容体－リンカー－ＶＬ、リガンド－リンカー－ＶＨ、または受容体－リンカー－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－切断性リンカー－ＶＬ、受容体－切断性リンカー－ＶＬ、リガンド－切断性リンカー－ＶＨ、または受容体－切断性リンカー－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１１４）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１１４）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１４）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１４）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１４５）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１４５）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１４５）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１４５）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１４７）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１４７）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１４７）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１４７）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１５４）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１５４）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１５４）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１５４）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号２０３）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号２０３）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号２０３）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号２０３）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対のリガンドまたは受容体の少なくとも１つは、免疫調節性標的に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、リガンド受容体対は、免疫チェックポイントの調節、免疫細胞活性の調節、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の調節、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）の調節、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の調節及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の調節からなる群から選択される細胞応答に関与する。
ある特定の実施形態では、受容体は、その同族リガンドに対する受容体の結合親和性を野生型受容体と比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、リガンドのその同族受容体に対する結合親和性を野生型リガンドと比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＰＤ１－ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８６、ＰＤＬ１－ＣＤ８０、ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ、ＮＣＲＳＲＬＧ１－ＮＫｐ３０及びＣＤ４７－ＳＩＲＰａからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＰＤ１－ＰＤＬ１である。ある特定の実施形態では、リガンドＰＤＬ１は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、受容体ＰＤ１は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０である。ある特定の実施形態では、リガンドＣＤ８０は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、受容体ＣＴＬＡ４は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、受容体及びリガンドは、第１及び第２のポリペプチドの各Ｎ末端に融合されている。ある特定の実施形態では、第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つは、複数のプロテアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、リガンドまたは受容体のうちの１つは、１つ以上の追加のプロテアーゼ切断部位を含むように操作されており、かつリガンドまたは受容体の１つ以上のプロテアーゼ切断部位と、第１または第２のペプチドリンカーのプロテアーゼ切断部位とが、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼによって切断可能である。
ある特定の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４）、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、アダマリシン、セラリシン、アスタシン、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ（ＧＢ）、ヘプシン、エラスターゼ、レグマイン、マトリプターゼ、マトリプターゼ２、メプリン、ニューロシン、ＭＴ－ＳＰ１、ネプリライシン、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＴＡＣＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ｕＰＡ、カルパイン、ＦＡＰ及びＫＬＫからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、プロテアーゼは、ｕＰＡまたはマトリプターゼである。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、３～５０または５～２０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つは、プロテアーゼ切断部位を有さない。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧｌｙｎＳｅｒ）リンカーであり、ここで、（ＧｌｙｎＳｅｒ）リンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１～５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｎリンカー（式中、ｎは、１～５の整数である）である。ある特定の実施形態では、プロテアーゼ切断部位を有さないペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３８）を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリプロリンリンカーであり、任意で、ＰＰＰまたはＰＰＰＰである。ある特定の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）プロリン（Ｐ）ポリペプチドリンカーであり、任意で、ＧＰＰＰＧ、ＧＧＰＰＰＧＧ、ＧＰＰＰＰＧまたはＧＧＰＰＰＰＧＧである。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列と比較して、最大３０パーセントまでのアミノ酸配列同一性の差を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリンヒンジ領域配列を含む。ある特定の実施形態では、プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号２８）を含む。
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合は、リガンド－受容体対と融合していない親の抗原結合ドメインと比較して、１０倍以上減少する。ある特定の実施形態では、細胞環境におけるプロテアーゼ切断部位の切断により、リガンド－受容体対の一方のメンバーが融合タンパク質から放出され、それにより、抗原結合ドメインがその同族抗原に結合することが可能になる。
ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、がん細胞または免疫細胞上に発現する抗原に結合する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、Ｔ細胞上に発現する抗原に結合する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。ある特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、分化抗原群３（ＣＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、組織因子（ＴＦ）、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、分化抗原群４０（ＣＤ４０）及びカドヘリン３（ＣＤＨ３）からなる群から選択される抗原に結合する。
ある特定の実施形態では、抗体または抗体断片は、第２のＶＨポリペプチド及び第２のＶＬポリペプチドを含む第２の抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、第２のリガンド－受容体対を含み、第２のリガンド－受容体対のリガンドは、第２のＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方に第３のペプチドリンカーを介して融合されており、第２のリガンド－受容体対の受容体は、第２のＶＨまたはＶＬポリペプチドの他方に第４のペプチドリンカーを介して融合されており、第３及び第４のペプチドリンカーのうちの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含み、リガンド－受容体対は、第２の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、２つの異なる抗原に結合する。ある特定の実施形態では、一方の抗原は、Ｔ細胞によって発現される抗原であり、他方の抗原は、がん細胞によって発現される抗原である。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ３及びＨＥＲ２に結合する。
また、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを含むＦｃ領域と、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含むリガンド－受容体対とを含む融合タンパク質であって、リガンドは、第１のＦｃポリペプチドの末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のＦｃポリペプチドの各々同様の末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されており、第１及び第２のペプチドリンカーは、リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、第１及び第２のペプチドリンカーのうちの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含む、融合タンパク質も本明細書に記載される。
[本発明１００１]
生物学的に機能的なタンパク質、リガンド－受容体対、第１のペプチドリンカー及び第２のペプチドリンカーを含む、融合タンパク質であって、
前記生物学的に機能的なタンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、かつ
前記リガンド－受容体対は、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含み、
前記リガンドは、前記第１のポリペプチドの末端に前記第１のペプチドリンカーを介して融合されており、
前記受容体は、前記第２のポリペプチドの各々同様の末端に前記第２のペプチドリンカーを介して融合されており、前記第１及び第２のペプチドリンカーは、前記リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、前記第１及び第２のペプチドリンカーのうちの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含む、
前記融合タンパク質。
[本発明１００２]
前記リガンド及び前記受容体が、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ポリペプチドの細胞外部分を含む、本発明１００１の融合タンパク質。
[本発明１００３]
前記リガンド及び前記受容体が、免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ポリペプチドの細胞外部分を含む、本発明１００１の融合タンパク質。
[本発明１００４]
前記生物学的に機能的なタンパク質が、抗体または抗原結合抗体断片を含む、本発明１００１～１００３のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１００５]
前記生物学的に機能的なタンパク質がポリペプチド骨格からなる、本発明１００１の融合タンパク質。
[本発明１００６]
前記ポリペプチド骨格が、二量体Ｆｃ領域であり、前記第１のポリペプチドが、第１のＦｃポリペプチドからなり、かつ前記第２のポリペプチドが、第２のＦｃポリペプチドからなり、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドは、二量体Ｆｃ領域を形成する、本発明１００５の融合タンパク質。
[本発明１００７]
前記生物学的に機能的なタンパク質がポリペプチド骨格を含む、本発明１００１の融合タンパク質。
[本発明１００８]
前記ポリペプチド骨格が二量体Ｆｃ領域を含む、本発明１００７の融合タンパク質。
[本発明１００９]
前記二量体Ｆｃ領域がヘテロ二量体Ｆｃである、本発明１００６または本発明１００８の融合タンパク質。
[本発明１０１０]
前記リガンド－受容体対の前記リガンドまたは前記受容体の少なくとも１つが、免疫調節性標的に結合することが可能である、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０１１]
前記リガンド受容体対が、免疫チェックポイントの調節、免疫細胞活性の調節、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の調節、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）の調節、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の調節及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の調節からなる群から選択される細胞応答に関与する、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０１２]
前記受容体が、その同族リガンドに対する前記受容体の結合親和性を野生型受容体と比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０１３]
前記リガンドが、その同族受容体に対する前記リガンドの結合親和性を野生型リガンドと比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０１４]
前記リガンド－受容体対が、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＰＤ１－ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８６、ＰＤＬ１－ＣＤ８０、ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ、ＮＣＲＳＲＬＧ１－ＮＫｐ３０及びＣＤ４７－ＳＩＲＰａからなる群から選択される、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０１５]
前記リガンド－受容体対が、ＰＤ１－ＰＤＬ１である、本発明１０１４の融合タンパク質。
[本発明１０１６]
前記リガンドＰＤＬ１が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０１５の融合タンパク質。
[本発明１０１７]
前記受容体ＰＤ１が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０１５または本発明１０１６の融合タンパク質。
[本発明１０１８]
前記リガンド－受容体対が、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０である、本発明１０１４の融合タンパク質。
[本発明１０１９]
前記リガンドＣＤ８０が、配列番号２５、配列番号１８５、配列番号１８７または配列番号１８９に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０１８の融合タンパク質。
[本発明１０２０]
前記受容体ＣＴＬＡ４が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０１８または本発明１０１９の融合タンパク質。
[本発明１０２１]
前記リガンド－受容体対が、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＰＤＬ１－ＣＤ８０及びＣＤ２８－ＣＤ８０からなる群から選択され、前記リガンドＣＤ８０が、（ａ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ及びＤ９０Ｇ；（ｂ）Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｎ４８Ｋ、Ｉ６１Ｓ、Ｋ８９Ｎ；（ｃ）Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｄ９０Ｇ、Ｋ９３Ｅ；または（ｄ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｄ９０Ｇ；（ｅ）Ｉ５８Ｓ、Ｖ６８Ｓ、Ｌ７０Ｓ；（ｆ）Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓまたは（ｇ）Ｖ２２Ｓからなる群から選択される変異を有する配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０１４の融合タンパク質。
[本発明１０２２]
前記受容体及び前記リガンドが、前記第１及び第２のポリペプチドの各Ｎ末端に融合されている、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０２３]
前記第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つが、複数のプロテアーゼ切断部位を含む、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０２４]
前記リガンドまたは前記受容体と融合しているペプチドリンカーのうちの１つが、１つ以上の追加のプロテアーゼ切断部位を含むように操作されており、かつ前記リガンドまたは前記受容体の前記１つ以上のプロテアーゼ切断部位と、前記第１または第２のペプチドリンカーの前記プロテアーゼ切断部位とが、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼによって切断可能である、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０２５]
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４）、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、アダマリシン、セラリシン、アスタシン、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ（ＧＢ）、ヘプシン、エラスターゼ、レグマイン、マトリプターゼ、マトリプターゼ２、メプリン、ニューロシン、ＭＴ－ＳＰ１、ネプリライシン、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＴＡＣＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ｕＰＡ、カルパイン、ＦＡＰ及びＫＬＫからなる群から選択される、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０２６]
前記プロテアーゼが、ｕＰＡまたはマトリプターゼである、本発明１０２５の融合タンパク質。
[本発明１０２７]
前記ペプチドリンカーが、３～５０または５～２０アミノ酸長である、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０２８]
前記第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つが、プロテアーゼ切断部位を有さない、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０２９]
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ ｎ Ｓｅｒ）リンカーであり、ここで、（Ｇｌｙ ｎ Ｓｅｒ）リンカーは、（Ｇｌｙ ３ Ｓｅｒ） ｎ （Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） １ 、（Ｇｌｙ ３ Ｓｅｒ） １ （Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） ｎ 、（Ｇｌｙ ３ Ｓｅｒ） ｎ （Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） ｎ 、及び（Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） ｎ （式中、ｎは、１～５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０３０]
前記ペプチドリンカーが、（ＥＡＡＡＫ） ｎ リンカー（式中、ｎは、１～５の整数である）である、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０３１]
前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３８）を含む、本発明１０３０の融合タンパク質。
[本発明１０３２]
前記ペプチドリンカーが、ポリプロリンリンカー、任意で、ＰＰＰもしくはＰＰＰＰ、またはグリシン－プロリンリンカー、任意で、ＧＰＰＰＧ、ＧＧＰＰＰＧＧ、ＧＰＰＰＰＧもしくはＧＧＰＰＰＰＧＧである、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０３３]
前記ペプチドリンカーが、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列と比較して、最大３０パーセントまでのアミノ酸配列同一性の差を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリンヒンジ領域配列を含む、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０３４]
前記ペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号２８）を含むプロテアーゼ切断部位を含む、上記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０３５]
前記第１及び第２のポリペプチドの少なくとも１つが、第１のＶＨポリペプチド及び第１のＶＬポリペプチドを含み、前記第１のＶＨ及びＶＬポリペプチドは、前記抗体の第１の抗原結合ドメインを形成し、前記リガンドは、前記第１のＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方に前記第１のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記受容体は、前記第１のＶＨまたはＶＬポリペプチドの他方に前記第２のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記リガンド－受容体対は、前記第１の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する、本発明１００１～１００４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０３６]
前記第１及び第２のポリペプチドが二量体Ｆｃをさらに含む、本発明１０３５の融合タンパク質。
[本発明１０３７]
前記二量体Ｆｃ領域がヘテロ二量体Ｆｃである、本発明１０３６の融合タンパク質。
[本発明１０３８]
前記リガンド－受容体対の前記リガンドまたは前記受容体の少なくとも１つが、免疫調節性標的に結合することが可能である、本発明１０３５～１０３７のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０３９]
前記リガンド受容体対が、免疫チェックポイントの調節、免疫細胞活性の調節、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の調節、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）の調節、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の調節及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の調節からなる群から選択される細胞応答に関与する、本発明１０３５～１０３８のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０４０]
前記受容体が、その同族リガンドに対する前記受容体の結合親和性を野生型受容体と比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む、本発明１０３５～１０３８のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０４１]
前記リガンドが、その同族受容体に対する前記リガンドの結合親和性を野生型リガンドと比較して増加または減少させる１つ以上の変異を含む、本発明１０３５～１０４０のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０４２]
前記リガンド－受容体対が、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＰＤ１－ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＰＤＬ１、ＣＤ２８－ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８６、ＰＤＬ１－ＣＤ８０、ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ、ＮＣＲＳＲＬＧ１－ＮＫｐ３０及びＣＤ４７－ＳＩＲＰａからなる群から選択される、本発明１０３５～１０４１のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０４３]
前記リガンド－受容体対が、ＰＤ１－ＰＤＬ１である、本発明１０４２の融合タンパク質。
[本発明１０４４]
前記リガンドＰＤ－Ｌ１が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０４３の融合タンパク質。
[本発明１０４５]
前記受容体ＰＤ１が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０４３または本発明１０４４の融合タンパク質。
[本発明１０４６]
前記リガンド－受容体対が、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０である、本発明１０４２の融合タンパク質。
[本発明１０４７]
前記リガンドＣＤ８０が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０４６の融合タンパク質。
[本発明１０４８]
前記リガンド－受容体対が、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＰＤＬ１－ＣＤ８０及びＣＤ２８－ＣＤ８０からなる群から選択され、前記リガンドＣＤ８０が、（ａ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ及びＤ９０Ｇ；（ｂ）Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｎ４８Ｋ、Ｉ６１Ｓ、Ｋ８９Ｎ；（ｃ）Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｄ９０Ｇ、Ｋ９３Ｅ；（ｄ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｄ９０Ｇ；（ｅ）Ｉ５８Ｓ、Ｖ６８Ｓ、Ｌ７０Ｓ；（ｆ）Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓまたは（ｇ）Ｖ２２Ｓからなる群から選択される変異を有する配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０４２の融合タンパク質。
[本発明１０４９]
前記受容体ＣＴＬＡ４が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０４６～１０４８のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０５０]
前記リガンド－受容体対がＰＤＬ１－ＣＤ８０であり、かつ前記ＰＤＬ１が配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０４８の融合タンパク質。
[本発明１０５１]
前記リガンド－受容体対がＣＤ２８－ＣＤ８０であり、かつ前記ＣＤ２８が配列番号２５４に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０４８の融合タンパク質。
[本発明１０５２]
前記リガンド－受容体対が、ＣＤ２８－ＰＤＬ１である、本発明１０４３の融合タンパク質。
[本発明１０５３]
前記ＣＤ２８が、配列番号２５４に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０５２の融合タンパク質。
[本発明１０５４]
前記ＰＤＬ１が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０５２または本発明１０５３の融合タンパク質。
[本発明１０５５]
前記リガンド－受容体対が、ＣＤ４７－ＳＩＲＰａである、本発明１０４２の融合タンパク質。
[本発明１０５６]
前記ＳＩＲＰａが、配列番号２５５に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０５５の融合タンパク質。
[本発明１０５７]
前記ＣＤ４７が、配列番号２５４に記載のアミノ酸配列を含む、本発明１０５５または本発明１０５６の融合タンパク質。
[本発明１０５８]
前記受容体及び前記リガンドが、前記第１及び第２のポリペプチドの各Ｎ末端に融合されている、本発明１０３５～１０５７のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０５９]
前記第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つが、複数のプロテアーゼ切断部位を含む、本発明１０３５～１０３８のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０６０]
前記リガンドまたは前記受容体の１つが、１つ以上の追加のプロテアーゼ切断部位を含むように操作されており、かつ前記リガンドまたは前記受容体の前記１つ以上のプロテアーゼ切断部位と、前記第１または第２のペプチドリンカーの前記プロテアーゼ切断部位とが、同じプロテアーゼまたは異なるプロテアーゼによって切断可能である、本発明１０３５～１０３９のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０６１]
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４）、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、アダマリシン、セラリシン、アスタシン、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ（ＧＢ）、ヘプシン、エラスターゼ、レグマイン、マトリプターゼ、マトリプターゼ２、メプリン、ニューロシン、ＭＴ－ＳＰ１、ネプリライシン、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＴＡＣＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ｕＰＡ、カルパイン、ＦＡＰ及びＫＬＫからなる群から選択される、本発明１０３５～１０６０のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０６２]
前記プロテアーゼが、ｕＰＡまたはマトリプターゼである、本発明１０６１の融合タンパク質。
[本発明１０６３]
前記ペプチドリンカーが、３～５０または５～２０アミノ酸長である、本発明１０３５～１０６２のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０６４]
前記第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つが、プロテアーゼ切断部位を有さない、本発明１０３５～１０６３のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０６５]
前記ペプチドリンカーが、（Ｇｌｙ ｎ Ｓｅｒ）リンカーであり、ここで、（Ｇｌｙ ｎ Ｓｅｒ）リンカーは、（Ｇｌｙ ３ Ｓｅｒ） ｎ （Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） １ 、（Ｇｌｙ ３ Ｓｅｒ） １ （Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） ｎ 、（Ｇｌｙ ３ Ｓｅｒ） ｎ （Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） ｎ 、及び（Ｇｌｙ ４ Ｓｅｒ） ｎ （式中、ｎは、１～５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、本発明１０３５～１０６４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０６６]
前記ペプチドリンカーが、（ＥＡＡＡＫ） ｎ リンカー（式中、ｎは、１～５の整数である）である、本発明１０３５～１０６４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０６７]
前記プロテアーゼ切断部位を有さないペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３８）を含む、本発明１０６４の融合タンパク質。
[本発明１０６８]
前記ペプチドリンカーが、ポリプロリンリンカー、任意で、ＰＰＰもしくはＰＰＰＰ、またはグリシン－プロリンリンカー、任意で、ＧＰＰＰＧ、ＧＧＰＰＰＧＧ、ＧＰＰＰＰＧもしくはＧＧＰＰＰＰＧＧである、本発明１０５１または１０５２の融合タンパク質。
[本発明１０６９]
前記ペプチドリンカーが、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列と比較して、最大３０パーセントまでのアミノ酸配列同一性の差を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリンヒンジ領域配列を含む、本発明１０３５～１０６４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７０]
前記プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカーが、アミノ酸配列ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号２８）を含む、本発明１０３５～１０６９のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７１]
前記第１の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合が、前記リガンド－受容体対と融合していない親の抗原結合ドメインと比較して、１０倍以上減少する、本発明１０３５～１０７０のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７２]
細胞環境における前記プロテアーゼ切断部位の切断により、前記リガンド－受容体対の一方のメンバーが前記融合タンパク質から放出され、それにより、前記抗原結合ドメインがその同族抗原に結合することが可能になる、本発明１０３５～１０７１のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７３]
前記第１の抗原結合ドメインがＦａｂである、本発明１０３５～１０７２のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７４]
前記第１の抗原結合ドメインが、がん細胞または免疫細胞上に発現する抗原に結合する、本発明１０３５～１０７３のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７５]
前記第１の抗原結合ドメインが、Ｔ細胞上に発現する抗原に結合する、本発明１０３５～１０７４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７６]
前記第１の抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、本発明１０３５～１０７４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７７]
前記第１の抗原結合ドメインが、ＴＡＡに結合し、かつ前記リガンド－受容体対の前記リガンドまたは前記受容体の少なくとも１つが、免疫調節性標的に結合することが可能である、本発明１０３５～１０７４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７８]
前記第１の抗原結合ドメインが、分化抗原群３（ＣＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、組織因子（ＴＦ）、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、及びカドヘリン３（ＣＤＨ３）からなる群から選択される抗原に結合する、本発明１０３５～１０７７のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０７９]
前記抗体または抗体断片が、第２のＶＨポリペプチド及び第２のＶＬポリペプチドを含む第２の抗原結合ドメインを含む、本発明１０３２～１０７８のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０８０]
前記融合タンパク質が、第２のリガンド－受容体対を含み、前記第２のリガンド－受容体対の前記リガンドは、前記第２のＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方に第３のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記第２のリガンド－受容体対の前記受容体は、前記第２のＶＨまたはＶＬポリペプチドの他方に第４のペプチドリンカーを介して融合されており、前記第３及び第４のペプチドリンカーのうちの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含み、かつ前記リガンド－受容体対は、前記第２の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する、本発明１０７９の融合タンパク質。
[本発明１０８１]
２つの異なる抗原に結合する、本発明１０７９または本発明１０８０の融合タンパク質。
[本発明１０８２]
一方の抗原は、Ｔ細胞によって発現される抗原であり、かつ他方の抗原は、がん細胞によって発現される抗原である、本発明１０８１の融合タンパク質。
[本発明１０８３]
前記Ｔ細胞によって発現される抗原がＣＤ３である、本発明１０８２の融合タンパク質。
[本発明１０８４]
以下：
（ａ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含むＶＬとを含む、抗ＣＤ３パラトープであって、
（ａ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２０７、２０８及び２０９であり、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ２１１、２１２及び２１４であるか、
（ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２２４、２２５及び２２６であり、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ２２８、２２９及び２３０であるか、
（ｃ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２３２、２３３及び２３４であり、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ２３６、２３７及び２３８であるか、または
（ｄ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４０、２４１及び２４２であり、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ２４４、２４５及び２４６である、
前記抗ＣＤ３パラトープ
を含む、本発明１０８３の融合タンパク質。
[本発明１０８５]
ＣＤ３及びＨＥＲ２に結合する、本発明１０８１～１０８４のいずれかの融合タンパク質。
[本発明１０８６]
第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを含む、Ｆｃ領域と、
免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含む、リガンド－受容体対と
を含む、融合タンパク質であって、
前記リガンドは、前記第１のポリペプチドの末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記受容体は、前記第２のポリペプチドの各々同様の末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されており、
前記第１及び第２のペプチドリンカーは、前記リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、かつ
前記第１及び第２のペプチドリンカーの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含む、
前記融合タンパク質。
[本発明１０８７]
生物学的に機能的なタンパク質、リガンド－受容体対、第１のペプチドリンカー及び第２のペプチドリンカーを含む、融合タンパク質であって、
前記生物学的に機能的なタンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、かつ
前記リガンド－受容体対は、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含み、
前記リガンドは、前記第１のポリペプチドの末端に前記第１のペプチドリンカーを介して融合されており、
前記受容体は、前記第２のポリペプチドの各々同様の末端に前記第２のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記第１及び第２のペプチドリンカーは、前記リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さである、
前記融合タンパク質。
[本発明１０８８]
前記リガンド及び受容体が、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドの各Ｎ末端に融合されている、本発明１０８６の融合タンパク質。
[本発明１０８９]
以下：
Ｆａｂ領域及びＦｃ領域であって、
前記Ｆａｂ領域が、抗原結合ドメインを形成するＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含む、
前記Ｆａｂ領域及びＦｃ領域；ならびに
免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含む、リガンド－受容体対であって、
前記リガンドが、前記ＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方のＮ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記受容体が、他方のＶＨまたはＶＬポリペプチドのＮ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されており、
前記第１及び第２のペプチドリンカーが、前記リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、
前記第１及び第２のペプチドリンカーの少なくとも１つが、プロテアーゼ切断部位を含み、かつ
前記リガンド－受容体対が、前記抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する、
前記リガンド－受容体対
を含む、融合タンパク質。
[本発明１０９０]
追加のＦａｂ領域またはｓｃＦｖをさらに含む、本発明１０８９の融合タンパク質。
[本発明１０９１]
がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に、上記本発明のいずれかの融合タンパク質の十分な量を投与することを含む、前記方法。
[本発明１０９２]
免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする患者に、上記本発明のいずれかの融合タンパク質の十分な量を投与することを含む、前記方法。
[本発明１０９３]
前記免疫応答が、免疫チェックポイントの阻害、免疫チェックポイントの刺激、免疫細胞活性化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の刺激、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の刺激からなる群から選択される、本発明１０９２の方法。
[本発明１０９４]
前記融合タンパク質が静脈内投与される、本発明１０９１～１０９３のいずれかの方法。
[本発明１０９５]
本発明１００１～１０９０のいずれかの融合タンパク質の少なくとも１つのポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする、ベクター。
[本発明１０９６]
本発明１０９５のベクターを含む、細胞。
[本発明１０９７]
本発明１０９５のベクター、本発明１０９６の細胞、本発明１００１～１０９０のいずれかの精製された融合タンパク質、またはこれらの組み合わせ、及び使用説明書を含む、キット。
[本発明１０９８]
細胞環境における前記プロテアーゼ切断部位の切断により、前記リガンド－受容体対の一方のメンバーが前記融合タンパク質から放出され、それにより、前記リガンド－受容体対の他方のメンバーが細胞表面上のその同族パートナーに結合することが可能になる、本発明１００１～１０９０のいずれかの融合タンパク質。
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
本明細書に記載されるある特定の融合タンパク質の構造の概略図を示している。ＰＤ－１（チェック模様）及びＰＤ－Ｌ１（縞模様）をそれぞれ重鎖及び軽鎖のＮ末端に融合することにより、Ｆａｂ（灰色）のパラトープは、その２つの間に形成されたＩｇスーパーファミリーヘテロ二量体によって立体的にブロックされ得る。マスキングドメインとＦａｂとの間に導入されたリンカーのうちの１つのＴＭＥ特異的タンパク質分解的切断（解放）を介するこのマスクの一方の側の除去により、マスクの一部が放出され得、標的に対する結合が回復され得る。さらに、Ｆａｂに共有結合したままのマスクの一部は、その免疫調節性パートナーに結合することによって機能性を付与する。 ＴＭＥプロテアーゼ切断性または非切断性のリンカーを用いてＮ末端に結合させたＩｇＳＦドメイン対を使用してマスクした２つのＦａｂアームを有する抗体の概略図を示している。Ｆａｂパラトープａ－ＴＡＡ１及びａ－ＴＡＡ２は、同じであっても異なっていてもよく、ＩｇＳＦ対１：２及び３：４も、同じであっても異なっていてもよい。 標的１に特異的なＦａｂアーム及び標的２に特異的なｓｃＦｖアームを有するＦａｂ×ｓｃＦｖ構築物の概略図を示している。Ｆａｂアーム及び標的１への結合は、ＴＭＥプロテアーゼ切断性または非切断性のリンカーを使用してＮ末端に結合させたＩｇＳＦドメイン対によってマスクされている。 本明細書に記載される修飾された二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃ融合タンパク質の概略図を示している。抗体様分子の一方のアームは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マスクによってブロックされた抗ＣＤ３ Ｆａｂを含有するのに対し、他方のアームは、抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖを含有する。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされていないバリアント３０４２１のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされていないバリアント３０４２１の非還元（左）及び還元（右）ＣＥ－ＳＤＳプロファイル。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた非切断性のバリアント３０４２３のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた非切断性のバリアント３０４２３の非還元（左）及び還元（右）ＣＥ－ＳＤＳプロファイル。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた軽鎖－切断性バリアント３０４３０のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた軽鎖－切断性バリアント３０４３０の非還元（左）及び還元（右）ＣＥ－ＳＤＳプロファイル。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた重鎖－切断性バリアント３０４３６のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 代表的な二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた重鎖－切断性バリアント３０４３６の非還元（左）及び還元（右）ＣＥ－ＳＤＳプロファイル。 調査したＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃシステムの未修飾バリアント（３０４２１）とＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたバリアント（３０４３０、３０４３６）のＤＳＣサーモグラムの重ね合わせを示している。 １：５０のｕＰａ：バリアント比で３７℃で２４時間行うｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）代表的なバリアントの還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされていないバリアント（３０４２１）、マスクされているが非切断性のバリアント（３０４２３）、及びマスクされた切断性バリアント（３０４３０、３０４３６、３１９３４）についてのプロファイルが示されている。 ＥＬＩＳＡによって決定される、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤ３標的指向化バリアントのネイティブ結合の結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１部位のみが結合した構築物（３１９２９、３１９３１）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び切断性ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１部位を有するバリアント（３０４３０、３０４３６）について示されている。バリアント３０４２３、３０４３０、３０４３６の試料については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。 Ｔ細胞及び腫瘍細胞を架橋する操作されたバリアントでの処置後にＴＤＣＣアッセイにおいて決定されたＰａｎ Ｔ細胞によるＪＩＭＴ－１腫瘍細胞の細胞殺傷を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 ＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＣＨＯ－Ｓ細胞に対する、選択したＣＤ３標的指向化バリアントのフローサイトメトリーによるネイティブ結合試験の結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１部位のみが結合した構築物（３１９２９、３１９３１）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３、３０４２６）または完全なマスク及び切断性ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１部位を有するバリアント（３０４３０、３０４３６）について示されている。親和性成熟ＰＤ－１部位のＦｃ融合も含まれている（３１８２９）。バリアント３０４２３、３０４２６、３０４３０、３０４３６の試料については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。 ＰＤ－１トランスフェクトＣＨＯ－Ｓ細胞に対する、選択したＣＤ３標的指向化バリアントのフローサイトメトリーによるネイティブ結合試験の結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１部位のみが結合した構築物（３１９２９、３１９３１）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３、３０４２６）または完全なマスク及び切断性ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１部位を有するバリアント（３０４３０、３０４３６）について示されている。親和性成熟ＰＤ－１部位のＦｃ融合も含まれている（３１８２９）。バリアント３０４２３、３０４２６、３０４３０、３０４３６の試料については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。 Ｔ細胞とＪＩＭＴ－１細胞の架橋及びＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合遮断を調べるハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイの概略図を示している。 Ｔ細胞とＪＩＭＴ－１細胞の架橋及びＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合遮断を調べるハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイの分析を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及び同じマスクされていないバリアントと過剰な抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１５０ｎＭ 抗ＰＤ－Ｌ１）について示されている。重鎖にＰＤ－１部位のみが結合した構築物（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）についても調査した。バリアント３０４３０について、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。測定は三連で実施し、標準偏差を反映したエラーバーを示す。 腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して標的指向化された修飾された単一特異性二価融合タンパク質を表す図である。Ｆａｂのパラトープは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１マスクによって立体的にブロックされる。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対して標的指向化されたマスクされた融合タンパク質の非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。すべての融合タンパク質について、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれている（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）。 ＥＧＦＲに対して標的指向化された代表的な融合タンパク質の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを示している。ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料が試験されている。各システムについて、ｕＰａ非切断性バリアント（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２）及びＶＬとＰＤ－Ｌ１部位との間にｕ－Ｐａ切断配列を有するバリアント（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）のデータが示されている。 ＭＳＬＮに対して標的指向化された代表的な融合タンパク質の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを示している。ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料が試験されている。各システムについて、ｕＰａ非切断性バリアント（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２）及びＶＬとＰＤ－Ｌ１部位との間にｕ－Ｐａ切断配列を有するバリアント（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）のデータが示されている。 ＴＦに対して標的指向化された代表的な融合タンパク質の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを示している。ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料が試験されている。各システムについて、ｕＰａ非切断性バリアント（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２）及びＶＬとＰＤ－Ｌ１部位との間にｕ－Ｐａ切断配列を有するバリアント（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）のデータが示されている。 ＣＤ１９に対して標的指向化された代表的な融合タンパク質の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイルを示している。ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料が試験されている。各システムについて、ｕＰａ非切断性バリアント（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２）及びＶＬとＰＤ－Ｌ１部位との間にｕ－Ｐａ切断配列を有するバリアント（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）のデータが示されている。 異なる抗原に対して標的指向化された選択した融合タンパク質の、当該抗原を発現する次の細胞株に対するフローサイトメトリーによるネイティブ結合の結果を示している：ＭＤＡ－ＭＢ－４６８上のＥＧＦＲ。すべてのシステムについて、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれ（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及び処置あり（＋ｕＰａ）で試験した。すべてのシステムについて、未修飾対照（３２４７４、１６４２７ １６４１７、６３２３、４３７２、１７６０６、１７２１４）ならびにｃＭｅｔ及びＣＤＨ３について無関係の対照（２２２７７）も含まれている。利用可能な場合（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ）、比較のためにＳＰＲのデータも含まれている。 異なる抗原に対して標的指向化された選択した融合タンパク質の、当該抗原を発現する次の細胞株に対するフローサイトメトリーによるネイティブ結合の結果を示している：ＯＶＣＡＲ３上のＭＳＬＮ。すべてのシステムについて、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれ（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及び処置あり（＋ｕＰａ）で試験した。すべてのシステムについて、未修飾対照（３２４７４、１６４２７１６４１７、６３２３、４３７２、１７６０６、１７２１４）ならびにｃＭｅｔ及びＣＤＨ３について無関係の対照（２２２７７）も含まれている。利用可能な場合（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ）、比較のためにＳＰＲのデータも含まれている。 異なる抗原に対して標的指向化された選択した融合タンパク質の、当該抗原を発現する次の細胞株に対するフローサイトメトリーによるネイティブ結合の結果を示している：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１上のＴＦ。すべてのシステムについて、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれ（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及び処置あり（＋ｕＰａ）で試験した。すべてのシステムについて、未修飾対照（３２４７４、１６４２７１６４１７、６３２３、４３７２、１７６０６、１７２１４）ならびにｃＭｅｔ及びＣＤＨ３について無関係の対照（２２２７７）も含まれている。利用可能な場合（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ）、比較のためにＳＰＲのデータも含まれている。 異なる抗原に対して標的指向化された選択した融合タンパク質の、当該抗原を発現する次の細胞株に対するフローサイトメトリーによるネイティブ結合の結果を示している：Ｒａｊｉ上のＣＤ１９。すべてのシステムについて、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれ（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及び処置あり（＋ｕＰａ）で試験した。すべてのシステムについて、未修飾対照（３２４７４、１６４２７１６４１７、６３２３、４３７２、１７６０６、１７２１４）ならびにｃＭｅｔ及びＣＤＨ３について無関係の対照（２２２７７）も含まれている。利用可能な場合（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ）、比較のためにＳＰＲのデータも含まれている。 異なる抗原に対して標的指向化された選択した融合タンパク質の、当該抗原を発現する次の細胞株に対するフローサイトメトリーによるネイティブ結合の結果を示している：ＥＢＣ１上のｃＭｅｔ。すべてのシステムについて、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれ（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及び処置あり（＋ｕＰａ）で試験した。すべてのシステムについて、未修飾対照（３２４７４、１６４２７１６４１７、６３２３、４３７２、１７６０６、１７２１４）ならびにｃＭｅｔ及びＣＤＨ３について無関係の対照（２２２７７）も含まれている。利用可能な場合（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ）、比較のためにＳＰＲのデータも含まれている。 異なる抗原に対して標的指向化された選択した融合タンパク質の、当該抗原を発現する次の細胞株に対するフローサイトメトリーによるネイティブ結合の結果を示している：ＪＩＭＴ１上のＣＤＨ３。すべてのシステムについて、非切断性バリアントのデータが示されており（３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６２）、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ及びＣＤ１９については、切断性バリアントの試料も含まれ（３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及び処置あり（＋ｕＰａ）で試験した。すべてのシステムについて、未修飾対照（３２４７４、１６４２７１６４１７、６３２３、４３７２、１７６０６、１７２１４）ならびにｃＭｅｔ及びＣＤＨ３について無関係の対照（２２２７７）も含まれている。利用可能な場合（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ）、比較のためにＳＰＲのデータも含まれている。 ＥＧＦＲ標的指向化バリアントで処置したＮＣＩ－Ｈ２９２細胞の成長阻害試験の結果を示している。データは、マスクされていないバリアント（３２４７４）及びＰＤ－１：ＰＤ－Ｌマスクされたバリアントについて示されている。マスクされたバリアントには、非切断性形態（３１７２２）及び軽鎖上に切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有する形態（３１７２３）が含まれる。無関係の対照（２２２７７）も含まれる。すべてのバリアントについて、試料は、処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）で試験されている。エラーバーは、三連での測定の標準偏差を反映している。 本明細書において調査された修飾された二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃバリアントの概略図を示している。融合タンパク質の一方のアームは、ＣＤ８０／ＣＴＬＡ４マスクによってブロックされた抗ＣＤ３ Ｆａｂを含有するのに対し、他方のアームは、抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖを含有する。 バリアント３０４４４のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた軽鎖－切断性バリアント３０４４４のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 バリアント３０４４４のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた軽鎖－切断性バリアント３０４４４の非還元（左）及び還元（右）ＣＥ－ＳＤＳプロファイル。 バリアント３０４４４のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。マスクされた軽鎖－切断性バリアント３０４４４の非還元（左）及び還元（右）ＣＥ－ＳＤＳプロファイル。 バリアント３０４４４のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。プロテインＡ精製後のマスクされた軽鎖－切断性バリアント３３５２５のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 バリアント３０４４４のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。プロテインＡ精製後のマスクされた軽鎖－切断性バリアント３３５２６のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 バリアント３０４４４のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。プロテインＡ精製後のマスクされた軽鎖－切断性バリアント３３５２７のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム。 ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）バリアント３０４４４の還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。 ＥＬＩＳＡによって決定される、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＣＤ３標的指向化バリアントのネイティブ結合の結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、完全なＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスク及び切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）ならびに完全なＣＤ８０／ＣＴＬＡ４ベースのマスク及び切断性ＣＴＬＡ４部位を有するバリアント（３０４４４）について示されている。バリアント３０４３０及び３０４４４の試料については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。 ヒンジを介してヘテロ二量体ＩｇＧ Ｆｃに融合された免疫調節因子対（例えば、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１）のＩｇＶの概略図を示している。ｕＰａなどのＴＭＥ関連プロテアーゼによって２つのリンカーのうちの１つが切断されると、一方の部位（例えば、ＰＤ－Ｌ１）が放出され、所望の機能を有する部位（例えば、ＰＤ－１）はＦｃに結合したまま残り、細胞上のそのパートナーに結合することが可能である。ＰＤ－１の場合、標的細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合し、チェックポイント機能を阻害することができる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＣＤ４０標的指向化バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラム（Ａ～Ｃ）ならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイル（Ｄ）を示している。同じバリアントのｕＰａ処置あり（－ｕＰａ）及び処置なし（＋ｕＰａ）の還元ＣＥ－ＳＤＳ（Ｅ）、フローサイトメトリー結合データ（Ｆ）及びＣＤ４０ＲＧＡアッセイ（Ｇ）の結果も示されている。試験品には、マスクされていないバリアント（３２４７７）、非切断性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７８）及びｕＰａによる切断によってＰＤ－Ｌ１部位を除去することができるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを有するバリアント（３２４７９）が含まれる。ＲＧＡアッセイ（Ｇ）を介した機能性調査では、ネイティブのＣＤ４０結合パートナーＣＤ４０Ｌ及び無関係の対照（ｖ２２２７７）も含まれる。ＣＤ４０ ＲＧＡアッセイのデータを表（Ｈ）にまとめる。 ＰＤ１及びＰＤＬ１は、免疫グロブリンドメインを含み、複合体を形成する。画像では、結合Ｆａｂは、パラトープ末端でＰＤ１－ＰＤＬ１複合体とドッキングしている。ＰＤ１及びＰＤＬ１を適切なリンカーでＶＨ鎖及びＶＬ鎖に連結すると、抗原結合をブロックできる可能性がある。 マスクとして機能し得る他の例示的な免疫調節性対の構造ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１（ＰＤＢ：４ＺＱＫ）、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２（ＰＤＢ：３ＢＰ５）、ＣＴＬＡ４／ＣＤ８６（ＰＤＢ：１Ｉ８５）、ＮＣＲＳＲＬＧ１／ＮＫｐ３０（ＰＤＢ：３ＰＶ６）、ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７（ＰＤＢ：４ＫＪＹ）、ＣＴＬＡ４／ＣＤ８０（ＰＤＢ：１Ｉ８Ｌ）。 図21B-1の続きの図である。 フローサイトメトリーによって決定される、Ｐａｎ Ｔ細胞に対するＣＤ３標的指向化バリアントのネイティブ結合の結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、抗ＣＤ３ワンアーム抗体（１８５６０）、ＰＤ－１部位のみが結合した構築物（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０、３０４３６）について示されている。バリアント３０４２３、３０４３０の試料については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。データは、無関係の対照（２２２７７）についても示されている。 Ｔ細胞及び腫瘍細胞を架橋する操作されたバリアントでの処置後にＴＤＣＣアッセイの２回の繰り返しにおいて決定されたＰａｎ Ｔ細胞によるＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７及びＭＣＦ－７腫瘍細胞の細胞殺傷を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及びマスクされていないバリアントと飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１２０ｎＭアテゾリズマブ）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０及び３０４２３については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 図23A-1の続きの図である。 Ｔ細胞及び腫瘍細胞を架橋する操作されたバリアントでの処置後にＴＤＣＣアッセイの２回の繰り返しにおいて決定されたＰａｎ Ｔ細胞によるＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７及びＭＣＦ－７腫瘍細胞の細胞殺傷を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及びマスクされていないバリアントと飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１２０ｎＭアテゾリズマブ）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０及び３０４２３については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 図23B-1の続きの図である。 Ｔ細胞及び腫瘍細胞を架橋する操作されたバリアントでの処置後にＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７及びＭＣＦ－７がん細胞とのＴＤＣＣアッセイの２回の繰り返しにおいて決定されたＰａｎ Ｔ細胞のＩＦＮγ放出を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及びマスクされていないバリアントと飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１２０ｎＭアテゾリズマブ）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０及び３０４２３については、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 図24-1の続きの図である。 ＴＤＣＣ及びＲＧＡアッセイで使用した一連のがん細胞株について、フローサイトメトリーによって決定されたＨｅｒ２及びＰＤ－Ｌ１の細胞あたりの受容体数を示している。 Ｔ細胞と４つの異なるがん細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７、ＭＣＦ－７）の架橋及びＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合遮断を調べるハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイの結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及びマスクされていないバリアントと飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１５０ｎＭアテゾリズマブ）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０について、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 Ｔ細胞と４つの異なるがん細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７、ＭＣＦ－７）の架橋及びＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合遮断を調べるハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイの結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及びマスクされていないバリアントと飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１５０ｎＭアテゾリズマブ）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０について、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 Ｔ細胞と４つの異なるがん細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７、ＭＣＦ－７）の架橋及びＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合遮断を調べるハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイの結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及びマスクされていないバリアントと飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１５０ｎＭアテゾリズマブ）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０について、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 Ｔ細胞と４つの異なるがん細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７、ＭＣＦ－７）の架橋及びＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合遮断を調べるハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイの結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）及びマスクされていないバリアントと飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ（３０４２１＋１５０ｎＭアテゾリズマブ）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ならびに完全な非切断性マスクを有するバリアント（３０４２３）または完全なマスク及び軽鎖上の切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有するバリアント（３０４３０）について示されている。バリアント３０４３０について、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）試料を試験した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）を陰性対照として使用した。 ＥＧＦＲ（ａ－ＥＧＦＲ）を標的とする修飾された単一特異性二価融合タンパク質を表す図である。Ｆａｂのパラトープは、ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７マスクによって立体的にブロックされる。 ＥＧＦＲ標的指向化ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７マスクされた完全な切断性バリアント（３４１６４）のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを示している。 ＥＧＦＲ標的指向化ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７マスクされた完全な切断性バリアント（３４１６４）の非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルを示している。 ＥＧＦＲ標的指向化ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７マスクされた完全な切断性バリアント（３４１６４）の還元ＣＥ－ＳＤＳは、同じバリアントのｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及び処置あり（＋ｕＰａ）についても示されている。 ＥＧＦＲ陽性Ｈ２９２細胞に対するハイコンテント分析によるネイティブ結合アッセイの結果を示している。試験品には、マスクされていないＥＧＦＲ標的指向化対照（ｖ３２４７４）、ｕＰａで処置されていない（－ｕＰａ）及び処置された（＋ｕＰａ）ＥＧＦＲ標的指向化ＳＩＲＰａ／ＣＤ４７マスクされた完全な切断性バリアント（３４１６４）、ならびに無関係の対照（ｖ２２２７７）が含まれる。 Ｈｅｒ２＋／ＰＤ－Ｌ１＋ ＪＩＭＴ－１細胞に対するフローサイトメトリー結合実験における単一タイトレーション点（１ｎＭ）のデータを示している。重鎖にＰＤ－１部位のみが結合した三重特異性バリアント（ｖ３１９２９）及び同じフォーマットであるが、ＰＤ－Ｌ１またはＨｅｒ２のいずれかに結合することができない二重特異性バリアント（それぞれｖ３２４９７及びｖ３３５５１）のデータを示している。 ヒトＰａｎ Ｔ細胞及びＨｅｒ２＋／ＰＤ－Ｌ１＋ ＪＩＭＴ－１細胞の架橋実験のデータを示している。重鎖にＰＤ－１部位のみが結合した三重特異性バリアント（ｖ３１９２９）及び同じフォーマットであるが、ＰＤ－Ｌ１またはＨｅｒ２のいずれかに結合することができない二重特異性バリアント（それぞれｖ３２４９７及びｖ３３５５１）のデータを示している。架橋アッセイには、無関係の対照（ｖ２２２７７）のデータも含まれる。 ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＴ細胞動員及び活性化の機序を示している。治療用抗体は、ＴＡＡ結合を介して腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に誘導される。 ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＴ細胞動員及び活性化の機序を示している。マスクのＰＤ－Ｌ１部位は、ＴＭＥ特異的プロテアーゼの切断を介して放出される。 ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＴ細胞動員及び活性化の機序を示している。活性化された治療薬は、マスクされていないａ－ＣＤ３パラトープを介してＴ細胞に係合して腫瘍細胞を殺傷するように活性化し、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１に結合することによって、チェックポイント活性を阻害する。 フローサイトメトリーによって決定される、Ｐａｎ Ｔ細胞に対するＣＤ３標的指向化バリアントのネイティブ結合の結果を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、ＰＤ－１部位のみが結合した構築物（３１９２９）及び重鎖に非機能性ＰＤ－１ドメインが付属したバリアント（３２４９７）について示されている。データは、無関係の対照（２２２７７）についても示されている。 Ｔ細胞及び腫瘍細胞を架橋する操作されたバリアントでの処置後にＴＤＣＣアッセイにおいて決定されたＰａｎ Ｔ細胞によるＪＩＭＴ－１腫瘍細胞の細胞殺傷を示している。結果は、マスクされていないバリアント（３０４２１）、重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）及び重鎖に非機能性ＰＤ－１ドメインが付属したバリアント（３２４９７）について示されている。 ３本のストランド及び４本のストランドの２つのベータシートに配置された７本の逆平行ベータストランドから構成されるベータサンドイッチを示す、ＩｇＳＦコアＩｇフォールディングの概略図である。 ストランドの配置が異なる、ＩｇＳＦのＩｇＣ１サブグループドメイン（上）およびＩｇＣ２サブグループドメイン（下）を示す概略図である。 ４本のストランド及び５本のストランドの２つのシートに配置された９本のベータストランドを含む、ＩｇＶドメインの概略図である。 ４本のストランド及び５本のストランドの２つのシートに配置された９本のベータストランドを含む、ＩｇＶドメインの概略図である。
詳細な説明
定義
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、ここで簡単に定義され、以下でより詳細に定義される。
「融合タンパク質」とは、例えば、ペプチド結合によって、互いに連結された複数のポリペプチド領域またはドメインを含むタンパク質を指す。したがって、本明細書で使用される「融合された」とは、ペプチド結合を介して互いに連結されたポリペプチド配列を指す。例としては、免疫調節性リガンド／受容体対に融合された抗体または骨格が挙げられる。本明細書に記載される融合タンパク質は、「バリアント」または「構築物」と称されることもある。
「生物学的に機能的なタンパク質」とは、広義には、生物学的機能を有するポリペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体、例えば、二量体Ｆｃを指す。
「リガンド－受容体対」とは、互いに特異的に結合する受容体ポリペプチド及びリガンドポリペプチドを指す。例としては、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０またはＣＤ２８－ＣＤ８０が挙げられる。
「受容体結合断片」とは、リガンド－受容体対の受容体に特異的に結合する任意のポリペプチドを指す。受容体結合断片は、天然に存在するものでも、天然に存在しないものであってもよい。
「免疫調節」分子は、直接的または間接的のいずれかで、免疫応答、例えば、免疫応答の上方制御または下方制御、及び／または免疫細胞活性を調節する能力を有する分子を指す。
「ペプチドリンカー」とは、他のペプチドまたはポリペプチドを接続または連結するペプチドを指す。
「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ」及び「Ｆｃドメイン」という用語は、本明細書において互換的に使用され、少なくとも定常領域の一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。
「二重特異性」とは、２つの異なるエピトープに特異的に結合することができる生物学的に機能的なタンパク質を指す。
「多重特異性」とは、２つ以上の異なる標的分子またはエピトープに特異的に結合することができる生物学的に機能的なタンパク質を指す。
「マスクされた」とは、ポリペプチドドメイン、例えば、抗体の抗原結合ドメインが標的配列への結合を立体的に阻害されていること、またはリガンドがその同族結合パートナー、例えば、その受容体への結合を立体的に阻害されていることを指す。
「プロテアーゼ活性化された」または「プロテアーゼ切断された」または「切断された」とは、プロテアーゼ切断部位を含む融合タンパク質であって、プロテアーゼによって切断された後の融合タンパク質を指す。
「プロテアーゼ切断部位」とは、融合タンパク質内のアミノ酸配列のうち、プロテアーゼ認識配列を含有し、プロテアーゼによって切断される部位を指す。
「免疫チェックポイント」とは、免疫系の活性化を制御する免疫系の制御経路を指す。
「特異的に結合する」（及びその文法上の変形）は、特定の抗原、エピトープ、リガンドまたは受容体の結合に関する場合、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。
以下に詳述されるように、「哺乳動物」には、ヒトと非ヒトの両方が含まれ、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明記されない限り、複数の指示物を含むことに留意すべきである。
本出願で使用される略語には以下が含まれる：ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）；ＰＤＬ－１（プログラム死リガンド１）；ＣＤ３（分化抗原群３）；ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４または分化抗原群１５２）；ＣＤ８０（分化抗原群８０）；ＣＤ２８（分化抗原群２８）；ＣＤ８６（分化抗原群８６）；ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激因子）；ＩＣＯＳＬ（誘導性Ｔ細胞共刺激因子リガンド）；ＣＤ４７（分化抗原群４７）；ＳＩＲＰＡ（シグナル制御タンパク質アルファ）、ＨＨＬＡ２（ヒト内在性レトロウイルスＨの長い末端反復関連２）、ＮＫｐ３０（ナチュラルキラー細胞受容体３）、ＮＣＲ３ＬＧ１（ナチュラルキラー細胞傷害受容体３リガンド１）、ＨＨＬＡ２（ＨＥＲＶ－Ｈ ＬＴＲ関連２）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子）ＶＴＣＮ１（Ｖ－セットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害因子１）、ＣＤ２７６（分化抗原群２７６）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、組織因子（ＴＦ）、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、及びカドヘリン３（ＣＤＨ３）。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の値からおよそ±１０％の変動を指す。そのような変動は常に、それが具体的に言及されているか否かにかかわらず、本明細書で提供される任意の所与の値に含まれることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する」という用語及びその文法的変化形は、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素及び／または方法工程を排除しない。組成物、使用または方法に関連して本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、追加の要素及び／または方法工程が存在する場合があるが、これらの追加は、列挙される組成物、方法または使用が機能する様式に実質的に影響を及ぼさないことを示す。組成物、使用または方法に関連して本明細書で使用される場合、「からなる」という用語は、追加の要素及び／または方法工程の存在を除外する。ある特定の要素及び／または工程を含むものとして本明細書に記載される組成物、使用または方法はまた、ある特定の実施形態では、それらの要素及び／または工程から本質的になる場合もあり、他の実施形態では、それらの要素及び／または工程からなる場合もあり、これらの実施形態が特に参照されるか否かを問わない。
本明細書で論述される任意の実施形態は、本明細書に開示される任意の方法、使用または組成物に関して実行され得ることが企図され、逆もまた同様である。
一実施形態における特徴の積極的な列挙が、別の実施形態では特徴を除外するための基礎として機能することも理解されるべきである。特に、所与の実施形態または特許請求の範囲について選択肢の一覧が提示される場合、１つ以上の選択肢が一覧から削除される場合があり、短縮された一覧が、代替的な実施形態を形成する場合があると理解されるべきであり、そのような代替的な実施形態が特に参照されるか否かを問わない。
本明細書で言及される様々なアミノ酸配列及びクローン配列は、表ＡＡに記載される。
融合タンパク質
リガンド－受容体対に融合された生物学的に機能的なタンパク質、例えば、抗体またはポリペプチド骨格を含む融合タンパク質が本明細書で開示される。本開示による融合タンパク質において、生物学的に機能的なタンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、リガンドは、ポリペプチドの一方の末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、他方のポリペプチドの各々同様の末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されている。いくつかの実施形態では、第１及び第２のペプチドリンカーの少なくとも１つは、標的細胞環境、例えば、腫瘍微小環境で自然に生じるプロテアーゼの切断部位を含む。本明細書で開示される融合タンパク質を使用する方法も開示される。
本開示による融合タンパク質は、標的係合に関連する任意のオンターゲット／オフ組織（例えば、オフ腫瘍）作用（すなわち、毒性）を減少させるためにマスクされる。標的細胞環境において、プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカー（複数可）が切断されると、融合タンパク質がマスク解除される。ある特定の実施形態では、本開示による融合タンパク質は、リガンド－受容体対に融合されたポリペプチド骨格を含む。この文脈において、融合タンパク質は、リガンド－受容体対のリガンド及び受容体のそれぞれが互いの会合を通じてネイティブな同族受容体またはリガンドとの係合を阻害している点でマスクされている。標的細胞環境において、プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカー（複数可）が切断されると、リガンド－受容体対の一方のメンバーが融合タンパク質から放出されることによって融合タンパク質のマスクが解除され、それにより、リガンド－受容体対の他方のメンバーがその同族パートナーに結合することが可能となる。よって、ある特定の実施形態では、本開示は、プログラムされたチェックポイントまたは共刺激性受容体ターゲティングのための生物学的設計を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示による融合タンパク質は、リガンド－受容体対に融合された抗原結合ドメインを含む抗体または抗原結合抗体断片を含む。この文脈において、融合タンパク質は、リガンド－受容体対が、抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害しているという点でマスクされている。融合タンパク質は、さらに、リガンド－受容体対のリガンド及び受容体のそれぞれが互いの会合を通じてネイティブな同族受容体またはリガンドとの係合を阻害している点でマスクされている。標的細胞環境において、プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカー（複数可）が切断されると、リガンド－受容体対の一方のメンバーが融合タンパク質から放出されることによって融合タンパク質のマスクが解除され、それにより、リガンド－受容体対の他方のメンバーがその同族パートナーに結合することと、抗原結合ドメインがその同族抗原に結合することとの両方が可能となる。よって、ある特定の実施形態では、本開示は、プログラムされた標的抗原係合及び同時チェックポイントまたは共刺激性受容体ターゲティングのための多機能性生物学的設計を提供する。ある特定の態様では、本明細書に記載される融合タンパク質の設計は、標的媒介性薬物素因を減少させる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、マスクされた抗原結合ドメイン、例えば、生物学的に機能的なタンパク質、及びマスクされた免疫調節性標的結合ドメイン、例えば、リガンド－受容体対を提供し、一方の結合機能性のプログラムされた活性化が他方の結合機能性の活性化をさらにもたらすことから、それにより、二機能性分子が得られる。よって、ある特定の実施形態では、本開示は、特定の標的組織環境における抗原結合ドメインのマスキング及び条件付き活性化、ならびに有害な毒性作用を減少させる免疫調節性標的のターゲティング及び活性化の方法を提供する。
リガンド－受容体対
リガンド－受容体対をそれぞれ含む融合タンパク質が本明細書に記載される。ある特定の態様では、リガンド受容体対は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に属するリガンド－受容体ドメインの免疫調節性対である（Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｋａｎｎａｎ；Ｍａｇｅ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇ；ａｎｄ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄａｖｉｄ Ｈ（Ａｐｒｉｌ ２０１５）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｉｎ：ｅＬＳ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ：Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ．，Ａ Ｆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ １，Ａ Ｎ Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８）Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ－－Ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：３８１－４０５）。
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のコアフォールディングに基づいて、タンパク質によく見られるドメインに分類される。このＩｇフォールディングは、３本のストランド及び４本のストランドの２つのベータシートに配置された合計で７本の逆平行ベータストランドから構成されるベータサンドイッチからなる（図３４Ａ）。２つのベータサンドイッチは、ストランドＢとストランドＦとの間にあるジスルフィド架橋を介して内部接続されている。Ｉｇフォールディングに共通して認識される構造モチーフは、「グリークキー」モチーフである。ＩｇＳＦの一般的なサブグループは、ＩｇＶ、ＩｇＣ１及びＩｇＣ２ドメインである。各メンバーは、共通の構造的特徴及びベータストランドの配置に基づいて識別される。ＩｇＣドメインは、３本のストランド及び４本のストランドの２つのシートに配置された７本のベータストランドを含み（図３４Ｂ）、一方、ＩｇＶドメインは、４本のストランド及び５本のストランドの２つのシートに配置された９本のベータストランド（図３４Ｃ、Ｄ）を含む。ＩｇＣ１及びＩｇＣ２は、ストランドの構造的配置が異なる。ＩｇＳＦドメインは、抗原受容体、免疫グロブリン及び免疫調節性受容体を含む、多種多様な生物学的に重要なタンパク質に存在し得る。コアベータサンドイッチの表面露出残基及びベータストランドを接続するループは、抗原認識、三次／四次アセンブリの他の構造的ドメインまたは受容体／リガンド対のための相互作用界面として機能することができる。免疫グロブリンの抗原認識部位（ＩｇＧ１などの抗体におけるＶＨ－ＶＬ対）は、２つのＩｇＶドメインの二量体を含むので、ＩｇＳＦまたはＩｇＶドメインのいずれかの二量体は、抗体のＮ末端に共有結合すれば、その抗原認識部位に立体マスクを形成する構造的な互換性がある（図２１）。
ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、免疫調節性であり、例えば、免疫チェックポイントであり、免疫細胞エフェクター機能調節、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の調節をもたらし、抗原提示細胞とエフェクター細胞との間の相互作用を調節し、またはこれらの組み合わせを行う。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＩｇＳＦ受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含む。受容体結合断片とは、リガンド－受容体対の受容体に特異的に結合する任意のポリペプチドを指し、天然に存在するものでも、天然に存在しないものであってもよい。「天然に存在する」とは、本明細書で使用される場合、また物体に適用される場合、物体が自然界に見られるという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離することができ、実験室で人為的に改変されていない、生物に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、免疫グロブリンドメインスーパーファミリーに属する２つの相互作用タンパク質ドメインであり得る。「天然に存在しない」とは、本明細書で使用される場合、天然に存在するタンパク質の変異体など、ＩｇＳＦと構造的に類似している操作されたポリペプチド配列を指す。
ある特定の実施形態では、本明細書における開示は、ＩｇＳＦに属するリガンド－受容体ドメインの免疫調節性対を抗体または抗体断片のマスクとして使用し、標的抗原結合を阻害することに関する。免疫グロブリンスーパーファミリーに属するリガンド－受容体ドメインの免疫調節性対の例としては、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーの対（例えば、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＰＤ１－ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８６、ＰＤＬ１－ＣＤ８０、ならびにＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ、ＮＣＲ３ＬＧ１－ＮＫｐ３０、ＨＨＬＡ２－ＣＤ２８Ｈ及びＣＤ４７－ＳＩＲＰαが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ８０（Ｂ７－１としても知られている）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＰＤＬ１（Ｂ７－Ｈ１）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２）、ＰＤＬ２（Ｂ７－ＤＣ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＶＴＣＮ１（Ｂ７－Ｈ４）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＮＣＲ３ＬＧ１（Ｂ７－Ｈ６）、ＨＨＬＡ２（Ｂ７－Ｈ７）は、Ｂ７ファミリーに属する。タンパク質のＢ７ファミリーは、典型的にはリガンドとみなされ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８Ｈ、ＮＫｐ３０、ＰＤ１及びＩＣＯＳを含むＣＤ２８ファミリーのメンバーと対合する。（Ｓ．Ｍ．Ｗｅｓｔ ａｎｄ Ｘ．Ａ．Ｄｅｎｇ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ Ｂ７－ＣＤ２８ ａｓ ａ ｆａｍｉｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）２０１９；２４４（１７）：１５７７－１５８３；ｄｏｉ：１０．１１７７／１５３５３７０２１９８５５９７０）。
ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、ＩｇＳＦ Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバーを含む。ある特定の実施形態では、リガンド及び受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ポリペプチドの細胞外部分を含む。ある特定の実施形態では、リガンド及び受容体は、ＩｇＳＦ免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ポリペプチドの細胞外部分を含む。ある特定の実施形態では、リガンドはＩｇＳＦ Ｂ７ファミリーのメンバーであり、受容体はＩｇＳＦ ＣＤ２８ファミリーのメンバーである。
ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対は、白血球共刺激性受容体を含む。Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーに属する白血球共刺激性受容体の例としては、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８としても知られている）及びＣＤ２８が挙げられる。共刺激性リガンド－受容体対の例としては、ＣＤ８０：ＣＤ２８、ＣＤ８６：ＣＤ２８及びＩＣＯＳ：ＩＣＯＳＬ（ＩＣＯＳリガンド）が挙げられる。共抑制性リガンド－受容体対の例としては、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＰＤ１－ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８６、ＰＤＬ１－ＣＤ８０及びＣＤ４７－ＳＩＲＰαが挙げられる。それらをＦａｂのＮ末端に連結させると、本明細書に記載される我々の結果は、ＣＤＲへのアクセスをブロックし、抗原への結合をブロックすることを示している（図２１Ａ）。
この大きなＩｇＳＦの他のメンバーも類似の様式で使用することができ、免疫調節機能を担うことができる。図２１Ｂは、既知のＢ７－ＣＤ２８メンバーの既知の構造図を示している。他の対のドメインの大きさ及び配向は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１と極めて類似しており、そのことから、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１受容体－リガンド対と同様に、結合または機能的なブロックに使用することができる。
機能的マスクの概念は、Ｂ７ファミリーのメンバー以外にも及ぶ。例えば、図２１Ｂは、ＩｇＳＦに属するドメインを含む別のリガンド受容体対であるＳＩＲＰα／ＣＤ４７の構造図を示しており、ＦａｂのＮ末端に位置し、結合をブロックするのに良好な空間適合性を示している。多数の候補治療薬が、この方向におけるアンタゴニストの使用によりがん細胞の食作用を増加させることを評価しており、機能性マスクの良好な候補となっている（Ｍｕｒａｔａ Ｙ，Ｓａｉｔｏ Ｙ，Ｋｏｔａｎｉ Ｔ，Ｍａｔｏｚａｋｉ Ｔ．（２０１８）ＣＤ４７－ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２０１８ Ａｕｇ；１０９（８）：２３４９－２３５７）。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質のリガンド－受容体対のリガンド－受容体ドメインの親和性は、野生型リガンド及び受容体と比較して変化している。ある特定の実施形態では、マスキング対のリガンド－受容体ドメインの一方または両方は、リガンド及び受容体が野生型リガンドまたは受容体とは異なる配列を含むように操作される。ある特定の実施形態では、リガンドは、リガンドのその同族受容体に対する結合親和性を増加させる１つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態では、野生型リガンドと比較したリガンド－受容体対のリガンドの相対結合親和性は、野生型リガンドのその天然に存在する同族受容体に対する結合親和性よりも１、１．５、２、２．５３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００、５０，０００または１００，０００倍を超えて大きい。
ある特定の実施形態では、受容体は、受容体のその同族リガンドに対する結合親和性を増加させる１つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態では、野生型受容体と比較したリガンド－受容体対の受容体の相対結合親和性は、野生型受容体のその天然に存在する同族リガンドに対する結合親和性よりも１、１．５、２、２．５、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００、または１００，０００倍を超えて大きい。
ある特定の実施形態では、リガンドは、リガンドのその同族受容体に対する結合親和性を減少させる１つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態では、野生型リガンドと比較したリガンド－受容体対のリガンドの相対結合親和性は、野生型リガンドのその天然に存在する同族受容体に対する結合親和性よりも１、１．５、２、２．５、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００、５０，０００または１００，０００倍を超えて小さい。
ある特定の実施形態では、受容体は、受容体のその同族リガンドに対する結合親和性を減少させる１つ以上の変異を含む。ある特定の実施形態では、野生型受容体と比較したリガンド－受容体対の受容体の相対結合親和性は、野生型受容体のその天然に存在する同族リガンドに対する結合親和性よりも１、１．５、２、２．５、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００、または１００，０００倍を超えて小さい。
リガンド－受容体対は、例えば、ＰＤ－Ｌ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ９ＮＺＱ７、３３－１４６）及びＰＤ－１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ１５１１６、１８－１３２）のＩｇＶドメインであり得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＰＤ－Ｌ１であり、例えば、配列番号８または配列番号１０に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、配列番号８と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、配列番号８と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、配列番号８と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。任意のＰＤ－Ｌ１バリアント、例えば、当該技術分野において知られている高親和性バリアント、例えば、Ｚ．Ｌａｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＰＤ－Ｌ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ；Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８，８８３６０－８８３７５（２０１７）またはＷＯ２０１８／１７００２１Ａ１に提供されているものを使用することができる。ある特定の実施形態では、受容体は、高親和性ＰＤ－Ｌ１バリアントである。いくつかの実施形態では、受容体は、配列番号１０に対応するアミノ酸配列または配列番号１０と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する高親和性ＰＤ－Ｌ１バリアントである。
いくつかの実施形態では、受容体は、ＰＤ－１であり、例えば、配列番号７または配列番号１１に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１は、配列番号７または配列番号１１と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１は、配列番号７または配列番号１１と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１は、配列番号７または配列番号１１と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。任意のＰＤ－１バリアント、例えば、当該技術分野において知られている高親和性バリアント、例えば、Ｒ．Ｌ．Ｍａｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＰＤ－１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏ－ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２，Ｅ６５０６－６５１４（２０１５）、ＷＯ２０１６／０２２９９４Ａ２または Ｅ．Ｌａｚａｒ－Ｍｏｌｎａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ－１：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ＥＢＩＯＭｅｄｉｃｉｎｅ １７．３０－４４（２０１７）及びＷＯ２０１９／２４１７５８Ａ１に記載されているものを使用することができる。
ある特定の実施形態では、受容体は、高親和性ＰＤ－１バリアントである。いくつかの実施形態では、受容体は、配列番号９に対応するアミノ酸配列または配列番号９と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する高親和性ＰＤ－１バリアントである。
ある特定のいくつかの実施形態では、リガンドは、ＣＤ８０であり、例えば、配列番号２５に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８０は、配列番号２５と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８０は、配列番号２５と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８０は、配列番号２５と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０は、配列番号１８５、配列番号１８７または配列番号１８９と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８０は、配列番号１８５、配列番号１８７または配列番号１８９と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８０は、その受容体に対する親和性を増加させる、または調製中にホモ二量体を形成する傾向を減少させる変異を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８０は、配列番号２５に対応するアミノ酸配列を有し、次の変異セット：（ａ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ及びＤ９０Ｇ；（ｂ）Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｎ４８Ｋ、Ｉ６１Ｓ、Ｋ８９Ｎ；（ｃ）Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｄ９０Ｇ，Ｋ９３Ｅ；または（ｄ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｄ９０Ｇのうちの１つを含む。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＰＤ－Ｌ２であり、例えば、配列番号２５０に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２は、配列番号２５０と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２は、配列番号２５０と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ２は、配列番号２５０と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＣＤ８６であり、例えば、配列番号２４８に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８６は、配列番号２４８と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８６は、配列番号２４８と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ８６は、配列番号２４８と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＩＣＯＳＬであり、例えば、配列番号２５６に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＣＯＳＬは、配列番号２５６と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＣＯＳＬは、配列番号２５６と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＣＯＳＬは、配列番号２５６と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＣＤ２７６であり、例えば、配列番号２５８に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２７６は、配列番号２５８と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２７６は、配列番号２５８と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２７６は、配列番号２５８と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＶＴＣＮ１であり、例えば、配列番号２５９に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＶＴＣＮ１は、配列番号２５９と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＶＴＣＮ１は、配列番号２５９と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＶＴＣＮ１は、配列番号２５９と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＶＩＳＴＡであり、例えば、配列番号２６０に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡは、配列番号２６０と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡは、配列番号２６０と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡは、配列番号２６０と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＨＨＬＡ２であり、例えば、配列番号２６２に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＨＬＡ２は、配列番号２６２と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＨＬＡ２は、配列番号２６２と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＨＨＬＡ２は、配列番号２６２と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドは、ＳＩＲＰαであり、例えば、配列番号２５５に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰαは、配列番号２５５と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰαは、配列番号２５５と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰαは、配列番号２５５と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、受容体は、ＣＴＬＡ４であり、例えば、配列番号２６に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４は、配列番号２６と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４は、配列番号２６と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４は、配列番号２６と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、受容体は、ＣＤ２８であり、例えば、配列番号２５３に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８は、配列番号２５３と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８は、配列番号２５３と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８は、配列番号２５３と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、受容体は、ＣＤ２８Ｈであり、例えば、配列番号２６３に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８Ｈは、配列番号２６３と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８Ｈは、配列番号２６３と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８Ｈは、配列番号２６３と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、受容体は、ＮＫｐ３０であり、例えば、配列番号２６４に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＮＫｐ３０は、配列番号２６４と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＮＫｐ３０は、配列番号２６４と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＮＫｐ３０は、配列番号２６４と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、受容体は、ＩＣＯＳであり、例えば、配列番号２５７に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＣＯＳは、配列番号２５７と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＣＯＳは、配列番号２５７と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＩＣＯＳは、配列番号２５７と約９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、ＩｇＳＦリガンド及び／または受容体は、免疫グロブリン可変ドメイン（ＩｇＶ）様構造を有する。本明細書に記載されるいくつかの例示的な天然に存在するＩｇＶドメイン受容体及びリガンドのアミノ酸配列は、表ＣＣに示される。
ある特定の実施形態では、天然に存在しないが対合する操作されたリガンド－受容体対のリガンド及び／または受容体は、天然に存在する免疫調節性受容体に対して親和性を有するドメインのうちの少なくとも１つを含む免疫グロブリンドメインを含む。
ある特定の実施形態では、免疫調節性リガンド－受容体対は、それらの同族標的対のアンタゴニストまたはアゴニストとして機能するように選択される。ある特定の実施形態では、免疫調節性リガンド－受容体対は、腫瘍環境において、それらの同族標的対のアンタゴニストまたはアゴニストとして機能するように選択される。ある特定の実施形態では、リガンド－受容体対のリガンドまたは受容体の一方または両方は、プロテアーゼ切断による活性化後に機能的役割を果たすように設計される。
融合タンパク質フォーマット
本明細書に記載される融合タンパク質は、多くの異なるフォーマットであり得る。融合タンパク質は、少なくともリガンド受容体対を含むモジュール構造を有すると考えることができ、リガンド及び受容体のそれぞれは、生物学的に機能的なタンパク質にペプチドリンカーを介して融合されている。次いで、生物学的に機能的なタンパク質は、少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含む。例えば、リガンド－受容体対のリガンドまたは受容体のＮ末端またはＣ末端のいずれかは、生物学的に機能的なタンパク質の第１及び第２のポリペプチドに、例えば、ペプチドリンカーを介して融合され得る。リガンドは、第１のポリペプチドに融合されており、受容体は、第２のポリペプチドの各々同様の末端に融合されている。「各々同様の末端」という用語は、リガンド－受容体対がポリペプチドに融合されていることを記述する場合、リガンド及び受容体が第１及び第２のポリペプチドのＮ末端または第１及び第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかにそれぞれ融合されていることを指す。よって、ある特定の実施形態では、リガンドは、第１のポリペプチドのＮ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のポリペプチドのＮ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されている。ある特定の実施形態では、リガンドは、第１のポリペプチドのＣ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のポリペプチドのＣ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されている。リガンド及び受容体は、それらのＣ末端またはそれらのＮ末端を介して融合され得る。リガンド及び受容体の両方は、そのＮ末端もしくはＣ末端を介して融合され得るか、またはリガンドもしくは受容体の一方は、そのＮ末端を介して融合され得、リガンドもしくは受容体の他方は、そのＣ末端を介して融合されている。
ある特定の実施形態では、リガンドのＮ末端は、第１のポリペプチドのＮ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体のＮ末端は、第２のポリペプチドのＮ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されている。ある特定の実施形態では、リガンドのＣ末端は、第１のポリペプチドのＣ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体のＣ末端は、第２のポリペプチドに第２のペプチドリンカーを介して融合されている。
ある特定の実施形態では、リガンドは、生物学的に機能的なタンパク質の第１のポリペプチドの末端に、プロテアーゼ切断部位を含む第１のペプチドリンカーを介して融合されている。ある特定の実施形態では、受容体は、生物学的に機能的なタンパク質の第２のポリペプチドの末端に、プロテアーゼ切断部位を含む第２のペプチドリンカーを介して融合されている。ある特定の実施形態では、リガンドは、生物学的に機能的なタンパク質の第１のポリペプチドの末端に、プロテアーゼ切断部位を含む第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、生物学的に機能的なタンパク質の第２のポリペプチドの末端に、プロテアーゼ切断部位を含む第２のペプチドリンカーを介して融合されている。第１及び第２のペプチドリンカーの両方がプロテアーゼ切断部位を含む場合、プロテアーゼ切断部位は、同じプロテアーゼによって切断可能であってもよいし、異なるプロテアーゼによって切断可能であってもよい。
ある特定の実施形態では、リガンドは、生物学的に機能的なタンパク質の第１のポリペプチドの末端に、プロテアーゼ切断部位を含む第１のペプチドリンカーを介して融合されており、リガンドは、第１のペプチドリンカーの切断部位と同じであっても異なっていてもよい内部プロテアーゼ切断部位を含むように操作される。ある特定の実施形態では、受容体は、生物学的に機能的なタンパク質の第２のポリペプチドの末端に、プロテアーゼ切断部位を含む第２のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のペプチドリンカーの切断部位と同じであっても異なっていてもよい内部プロテアーゼ切断部位を含むように操作される。ペプチドリンカーと、リンカーによって生物学的に機能的なタンパク質に接続されているリガンド－受容体対のメンバーの両方にプロテアーゼ切断部位を含めることにより、標的細胞環境において、リガンド－受容体対の当該メンバーの切断及び不活性化が可能となり、生物学的に活性なタンパク質に融合したままのリガンド－受容体対のメンバーのマスクが解除される（すなわち、条件付き活性化）。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、別の治療部分及び／または診断部分、例えば、化学療法剤、または放射性同位体にコンジュゲートされている。
生物学的に機能的なタンパク質
生物学的に機能的なタンパク質は、骨格として機能し、及び／または結合ドメインを含むことができる。ポリペプチド骨格の例としては、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、アルブミン類似体及び誘導体、毒素、サイトカイン、ケモカイン、成長因子ならびにロイシンジッパードメインなどのタンパク質対が挙げられる。ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、標識、薬物、またはこれらの組み合わせを含む。本明細書に記載される融合タンパク質の検出に好適である、当該技術分野において既知の任意の標識を使用することができる。生物学的に機能的なタンパク質は、タンパク質にコンジュゲーションすることができ、所望の生物学的結果を達成する、当該技術分野において知られている任意の薬物、毒素または化学物質を含み得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の生物学的に機能的なタンパク質は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。結合ドメインは、例えば、免疫グロブリンベースの結合ドメインもしくは非免疫グロブリンベースの抗体模倣体、またはそれらの標的に特異的に結合することが可能な他のポリペプチドもしくは低分子、例えば、天然もしくは人工のリガンドであり得る。非免疫グロブリンベースの抗体模倣体フォーマットには、例えば、アンチカリン、フィノマー、アフィマー、アルファボディ、ＤＡＲＰｉｎ、及びアビマーが含まれる。
本明細書に記載される融合タンパク質は、生物学的に機能的なタンパク質を含む。生物学的に機能的なタンパク質の例としては、抗体、例えば、抗原結合ドメイン及びポリペプチド骨格、例えば、二量体Ｆｃを含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。よって、ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質の第１及び第２のポリペプチドは、抗体の可変ドメイン及び／または定常ドメイン、または抗原結合機能もしくは骨格機能を融合タンパク質に付与する他のドメインを含むポリペプチドである。
抗体
ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、抗体、すなわち、免疫グロブリンである。本開示による抗体は、抗体断片を含む、本明細書に記載される様々なフォーマットを取り得る。よって、ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、抗体断片である。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、１つもしくは複数の免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の改変型によってコードされているポリペプチドであって、抗原に特異的に結合するポリペプチドを指すために本明細書互換的に使用される。
特異的結合は、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を採用）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｌｙｃｏ Ｊ，１７：３２３－３２９）、または従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，２００２，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ，２８：２１７－２２９）により測定することができる。ある特定の実施形態では、特異的結合は、無関係のタンパク質への結合の程度が、例えば、ＳＰＲによって測定した場合、標的抗原への結合の約１０％未満であることとして定義される。ある特定の実施形態では、特定の抗原またはエピトープに対する抗体または抗体断片の特異的結合は、≦１μΜ、例えば、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭの解離定数（ＫＤ）によって定義される。ある特定の実施形態では、特定の抗原またはエピトープに対する抗体または抗体断片の特異的結合は、１０－６Ｍ未満、例えば、１０－７Ｍ未満、または１０－８Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）によって定義される。いくつかの実施形態では、特定の抗原またはエピトープに対する抗体または抗体断片の特異的結合は、１０－６Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－７Ｍ～１０－１３Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、または１０－９Ｍ～１０－１３Ｍの解離定数（ＫＤ）によって定義される。
従来の免疫グロブリン構造単位は、典型的には、２対のポリペプチド鎖で構成され、それぞれの対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が持つ定常ドメインの種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）と呼ばれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンに基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４免疫グロブリンに基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ１免疫グロブリンに基づく。本開示の文脈において、抗体が特定の免疫グロブリンアイソタイプに基づく場合、その抗体は、特定の免疫グロブリンアイソタイプの定常領域のすべてまたは一部を含むことを意味する。抗体はまた、いくつかの実施形態では、アイソタイプ及び／またはサブクラスのハイブリッドを含み得ることが理解される。
免疫グロブリンの各ポリペプチド鎖のＮ末端ドメインは、抗原認識に主に関与する約１００～１１０アミノ酸長以上の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、軽鎖及び重鎖のそれぞれにあるこれらのドメインを指す。
したがって、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖内に異なるドメインを含むことが理解され得る。そのようなドメインは、重複し得、Ｆｃドメイン（またはＦｃ領域）、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＦｃまたはＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み得る。「Ｆｃドメイン」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと、任意で、ヒンジドメイン（またはヒンジ領域）とを含む。
免疫グロブリンのＶＨドメイン及びＶＬドメインのそれぞれには、配列が超可変であり、抗原結合部位を形成する、３つのループがある。これらのループのそれぞれは、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と呼ばれる。超可変領域（ＨＶＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ）という用語は、抗原結合ドメインを形成する可変領域の部分に関して、本明細書で互換的に使用される。ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＶＨ及びＶＬドメインは、約１５～３０アミノ酸長の複数のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、比較的不変のストレッチからなり、ＦＲは、より短いＣＤＲで隔てられ、ＣＤＲのそれぞれは、典型的には約５～１５アミノ酸長であるが、場合によってはそれより長いことも短いこともあり得る。ＶＨドメイン及びＶＬドメインのそれぞれを構成する３つのＣＤＲ及び４つのＦＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かってＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４に配置されている。
ＣＤＲ領域には、多くの異なる定義が一般に使用されており、これらには、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８３，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．３６９－８４７，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９６：９０１－９１７）に記載されているもの、ならびにＩＭＧＴ，ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔ定義が含まれる。これらの異なる定義には、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。例として、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔに従う定義が以下の表１に記載される。したがって、当業者であれば容易に理解できるように、ＣＤＲの正確な付番及び配置は、採用される付番システムによって異なり得る。しかしながら、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）の本明細書における開示は、既知の付番システムのいずれかによって定義される、関連する（固有の）重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）の開示を含むことが理解される。同様に、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）の本明細書における開示は、既知の付番システムのいずれかによって定義される、関連する（固有の）重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）の開示を含む。
（表１）
当業者であれば、限定された数のアミノ酸置換を、抗体がその標的と結合する能力を失うことなく、既知の抗体のＣＤＲ配列またはＶＨ配列もしくはＶＬ配列に導入することができることを理解するであろう。アミノ酸置換の候補は、コンピュータモデリングまたは上述のアラニンスキャニングなどの技術によって同定することができ、得られたバリアントは、標準的な技術によって結合活性について試験される。例えば、ある特定の実施形態では、融合タンパク質に含まれるＥＧＦＲ結合ドメインは、セツキシマブまたはパニツムマブに由来するＣＤＲのセットと９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するＣＤＲのセット（すなわち、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、結合ドメインは、ＥＧＦＲに結合する能力を保持している。ある特定の実施形態では、融合タンパク質に含まれるＥＧＦＲ結合ドメインは、３つのＣＤＲ全体で１～１０個のアミノ酸置換、例えば、ＣＤＲ全体で１～７個のアミノ酸置換、１～５個のアミノ酸置換、１～４個のアミノ酸置換、１～３個のアミノ酸置換、１～２個のアミノ酸置換、または１個のアミノ酸置換を含む、これらのＣＤＲ配列のバリアントを含み（すなわち、ＣＤＲは、修飾されるＣＤＲの任意の組み合わせで、最大１０個のアミノ酸置換を含むことによって修飾され得る）、バリアントは、ＥＧＦＲに結合する能力を保持している。典型的には、そのようなアミノ酸置換は、以下の表４の列１または列２に概説される保存的アミノ酸置換であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ウシ免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリン、ラクダ免疫グロブリン、ラット免疫グロブリンまたはマウス免疫グロブリンなどの哺乳動物の免疫グロブリンに由来する少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、キメラ抗体であり得、２つ以上の免疫グロブリンドメインを含み、少なくとも１つのドメインは、第１の哺乳動物の免疫グロブリン、例えば、ヒト免疫グロブリンに由来し、少なくとも第２のドメインは、第２の哺乳動物の免疫グロブリン、例えば、マウスまたはラット免疫グロブリンに由来する。いくつかの実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、ヒト免疫グロブリンに由来する少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインを含む。
当業者であれば、これらのドメインを様々な様式で組み合わせて、異なるフォーマットの多重特異性抗体を含む、異なるフォーマットを有する抗体を提供することができることを理解するであろう。これらのフォーマットは、一般に、当該技術分野において知られている抗体フォーマットに基づくものである（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎによる概説、２０１７，ＭＡＢＳ，９（２）：１８２－２１２、及びＭｕｌｌｅｒ ＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．（２０１４）を参照されたい）。
本明細書に記載される生物学的に機能的な タンパク質の抗体 は、異なる価数を有し得る。ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、単一の抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、異なる価数及び特異性を有する抗体を含む。本明細書で使用される「二重特異性抗体」は、２つの結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、２つの結合ドメインのそれぞれは、固有の結合特異性を有する。本明細書で使用される「多重特異性抗体」は、２つ以上の結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上の結合ドメインのそれぞれは、固有の結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、２つ以上の結合ドメインのうちの少なくとも２つは、固有の結合特異性を有する。例えば、抗体は、二価で二重特異性であってもよいし、二価で単一の特異性を有してもよい。あるいは、抗体は、三価で二重特異性であり得、すなわち、抗体は、３つの結合ドメインを含む。抗体はまた、二重特異性で四価であり得、すなわち、抗体は、４つの結合ドメインを含む。他の価数も可能である。
抗体が同じ標的分子に結合する２つの結合ドメインを含む場合、結合ドメインは、標的分子上の同じエピトープに結合することができるか、または標的分子上の異なるエピトープに結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、標的分子上の異なるエピトープに結合する２つの結合ドメインを含む。「バイパラトープ」という用語は、同じ標的分子（抗原）上の異なるエピトープに結合する２つの結合ドメインを含む抗体を指すために使用することができる。バイパラトープ抗体は、２つの異なるエピトープを介して単一の抗原分子に結合することができるか、またはそれぞれ異なるエピトープを介して２つの別個の抗原分子に結合することができる。
ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれが第１の標的分子上の異なるエピトープに結合する第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインと、第２の標的分子に結合する第３の結合ドメインとを含むという点で、バイパラトープであり、二重特異性である。あるいは、二重特異性バイパラトープ抗体は、それぞれが第１の標的分子上の異なるエピトープに結合する第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインと、第２の標的分子上の異なるエピトープに結合する第３の結合ドメイン及び第４の結合ドメインとを含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体は、骨格をさらに含み、結合ドメインは、骨格に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」とは、本明細書で使用される場合、記載される構成要素が、そのそれぞれが意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。結合ドメインは、骨格に直接または間接的に連結することができる。間接的に連結されるとは、所与の結合ドメインが別の構成要素、例えば、リンカーまたは他の結合ドメインのうちの１つを介して骨格に連結されることを意味する。骨格を含む融合タンパク質の様々なフォーマットについては、以下でより詳細に記載される。
抗原結合ドメインフォーマット
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などの抗体断片である少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する抗体を含む。
「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ断片」は、ＣＤＲを含む軽鎖及び重鎖それぞれの可変ドメインＶＬ及びＶＨとともに、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’またはＦａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端にヒンジ領域由来の１つ以上のシステイン残基を含む数個のアミノ酸残基が付加されている点で、Ｆａｂ断片とは異なる。
Ｆａｂ断片は、２つの個別のポリペプチド鎖（軽鎖及び重鎖）を含み得るか、または一本鎖Ｆａｂであり得る。一本鎖Ｆａｂは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって接続され、一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子である。典型的には、一本鎖のＦａｂ分子で、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端に接続されているが、他のフォーマットも可能である。
「ｓｃＦｖ」は、一本のポリペプチド鎖で、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ｓｃＦｖは、任意で、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含むことができ、これは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを補助することができる。ｓｃＦｖは、ＶＬがリンカーによってそのＣ末端からＶＨのＮ末端に接続されたもの、すなわち、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得、あるいは、ｓｃＦｖは、ＶＨがリンカーによってそのＣ末端を介してＶＬのＮ末端に接続されたもの、すなわち、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。
「ｓｄＡｂ」という用語は、単一免疫グロブリンドメインを指す。ｓｄＡｂは、例えば、ラクダ由来のものであり得る。ラクダ抗体は、軽鎖を持たず、抗原結合部位は、「ＶＨＨ」と呼ばれる単一ドメインからなる。ｓｄＡｂは、抗原結合部位：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を形成する３つのＣＤＲ／超可変ループを含む。ｓｄＡｂは、かなり安定であり、例えば、抗体のＦｃ鎖を含む融合体として発現が容易である（例えば、Ｈａｒｍｓｅｎ ＆ Ｄｅ Ｈａａｒｄ，２００７，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３－２２を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、抗体に含まれる結合ドメインのうちの１つ以上は、標的受容体に対する天然もしくは人工リガンド、またはそのようなリガンドの機能性断片、すなわち、標的受容体に特異的に結合することが可能な断片であり得る。
抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｄＡｂの個々の組み合わせの形態であってもよい。観賞者例えば、結合ドメインがｓｃＦｖの形態である場合、タンデムｓｃＦｖ（（ｓｃＦｖ）２またはｔａＦｖ）またはトリプルボディ（３つのｓｃＦｖ）などのフォーマットを構築することができ、この場合、ｓｃＦｖはともにフレキシブルリンカーによって連結されている。ｓｃＦｖはまた、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ（タンデムダイアボディまたはＴａｎｄＡｂ）フォーマットを構築するために使用することができ、これらは、短いリンカーで接続された２、３及び４つのｓｃＦｖをそれぞれ含む。リンカーの長さが制限されていることから（通常約５アミノ酸長）、ｓｃＦｖは、頭部から尾部へ二量体化する。前述のフォーマットのいずれにおいても、ｓｃＦｖは、ドメイン間ジスルフィド結合を含めることによって、さらに安定化し得る。例えば、各鎖中に追加のシステイン残基を導入することにより（例えば、ＶＨの位置４４及びＶＬの位置１００）、ＶＬとＶＨとの間にジスルフィド結合を導入することができ（例えば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：１２２１－１２２５を参照されたい）、あるいは、２つのＶＨの間にジスルフィド結合を導入して、ＤＡＲＴフォーマットを有する抗原結合ドメインを提供することができる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９９：４３６－４４９を参照されたい）。
同様に、好適なリンカーにより互いに接続されたＶＨまたはＶＨＨなどの２つ以上のｓｄＡｂを含むフォーマットも生物学的に機能的なタンパク質に使用することができる。骨格を欠く抗体フォーマットの他の例としては、Ｆａｂ断片に基づくもの、例えば、Ｆａｂ２、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ’）３フォーマットが挙げられ、この場合、Ｆａｂ断片は、リンカーまたはＩｇＧヒンジ領域により接続されている。
また、異なる形態の抗原結合ドメインの組み合わせを採用して、代替フォーマットを生成することができる。例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂをＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖のいずれかまたは両方のＣ末端に融合させることで、二価の（Ｆａｂ－ｓｃＦｖ）もしくは（Ｆａｂ－ｓｄＡｂ）または三価の（Ｆａｂ－（ｓｃＦｖ）２もしくはＦａｂ－（ｓｄＡｂ）２）をもたらすことができる。同様に、１つまたは２つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂをＦ（ａｂ’）断片のヒンジ領域に融合させて、三価または四価のＦ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ／ｓｄＡｂを得ることができる。結合ドメインは、上記の形態（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／またはｓｄＡｂ、またはリガンドベースの結合ドメイン）のうちの１つまたは組み合わせであり得る。
ある特定の具体的な実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、免疫細胞抗原、例えば、ＣＤ３、及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、ＨＥＲ２に結合する二重特異性抗体を含む。ある特定のより具体的な実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、Ｆａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、Ｆａｂは、免疫細胞抗原に結合し、ｓｃＦｖは、ＴＡＡに結合する。ある特定のより具体的な実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、Ｆａｂ－ｓｃＦｖフォーマットの二重特異性抗体を含み、Ｆａｂは、ＣＤ３に結合し、ｓｃＦｖは、ＨＥＲ２に結合する。いくつかの実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、Ｆａｂ－Ｆａｂフォーマットの二重特異性抗体を含み、一方のＦａｂは、ＣＤ３に結合し、他方のＦａｂは、ＨＥＲ２に結合する。
ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、ヘテロ二量体Ｆｃに作動可能に連結された２つ以上の抗原結合ドメインを含む。この文脈において、生物学的に機能的なタンパク質は、二価、三価または四価であり得る。フォーマットの非限定的な例は、以下に記載される。他の構造は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６７：９５－１０６を参照されたい）。
ヘテロ二量体Ｆｃに作動可能に連結された２つの結合ドメインを含む生物学的に機能的なタンパク質、すなわち、二価抗体の例示的な構造には以下が含まれるが、これらに限定されない：ａ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第２の結合ドメインが、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂである、ｍＡｂフォーマット；ｂ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂである、ハイブリッドフォーマット；及びｃ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖである、デュアルｓｃＦｖフォーマット。
他の例としては、第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂまたはｓｃＦｖである一方の結合ドメイン（第１または第２のいずれか）及び第２のＦｃポリペプチドのＣ末端に作動可能に連結されたＦａｂまたはｓｃＦｖである他方の結合ドメインを含む抗体が挙げられる。
ヘテロ二量体Ｆｃに作動可能に連結された３つの結合ドメインを含む多重特異性抗体（すなわち、三価抗体）の例示的な構造には以下が含まれるが、これらに限定されない：
Ａ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第２の結合ドメインが、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり第３の結合ドメインが、一方のＦｃポリペプチドのＣ末端に結合されたＶＨドメイン及び他方のＦｃポリペプチドのＣ末端に結合されたＶＬドメインから構成される、ｍＡｂ－Ｆｖフォーマット；
Ｂ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第２の結合ドメインが、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１または第２のＦｃポリペプチドのいずれかのＣ末端に作動可能に連結されるｓｃＦｖである、ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット；
Ｃ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第２の結合ドメインが、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されるＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１または第２の結合ドメインのいずれかのＮ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖである、ｓｃＦｖ－ｍＡｂフォーマット；
Ｄ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１の結合ドメイン（ｓｃＦｖ）に作動可能に連結されたＦａｂである、セントラルｓｃＦｖフォーマット；
Ｅ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１または第２の結合ドメインのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂである、Ｆａｂハイブリッドフォーマット；
Ｆ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１または第２の結合ドメインのＮ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖである、ｓｃＦｖハイブリッドフォーマット；
Ｇ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１または第２のＦｃポリペプチドのＣ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖである、ハイブリッドｓｃＦｖフォーマット；
Ｈ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１または第２のＦｃポリペプチドのＣ末端に作動可能に連結されたＦａｂである、ハイブリッドＦａｂフォーマット；ならびに
Ｉ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの第１のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第２の結合ドメインが、第２のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されるＦａｂであり、第３の結合ドメインが、第１または第２の結合ドメインのいずれかのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂである、Ｆａｂ－ｍＡｂフォーマット。
ヘテロ二量体Ｆｃに作動可能に連結された４つの結合ドメインを含む多重特異性抗体、すなわち、四価抗体の例示的な構造には以下が含まれるが、これらに限定されない：ｉ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第３の結合ドメインが、ｓｃＦｖの一方に作動可能に連結されたＦａｂであり、第４の結合ドメインが、他方のｓｃＦｖに作動可能に連結されたＦａｂである、セントラルｓｃＦｖ２フォーマット；及びｉｉ）第１の結合ドメインが、ヘテロ二量体Ｆｃの一方のＦｃポリペプチドのＮ末端作動可能に連結されたＦａｂであり、第２の結合ドメインが、他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結されたＦａｂであり、第３の結合ドメインが、Ｆａｂの一方に作動可能に連結されたｓｃＦｖであり、第４の結合ドメインが、他方のＦａｂに作動可能に連結されたｓｃＦｖである、デュアル可変ドメインフォーマット。
本明細書に記載される生物学的に機能的なタンパク質の抗体は、標識、薬物、またはこれらの組み合わせを含むことができる。本明細書に記載される融合タンパク質の検出に好適である、当該技術分野において既知の任意の標識を使用することができる。抗体薬物コンジュゲートは、以下でより詳細に記載される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される生物学的に機能的なタンパク質の抗体の抗原結合ドメインは、同じ細胞上の同じ抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、同じ細胞上の複数の抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、複数の抗原に結合し、少なくとも１つの抗原は、他の抗原とは異なる細胞上にある。ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合ドメイン（複数可）は、腫瘍細胞または免疫細胞に結合する。ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合ドメインは、腫瘍細胞及び免疫細胞に結合する。
キメラ抗体及びヒト化抗体及びバリアント抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種に由来する免疫グロブリンから誘導することができ、例えば、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。「キメラ抗体」とは、典型的には、げっ歯類抗体（通常、マウス抗体）由来の少なくとも１つの可変ドメイン及びヒト抗体由来の少なくとも１つの定常ドメインを含む抗体を指す。「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体に由来する配列を最小限で含有するキメラ抗体の一種である。
キメラ抗体のヒト定常ドメインは、置き換えられる非ヒト定常ドメインと同じアイソタイプである必要はない。キメラ抗体は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－５５、及び米国特許番号 ４，８１６，５６７に考察されている。一般に、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、標的抗原に対して望ましい特異性及び親和性を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである。このヒト化抗体を作製するための技術は、多くの場合、「ＣＤＲグラフト化」と呼ばれる。「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」はいずれも、一般に、複数の種に由来する免疫グロブリン領域またはドメインを組み合わせた抗体を指す。
場合によっては、抗体の性能をさらに改良するために、追加の修飾がなされる。例えば、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基で置き換えるか、またはレシピエント抗体もしくはドナー抗体のいずれにも見られない残基をヒト化抗体に含めてもよい。一般に、ヒト化抗体の可変ドメインは、非ヒト免疫グロブリンに由来する超可変領域のすべてまたは実質的にすべてと、ヒト免疫グロブリン配列に由来するＦＲのすべてまたは実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、例えば、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９及びＰｒｅｓｔａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６により詳細に記載される。
非ヒトＣＤＲをグラフトするのに最適なヒトフレームワークを選択するための数多くのアプローチが当該技術分野において知られている。初期のアプローチは、ＣＤＲを提供する非ヒト抗体との配列の同一性に関係なく、十分に特性化されたヒト抗体の限られたサブセットを使用していた（「固定フレームワーク」アプローチ）。最近のアプローチは、ＣＤＲを提供する非ヒト抗体の可変領域と高いアミノ酸配列同一性を有する可変領域が採用されている（「相同性マッチング」または「ベストフィット」アプローチ）。別のアプローチは、いくつかの異なるヒト抗体に由来する軽鎖または重鎖可変領域内のフレームワーク配列の断片を選択することである。ＣＤＲグラフト化により、場合によっては、グラフトされた分子のその標的抗原に対する親和性が部分的または完全に失われることがある。そのような場合、親和性は、ヒト由来の残基の一部を対応する非ヒト由来の残基に復帰変異させることによって、回復することができる。これらのアプローチによってヒト化抗体を調製するための方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，５３３－５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７（２０）：４５９３－４５９９を参照されたい）。
このような従来のアプローチに代えてまたは加えて、ＣＤＲグラフト化ヒト化抗体の免疫原性をさらに減少させるために、より最近の技術を採用することができる。例えば、体細胞変異（複数可）を有するヒトフレームワークではなく、ヒト生殖細胞系列配列またはコンセンサス配列に基づくフレームワークをアクセプターヒトフレームワークとして採用することができる。非ヒトＣＤＲの潜在的な免疫原性を減少させることを目的とした別の技術は、特異性決定残基（ＳＤＲ）のみをグラフト化することである。このアプローチでは、抗原結合活性に必要な最小限のＣＤＲ残基（「ＳＤＲ」）のみを、ヒト生殖細胞系列のフレームワークにグラフトする。この方法により、ヒト化抗体の「ヒトらしさ」（すなわち、ヒト生殖細胞系列配列との類似性）が向上し、そのため、可変領域の免疫原性のリスクを低減するのに役立つ。これらの技術は、様々な刊行物に記載されている（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ＆ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，２００８，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ，１３：１６１９－１６３３；Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９：１１１９－１１２５；Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：３５－４２；Ｐｅｌａｔ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３８４：１４００－１４０７；Ｔａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６４：１４３２－１４４１；Ｇｏｎｚａｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１：８６３－８７２、及びＫａｓｈｍｉｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６：２５－３４を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、抗体は、ヒト化された抗体配列、例えば、１つ以上のヒト化可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質に含まれる抗原結合ドメインは、親抗体のＣＤＲに１つ以上のアミノ酸置換を含む既知の抗体の置換バリアントである。ある特定の実施形態では、置換バリアントは、親抗体と比べて、ある特定の生物学的特性に変更（例えば、改善）を有する。例えば、置換バリアントは、標的タンパク質に対して増加した親和性を有し得るか、または減少した免疫原性を有し得る。いくつかの実施形態では、置換バリアントは、親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持している。
ＣＤＲホットスポットは、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基である（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７：１７９－１９６を参照されたい）。二次ライブラリーの構築及び再選択による親和性成熟は、記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７８：１－３７，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００１）を参照されたい）。
親和性成熟の方法は、当該技術分野においてよく知られている例えば、様々な技術によって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入することができ、これらの技術には、例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向性変異導入が含まれる。次いで、二次ライブラリーを作製し、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に２、３、４またはそれ以上の残基）をランダム化させるＣＤＲ指向性アプローチを伴う。多くの場合、重鎖または軽鎖のいずれかまたは両方のＣＤＲ３がＣＤＲ指向性アプローチの標的となる。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入法（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５を参照されたい）を使用して、または抗原抗体複合体の結晶構造を使用して抗体と抗原との間の接触点を特定するコンピュータモデリングによって、同定することができる。
ある特定の実施形態では、置換バリアントは、置換が、結合ドメインのその標的抗原に結合する能力を実質的に減少させないという条件で、１つ以上のＣＤＲ内に１つ以上の置換を含む。例えば、置換バリアントは、１つ以上のＣＤＲ内に、結合親和性を実質的に減少させない本明細書に記載される１つ以上の保存的置換を含み得る。いくつかの実施形態では、置換バリアントは、ＣＤＲ内に、抗原接触アミノ酸に関与しない１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、置換バリアントは、各ＣＤＲがいずれも変更されていないか、または１つ、２つもしくは３つを超えないアミノ酸置換を含有するバリアントＶＨ配列またはＶＬ配列を含む。
グリコシル化バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、ネイティブなグリコシル化が変更されたＩｇＧ Ｆｃに基づく生物学的に機能的なタンパク質を含む。当該技術分野で知られているように、Ｆｃのグリコシル化は、エフェクター機能を増加または減少させるように変更することができる。
例えば、位置２９７の保存的アスパラギン残基のアラニン、グルタミン、リシンまたはヒスチジンへの変異（すなわち、Ｎ２９７Ａ、Ｑ、ＫまたはＨ）は、すべてのエフェクター機能を欠く脱グリコシル化Ｆｃをもたらす（Ｂｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：４０３－４１１；Ｔａｏ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：２５９５－２６０１）。
逆に、重鎖Ｎ２９７に連結するオリゴ糖からフコースを除去すると、ＦｃγＲＩＩＩａへの改善された結合により、ＡＤＣＣが向上することが示されている（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７：２６７３３－２６７４０、及びＮｉｗａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０６：１５１－１６０を参照されたい）。そのような低フコース抗体は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を欠くノックアウトチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８７：６１４－６２２）、Ｎ２９７に連結する糖鎖にフコースを結合させる能力を減少されたバリアントＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ１３（国際公開番号ＷＯ０３／０３５８３５）、または脱フコシル化抗体を生成する他の細胞（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２４：２１０－２１５；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，ｉｂｉｄ，及びＳｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：３４６６－３４７３）において産生することができる。炭水化物加えて、国際公開番号ＷＯ２００９／１３５１８１は、抗体産生時にフコース類似体を培養培地に添加して、抗体上の糖鎖へのフコースの組み込みを阻害することを記載している。
Ｆｃグリコシル化部位（Ｎ２９７）上にフコースをほとんどまたは全く含まない抗体を酸性する他の方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ＧｌｙｍａＸ（登録商標）技術（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ）（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０（１２）：１６０７－１６１８及び米国特許番号 ８，４０９，５７２を参照されたい）。
他のグリコシル化バリアントには、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、抗体のＦｃ領域に結合している二分岐型オリゴ糖がＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）によって二分されているバリアントが含まれる。そのようなグリコシル化バリアントは、減少したフコシル化及び／または改善したＡＤＣＣ機能を有する。例えば、国際公開番号ＷＯ２００３／０１１８７８、米国特許番号６，６０２，６８４及び米国特許出願公開番号ＵＳ２００５／０１２３５４６を参照されたい。有用なグリコシル化バリアントにはまた、Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するものが含まれ、これは、改善したＣＤＣ機能を有し得る（例えば、国際公開番号ＷＯ１９９７／０３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４及びＷＯ１９９９／２２７６４を参照されたい）。
ポリペプチド骨格
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の生物学的に機能的なタンパク質は、ポリペプチド骨格であり、これは、例えば、リガンド受容体対のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を安定化または延長するように機能することができる。
ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、二量体Ｆｃ領域からなる。ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質の第１及び第２のポリペプチドは、二量体Ｆｃからなり、第１のポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドからなり、第２のポリペプチドは、第２のＦｃポリペプチドからなり、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、二量体Ｆｃ領域を形成する。ある特定の実施形態では、二量体Ｆｃ領域ｉは、ヘテロ二量体Ｆｃである。ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、本明細書でより詳細に記載される。
ある特定の実施形態では、ポリペプチド骨格は、第１及び第２のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、リガンド受容体対のリガンドは、ペプチドリンカーを介して、第１のポリペプチドに融合されており、受容体は、ペプチドリンカーを介して、第２のポリペプチドの各々同様の末端に融合されている。よって、ある特定の実施形態では、リガンドは、第１のポリペプチドのＮ末端にペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のポリペプチドのＮ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されている。逆に、ある特定の実施形態では、リガンドは、第１のポリペプチドのＣ末端にペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のポリペプチドに第２のペプチドリンカーを介して融合されている。
ある特定のより具体的な実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質は、二量体Ｆｃ領域からなるポリペプチド骨格と、ＰＤＬ－１及びＰＤ－１であるリガンド－受容体対とを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、二量体Ｆｃ領域からなる生物学的に機能的なタンパク質と、ＣＤ８０及びＣＴＬＡ４であるリガンド－受容体対とを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド骨格のＦｃドメインは、配列番号４及び５に対応するアミノ酸配列、ならびに任意で、配列番号６に対応するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチド骨格は、配列番号４及び配列番号５を含むヘテロ二量体Ｆｃからなり、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号４を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号５を含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃからなるポリペプチド骨格は、それぞれ表２及び表３の修飾されたＣＨ３及び／またはＣＨ２ドメインを含む。
Ｆｃドメイン
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、生物学的に機能的なタンパク質、例えば、二量体免疫グロブリンＦｃ領域を含む抗体またはポリペプチド骨格を含む。「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。本明細書で別段特定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されているようにＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番システムに従う。二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃ領域を形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。
Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ２ドメインのいずれかを含み得る。ＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３配列を含み、それぞれが二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドの一方を含む。同様に、ＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２配列を含み、それぞれが二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドの一方を含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ Ｆｃに基づくＦｃを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに基づくＦｃを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、２つの異なるＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体Ｆｃに基づくＦｃを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＩｇＧ Ｆｃに基づくＦｃを含み、ＣＨ３ドメインは、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＩｇＧ Ｆｃに基づくＦｃを含み、ＣＨ２ドメインは、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＩｇＧ Ｆｃに基づくＦｃを含み、ＣＨ３ドメインは、１つ以上のアミノ酸修飾を含み、ＣＨ２ドメインは、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。
修飾されたＦｃ ＣＨ３ドメイン
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体免疫グロブリンＦｃを含み、修飾されたＣＨ３ドメインは、１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含む。本明細書で使用される場合、「非対称アミノ酸修飾」とは、第１のＦｃポリペプチド上の特定の位置におけるアミノ酸が、第２のＦｃポリペプチド上の対応する位置におけるアミノ酸と異なる修飾を指す。これらの非対称アミノ酸修飾は、各Ｆｃポリペプチド上の対応する位置における２つのアミノ酸のうちの一方のみの修飾を含み得、または第１及び第２のＦｃポリペプチドのそれぞれの対応する位置における両方のアミノ酸の修飾を含み得る。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含み、修飾されたＣＨ３ドメインは、ホモ二量体Ｆｃの形成よりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含む。ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するためにＦｃのＣＨ３ドメインに行うことができるアミノ酸修飾は、当該技術分野において知られており、例えば、国際公開番号ＷＯ９６／０２７０１１（「ノブ・イントゥー・ホール」）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５，１９６３７－４６（「静電的ステアリング」）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２３（４）：１９５－２０２（鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）技術）及びＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１１０（１３）：５１４５－５０（Ｆａｂアーム交換）に記載のものが含まれる。他の例としては、国際公開番号ＷＯ２０１２／０５８７６８及びＷＯ２０１３／０６３７０２に記載される、非対称に修飾された安定なＦｃ領域をもたらす正及び負の設計戦略を組み合わせたアプローチが挙げられる。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、国際公開番号ＷＯ２０１２／０５８７６８または国際特許公開番号ＷＯ２０１３／０６３７０２に記載される修飾されたＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃを含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。以下の表２は、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１～４４７に対応するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列のアミノ酸配列を提供する。ＣＨ２ドメインは、典型的には、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１～３４０を含むものと定義され、ＣＨ３ドメインは、典型的には、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１～４４７を含むものと定義される。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ホモ二量体Ｆｃの形成よりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含む修飾されたＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃを含み、修飾されたＣＨ３ドメインは、位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を含む第１のＦｃポリペプチドと、位置Ｔ３６６及びＴ３９４にアミノ酸修飾を含む第２のＦｃポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第１のＦｃポリペプチドの位置Ｆ４０５におけるアミノ酸修飾は、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖである。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第１のＦｃポリペプチドの位置Ｙ４０７におけるアミノ酸修飾は、Ｙ４０７ＩまたはＹ４０７Ｖである。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第２のＦｃポリペプチドの位置Ｔ３６６におけるアミノ酸修飾は、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｍである。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第２のＦｃポリペプチドの位置Ｔ３９４におけるアミノ酸修飾は、Ｔ３９４Ｗである。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第１のＦｃポリペプチドは、位置Ｌ３５１におけるアミノ酸修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第１のＦｃポリペプチド中の位置Ｌ３５１におけるアミノ酸修飾は、Ｌ３５１Ｙである。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第２のＦｃポリペプチドは、位置Ｋ３９２におけるアミノ酸修飾をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第２のＦｃポリペプチド中の位置Ｋ３９２におけるアミノ酸修飾は、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍである。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方または両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ホモ二量体Ｆｃの形成よりもヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含む修飾されたＣＨ３ドメインを有するヘテロ二量体Ｆｃを含み、修飾されたＣＨ３ドメインは、アミノ酸修飾Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖをアミノ酸修飾Ｙ４０７ＩまたはＹ４０７Ｖとともに含む第１のＦｃポリペプチドと、アミノ酸修飾Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｍをアミノ酸修飾Ｔ３９４Ｗとともに含む第２のＦｃポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第２のＦｃポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＣＨ３ドメインの第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方または両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、上記のように、位置Ｆ４０５及びＹ４０７におけるアミノ酸修飾を含み、任意で、位置Ｌ３５１におけるアミノ酸修飾をさらに含む第１のＦｃポリペプチドと、位置Ｔ３６６及びＴ３９４におけるアミノ酸修飾を含み、任意で、位置Ｋ３９２におけるアミノ酸修飾をさらに含む第２のＦｃポリペプチドとを有する修飾されたＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含み、第１のＦｃポリペプチドは、位置Ｓ４００もしくはＱ３４７の一方もしくは両方にアミノ酸修飾をさらに含み、及び／または第２のＦｃポリペプチドは、位置Ｋ３６０もしくはＮ３９０の一方もしくは両方にアミノ酸修飾をさらに含み、位置Ｓ４００におけるアミノ酸修飾は、Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｋであり、位置Ｑ３４７におけるアミノ酸修飾は、Ｑ３４７Ｒ、Ｑ３４７ＥまたはＱ３４７Ｋであり、位置Ｋ３６０におけるアミノ酸修飾は、Ｋ３６０ＤまたはＫ３６０Ｅであり、位置Ｎ３９０におけるアミノ酸修飾は、Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０ＫまたはＮ３９０Ｄである。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、表２に示されるバリアント１、バリアント２、バリアント３、バリアント４またはバリアント５のいずれか１つの修飾を含む修飾されたＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。ある特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、配列番号４または配列番号５に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＨ３は、配列番号４または配列番号５と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、配列番号４または配列番号５と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
（表２）
修飾されたＦｃ ＣＨ２ドメイン
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ Ｆｃに基づくＦｃを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ Ｆｃに基づくＦｃを含み、ＣＨ２ドメインの修飾は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体などの１つ以上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する変化した結合をもたらす。
異なるＦｃγ受容体に対するＦｃの親和性を選択的に変化させるＣＨ２ドメインに対する多数のアミノ酸修飾は、当該技術分野で知られている。増加した結合をもたらすアミノ酸修飾及び減少した結合をもたらすアミノ酸修飾はいずれとも、ある特定の適応症において有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ（活性化受容体）に対するＦｃの結合親和性の増加は、増加した抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらし、ひいては標的細胞の増加した溶解をもたらす。ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性受容体）に対する減少した結合は同様に、いくつかの状況において有益であり得る。ある特定の適応症において、ＡＤＣＣの減少、または排除及び補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）が所望であり得る。そのような場合では、ＦｃγＲＩＩｂに対する増加した結合をもたらすアミノ酸修飾またはＦｃγ受容体のすべてに対するＦｃ領域の結合を減少または排除するアミノ酸修飾（「ノックアウト」バリアント）を含む修飾されたＣＨ２ドメインが有用であり得る。
Ｆｃγ受容体によるＦｃの結合を変化させるＣＨ２ドメインに対するアミノ酸修飾の例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した親和性）（Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６５（１－２）：１３２－４１）；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ（ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した親和性）（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７（１８）：８８８２－９０）；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した親和性）（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１３（６）：Ｒ１２３）；Ｆ２４３Ｌ（ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した親和性）（Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２４（９）：６７１－８）；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した親和性）（Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（９）：６５９１－６０４）；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａに対する増加した親和性）（（Ｌａｚａｒ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３（１１）：４００５－１０）、及びＳ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ及びＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＦｃγＲＩＩｂに対する増加した親和性）（Ｃｈｕ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４５（１５）：３９２６－３３）。
Ｆｃγ受容体に対するＦｃ結合に影響を及ぼす追加の修飾は、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｔｒｏｈｌ ＆ Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ １１，ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９，Ｏｃｔ ２０１２，ｐａｇｅ ２８３）に記載されている。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、修飾されたＣＨ２ドメインを有するＩｇＧ Ｆｃに基づくＦｃを含み、修飾されたＣＨ２ドメインは、Ｆｃγ受容体のすべてに対するＦｃ領域の減少または排除された結合をもたらす１つ以上のアミノ酸修飾（すなわち、「ノックアウト」バリアント）を含む。
様々な刊行物が「ノックアウト」バリアントを生成するために抗体を操作するために使用されたストラテジーを記載している（例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８５－６９１，ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ ＆ Ｓｔｒｏｈｌ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ” Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１２，ｐｐ ２２５－２４９を参照されたい）。これらのストラテジーには、グリコシル化の修飾を介するエフェクター機能の減少（以下でより詳細に記載される）、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４骨格の使用、またはＦｃのヒンジもしくはＣＨ２ドメインにおける変異の導入が含まれる（米国特許公開番号２０１１／０２１２０８７、国際公開番号ＷＯ２００６／１０５３３８、米国特許公開番号２０１２／０２２５０５８、米国特許公開番号２０１２／０２５１５３１及びＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２０：２０４－２１９も参照されたい）。
Ｆｃに結合するＦｃγＲ及び／または補体を減少させるための既知のアミノ酸修飾の具体的な非限定的な例には、表３で特定されているものが含まれる。
（表３）
追加の例には、アミノ酸修飾Ｌ２３５Ａ／Ｌ２３６Ａ／Ｄ２６５Ｓを含むように操作されたＦｃ領域が含まれる。また、すべてのＦｃγ受容体に対するＦｃの結合を減少させるＣＨ２ドメインにおける非対称アミノ酸修飾は、国際公開番号ＷＯ２０１４／１９０４４１に記載されている。
ある特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、配列番号６に対応するアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＨ２は、配列番号６と実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、配列番号６と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
抗体薬物コンジュゲート
本明細書に記載される融合タンパク質のある特定の実施形態は、薬物にコンジュゲートされた抗体、すなわち、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である生物学的に機能的なタンパク質を含む。ＡＤＣの薬物は、任意の治療分子、例えば、毒素、化学療法剤、低分子阻害剤であり得る。ＡＤＣは、切断性リンカーまたは非切断性リンカーであり得るリンカーを介して、薬物にコンジュゲートすることができる。切断性リンカーは、細胞内条件下、例えばリソソームプロセスによって容易に切断され得る。切断性リンカーの例としては、プロテアーゼ感受性、酸感受性、還元感受性または光切断性であるリンカーが挙げられる。薬物のコンジュゲーションは、当該技術分野において知られている任意の方法によって実施することができ、リシンまたはシステインコンジュゲーション、ビスチオールリンカー、抗体のグリコシル化部位を使用したコンジュゲーション、紫外線コンジュゲーション、及び非天然アミノ酸の使用が挙げられるがこれらに限定されない。
ペプチドリンカー、プロテアーゼ及びプロテアーゼ切断部位
本明細書に記載される融合タンパク質は、少なくとも第１及び第２のペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーは、他のペプチドまたはポリペプチドを接続または連結するペプチドである。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、生物学的に機能的なタンパク質、例えば、抗体または二量体Ｆｃ骨格のポリペプチドを、リガンド－受容体対のリガンド及び／または受容体に融合させる。
ある特定の実施形態では、生物学的に機能的なタンパク質がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃポリペプチドは、リガンド－受容体対のリガンドもしくは受容体に融合されるか、またはリンカーにより、Ｆｃポリペプチドをリガンド－受容体対のリガンドもしくは受容体に接続することができる。ある特定の実施形態では、リガンドは、第１のポリペプチドの末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、受容体は、第２のポリペプチドの各々同様の末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されている。本明細書に記載される融合タンパク質のある特定の実施形態では、受容体及びリガンドはいずれも第１及び第２のポリペプチドの各Ｎ末端にペプチドリンカーを介して融合されている。本明細書に記載される融合タンパク質のある特定の実施形態では、受容体及びリガンドはいずれも第１及び第２のポリペプチドの各Ｃ末端にペプチドリンカーを介して融合されている。
ペプチドリンカーは、リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さである。スペーシング機能を提供することに加えて、ペプチドリンカーは、融合タンパク質内で及び融合タンパク質とそれらの標的（複数可）との間またはそれらの中で、本明細書における融合タンパク質の１つ以上のドメインを適切に配向させるのに好適な柔軟性または硬質性を提供し得る。さらに、ペプチドリンカーは、それを必要とする対象、例えば、ヒトへの投与後にｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で全長融合タンパク質の発現及び精製されたタンパク質の安定性を支持し得、好ましくはそれらの同じ対象において非免疫原性であり、または免疫原性が低下している。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ、ＩＩ型膜タンパク質のファミリーであるＣ型レクチンの茎部領域の一部もしくはすべてまたはこれらの組み合わせを含み得る。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、約２～約１５０アミノ酸である。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが約３～約５０アミノ酸、または約５～約２０アミノ酸、または約１０～約５０アミノ酸、または約２～約４０アミノ酸、または約８～約２０アミノ酸、約１０～約６０アミノ酸、約１０～約３０アミノ酸、または約１５～約２５アミノ酸の範囲である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸である。
本明細書に記載される融合タンパク質のペプチドリンカーの少なくとも１つは、切断配列とも呼ばれるプロテアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、プロテアーゼ切断部位を含む少なくとも１つのペプチドリンカー及びプロテアーゼ切断部位を含まない少なくとも１つのペプチドリンカーを含む。使用される場合、プロテアーゼ切断部位は、所望のプロテアーゼ（複数可）による認識及び切断を最大化するように、また、他のプロテアーゼによる認識及び非特異的切断を最小化するようにペプチドリンカー内に位置する。ペプチドリンカーは、１つ以上の切断部位を含み得る。この点に関して、融合タンパク質は、１、２、３、４、５またはそれ以上のプロテアーゼによって切断され得る。また、プロテアーゼ切断部位（複数可）は、ペプチドリンカー内に位置し得（または言い換えれば、リンカーによって囲まれ得）、最良の所望の切断及び切断後の融合タンパク質断片（例えば、受容体リガンド対のリガンド、リガンド受容体対の受容体またはリガンドと受容体の両方）の放出を達成するように全体として融合タンパク質内に位置する。ペプチドリンカーによって融合タンパク質に融合されており、かつペプチドリンカーの切断後に融合タンパク質から放出されるポリペプチド部位は、本明細書で切断性部位（ＣＭ）と称され得る。融合タンパク質が複数のＣＭを含むある特定の実施形態では、それらは、同じ切断部位または異なる切断部位を有する同じまたは異なるペプチドリンカーによって融合タンパク質に融合されている場合がある。
プロテアーゼ切断部位または切断配列は、融合タンパク質または生物学的に機能的なタンパク質の活性が所望である組織において共局在化したプロテアーゼに基づいて選択され得る。切断部位は、複数のプロテアーゼの基質、例えば、セリンプロテアーゼ及び第２の異なるプロテアーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の基質として機能し得る。いくつかの実施形態では、切断部位は、複数のセリンプロテアーゼ、例えば、マトリプターゼ及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の基質として機能し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、複数のＭＭＰ、例えば、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１４の基質として機能し得る。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、約０．００１－１５００×１０４Ｍ－１Ｓ－１または少なくとも０．００１、０００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、または１５００×１０４Ｍ－１Ｓ－１の速度でプロテアーゼによって特異的に切断される。
酵素による特異的切断のため、酵素とペプチドリンカーとの間の接触が行われる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質が少なくとも第１のペプチドリンカーを含み、十分な酵素活性の存在下にある場合、ペプチドリンカーは、切断される。十分な酵素活性は、酵素がペプチドリンカーと接触し、切断をもたらす能力を指し得る。酵素は、ペプチドリンカーの近傍にあり得るが、他の細胞性因子または酵素のタンパク質修飾により、切断することができないことが容易に想定され得る。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、５～１０アミノ酸長、または７～１０アミノ酸長、または８～１０アミノ酸長のプロテアーゼ切断部位を含む。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、５～１０アミノ酸長、または７～１０アミノ酸長、または８～１０アミノ酸長のプロテアーゼ切断部位からなる。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位には、約１～２０アミノ酸長、２～５アミノ酸長、５～１０アミノ酸長、１０～１５アミノ酸長、１０～２０アミノ酸長、１２～１６アミノ酸長、または約５もしくは約１０アミノ酸長のリンカー配列がＮ末端で先行する。別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位には、約１～２０アミノ酸長、２～５アミノ酸長、５～１０アミノ酸長、１０～１５アミノ酸長、１０～２０アミノ酸長、１２～１６アミノ酸アミノ酸長、またはいくつかの場合では、約５もしくは約１０アミノ酸長のリンカー配列がＣ末端で後続する。さらに別の実施形態では、プロテアーゼ切断部位には、Ｎ末端でリンカー配列が先行し、Ｃ末端でリンカー配列が後続する。よって、ある特定の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、２つのリンカーの間に位置する。プロテアーゼ切断部位のＮ末端上またはＣ末端上のいずれかのリンカーは、例えば、約２～２０、６～２０、８～１５、８～１０、１０～１８、または１２～１６アミノ酸長などの様々な長さのものであり得る。ある特定の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端リンカー配列は、約３アミノ酸長または約５アミノ酸長である。
本開示の例示的なペプチドリンカーは、多様なプロテアーゼ、例えば、限定されないが、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４）、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１など）、アダマリシン、セラリシン、アスタシン、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４）、カテプシン、（例えば、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＳ）、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ（ＧＢ）、ヘプシン、エラスターゼ、レグマイン、マトリプターゼ、マトリプターゼ２、メプリン、ニューロシン、ＭＴ－ＳＰ１、ネプリライシン、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＴＡＣＥ、ＴＭＰＲＳＳ３／４、ｕＰＡ、及びカルパイン、ＦＡＰ及びＫＬＫのいずれかによって認識される１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ｕＰＡまたはマトリプターゼである。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、複数のプロテアーゼによって切断される切断部位を含む。この点に関して、個々の切断部位は、１、２、３、４、５またはそれ以上のプロテアーゼによって切断することができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、ある酵素によって実質的に切断されるが他の酵素によって実質的に切断されない切断部位を含み得る。よって、いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、高い特異性を有する切断部位を含む。「高い特異性」は、特定のプロテアーゼによって観察される＞９０％の切断及び他のプロテアーゼによって観察される５０％未満の切断を意味する。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、あるプロテアーゼによって＞８０％の切断を実証するが、他のプロテアーゼによって５０％未満の切断を実証する切断部位を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、あるプロテアーゼによって＞７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％の切断を実証するが、他のプロテアーゼによって６５％、６０％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、または４５％未満の切断を実証する切断部位を含む。例として、一実施形態では、切断部位は、マトリプターゼによって＞９０％切断され、ｕＰａ及びプラスミンによって約７５％切断され得る。別の実施形態では、切断部位は、ｕＰａ及びマトリプターゼによって切断され得るが、プラスミンによる特異的切断は観察されない。さらに別の実施形態では、切断部位は、ｕＰａによって切断されるが、マトリプターゼまたはプラスミンによって切断されない場合がある。一実施形態では、切断部位は、非特異的プロテアーゼ切断（例えば、プラスミンまたは他の非特異的プロテアーゼによる切断）に対する耐性のいくらかのレベルを実証することができる。この点に関して、プロテアーゼ切断部位は、「高い非特異的プロテアーゼ耐性」（プラスミンまたは同等の非特異的プロテアーゼによる＜２５％の切断）、「中程度の非特異的プロテアーゼ耐性」（プラスミンまたは同等の非特異的プロテアーゼによる＜７５％の切断）、または「低い非特異的プロテアーゼ耐性」（プラスミンまたは同等の非特異的プロテアーゼによる最大で約９０％の切断）を有し得る。そのような切断活性は、当該技術分野で知られているアッセイを使用して、例えば、適切なプロテアーゼとのインキュベートと、それに続くＳＤＳ－ＰＡＧＥまたは他の分析によって測定することができる。ある特定の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼとの２４時間の接触までプロテアーゼ切断に対する最大で完全な耐性を示し得る。他の実施形態では、プロテアーゼ切断配列は、プロテアーゼとの０．５時間～３６時間の接触の後、非特異的プロテアーゼ切断に対して最大で完全な耐性を示し得る。別の実施形態では、プロテアーゼ切断配列は、適切なプロテアーゼとの０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２０、２４、３６、４８、または７２時間の接触の後、非特異的プロテアーゼ切断に対して最大で完全な耐性を示す。
よって、ある特定の実施形態では、切断部位は、様々な所望のプロテアーゼにとっての優先傾向に基づいて選択される。このように、切断部位を含む特定のペプチドリンカーのための所望の切断プロファイルは、特定のプロテアーゼまたはプロテアーゼのセットがペプチドリンカー内の特定の切断部位の高い、特異的な、上昇した、効率的な、中程度の、低いまたは生じない切断を実証し得る所望の目的（例えば、特定の腫瘍微小環境または特定の器官における高特異性切断）のために選択することができる。切断を決定するための方法は、当該技術分野で知られている。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、各切断部位間に追加のリンカーを伴ってまたは伴わずに、タンデムで配置された１つ以上の切断部位を含み得る。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、第１の切断部位及び第２の切断部位を含み、第１の切断部位は、第１のプロテアーゼによって切断され、第２の切断部位は、第２のプロテアーゼによって切断される。非限定的な例として、ペプチドリンカーは、マトリプターゼ及びｕＰａによって切断される第１の切断部位及びＭＭＰによって切断される第２の切断部位を含み得る。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、第１の切断部位、第２の切断部位及び第３の切断部位を含み、第１の切断部位は、第１のプロテアーゼによって切断され、第２の切断部位は、第２のプロテアーゼによって切断され、第３の切断部位は、第３のプロテアーゼによって切断される。
本明細書における融合タンパク質において有用な例示的なタンパク質分解酵素及びそれらの認識配列は、当業者によって特定され得、ＭＥＲＯＰＳデータベース（例えば、Ｒａｗｌｉｎｇｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４６，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１，４ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１８，Ｐａｇｅｓ Ｄ６２４－Ｄ６３２を参照されたい）、及び他の場所（Ｈｏａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１８；ＧＴＥＸ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７）に記載されているものなど、当該技術分野で知られている。
本明細書において使用する切断部位を特定するには、他の方法も使用することができ、例えば、米国特許番号９，４５３，０７８、１０，１３８，２７２、９，５６２，０７３及び公開された国際出願番号ＷＯ２０１５０４８３２９；ＷＯ２０１５１１６９３３；ＷＯ２０１６１１８６２９に記載されている。
したがって、本開示の一実施形態は、少なくとも２つのペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、ペプチドリンカーの少なくとも１つは、本明細書に示される切断部位の１つ以上を含む、融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位を含み、ｕＰＡによって切断可能である、融合タンパク質を提供する。一実施形態では、本開示は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号２８）を含む、融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカー配列は、ＴＳＧＲＳＡＮＰ、ＬＳＧＲＳＤＮＨ、ＧＳＧＲＳＡＱＶ、ＧＳＳＲＮＡＤＶ、ＧＴＡＲＳＤＮＶ、ＧＴＡＲＳＤＮＶ、ＧＧＧＲＶＮＮＶ、ＭＳＡＲＩＬＱＶまたはＧＫＧＲＳＡＮＡ（それぞれ配列番号３０～３７）から選択される少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドリンカーを含む融合タンパク質は、２つの異種ポリペプチド、すなわち、ペプチドリンカーのアミノ（Ｎ）末端に位置する第１のポリペプチド及びペプチドリンカーのカルボキシル（Ｃ）末端に位置する第２のポリペプチドを含み、よって、２つの異種ポリペプチドは、ペプチドリンカーよって分離されている。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、プロテアーゼ切断部位を含まない少なくとも１つのペプチドリンカーを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＥＡＡＡＫ）ｎ（式中、ｎは、１～５の整数である）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＥＡＡＡＫ（配列番号３９）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３８）。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ポリプロリンリンカーを含み、任意で、ＰＰＰ（配列番号４１）またはＰＰＰＰ（配列番号４０）のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）－プロリン（Ｐ）ポリペプチドリンカーであり、任意で、ＧＰＰＰＧ、ＧＧＰＰＰＧＧ、ＧＰＰＰＰＧまたはＧＧＰＰＰＰＧＧである。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧｌｙｎＳｅｒリンカーである。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１～５の整数である）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、異なるドメインを接続するのに好適なペプチドリンカーには、グリシン－セリンリンカーを含む配列、例えば、限定されないが、（ＧｍＳ）ｎ－ＧＧ、（ＳＧｎ）ｍ、（ＳＥＧｎ）ｍ（式中、ｍ及びｎは、０～２０である）が含まれる。
ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、抗体ヒンジ領域配列から得られ、それに由来し、もしくはそれから設計されるアミノ酸配列、結合ドメインを受容体に連結させる配列、または結合ドメインを細胞表面膜貫通領域もしくは膜アンカーに連結させる配列である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、生理的条件または他の標準的なペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド保存のための条件）下で少なくとも１つのジスルフィド結合に関与することが可能な少なくとも１つのシステインを有する。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンヒンジペプチドに対応するまたはそれと同様のペプチドリンカーは、そのヒンジのアミノ末端に対して配置されたヒンジシステインに対応するシステインを保持する。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、ＩｇＧ１ヒンジからのものであり、任意のシステイン残基を除去するために修飾されているか、またはヒンジシステインに対応する１つのシステインもしくは２つのシステインを有するＩｇＧ１ヒンジである。
ある特定の実施形態では、本明細書において使用するためのペプチドリンカーは、「変化した野生型免疫グロブリンヒンジ領域」または「変化した免疫グロブリンヒンジ領域」を含み得る。そのような変化したヒンジ領域は、（ａ）最大で３０パーセントのアミノ酸変化（例えば、最大で２５パーセント、２０パーセント、１５パーセント、１０パーセント、または５パーセントのアミノ酸置換または欠失）を有する野生型免疫グロブリンヒンジ領域、（ｂ）最大で３０パーセントのアミノ酸変化（例えば、最大で２５パーセント、２０パーセント、１５パーセント、１０パーセント、または５パーセントのアミノ酸置換または欠失）を有する長さが少なくとも１０アミノ酸（例えば、少なくとも１２、１３、１４または１５アミノ酸）である野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部、または（ｃ）コアヒンジ領域を含む野生型免疫グロブリンヒンジ領域の一部（一部は、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸であり得る）を指す。ある特定の実施形態では、上側及びコア領域を含むＩｇＧ１ヒンジなどの野生型免疫グロブリンヒンジ領域における１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）によって置換され得る。変化した免疫グロブリンヒンジ領域は、代替的にまたは追加的に、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された、上側及びコア領域を含むＩｇＧ１ヒンジなどの野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有し得る。
接続領域として使用され得る代替的なヒンジ及びリンカー配列は、ＩｇＶ様またはＩｇＣ様ドメインを接続する細胞表面受容体の一部から作ることができる。細胞表面受容体がタンデムで複数のＩｇＶ様ドメインを含有するＩｇＶ様ドメイン間の領域、及び細胞表面受容体が複数のタンデムＩｇＣ様領域を含有するＩｇＣ様ドメイン間の領域もまた、接続領域またはリンカーペプチドとして使用される可能性がある。ある特定の実施形態では、ヒンジ及びリンカー配列は、５～６０アミノ酸長であり、主に柔軟性であり得るが、より硬質の特性も提供し得、最小のベータシート構造を有する主にらせん形の構造を含有し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるプロテアーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、対象となる特定の標的細胞、例えば、標的腫瘍細胞の腫瘍微小環境の近傍でより高い量で発現している。対象となる標的（例えば、特定の腫瘍タイプ、特定の腫瘍関連抗原を発現する特定の腫瘍）がプロテアーゼと共局在化した（プロテアーゼの基質は当該技術分野で知られている）多様な異なる状態または疾患が知られている。がんの例では、標的組織は、がん性組織、特に固形腫瘍のがん性組織であり得る。多数のがん、例えば、液性腫瘍または固形腫瘍におけるプロテアーゼのレベル増加は、文献に報告されている。例えば、Ｌａ Ｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ９０（７）：１４１４－１４２１を参照されたい。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー－ＶＬ、受容体－リンカー－ＶＬ、リガンド－リンカー－ＶＨ、または受容体－リンカー－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－切断性リンカー－ＶＬ、受容体－切断性リンカー－ＶＬ、リガンド－切断性リンカー－ＶＨ、または受容体－切断性リンカー－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１１４）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１１４）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１４）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１４）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１４５）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１４５）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１４５）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１４５）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１４７）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１４７）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１４７）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１４７）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号１５４）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号１５４）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号１５４）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号１５４）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー（配列番号２０３）－ＶＬ、受容体－リンカー（配列番号２０３）－ＶＬ、リガンド－リンカー（配列番号２０３）－ＶＨ、または受容体－リンカー（配列番号２０３）－ＶＨを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー－Ｆｃまたは受容体－リンカー－Ｆｃを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－切断性リンカー－Ｆｃまたは受容体－切断性リンカー－Ｆｃを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－切断性リンカー（配列番号２８）－Ｆｃまたは受容体－切断性リンカー（配列番号２８）－Ｆｃを含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－リンカー－Ｆｃ１または受容体－リンカー－Ｆｃ１を含む。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、リガンド－切断性リンカー－Ｆｃ２または受容体－切断性リンカー－Ｆｃ２を含む。
ある特定の実施形態では、Ｆｃ１及びＦｃ２は、ヘテロ二量体を形成することができる。ある特定の実施形態では、Ｆｃ１は、リガンドに連結され、Ｆｃ２は、受容体に連結される。ある特定の実施形態では、リガンドとＦｃ１を接続するリンカーは、切断性であり、受容体とＦｃ２を接続するリンカーは、非切断性である。ある特定の実施形態では、リガンドとＦｃ１を接続するリンカーは、非切断性であり、受容体とＦｃ２を接続するリンカーは、切断性である。ある特定の実施形態では、リガンドとＦｃ１を接続するリンカーは、切断性であり、受容体とＦｃ２を接続するリンカーは、切断性である。ある特定の実施形態では、リガンドとＦｃ１を接続するリンカーは、非切断性であり、受容体とＦｃ２を接続するリンカーは、非切断性である。
標的
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質の抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する。ＴＡＡは、腫瘍細胞表面上に発現する任意の抗原物質である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰａ）、トロホブラスト糖タンパク質（５Ｔ４）、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質２（Ｔｒｏｐ２）、フィブロネクチンＥＤＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）、フィブロネクチンＦ．ＩＩＩＢドメイン、ＣＧＳ－２、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＥＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃＭｅｔ、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ｃ－Ｍｅｔ、ＦＯＬＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、及びＣＥＡ、５Ｔ４、ＡＦＰ、Ｂ７－Ｈ３、カドヘリン－６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０５、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ３５２、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＤＬＬ３、ＤＲ５、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＰＣ３、ｇｐＡ３３、ＦＬＴ－３、ｇｐＮＭＢ、ＨＰＶ－１６Ｅ６、ＨＰＶ－１６Ｅ７、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＳＬＣ３９Ａ６、ＭＡＧＥ、メソテリン（ＭＳＬＮ）、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｐ－カドヘリン、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＴＲＫ５、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＭ１、組織因子（ＴＦ）、Ｔｒｏｐ２、ＷＴ１から選択されるＴＡＡに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する。免疫チェックポイントタンパク質の例には、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ－１、０Ｘ４０、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯｌ、ＩＤ０２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４７、またはＳＩＲＰａが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、炎症性または線維性組織細胞上に発現する抗原に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、サイトカイン受容体に特異的に結合する。サイトカイン受容体の例には、Ｉ型サイトカイン受容体、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、Ｇ－ＣＳＦ受容体、Ｉ型ＩＬ受容体、Ｅｐｏ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、ＴＰＯ受容体；ＩＩ型サイトカイン受容体、例えば、ＩＦＮ－アルファ受容体（ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２）、ＩＦＢ－ベータ受容体、ＩＦＮ－ガンマ受容体（ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２）、ＩＩ型ＩＦ受容体；ケモカイン受容体、例えば、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、ＸＣケモカイン受容体；腫瘍壊死受容体スーパーファミリー受容体、例えば、ＴＮＦＲＳＦ５／ＣＤ４０、ＴＮＦＲＳＦ８／ＣＤ３０、ＴＮＦＲＳＦ７／ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦｌＡ／ＴＮＦＲｌ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＲ２／ＣＤ１２０ｂ；ＴＧＦ－ベータ受容体、例えば、ＴＧＦ－ベータ受容体１、ＴＧＦ－ベータ受容体２；Ｉｇスーパーファミリー受容体、例えば、ＩＦ－１受容体、ＣＳＦ－１Ｒ、ＰＤＧＦＲ（ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ＳＣＦＲが含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質の抗原結合ドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの対象となる分子または標的に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、対象となる標的は、分化抗原群３（ＣＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、組織因子（ＴＦ）、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、分化抗原群４０（ＣＤ４０）、カドヘリン３（ＣＤＨ３）、またはこれらの組み合わせである。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、抗体を含み、抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＣＤ３、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＤ４０、ＣＤＨ３、またはこれらの組み合わせ上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ＨＥＲ２であり、融合タンパク質の抗ＨＥＲ２パラトープは、配列番号１２０に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１２４に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２パラトープは、配列番号１２０と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１２４と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２パラトープは、配列番号１２０と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１２４と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２パラトープは、配列番号１２０と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１２４と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２パラトープは、配列番号３に対応するアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２は、配列番号１２１、１２２及び１２３にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号１２５、１２６及び１２７にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ＥＧＦＲであり、融合タンパク質の抗ＥＧＦＲパラトープは、配列番号１４に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１３に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲパラトープは、配列番号１４と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１３と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲパラトープは、配列番号１４と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１３と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲパラトープは、配列番号１４と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１３と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲは、配列番号８４、８５及び８６にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号５９、６０及び６１にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ＭＳＬＮであり、融合タンパク質の抗ＭＳＬＮパラトープは、配列番号１６に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１５に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ＭＳＬＮパラトープは、配列番号１６と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１５と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＭＳＬＮパラトープは、配列番号１６と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１５と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＭＳＬＮパラトープは、配列番号１６と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１５と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＭＳＬＮは、配列番号６９、７０及び７１にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号７４、７５及び７６にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ＴＦ（組織因子）であり、融合タンパク質の抗ＴＦパラトープは、配列番号１８に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１７に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ＴＦパラトープは、配列番号１８と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１７と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＴＦパラトープは、配列番号１８と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１７と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＴＦパラトープは、配列番号１８と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１７と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＴＦは、配列番号５４、５５及び５６にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号４８、４９及び５０にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ＣＤ１９であり、融合タンパク質の抗ＣＤ１９パラトープは、配列番号２０に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１９に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９パラトープは、配列番号２０と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１９と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９パラトープは、配列番号２０と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１９と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ１９パラトープは、配列番号２０と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１９と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９は、配列番号６４、６５及び６６にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号７４、７５及び１６５にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ｃ－Ｍｅｔであり、融合タンパク質の抗ｃ－Ｍｅｔパラトープは、配列番号２２に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号２１に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ｃ－Ｍｅｔパラトープは、配列番号２２と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号２１と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ｃ－Ｍｅｔパラトープは、配列番号２２と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号２１と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ｃ－Ｍｅｔパラトープは、配列番号２２と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号２１と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ｃ－Ｍｅｔは、配列番号９９，１００及び１０１にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号９４、９５及び９６にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ＣＤＨ３であり、融合タンパク質の抗ＣＤＨ３パラトープは、配列番号２４に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号２３に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤＨ３パラトープは、配列番号２４と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号２３と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤＨ３パラトープは、配列番号２４と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号２３と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤＨ３パラトープは、配列番号２４と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号２３と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤＨ３は、配列番号８９、９０及び９１にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号９４、９５及び９６にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
いくつかの実施形態では、対象となる標的は、ＣＤ４０であり、融合タンパク質の抗ＣＤ４０パラトープは、配列番号１７２に対応するアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１７７に対応するアミノ酸配列を有するＶＬを有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ４０パラトープは、配列番号１７２と実質的に同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１７７と実質的に同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ４０パラトープは、配列番号１７２と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１７７と約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ４０パラトープは、配列番号１７２と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＨアミノ酸配列及び配列番号１７７と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４０は、配列番号１７３、１７４及び１７５にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＨと、配列番号１７８、１７９及び１８０にそれぞれ対応するアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有するＶＬとを有する。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質の抗原結合ドメインは、免疫細胞上の分子、例えば、ポリペプチドに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＴＡＡに特異的に結合する抗原結合ドメインと、免疫細胞上の分子、例えば、ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合ドメインの両方を含む。よって、ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、腫瘍細胞及び免疫細胞の両方に結合する。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、好中球、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原及び腫瘍細胞上の１つ以上のＴＡＡに結合する。
マスクされたＴ細胞エンゲージャー
Ｔ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）は、多くの場合二重特異性抗体であるポリペプチド構築物であり、腫瘍細胞上のＴＡＡとＴ細胞上のＣＤ３エピトープに同時に結合して、ＴＣＲに依存しない人工的な免疫シナプスを形成する。これにより、Ｔ細胞は活性化され、腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を発揮する。Ｔ細胞を腫瘍細胞に標的指向させることが可能な二重特異性抗体は、特定されており、がん治療での有効性が検証されている。ブリナツモマブは、ＢｉＴＥ（商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）と呼ばれるフォーマットの二重特異性抗ＣＤ３－ＣＤ１９抗体の一例であり、再発性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ性白血病などのＢ細胞疾患の治療に特定されており（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２：４９４１－４９４４）、ＦＤＡの承認を受けている。腫瘍に関連する他の標的抗原を指向するＴ細胞エンジャーも作製されており、いくつかは臨床試験に入っている：肺癌、胃癌及び大腸癌に対するＡＭＧ１１０／ＭＴ１１０ ＥｐＣＡＭ；胃腸腺癌に対するＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ５６５ ＣＥＡ；ならびに前立腺癌に対するＡＭＧ ２１２ ／ ＢＡＹ２０１０１１２ ＰＳＭＡ（Ｓｕｒｕａｄｅｖａｒａ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１５ Ｊｕｎ；４（６）：ｅ１００８３３９を参照されたい）。これらの研究は、有望な臨床上の有効性を示したものの、主にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）に起因する重篤な用量制限毒性によってまたも支障が生じた。これにより、治療ウィンドウが狭くなった。腫瘍微小環境で主に活性化されるマスクされたＴ細胞結合パラトープの使用は、ＴＣＥの毒性を低減する可能性がある。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原及び腫瘍細胞上のＴＡＡに結合する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原、腫瘍細胞上のＴＡＡ及び腫瘍細胞上のＩｇＳＦ細胞外ドメインに結合する。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原、腫瘍細胞上のＴＡＡ及びＴ細胞上のＩｇＳＦ細胞外ドメインに結合する。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、腫瘍微小環境中のプロテアーゼによってマスク解除され、腫瘍細胞上のＴＡＡ及びＴ細胞上のＣＤ３抗原に結合し、それにより、実施例２０に示されるように、Ｔ細胞と腫瘍細胞の架橋をもたらす。ある特定の実施形態では、マスクされていない融合タンパク質は、図３１に図示されるように、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原と、腫瘍細胞上のＴＡＡ及びＩｇＳＦリガンドの両方と結合する。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞上のＩｇＳＦリガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）の結合により、Ｔ細胞上のそのＩｇＳＦ受容体（例えば、ＰＤ－１）の結合を阻害することで、チェックポイント阻害をブロックする（図３１Ｃ）。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、表ＢＢに示されるパラトープのものと実質的に同一である抗ＣＤ３パラトープＶＨ及びＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ３パラトープは、以下のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号２０６に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２１０に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｃ）配列番号２１５に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２１９に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｄ）配列番号２２３に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２２７に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｄ）配列番号２３１に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２３５に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｅ）配列番号２３９に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２４３に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ。
ある特定の実施形態では、ＣＤ３パラトープは、以下に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるＶＨ及びＶＬを含む：
（ａ）配列番号２に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｂ）配列番号２０６に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２１０に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｃ）配列番号２１５に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２１９に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
配列番号２２３に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２２７に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；
配列番号２３１に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２３５に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ；または
配列番号２３９に対応するアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２４３に対応するアミノ酸配列を含むＶＬ。
ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３パラトープは、配列番号２０７、２０８及び２０９に対応するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨと、配列番号２１１、２１２及び２１４に対応するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬとを含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３パラトープは、配列番号２２４、２２５及び２２６に対応するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨと、配列番号２２８、２２９及び２３０に対応するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬとを含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３パラトープは、配列番号２３２、２３３及び２３４に対応するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨと、配列番号２３６、２３７及び２３８に対応するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬとを含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３パラトープは、配列番号２４０、２４１及び２４２に対応するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の３つの重鎖ＣＤＲを含むＶＨと、配列番号２４４、２４５及び２４６に対応するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の３つの軽鎖ＣＤＲを含むＶＬとを含む。
ＣＡＲ構築物
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲ断片に含まれ得る。ＣＡＲは、１つ以上の細胞外リガンド結合ドメイン、任意で、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達領域を含み得る。１つ以上の細胞外リガンド結合ドメインは、１つ以上の融合タンパク質を含むことができる。細胞外リガンド結合ドメインは、典型的には、一本鎖免疫グロブリン可変断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂもしくは天然タンパク質リガンドなどの他のリガンド結合ドメインを含み得る。ヒンジ領域は、一般に、１つ以上のアミノ酸などの可変長のポリペプチドヒンジ、ＣＤ８アルファヒンジ領域またはＩｇＧ４領域（またはその他）、及びこれらの組み合わせを含み得る。膜貫通ドメインは、典型的には、ＣＤ８アルファ、ＣＤ２８、またはＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、もしくはＮＫＧ２Ｄなどの他の膜貫通タンパク質、及びこれらの組み合わせに由来する膜貫通領域を含み得る。細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３ゼータ、ＯＸ４０、２Ｂ４、または他の細胞内シグナル伝達ドメイン、及びこれらの組み合わせなどの１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例えば、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８及びＣＤ３ゼータ、４－１ＢＢ及びＣＤ３ゼータ、またはＣＤ３ゼータを含み得る。Ｔ細胞及びＮＫ細胞などのリンパ球は、キメラ抗原受容体細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ）を産生するように改変することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞表面などの標的細胞表面上、または腫瘍微小環境中の細胞上の特定の１つまたは複数の可溶性抗原を認識することができます。細胞外リガンド結合ドメインが同族リガンドに結合すると、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、リンパ球を活性化することができる。例えば、Ｂｒｕｄｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１８）１５：３１ －４６；Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０１４）３７１ ：１５０７－１５１７；Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃ．（２０１３）３：３８８－３９８（２０１８）；米国特許第７，４４６，１９０号及び同第８，３９９，６４５号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるリガンド受容体対構築物を含むＣＡＲ構築物が提供される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ構築物は、リガンド受容体対構築物に融合され得るｓｃＦｖを含む。ある特定の実施形態では、リガンド受容体対構築物は、リンカーありまたはなしでｓｃＦｖのＮ末端に融合され得る一本鎖リガンド受容体対構築物である。ある特定の実施形態では、一本鎖リガンド受容体対構築物は、プロテアーゼ切断性リンカーを含む。ある特定の実施形態では、受容体は、第１のリンカーありまたはなしでｓｃＦｖのＮ末端に融合されており、リガンドは、ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖を接続する第２のリンカーに内部融合されている。ある特定の実施形態では、リンカーは、プロテアーゼによって切断可能なプロテアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、リガンドは、第１のリンカーありまたはなしでｓｃＦｖのＮ末端に融合されており、受容体は、ｓｃＦｖの重鎖及び軽鎖を接続する第２のリンカーに内部融合されている。ある特定の実施形態では、第１のリンカーは、プロテアーゼによって切断可能であり、第２のリンカーは非切断性である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、リガンド受容体対ＣＡＲを発現するように改変することができる。
配列相同性
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットに関する。この文脈におけるポリヌクレオチドは、融合タンパク質の全部または一部をコードし得る。
「核酸」、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。
所与のポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドは、適切な制御配列の制御下に置かれると、ｉｎ ｖｉｖｏで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、ポリヌクレオチドである。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コーディング配列の３’側に配置され得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質の少なくとも一部をコードするポリペプチド、例えば、生物学的に機能的なタンパク質の第１または第２のポリペプチドと同一であるまたは実質的に同一であるポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列に関する。２つ以上のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一」または「同一率」という用語は、同じである２つ以上の配列または部分配列を指す。配列が「実質的に同一」であるのは、比較ウィンドウにわたってまたは指定領域にわたって最も対応するように比較及びアラインメントされる場合に、当業者に知られている一般的に使用されている配列比較アルゴリズムのうち１つを使用して、または手動アラインメント及び目視検査によって測定される場合、当該配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ（例えば、指定領域にわたって約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性）を有する場合である。この定義は、試験ポリヌクレオチド配列の相補体も指す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、または７５～１００アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、または指定されない場合、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの配列全体にわたって存在し得る。配列比較については、典型的には、指定された参照配列と試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータが使用され得るか、または代替パラメータが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列と比較して試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、２０～１０００の連続するアミノ酸またはヌクレオチド位置、例えば、約５０～約６００または約１００～約３００または約１５０～約２００の連続するアミノ酸またはヌクレオチド位置であり得る連続するアミノ酸またはヌクレオチド位置を含む配列のセグメントを指し、そのセグメントにわたり、試験配列は、２つの配列が最適にアラインメントされた後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。最大全長配列までのより長いセグメントも、ある特定の実施形態では、比較ウィンドウとして使用することができる。比較を目的とした配列のアラインメント方法は、当業者に既知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９７０，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４の類似法の検索によって、またはこれらのアルゴリズム（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡまたはＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のコンピュータによる実行によって、または手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）によって実施することができる。パーセント配列同一性を決定するのに好適な利用可能なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから公的に入手可能である。
本明細書に記載されるある特定の実施形態は、１つ以上のアミノ酸置換を含むバリアント配列に関する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的置換である。一般に、「保存的置換」は、あるアミノ酸を、物理的、化学的、及び／または構造的に類似した特性を有する別のアミノ酸で置換することとみなされる。一般的な保存的置換は、表４の列１に列挙される。当業者であれば、何が保存的置換を構成するかを決定する主な要因は、通常、アミノ酸側鎖のサイズ及びその物理的／化学的特性であるが、ある特定の環境では、列１に列挙されるものよりも広範なアミノ酸で所与のアミノ酸を置換することができることを理解するであろう。これらの追加のアミノ酸は、置換されるアミノ酸と類似の特性を有するが、サイズが大きく異なる傾向、または類似のサイズであるが、物理的／化学的特性が大きく異なる傾向がある。この広範な保存的置換は、表４の列２に列挙される。当業者であれば、アミノ酸置換が行われる特定のタンパク質環境を考慮して、選択すべき最も適切な置換基群を容易に見極めることができるであろう。
（表４）
融合タンパク質の調製
本明細書に記載される融合タンパク質は、当該技術分野において知られている標準的な組換え方法を使用して生成することができる（例えば、米国特許番号４，８１６，５６７及び“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１４を参照されたい）。
融合タンパク質をコードするベクター
本明細書に記載される融合タンパク質の組換え産生のためには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを生成し、１つ以上のベクターに挿入し、さらなるクローニング及び／または宿主細胞での発現を行う。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、当該技術分野において知られている標準的な方法によって生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４ ＆ ｕｐｄａｔｅ、及び“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１４を参照されたい）。当業者によって理解されるように、融合タンパク質の発現に必要なポリヌクレオチドの数は、融合タンパク質のフォーマット、例えば、融合タンパク質が抗体を含むか否か、及び融合タンパク質内のポリペプチドの数に依存する。例えば、融合タンパク質が２つのポリペプチド鎖を含む場合、１つのポリペプチド鎖をそれぞれコードする２つのポリヌクレオチドが必要とされるであろう。同様に、ある特定の実施形態では、融合タンパク質がｍＡｂフォーマットの生物学的に機能的なタンパク質を含む場合、１つのポリペプチド鎖をそれぞれコードする２つのポリヌクレオチドが必要とされる。複数のポリヌクレオチドが必要な場合、１つのベクターまたは複数のベクターに組み込むことができる。
一般に、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットは、発現のために、ポリヌクレオチドの効率的な転写に必要な転写エレメントなどの１つ以上の調節エレメントとともに、発現ベクターに組み込まれる。そのような調節エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及びポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、調節エレメントの選択は、融合タンパク質のポリペプチドの発現に選択された宿主細胞に依存し、そのような調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類または昆虫の遺伝子を含む様々な供給源に由来し得ることを理解するであろう。発現ベクターは、任意で、発現されるタンパク質の発現または精製を促進する異種核酸配列をさらに含有することができる。例としては、シグナルペプチド及び親和性タグ、例えば、金属親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンコード配列、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード配列及びビオチンコード配列が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。
本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される融合タンパク質の少なくとも一部をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター（発現ベクターなど）に関する。ポリヌクレオチド（複数可）は、１つのベクターまたは複数のベクターに含まれ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マルチシストロンベクターに含まれる。
ポリヌクレオチドの発現に使用される発現ベクターには、ｐＴＴ５及びｐＵＣ１５が含まれるが、これらに限定されない。
融合タンパク質をコードするベクターを含む細胞
融合タンパク質ポリペプチドのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞には、当該技術分野において知られている様々な原核生物または真核細胞が含まれる。真核生物宿主細胞には、例えば、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞及び酵母細胞（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の細胞など）が含まれる。原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、Ａ．サルモニシダ（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）細胞または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞が含まれる。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、例えば、米国特許番号５，６４８，２３７、５，７８９，１９９、及び５，８４０，５２３、ならびにＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，ｐｐ．２４５－２５４，Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３に記載されているように、細菌において生成される。
真核微生物、例えば、糸状菌または酵母など、特に、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母株は、ある特定の実施形態では、好適な発現宿主細胞である（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５を参照されたい）。
グリコシル化された融合タンパク質の発現に好適な宿主細胞は、通常、真核細胞である。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号及び同第６，４１７，４２９号は、トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載している。融合タンパク質の発現には、懸濁液中で成長するように適合されている哺乳動物細胞株が特に有用である。例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）株２９３または２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９を参照されたい）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリＴＭ４細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２３：２４３－２５１を参照されたい）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ，３８３：４４－６８を参照されたい）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む；Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７７：４２１６を参照されたい）、及び骨髄腫細胞株（Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０など）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体の産生に好適な例示的な哺乳動物宿主細胞株は、Ｙａｚａｋｉ ＆ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，ｐｐ．２５５－２６８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）に概説されている。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、一過性または安定した高等真核細胞株、例えば、哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物のＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＳ０細胞またはＣＯＳ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、融合タンパク質の成熟グリコシル化を可能にする安定細胞株である。
融合タンパク質コードする発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞は、融合タンパク質を産生するための常法を使用して培養することができる。あるいは、いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードする発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞は、融合タンパク質を対象に治療的にもしくは予防的に送達するために使用することができ、またはポリヌクレオチドもしくは発現ベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏで対象由来の細胞に投与され、次いで、その細胞を対象の体内に戻すことができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される結合ドメインのＶＬ及び結合ドメインのＶＨをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、形質転換されている）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される結合ドメインのＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター及び対応する結合ドメインのＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｘｐｉ２９３（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）またはＨＥＫ２９３細胞である。
本開示のある特定の実施形態は、融合タンパク質を作製する方法であって、融合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたは融合タンパク質をコードする１つ以上の発現ベクターが導入された宿主細胞を、融合タンパク質の発現に好適な条件下で培養することと、任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地から）から融合タンパク質を回収することとを含む、方法に関する。
使用され得る細胞培養培地としては、ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｅｘｐｉ２９３（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞培養培地には、血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、アミノ酸、例えば、Ｌ－グルタミン、抗生物質、例えば、ペニシリン、及びストレプトマイシン、及び／または抗真菌剤、例えば、アムホテリシン、または細胞培養を支援するために常法により使用される任意の他の添加物が添加され得る。
融合タンパク質の精製
典型的には、融合タンパク質は、発現後に精製される。タンパク質は、当業者に既知の様々な方法で単離または精製することができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照されたい）。標準的な精製方法としては、ＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して大気圧で、または高圧で実施される、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、及び逆相を含むクロマトグラフィー技術が挙げられる。さらなる精製方法としては、電気泳動、免疫学的、沈殿、透析及びクロマトフォーカシング技術も挙げられる。タンパク質濃度と組み合わせた限外濾過及びダイアフィルトレーション技術も有用である。当該技術分野において周知であるように、様々な天然タンパク質がＦｃ及び抗体と結合するため、これらのタンパク質は、特定の抗体の精製に使用される。例えば、細菌タンパク質のＡ及びＧはＦｃ領域に結合する。同様に、細菌タンパク質のＬは一部の抗体のＦａｂ領域に結合する。また、精製は、特定の融合パートナーによって可能となり得る。例えば、抗体は、ＧＳＴ融合が用いられる場合にはグルタチオン樹脂、Ｈｉｓタグが用いられる場合にはＮｉ＋２アフィニティークロマトグラフィー、またはｆｌａｇタグが使用される場合には固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して精製することができる。必要な精製度は、抗体の用途に応じて変動することになる。いくつかの場合では、精製を必要としないこともある。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、実質的に純粋である。「実質的に純粋」（または「実質的に精製された」）という用語は、本明細書に記載される融合タンパク質に関して使用される場合、融合タンパク質が、その天然に存在する環境中、例えば、天然細胞、または組換え産生融合タンパク質の場合には宿主細胞において見られるような当該タンパク質に通常付随するまたは当該タンパク質と相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まないことを意味する。ある特定の実施形態では、実質的に純粋な融合タンパク質は、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満（乾燥重量）の夾雑タンパク質を有するタンパク質調製物である。
タンパク質精製及び／または均質性の評価は、当該技術分野において知られている任意の方法、例えば、限定されないが、非還元／還元ＣＥ－ＳＤＳ、非還元／還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、超高速液体クロマトグラフィー－サイズ排除クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ－ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって実施することができる。
翻訳後修飾
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、１つ以上の翻訳後修飾を含む。そのような翻訳後修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏで生じることもあれば、融合タンパク質を宿主細胞から単離した後にｉｎ ｖｉｔｒｏで実施されることもある。
翻訳後修飾としては、当該技術分野で知られている様々な修飾が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｐｏｓｔ－Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１－１２，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６－６４６、及びＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８－６２を参照されたい）。融合タンパク質が１つ以上の翻訳後修飾を含むこれらの実施形態では、融合タンパク質は、１つまたはいくつかの部位で同じ種類の修飾を含んでもよいし、異なる部位に異なる修飾を含むこともできる。
翻訳後修飾の例としては、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、ホルミル化、酸化、還元、タンパク質分解的切断または特定の化学的切断（臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼまたはＮａＢＨ４による）が挙げられる。
翻訳後修飾の他の例としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型糖鎖の付加または除去、Ｎ結合型またはＯ結合型結合型糖鎖の化学修飾、Ｎ末端またはＣ末端の処理、アミノ酸骨格への化学部分の結合、及び原核生物宿主細胞の発現から生じるＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。翻訳後修飾はまた、タンパク質の検出及び単離を可能にするために、検出可能な標識、例えば、酵素、蛍光、同位体または親和性標識などによる修飾を含むこともできる。好適な酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが挙げられるが、これらに限定されない。発光材料の例は、ルミノールであり、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン及びフッ素が挙げられる。
翻訳後修飾の追加の例としては、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部位の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ガンマ－カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、ペグ化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質への転移ＲＮＡ媒介アミノ酸付加、及びユビキチン化が挙げられる。
融合タンパク質のマスキング及びプログラムされた活性化
本開示によれば、融合タンパク質は、その目的の標的（複数可）との係合からマスクされている。融合タンパク質のその標的（複数可）への結合が減少する程度は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー、結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ））、マイクロ流体、または等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）などの標準的な技術によって測定され得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、リガンド－受容体対によってマスクされた抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、対応するマスクされていない抗原結合ドメインと比較して、少なくとも３倍減少し、例えば、抗原結合ドメインのその同族抗原への結合は、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも７０倍または少なくとも８０倍、または少なくとも９０倍または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍または少なくとも４００倍、または少なくとも６００倍または少なくとも８００倍または少なくとも１０００倍または少なくとも２０００倍または少なくとも５０００倍または少なくとも１０，０００倍減少する。
本開示によれば、リガンド－受容体対のリガンドまたは受容体と生物学的に機能的なタンパク質との間のペプチドリンカーの少なくとも１つのプロテアーゼ切断は、融合タンパク質をマスク解除（活性化）し、その目的の標的（複数可）に結合することができるようにする。ペプチドリンカーの切断に対する感受性は、本明細書の実施例に記載されているものを含む標準的な技術によってｉｎ ｖｉｔｒｏで試験され得る。融合タンパク質のその標的（複数可）の結合がプロテアーゼ切断後に回復する程度もまた、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー、結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）、マイクロ流体、または等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）などの標準的な技術によって試験され得る。融合タンパク質のその目標（複数可）への結合の回復は、部分的または完全であり得る。結合の部分的回復は、融合タンパク質の関連ドメイン（例えば、リガンド、受容体または抗原結合ドメイン）のその目的の標的に対する測定可能な結合と定義され、例えば、親ドメインの結合の１／１００～１／２であり得る。部分的回復は、親ドメインの結合の約１／１００、１／７５、１／５０、１／２５、１／１０、１／５、または１／２であり得る。
治療方法
ある特定の態様では、本開示は、疾患または状態の治療のための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載される融合タンパク質を投与することを含む、方法を含む。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、がんの治療のためのものである。がんとしては、造血器腫瘍（白血病、骨髄腫及びリンパ腫を含む）、癌腫（腺癌及び扁平上皮癌を含む）、黒色腫及び肉腫を挙げることができるが、これらに限定されない。癌腫及び肉腫は、「固形腫瘍」と称されることも多い。ある特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、がんは、白血病である。ある特定の実施形態では、がんは、リンパ腫である。
融合タンパク質は、細胞毒性または細胞増殖抑制効果のいずれかを発揮することができ、腫瘍を有する対象の腫瘍のサイズの縮小、腫瘍のサイズの増大の減速もしくは防止、腫瘍の消失もしくは除去からその再発までの無病生存期間の増加、腫瘍の初発もしくは後続の発生（例えば、転移）の防止、無増悪期間の増加、腫瘍に関連する１つ以上の有害症状の軽減、または全生存期間の増加のうちの１つ以上をもたらし得る。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、免疫不全障害または疾患の治療のためのものである。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、自己免疫疾患または状態の治療のためのものである。
本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む。融合タンパク質は、適切な投与経路によって対象に投与することができる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／または様式は、所望の結果に応じて変わり得る。典型的には、免疫治療抗体は、全身投与または局所投与によって投与される。局所投与は、腫瘍部位または腫瘍流入リンパ節への投与であり得る。一般に、融合タンパク質は、非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下または脊髄投与によって、例えば、注射または注入によって投与される。
治療は、「治療上有効な量」の融合タンパク質の投与によって達成される。「治療上有効な量」とは、所望の治療結果を達成するために、必要な投与量及び期間において有効な量を指す。治療上有効な量は、対象の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの因子によって変化し得る。治療上有効な量はまた、融合タンパク質のあらゆる毒性または有害な作用よりも治療上有益な効果が上回るものである。「十分な量」とは、所望の効果をもたらすのに十分な量、例えば、免疫調節性リガンド－受容体の免疫細胞への結合によって、標的細胞または組織に対する免疫応答を調節するのに十分な量を意味する。
融合タンパク質の好適な投与量は、熟練した医療従事者によって決定され得る。選択される投与レベルは、採用される特定の融合タンパク質の活性、投与経路、投与時間、ポリペプチドの排泄速度、治療の期間、融合タンパク質と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／または物質、例えば、抗がん剤、治療される対象の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康及び過去の病歴、ならびに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態的因子に依存する。
免疫細胞または免疫応答を調節する方法
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、対象の免疫系を調節するために、それを必要とする対象、例えば、がんを有する対象に投与される。よって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、免疫応答を下方制御するか、または免疫応答を上方制御する。
この実施形態によれば、対象への十分な量の融合タンパク質の投与は、免疫応答の活性化または上方制御するために、次のうちの１つに影響を与えることができる：免疫チェックポイントの調節、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の調節、Ｔ細胞活性化の調節、炎症促進性サイトカインの調節、Ｔ細胞によるインターフェロン－γ産生の調節、Ｔ細胞抑制の調節、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）もしくは骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の生存及び／または分化の調製、及び／または細胞に対する細胞毒性もしくは細胞増殖抑制効果の調節。
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイントの阻害、免疫チェックポイントの刺激、免疫細胞の活性化、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の刺激、及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｔ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）），細胞依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の刺激を含む、免疫応答を調節する方法が本明細書で提供される。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、プロテアーゼによって活性化されると、標的白血球の共刺激性受容体をアゴナイズすることが可能である。白血球の共刺激性受容体アゴニズムの機能的効果には、Ｔエフェクター細胞の活性化、炎症性骨髄細胞の分化及び活性化、及び／またはＢ細胞及び／またはＮＫＴ細胞の動員が含まれる。Ｔエフェクター細胞の活性化は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン－２１ （ＩＬ－２１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ－１β）及び／またはＣ－Ｘ－Ｃモチーフリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）などの１つ以上のサイトカインのＴ細胞による産生増加をもたらし得る。Ｔエフェクター細胞によるＩＬ－２１及びＣＸＣＬ１３の産生増加は、例えば、ＴＭＥにおける炎症性骨髄細胞の分化及び活性化を支援し、Ｂ細胞及びＮＫＴ細胞などの抗腫瘍リンパ系細胞を動員し、及び／または三次リンパ系構造の形成を支援し得る。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｔエフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－１７、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１及び／またはＣ－Ｘ－Ｃモチーフリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）のＴエフェクター細胞による産生を増加させる。
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、単球のＣＳＦ１依存性生存を減少させ、Ｔエフェクター細胞を活性化させる。
本開示のある特定の実施形態は、例えば、がんを治療するために、融合タンパク質を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで白血球の共刺激性受容体アゴニズムを調節する方法に関する。
ある特定の実施形態では、方法は、例えば、自己免疫疾患または障害を治療するための、免疫細胞または免疫応答の抑制または下方制御に関する。よって、ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、免疫細胞を調節するのに十分な量で投与される。ある特定の実施形態では、免疫応答の下方制御は、免疫チェックポイントの調節、Ｔ細胞受容体シグナル伝達の調節、Ｔ細胞活性化の調節、炎症促進性サイトカインの調節、Ｔ細胞によるインターフェロン－γ産生の調節、Ｔ細胞抑制の調節、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）もしくは骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の生存及び／または分化の調製、及び／または細胞に対する細胞毒性もしくは細胞増殖抑制効果の調節による。
標的細胞のＡＤＣＣを変更する方法
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し、ひいては、標的細胞の増加した溶解をもたらす。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＦｃＲγＩＩＩａ（活性化受容体）に対するＦｃの結合親和性が増加したＦｃ領域を含み、その結果、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加及び標的細胞の溶解増加がもたらされる。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲγＩＩＩａ（活性化受容体）に対するＦｃの結合親和性の増加をもたらすアミノ酸修飾を含む修飾されたＣＨ２ドメインを含み、その結果、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加がもたらされる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を減少させる。ある特定の適応症において、ＡＤＣＣの減少、または排除及び補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）が望ましい。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、含み、ＦｃγＲＩＩｂに対する増加した結合をもたらすアミノ酸修飾またはＦｃγ受容体のすべてに対するＦｃ領域の結合を減少または排除するアミノ酸修飾（「ノックアウト」バリアント）を含む修飾されたＣＨ２ドメインを含むＦｃ領域が有用であり得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性受容体）への結合が減少したＦｃ領域を含む。
医薬組成物
本開示による融合タンパク質は、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、１つ以上の融合タンパク質に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当業者によく知られた他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性でなければならず、活性成分の有効性を妨げるものであってはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔、筋肉内、腹腔内の経路に依存し得る。
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンなどの固体担体またはアジュバントを含み得る。液体の医薬組成物は、一般に、水、石油、動物性もしくは植物性の油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれ得る。
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または患部への注射の場合、有効成分は、パイロジェンフリーであり、かつ好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形態であり得る。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム、リンゲル注射液、加乳酸リンゲル注射液などの等張ビヒクルを使用して、好適な溶液を調製することは十分に可能である。保存剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤及び／または他の添加物は、必要により、含めることができる。
個体に投与される本開示による融合タンパク質の場合、投与は、好ましくは、個体に利益を示すのに十分な「治療上有効な量」である。「予防上有効な量」もまた、個体に利益を示すのに十分であれば、投与することができる。実際の投与量、ならびに投与の速度及び期間は、治療されるタンパク質凝集疾患の性質及び重症度に依存する。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医または他の医師の責任の範囲であり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に知られている他の因子が考慮される。上に言及される技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出すことができる。
組成物は、治療される状態に応じて、単独でまたは他の治療と組み合わせて同時または順次のいずれかで投与することができる。
キット
本開示はまた、本明細書に記載される１つ以上の組成物及び使用説明書を含むキットも提供する。よって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質を発現させるためのベクター及び使用説明書を含むキットが本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質を発現させるためのベクターを含む宿主細胞及び使用説明書を含むキットが本明細書において記載される。ある特定の実施形態では、精製された融合タンパク質及び使用説明書を含むキットである。精製された融合タンパク質は、凍結乾燥されるか、または粉末もしくは顆粒などの乾燥形態で提供することができ、キットは、凍結乾燥または乾燥された構成要素（複数可）を再構成するのに好適な溶媒をさらに含有し得る。
キットは、典型的には、容器と、容器上または容器に付随するラベル及び／または添付文書を含む。ラベルまたは添付文書には、治療用製品の市販パッケージに慣習的に含まれている説明が含まれ、当該治療用製品の使用に関する適応症、使用方法、投与量、投与、禁忌及び／または警告についての情報もしくは指示が記載されている。ラベルまたは添付文書は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定める形式での通知をさらに含み得、その通知は、ヒトまたは動物への投与のための製造、使用または販売について当該機関が承認することを示すものである。容器は、融合タンパク質を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、容器は、滅菌アクセスポートを有し得る。例えば、容器は、静脈内輸液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る。
融合タンパク質を含む組成物を収容する容器に加えて、キットは、キットの他の構成要素を含む１つ以上の追加の容器を含み得る。例えば、薬学的に許容される緩衝液（注射用静菌水）（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液など）、他の緩衝液または希釈剤。
好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、静脈内輸液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。必要であれば、キットの１つ以上の構成要素は、凍結乾燥されるか、または粉末もしくは顆粒などの乾燥形態で提供することができ、キットは、凍結乾燥または乾燥された構成要素（複数可）を再構成するのに好適な溶媒をさらに含有し得る。
キットは、フィルター、針、及びシリンジなどの商業的または使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定する意図はない。使用される数（例えば、量、温度など）に関しては、正確を期すように努めたが、多少の実験誤差及び偏差は、当然のことながら、許容されるものとする。
本開示の実施には、特に指定のない限り、当該技術分野の範囲内にある、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献に十分で説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
実施例１ マスクされた抗ＣＤ３×抗Ｈｅｒ２ Ｔ細胞エンゲージャー融合タンパク質の設計
抗ＣＤ３ Ｆａｂ×抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖ Ｆｃに、リガンド－受容体対ＰＤ－１－ＰＤＬ－１の一方をＦａｂの軽鎖のＮ末端に連結させ、他方を重鎖のＮ末端に連結させることによって抗ＣＤ３ Ｆａｂ上にマスクを付属させた。融合タンパク質構築物を以下のように設計した。
方法
融合タンパク質は、Ｆｃに融合された抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖを有するヘテロ二量体を形成する抗ＣＤ３重鎖及び軽鎖を含む半抗体を有する修飾された二重特異性Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃ形式であった。抗ＣＤ３パラトープは、ＵＳ２０１５０２３２５５７Ａ１（ＶＬ配列番号１；ＶＨ配列番号２）に記載されていた。抗Ｈｅｒ２パラトープは、ＵＳ１００００５７６Ｂ１（配列番号３）に記載されているグリシンセリンリンカーによって接続されたトラスツズマブＶＬ及びＶＨに基づくｓｃＦｖ形式であった（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ｐ１８５ＨＥＲ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８９，４２８５－４２８９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．８９．１０．４２８５（１９９２））。選択的ヘテロ二量体対合を可能とするために、先行記載されているように変異を抗ＣＤ３ ＣＨ３及び抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖ－Ｆｃ ＣＨ３鎖に導入した（Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｏ ａｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ：ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ．ＭＡｂｓ ５，６４６－６５４，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２５６３２（２０１３）；（Ａ鎖ＣＨ３ドメイン、配列番号４、Ｂ鎖ＣＨ３ドメイン配列番号５）。Ｆｃガンマ受容体に対する結合を減少させるために変異（野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２と比較してＬ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ）も両方のＣＨ２ドメインに導入した（配列番号６）。さらに、ヒトＰＤ－１（配列番号７）及び／またはＰＤ－Ｌ１（配列番号８）のＩｇＶドメインの修飾されたタンパク質配列に基づくポリペプチド（Ｗｅｓｔ，Ｓ．Ｍ．＆ Ｄｅｎｇ，Ｘ．Ａ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ Ｂ７－ＣＤ２８ ａｓ ａ ｆａｍｉｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ），１５３５３７０２１９８５５９７０，ｄｏｉ：１０．１１７７／１５３５３７０２１９８５５９７０（２０１９）を、らせん形ターンを形成することが予測される配列の可変数のリピートから構成されたリンカー（（ＥＡＡＡＫ）ｎ，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｚａｒｏ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｃ．Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６５，１３５７－１３６９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０３９（２０１３））を使用して、抗ＣＤ３可変ドメインの重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）及びカッパ軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）のＮ末端にそれぞれ融合した。これらのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１部位は、二量体化し、エピトープ結合を立体的にブロックすることが予測された。すべてのバリアントにおいて、マスクの一方の半分として使用されるＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１配列のいずれかは、以前に記載されているようにＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体の親和性を増加させるための変異を含有していた（Ｍａｕｔｅ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＰＤ－１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏ－ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２，Ｅ６５０６－６５１４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１９６２３１１２（２０１５）；配列番号９；Ｌｉａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＰＤ－Ｌ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８，８８３６０－８８３７５，ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２１７２９（２０１７）；配列番号１０）。また、すべてのＷＴ ＰＤ－１部位において、対合していないシステインは、露出した還元基の不利益を除去するためにセリンに変異された（配列番号１１）。いくつかのバリアントはまた、プロテアーゼに対する融合タンパク質の曝露によってマスクの一部またはすべての除去を可能にするために、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）関連プロテアーゼｕＰａのための切断配列（ＭＳＧＲＳＡＮＡ配列番号２８）を含有していた。マスクされたＦａｂのための構築物設計の概略図及び意図された作用のメカニズムが図１に示されている。最後の設計は、マスクされた抗ＣＤ３ Ｆａｂ及び抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖを含有する二重特異性Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃ分子であった。概略図が図２に示されており、使用された配列が表Ａに列挙されている。
（表Ａ）
実施例２ マスクされた抗ＣＤ３バリアントの産生
実施例１で設計した、修飾されたＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖバリアントの配列を、以下のように、発現ベクターに導入し、発現させ、精製した。
方法
シグナルペプチド（Ｂａｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２９４：８３５－８４２、配列番号２７）及びＣＨ３のＧ４４６（ＥＵ付番）で終結する重鎖クローンを含む重鎖ベクターインサートをｐＴＴ５ベクターにライゲートして、重鎖発現ベクターを作製した。同じシグナルペプチド及び軽鎖クローンを含む軽鎖ベクターインサートをｐＴＴ５ベクターにライゲートして、軽鎖発現ベクターを作製した。得られた重鎖及び軽鎖発現ベクターをシーケンシングして、コーディングＤＮＡの正しいリーディングフレーム及び配列を確認した。
修飾されたＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃバリアントの重鎖及び軽鎖を、２５ｍＬのＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の培養液で共発現させた。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞を、８％ＣＯ２の加湿雰囲気中で１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカー上でＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で３７℃で培養した。総細胞数７．５×１０７細胞を含む容量２５ｍＬに、Ｈ１：Ｌ１：Ｈ２のトランスフェクション比が４０：４０：２０で、合計２５μｇのＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション前に、ＤＮＡを１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に希釈した。１．４２ｍＬの体積のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ中で、８０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を希釈し、５分間のインキュベート後、ＤＮＡトランスフェクションミックスと合わせて３ｍＬの合計体積とした。１０～２０分後、ＤＮＡ－ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬混合物を細胞培養物に添加した。３７℃で１８～２２時間インキュベートした後、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １及び１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を各培養物に添加した。細胞を５～７日間インキュベートし、タンパク質精製のために上清を回収した。
清澄化された上清試料を、５０％ｍＡｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を含有する１ｍＬのスラリーにバッチモードで適用した。カラムは、ＰＢＳで平衡させた。ローディング後、カラムをＰＢＳで洗浄し、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５でタンパク質を溶出した。溶出した試料を、１０％（ｖ／ｖ）１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９を添加することによってｐＨを調節し、最終ｐＨ６～７にした。濃縮後、物質のすべてをＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に注入し、ＰＢＳ ｐＨ７．４で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムで実行した。タンパク質を０．７５ｍＬ／分の速度でカラムから溶出し、０．５ｍＬの画分に回収した。ピーク画分をプールし、３０ｋＤａのＭＷＣＯポリエーテルスルホンコンセントレータであるＶｉｖａｓｐｉｎ２０（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して濃縮した。Ｓｕｐｏｒ（商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅを備えた０．２μｍのＰＡＬＬ Ａｃｒｏｄｉｓｃ（商標）Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒを通して滅菌濾過した後、タンパク質をＡ２８０ｎｍ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）に基づいて定量し、さらなる使用まで－８０℃で保存した。
結果
試料は、プロテインＡ精製後にＵＰＬＣ－ＳＥＣによって決定されたように有意な量の高分子量種を含有しており（示されていない）、高純度の試料を得るために分取ＳＥＣを使用した。分取ＳＥＣ後の収率は、バリアント当たり１．５～５ｍｇの範囲であった。試料純度及び安定性を、実施例３及び実施例４で評価した。
実施例３ マスクされた抗ＣＤ３バリアントの純度及び均質性評価
精製されたバリアントを、以下に記載されるように非還元／還元ＣＥ－ＳＤＳ ＵＰＬＣ－ＳＥＣによって純度及び試料均質性について評価した。
方法
精製後、試料の純度を、ＣＥ－ＳＤＳ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、非還元及び還元Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓアッセイによって評価した。手順は、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ユーザーガイドバージョン２に従って、以下の変更を加えて実施した。ｍＡｂ試料を２ｕＬまたは５ｕＬ（濃度範囲５～２０００ｎｇ／ｕｌ）のいずれかで、７ｕｌのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃７６０３２８）とともに、９６ウェルプレート（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の別個のウェルに添加した。３．５μｌのＤＴＴ（１Ｍ）を１００μｌのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒに添加することによって還元緩衝液を調製する。次いでｍＡｂ試料を９０℃で５分間変性し、３５μｌの水を各試料ウェルに添加する。ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）装置を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０４９９）及びＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２００アッセイ設定（１４ｋＤａ～２００ｋＤａ）を使用して稼働させた。
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａカラムを使用して２５℃でＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステムでＵＰＬＣ－ＳＥＣを実施した。注入前に、試料を１００００ｇで５分間遠心分離し、５μｌをカラムに注入した。試料をＰＢＳ，ｐＨ７．４中で１ｍＬ／分の流速で７分間実行し、１９０～４００ｎｍでＵＶ吸光度によって溶出をモニタリングした。クロマトグラムを２８０ｎｍで抽出した。ＯｐｅｎＬＡＢ ＣＤＳ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用してピーク積分を実施した。
結果
図３Ａ、３Ｃ、３Ｅ、及び３Ｇにおけるバリアントの分取ＳＥＣ精製後の試料の代表的なＵＰＬＣ－ＳＥＣトレースは、８９％～９４％の正しい種を含有していた非常に均質な試料を示した。主要種と比較した短保持時間での小さなピークの存在は、すべての試料において少量の高分子量種、例えば、オリゴマー及び凝集物の存在を示している。
非還元ＣＥ－ＳＤＳ（図３Ｂ、３Ｄ、３Ｅ及び３Ｆ）の分析は、単一の主な種を示し、すべてのバリアントのインタクト鎖に対応するバンドのみが還元ＣＥ－ＳＤＳ実行で見られた。特に、マスクされた重鎖及び軽鎖は、予期されたものよりも有意に高い見かけの分子量を示した（ＨＣについて１１０ｋＤａ対６３ｋＤａ、ＬＣについて５４ｋＤａ対３７ｋＤａ）。これはまた、非還元ジスルフィド結合種の高い見かけの分子量に反映された（２１５ｋＤａ対１５２ｋＤａ）。設計におけるＰＤ１及びＰＤ－Ｌ１部位の両方のグリコシル化は、見かけの分子量の増加を引き起こす可能性が高い（Ｔａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌｏｏｐ ｉｎ ＰＤ－１ ｄｏｍｉｎａｔｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１４３６９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４３６９（２０１７），Ｌｉ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ－１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７，１２６３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２６３２（２０１６））。
実施例４ マスクされた抗ＣＤ３バリアントの安定性評価
精製されたバリアントを以下に記載されているように示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって熱安定性について評価した。
方法
修飾されたＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃバリアントの代表的なセットの試料をＰＢＳで０．５－１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＮａｎｏＤＳＣ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ，ＵＳＡ）を使用するＤＳＣ分析のために、試料及び参照の９６ウェルプレートにそれぞれ９５０μｌの試料及びマッチング緩衝液（ＰＢＳ）を添加した。ＤＳＣ実行の開始時に、緩衝液（ＰＢＳ）ブランク注入を実施してベースラインを安定化した。次いで、各試料を注入し、６０ｐｓｉの窒素圧力で２５℃から９５℃まで１℃／分でスキャンした。ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅソフトウェアを使用してサーモグラムを分析した。試料サーモグラムからマッチング緩衝液サーモグラムを差し引き、シグモイド曲線を使用してベースラインのフィッティングを行った。次いで、データを２状態スケールＤＳＣモデルでフィッティングした。
結果
未修飾ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントのＤＳＣサーモグラム（３０４２１、図４）は、６８℃及び８３℃で転移を示した。６８℃のＴｍでの転移は、抗ＣＤ３ Ｆａｂ、抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖ及びＣＨ２ドメインのアンフォールディングについての分解されない個々の転移に対応するが、Ｔｍ＝８３℃での転移は、重鎖におけるＣＨ３ドメインのアンフォールディングに対応する可能性が高い。ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１マスクを有するバリアントのサーモグラム（３０４３０、３０４３６；図４）はまた、マスクされていないバリアントと同様の温度及び同様のサーモグラムトレースで２つの転移を示した。このことは、融合したマスキングドメインが抗ＣＤ３ ＦａｂのＴｍに影響を及ぼさず、Ｆａｂと協働的に、または非協働的ではあるがＦａｂ、ｓｃＦｖ及びＣＨ２と同様のＴｍを伴ってアンフォールディングされることを示している。
実施例５ 抗ＣＤ３バリアントのｕＰａ切断
リンカーにおける導入されたプロテアーゼ切断部位の切断による融合タンパク質の抗ＣＤ３ Ｆａｂからのマスクの一部またはすべての放出を評価するために、試料をｉｎ ｖｉｔｒｏでｕＰａで処置した。反応を以下のように還元ＣＥ－ＳＤＳによってモニタリングした。
方法
バリアントの分取切断のため、２５～１００ｕｇの精製された試料をＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の０．２ｍｇ／ｍＬの最終バリアント濃度まで希釈し、組換えヒトｕ－プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰａ）／ウロキナーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃Ｐ００７４９）を１：５０のプロテアーゼ：基質モル比で添加した。３７℃で２４時間インキュベートした後、試料断片を、実施例に２記載の還元ＣＥ－ＳＤＳで分析し、次いで凍結し、さらなる使用のために－８０℃で保存した。
結果
ｕＰａで処置された及び処置されていないマスクされたバリアントの還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルの分析は、調査された条件下で、マスクの一部またはすべてが、導入された切断部位における切断によって有効にＦａｂから除去されたことを明らかにした（図５）。成功裏に切断されたバリアント（３０４３０、３０４３６、３１９３４）について、マスクされた重鎖及び／または軽鎖の断片を表すバンドは、切断により完全に消失したのに対し、マスクされていない重鎖及び／または軽鎖の断片は出現する。遊離ＰＤ－１の断片に対応する低強度の広いバンドは、バリアント３０４３０について観察され得るのに対し、バリアント３０４３６では放出されたＰＤ－Ｌ１についてこのようなことはなかった。グリコシル化による小さなサイズ及びサイズ不均一（Ｔａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌｏｏｐ ｉｎ ＰＤ－１ ｄｏｍｉｎａｔｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１４３６９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４３６９（２０１７），Ｌｉ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ－１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７，１２６３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２６３２（２０１６））は、遊離ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１断片をそれぞれ、ほとんど検出できなくし、検出不可能とした可能性が高い。切断配列を含有しないバリアント（３０４２１、３０４２３）では、切断は観察されなかった。
実施例６ ＣＤ３結合のマスキング／マスク解除
実施例５の抗ＣＤ３バリアントの切断されていない試料及び切断された試料を、以下のように、ＣＤ３結合Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合をＥＬＩＳＡによって、Ｐａｎ Ｔ細胞への結合をフローサイトメトリーによって試験した。
方法
ＥＬＩＳＡ
ヒトＪｕｒｋａｔ細胞（Ｆｕｊｉｓａｋｉ Ｃｅｌｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｊａｐａｎ）を、加湿＋５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で２ｍＭのＬ－グルタミン及び１Ｘペニシリン／ストレプトマイシンを含む１０％の熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培地中で維持した。
実施例５の修飾されたＣＤ３×Ｈｅｒ２バリアントの試料を、飽和量の無関係のヒトＩｇを含有するブロッキング緩衝液に２倍希釈し、続いて、合計で８つの濃度点のためにブロッキング緩衝液で７つの３倍段階希釈を行った。細胞（陰性／ブランク対照）に対するバックグラウンドシグナルを測定するために対照ウェルにブロッキング緩衝液を単独で添加した。
すべてのインキュベートを４℃で実施した。アッセイの日に、指数関数的に増殖する細胞を遠心分離し、９６ウェルフィルタープレート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）において完全培地及びブロッキング緩衝液の１：１の混合物中に播種した。等体積の２Ｘバリアントまたは対照を細胞に添加し、１時間インキュベートした。次いでプレートを真空濾過を使用して４回洗浄した。ＨＲＰがコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）をウェルに添加し、さらに１時間インキュベートした。プレートを真空濾過によって７回洗浄し、続いてＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ，ＵＳＡ）を室温で添加した。反応を０．５体積の１Ｍ硫酸を添加することによって停止させ、上清を濾過によって透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に移した。４５０ｎｍにおける吸光度を、パスチェック補正を備えるＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ３４０ＰＣプレートリーダーで読み取った。
ブランクを差し引いたＯＤ４５０対線形または対数抗体濃度の結合曲線をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてフィッティングした。各試験品についてのＢｍａｘ及び見かけのＫｄ値を決定するために、ヒルスロープを用いた１部位特異的４パラメータ非線形回帰曲線フィッティングモデルを用いた。
フローサイトメトリー
抗体を、３００ｎＭから１．７ｐＭまでｖ底９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ＡＧ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）においてＦＡＣＳ緩衝液－２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中１：３の希釈率で合計２０ｕＬ／ウェルでタイトレーションした。健康なドナー末梢血ｐａｎ Ｔ細胞（ＢｉｏＩＶＴ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を解凍し、１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ａ１０４９１０１、ＡＴＣＣ改変）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる培地で洗浄した。細胞を計数し、ＦＡＣＳ 緩衝液中再懸濁し、９６ウェルプレートにウェルあたり５０，０００細胞で添加した。細胞をバリアントと４℃で１時間インキュベートし、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液及び１ｍｇ／ｍＬの二次抗体ＡＦ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で２回洗浄した。１０００倍に希釈した生死判定色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）もウェルに添加した。プレートを振盪しながら（２００ｒｐｍ）室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。アッセイの読み出しには、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でのフローサイトメトリーによって、ＡＰＣ蛍光の幾何平均を測定した。生データをＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。Ｍａｃ ＯＳ Ｘ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してグラフを生成した。
結果
ＥＬＩＳＡ
図６で分かるように、ＣＤ３ Ｆａｂに付加された完全なＰＤ１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを含有するバリアント（３０４２３、３０４３０、３０４３６）は、マスクされていない対照（３０４２１）と比較して４０～１８０倍減少した結合を示した。ｕＰａで処置すると、切断性バリアント３０４３０及び３０４３６のＣＤ３結合が部分的に回復した（マスクされていない対照の６～７倍以内）。この部分的回復は、切断後にマスクに残されるマスクの一部によるエピトープ結合の立体障害によって引き起こされた可能性がある。付随して、それぞれ重鎖または軽鎖のいずれかに付加されたＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１のみを有していた対照（３１９２９、３１９３１）は、十分にマスクされたバリアントのｕＰａ切断試料のようにマスクされていない対照と比較して同様の結合減少（４～５倍）を示した。
フローサイトメトリー
図２２で分かるように、ＣＤ３ Ｆａｂに付加された完全なＰＤ１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを含有するバリアント（３０４２３、３０４３０）は、マスクされていない対照（３０４２１）と比較して＞４３倍減少した結合を示した。ｕＰａで処置すると、切断性バリアント３０４３０のＣＤ３結合が部分的に回復した（マスクされていない対照の２９倍以内）。この部分的回復は、切断後にマスクに残されるマスクの一部によるエピトープ結合の立体障害によって引き起こされた可能性がある。付随して、重鎖に付加されたＰＤ－１のみを有していた対照（３１９２９）は、十分にマスクされたバリアントのｕＰａ切断試料のようにマスクされていない対照と比較して同様の結合減少（１４倍）を示した。別の実験では、重鎖に付加された非機能性ＰＤ－１ドメインを含むバリアント（３２４９７）は、機能性ＰＤ－１を含む同等のバリアントで見られたように（３１９２９、５倍）マスクされていない対照と比較して同様の結合減少（６倍）を示した（図３２）。
実施例７ マスクされた及びマスクされていないバリアントのＴ細胞依存性細胞傷害
ＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントがＨｅｒ２保有細胞の殺傷のためにＴ細胞に係合し、それを活性化する能力に対するＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクの機能的影響を、以下のようにＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）アッセイにおいて評価した。
方法
共培養アッセイ
１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地中で培養したＪＩＭＴ－１（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０％ウシ胎仔血清が補充されたＡＴＣＣ改変ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地で培養したＨＣＣ１９５４ （ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及びＨＣＣ８２７（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ならびに１０％ウシ胎仔血清及び０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が補充されたＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地中で培養したＭＣＦ－７（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、Ｔ－１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内でインキュベーターにおいて３７℃で５％二酸化炭素で水平に維持した。アッセイのセットアップ日に、バリアントを、５ｎＭから０．０８ｐＭまで３８４ウェル細胞培養処置オプティカルボトムプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において直接的に１：３の希釈率で三連でタイトレーションした。腫瘍細胞をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でリンスし、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて回収し、培地で希釈し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して計数した。初代ヒトｐａｎ－Ｔ細胞（ＢｉｏＩＶＴ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）のバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、培地中で洗浄し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌを使用して計数した。Ｐａｎ Ｔ細胞懸濁液を腫瘍細胞と５：１のエフェクター対標的比で混合し、洗浄し、０．５５Ｅ６細胞／ｍｌで懸濁した。２０ｕＬの混合細胞懸濁液をタイトレーションされたバリアントを含有するプレートに添加した。プレートをインキュベーター内で３７℃で５％二酸化炭素で４８時間インキュベートした。次いで試料をハイコンテント細胞傷害評価に供し、上清をＩＦＮγ分析のために回収した。
ハイコンテント細胞傷害分析
核の可視化及び生存性の評価のために、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。１０μＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を培地に１：１０００で希釈し、４８時間後に細胞に添加し、３７℃でさらに１時間インキュベートした。次いで、生存及び死腫瘍細胞ならびにエフェクター細胞を区別し、定量するために、プレートをＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ－５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でハイコンテント画像分析に供した。プレートを以下の設定：対物レンズ：１０ｘ、チャネル１～３８６ｎｍ：（２のゲインで固定曝露時間０．００８ｍｓ）を有するＳｐｏｔＡｎａｌｙｓｉｓ．Ｖ４ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを使用してＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ハイコンテント装置でスキャンした。
ＩＦＮγの定量
ＭＳＤ Ｕ－ＰＬＥＸ ３８４ウェルシングルスポットアッセイでのＩＦＮγ定量のために、ストレプトアビジンをコーティングしたマルチアレイプレート（ＭＡ６０００ ３８４ ＳＡプレート、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、５０ｕＬの希釈剤１００でブロッキングし、封止し、振盪しながら（８００ｒｐｍ）室温で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、すべてのウェルを吸引した。ビオチン化した捕捉ＩＦＮγ抗体を希釈剤１００に１：１６．５の比で添加し、１０ｕＬの捕捉抗体溶液をブロッキングしたプレートの各ウェルに添加した。プレートを封止し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、共培養アッセイから得られた凍結上清を濡れた氷上で解凍した。プレートを洗浄し、５μｌの希釈剤４３を各ウェルに添加し、続いて、５μｌの解凍した上清試料または標準を添加した。プレートを封止し、振盪しながら（８００ｒｐｍ）室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを洗浄し、希釈剤３で１：１０００に希釈した１０ｕＬのスルホタグ検出抗体を各ウェルに添加した。プレートを封止し、振盪しながら（８００ｒｐｍ）室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを洗浄し、４０μｌのＭＳＤ ＧＯＬＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒを各ウェルに添加した。プレートをＭＥＳＯ ＳＥＣＴＯＲ Ｒ６００装置（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で読み取った。
ＰＤ－Ｌ１及びＨｅｒ２受容体の定量
Ｈｅｒ２及びＰＤ－Ｌ１受容体の定量は、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ抗ヒト及び抗マウスＩｇＧのキット（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）をそれぞれ使用するフローサイトメトリーにより実施した。腫瘍細胞をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でリンスし、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて回収した。細胞をＶｉ－Ｃｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して計数し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液－２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中に４×１０＾６ｃ／ｍＬで再懸濁した。２５ｕＬの腫瘍細胞懸濁液を９６ウェルＶ底プレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ ＡＧ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に三連で添加した。抗Ｈｅｒ２－ＡＦ６４７（トラスツズマブ、一価抗体、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、抗ＰＤＬ１－ＡＰＣ（クローンＭＩＨ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）または無関係の陰性対照ＩｇＧ－ＡＦ６５７（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）抗体を１５ｕｇ／ｍＬでＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＩｇＧビーズ（抗ヒトまたは抗マウス）及びブランクビーズを入れたウェル及びエッペンドルフチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に添加した。細胞及びビーズを抗体と４℃で１時間、暗所でインキュベートした。細胞及びビーズを洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。分析のために、特定のロットのビーズについて、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）によって提供されているスプレッドシートを使用して標準曲線を作成し、同じスプレッドシートを使用して、細胞集団の幾何平均を入力することによって、表面抗原結合能力（ＡＢＣ）を生成した。ＡＢＣの値は、一価の結合モデルを仮定して、細胞表面に発現している受容体の分子数を表す。受容体数の信頼できる決定の範囲を決定する標準曲線は、Ｈｅｒ２で３５００受容体／細胞～３３００００受容体／細胞の範囲であり、ＰＤ－Ｌ１で４４００受容体／細胞～６３００００受容体／細胞であった。
結果
実施例６におけるＣＤ３への結合においてＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃバリアントについて確認されたマスキング効果は、同じ試料が、Ｈｅｒ２を発現するＪＩＭＴ－１細胞を用いたＴＤＣＣアッセイにおいて機能について調べられた場合に再現された（図７）。マスクされていないバリアント（３０４２１）は、低いバリアント濃度で頑強な腫瘍細胞殺傷を示したのに対し、マスクされた非切断性バリアント（３０４２３）の効力は、４９０００倍低下した。軽鎖上に切断性ＰＤ－Ｌ１部位を有する十分にマスクされたバリアント（３０４３０）もまた、ｕＰａの処置なしで、効力が５８００倍減少した。非切断性バリアントと切断性バリアントとの間のマスキングのこの相違は、ＣＤ３結合についても同様に確認された（実施例６）。ｕＰａによってマスクが切断されると、３０４３０の効力は、マスクされていない（３０４２１）バリアントのものに戻った。マスクのＰＤ－１部位のみが結合した対照バリアント（３１９２９）は、３０４２１及びｕＰａ処置された３０４３０と同様の効力を示した。無関係の抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体（２２２７７）は、腫瘍細胞殺傷のためのＴ細胞の活性化を示さなかった。
ＪＩＭＴ－１をＨｅｒ２及びＰＤ－Ｌ１陽性細胞株として使用するＴＤＣＣを繰り返し、それらの受容体レベルが異なる３つの他の細胞株に拡大し、先の実験とは異なるＴ細胞ドナーを使用した。２回の繰り返しの細胞傷害データを図２３に示す。繰り返しｎ＝１については、Ｔ細胞の免疫活性化の代わりにサイトカインＩＦＮγのレベルについてもモニタリングした（図２４）。使用したすべての細胞株について受容体数を決定し、図２５に示す。マスクされていない対照（３０４２１）の効力は、異なる細胞株の細胞傷害について、０．０３ｐＭ（ＨＣＣ１９５４：高Ｈｅｒ２、高ＰＤ－Ｌ１）～３ｐＭ（ＭＣＦ－７：中Ｈｅｒ２、低ＰＤ－Ｌ１）であることが決定された。ＩＦＮγ放出によって決定されるこのマスクされていない対照の効力は、８．４ｐＭ（ＨＣＣ１９５４：高Ｈｅｒ２、高いＰＤ－Ｌ１）～５０ｐＭ（ＨＣＣ８２９：低Ｈｅｒ２、中ＰＤ－Ｌ１）であった。ＥＣ５０増加によって測定される非切断性（３０４２３）及び切断性（３０４３０）のマスクされたバリアントのマスキングは、すべての細胞株で確認され、細胞傷害の読み出しでは７２～＞４５０倍、ＩＦＮγの読み出しでは８．２～＞３５０倍の範囲であった。重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ｕＰａ処置後の切断性マスクされたバリアント（３０４３０＋ｕＰａ）及びマスクされていない対照と飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせ（３０４２１＋１２０ｎＭアテゾリズマブ）は、ＰＤ－Ｌ１にも係合する能力があるため、ＰＤ－Ｌ１が顕著に発現している細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７）において、マスクされていない対照（３０４２１）と比較して、より高い効力を示した（細胞傷害におけるＥＣ５０が０．０１９～０．８４倍低い）。ＰＤ－Ｌ１の発現が極めて低い細胞株（ＭＣＦ－７）では、マスクされていない対照（３０４２１）とＰＤ－Ｌ１に係合が可能なこれらのバリアント（３１９２９、３０４２１＋１２０ｎＭアテゾリズマブ、３０４３０＋ｕＰａ）との間で細胞傷害の読み出しに有意差は示されなかった。しかしながら、抗ＰＤ－Ｌ１部位を含むこれらのバリアントは、マスクされていない対照（３０４２１）と比較して、すべての試験細胞株について、ＩＦＮγ放出の高い効力を示した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）は、細胞株のいずれにおいてもＴＤＣＣで活性を示さなかった。
実施例８ マスクされた抗ＣＤ３バリアントのＰＤ１及びＰＤ－Ｌ１結合分析
マスキングドメインとして使用されたＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１部位の生物活性の代わりとして、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１を発現するＣＨＯ細胞に対する修飾バリアントの結合を以下のように決定した。
方法
ＣＨＯ細胞のトランスフェクション
ＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）を１％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で培養した。Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してトランスフェクションを実施した。ＣＨＯ－Ｓ細胞を計数し、ＰＢＳで２回、再懸濁緩衝液Ｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で１回洗浄した後、１００ Ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁した。ＰＤ－１、ＰＤＬ－１またはＧＦＰプラスミドＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を１ｕｇ／１ Ｅ６細胞で添加した。ネオンチューブに３ｍＬの電解緩衝液Ｅ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を充填した。１００μＬのネオンチップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、各プラスミドのトランスフェクションを以下の設定で行った：電圧－１６２０、幅－１０、パルス－３。トランスフェクトした細胞を予め温めたフラスコに各条件につき１ Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で移した。
フローサイトメトリーによるＰＤ１／ＰＤＬ１
実施例２で精製されたバリアント及び実施例５でｕＰａ処置されたバリアントを、２００ｎＭからｖ底９６ウェルプレート（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）において直接的に１：３の希釈率でタイトレーションした。ＣＨＯ－ＰＤ１、ＣＨＯ－ＰＤＬ－１、及びＣＨＯ－ＧＦＰ細胞を解凍し、１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．ＵＳＡ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ａ１０４９１０１、ＡＴＣＣ改変）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）中に再懸濁した。ＣＨＯ－ＰＤ１細胞及びＣＨＯ－ＰＤＬ－１細胞のそれぞれをＣＨＯ－ＧＦＰ細胞と２：１で合わせ、２０ｕＬの細胞懸濁液をタイトレーションされたバリアントを含むプレートに添加した。細胞をバリアントと４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１ｕｇ／ｍＬの二次抗体ＡＦ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を、１０００倍に希釈した生死判定色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
アッセイの読み取りには、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｒｕｇｒａｍ，Ｉｎｄｉａ）でのフローサイトメトリーによって、ＡＰＣ蛍光の幾何平均を測定した。非特異的結合は、ＧＦＰ陽性細胞のＡＰＣ蛍光幾何平均を測定することによって決定した。Ｍａｃ ＯＳ Ｘ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してグラフを生成した。
結果
図８に示されるように、ＰＤ－Ｌ１（Ａ）またはＰＤ－１（Ｂ）への結合は、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）のマスクされたバリアント（３０４２３、３０４２６、３０４３０、３０４３６）では観察されなかった。重鎖または軽鎖のいずれかに結合された親和性成熟ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１部位のみを含むバリアントは、それぞれ０．３ｎＭ及び６ｎＭのＩＣ５０を有する結合を示した。非切断性バリアント（３０４２３、３０４２６）は、プロテアーゼ（＋ｕＰａ）で処置された場合、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に結合しなかったが、ＦａｂとＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１マスクとの間にｕＰａ切断配列を含有するｕＰａで処置された試料については、部分的な結合が回復した。具体的に、ＰＤ－Ｌ１への結合は、３０４３０で部分的に回復し、関連する片側マスク対照３１９２９（Ａ）の５３倍以内であった。ＰＤ－１への結合は、３０４３６で部分的に回復し、片側マスク対照３１９３１（Ｂ）の１２倍以内であった。これは、プロテアーゼによって切断された場合に、これらのバリアント上に残されるように設計された免疫調節因子（３０４３０のＰＤ－１、３０４３６のＰＤ－Ｌ１）の特性と一致する。ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスク（３０４２１）を含まないバリアント及び無関係の対照（２２２７７）は、予想とおり、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１への結合を示さなかった。ＪＩＭＴ－１を標的細胞として使用する別の実験では、重鎖に付加された非機能性ＰＤ－１ドメインを含むバリアント（３２４９７）は、マスクされていない対照（ｖ３０４２１）と比較して、ＴＤＣＣ効力の減少を示したが（５５倍のＥＣ５０、図３３）、機能性ＰＤ－１（３１９２９）を含む同等のバリアントは、先に見られたマスクされていない対照（ｖ３０４２１）と比較して、ＴＤＣＣ効力の増加を示した（０．２倍のＥＣ５０）。
実施例９ ハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤ－１マスクの機能性付加の調査
バリアントのＴ細胞係合機能に加えて、マスクのＰＤ－１部位によるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイント係合のブロッキングを調査するために、カスタムハイブリッドＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を以下のように実施した。
方法
１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地中で培養したＪＩＭＴ－１（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０％ウシ胎仔血清が補充されたＡＴＣＣ改変ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地で培養したＨＣＣ１９５４ （ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及びＨＣＣ８２７（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、１０％ウシ胎仔血清及び０．０１ｍｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が補充されたＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地中で培養したＭＣＦ－７（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ならびに１０％ウシ胎仔血清が補充されたＡＴＣＣ改変ＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養したヒトＰＤ－１及びＮＦＡＴ誘導ルシフェラーゼを安定して発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃ Ｊ１２５０，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、アッセイのセットアップ前に、Ｔ－７５またはＴ－１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内でインキュベーターにおいて３７℃で５％二酸化炭素で維持した。実験日に、バリアントを、１５０ｎＭから０．８５ｐＭまで３８４ウェルのローフランジ白平底ポリスチレンＴＣ処置済みマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ＃３５７０，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において直接的にウェルあたり２０ｕＬの総量で１：３の希釈率で三連でタイトレーションした。細胞解離緩衝液を使用して腫瘍細胞を解離し、１％ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０中、Ｊｕｒｋａｔ細胞と１：１の比で混合した。２０ｕＬの混合細胞懸濁液をタイトレーションされたバリアントを含有するプレートに添加した。プレートを３７℃で５％二酸化炭素で１６時間インキュベートした。インキュベート後、４０ｕＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃ Ｇ７９４０，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を泡が形成されないように確認しながらすべてのウェルに添加し、プレートをマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）のルミネセンスモードで１５０のゲインを用いて１０分後に読み取った。アッセイのセットアップの概略図を図９Ａに示す。
結果
マスクによる機能付加を調べるためのカスタムＲＧＡの分析を図９Ｂに示す。Ｔ細胞と腫瘍細胞を架橋することが可能なマスクされていないバリアント（３０４２１）と飽和量（１５０ｎＭ）の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて細胞を処置すると、高いＲＧＡ応答が見られた。マスクされていない二重特異性ＣＤ３×Ｈｅｒ２抗体は、Ｔ細胞と腫瘍細胞を生産的に架橋することができたが、高濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合を堅固にブロックするため、すべての試験バリアント濃度にわたって、高いシグナルをもたらした。逆に、マスクされていないバリアント（３０４２１）のみで処置した場合、修飾されたＴ細胞とＪＩＭＴ－１細胞との間のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の係合により、シグナルは有意に減少した。ｕＰａ（－ｕＰａ）で処置されていない非切断性（３０４２３）及び切断性（３０４３０）のマスクされたバリアントは、マスクされていない３０４２１と比較して、１０ｎＭを下回るバリアント濃度で有意な活性の減少を示すことから、ＣＤ３パラトープの立体障害によるＴ細胞エンゲージャー機能の生産的阻害を示している。ｕＰａ－処置されていない３０４３０の試料は、３０４２３よりもＲＧＡ応答を誘発する力が強かった。ｕＰａ（＋ｕＰａ）で処置した場合、切断性マスクされたバリアント（３０４３０）は、１００ｐＭを超えるバリアント濃度で、マスクされていない対照（３０４２１）よりも高いＲＧＡ活性を示したことから、ＣＤ３パラトープのマスク解除及び切断後にバリアントに残されたマスクの機能性ＰＤ－１部位によるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイントの係合ブロックを示している。この所見と一致して、ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖にＰＤ－１ドメインだけが結合した対照も類似のプロファイルを示し、マスクされていない対照（３０４２１）と比較した場合、１００ｐＭを超えるバリアント濃度でＲＧＡ活性の増加を示した。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）は、ＲＧＡ活性を示さなかった。
実施例７で決定されるように、ＪＩＭＴ－１をＨｅｒ２及びＰＤ－Ｌ１陽性細胞株として使用するＲＧＡを繰り返し、それらの受容体レベルが異なる３つの他の細胞株に拡大した。ここで実施したＲＧＡのデータを図２６に示す。ＥＣ５０増加によって測定される非切断性（３０４２３）及び切断性（３０４３０）のマスクされたバリアントのマスキングは、すべての細胞株で確認され、マスクされていない対照（３０４２１）と比較して、４～５３０倍の範囲であった。マスクされていない対照（３０４２１）の効力は、細胞株間で同等であったが（ＥＣ５０＝２０－５０ｐＭ）、Ｈｅｒ２及び／またはＰＤ－Ｌ１受容体数が少ない細胞株（ＨＣＣ８２７及びＭＣＦ－７）で試験したバリアントは、受容体の発現が高い細胞株（ＨＣＣ１９５４及びＪＩＭＴ－１）よりも強いマスキングを示した。ｕＰａ（＋ｕＰａ）で処置すると、切断性のマスクされたバリアント（３０４３０）は、マスクされていない対照の１．７～３．６倍以内に効力を回復した。重鎖にＰＤ－１部位のみが結合したバリアント（３１９２９）、ｕＰａ処置後の切断性マスクされたバリアント（３０４３０＋ｕＰａ）及びマスクされていない対照と飽和量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせ（３０４２１＋１２０ｎＭアテゾリズマブ）は、ＰＤ－Ｌ１にも係合する能力があるため、ＰＤ－Ｌ１が顕著に発現している細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１、ＨＣＣ８２７）において、より高い効果を示した（１．６～３．３倍高い最大ＲＬＵ）。ＴＡＡ及びＰＤ－Ｌ１の発現が高い細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＪＩＭＴ－１）でも、これらのバリアントは、高い効力を示した（ＥＣ５０で０．２～０．４倍）。ＰＤ－Ｌ１の発現が極めて低い細胞株（ＭＣＦ－７）では、マスクされていない対照（３０４２１）とＰＤ－Ｌ１に係合が可能なもの（３１９２９、３０４２１＋１２０ｎＭアテゾリズマブ、３０４３０＋ｕＰａ）との間に差は示されなかった。無関係の抗ＲＳＶ抗体（２２２７７）は、細胞株のいずれにおいてもＲＧＡで活性を示さなかった。
実施例１０ マスクされた抗ＥＧＦＲ、抗メソテリン、抗ＴＦ、抗ＣＤ１９、抗ｃＭｅｔ及び抗ＣＤＨ３バリアントの調製
異なる抗原を標的とする抗体へのマスキング技術の適用性を調査するために、いくつかの異なるエピトープに対して標的指向化されたｍＡｂの可変ドメインをＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体を含むマスキングドメインに付加した。融合タンパク質構築物を以下のように設計した。
方法
ヒトＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１のＷＴ及び修飾されたＩｇＶドメインのタンパク質配列を、非切断性及びｕＰａ切断性リンカーを介して、実施例１に記載されるように、いくつかの異なるエピトープ（ＥＧＦＲ、メソテリン、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３）に対して標的指向化された抗体のＩｇＧ１重鎖及びカッパ軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）のＮ末端にそれぞれ融合させた。ＶＬ配列及びＶＨ配列ならびにその供給源を表２に記載する。実施例１の構築物との顕著な違いは、ホモ二量体完全サイズ抗体のアセンブリを可能とする野生型（ＷＴ）ＣＨ３（配列番号１２）の使用である。マスクされたＦａｂのための構築物設計の概略図及び意図された作用のメカニズム（ＭｏＡ）は、図１に示されている。最終設計である２つの同一の重鎖及び軽鎖を含む二価の完全にマスクされたｍＡｂの概略図は、図１０に示されている。最終バリアントの使用配列は、表Ｂに列挙される。
（表Ｂ）
（表Ｃ）
実施例１１ マスクされた抗ＥＧＦＲ、抗メソテリン、抗ＴＦ、抗ＣＤ１９、抗ｃＭｅｔ及び抗ＣＤＨ３バリアントの産生
実施例１０で設計した、修飾されたバリアントの配列を、以下のように、発現ベクターにクローニングし、発現させ、精製した。
方法
実施例１０から得たいくつかの異なるエピトープ（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３）に対して標的指向化された修飾されたバリアントの重鎖及び軽鎖配列を等モル比でＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞にトランスフェクトし、その他は実施例２に記載されるように発現及び精製した。
結果
高純度の試料を得るために、実施例２に記載の分取ＳＥＣを使用した。分取ＳＥＣ後の収率は、バリアント当たり１．５～６ｍｇの範囲であった。試料純度を実施例１２に記載のとおりに評価した。
実施例１２ マスクされた抗ＥＧＦＲ、抗メソテリン、抗ＴＦ、抗ＣＤ１９、抗ｃＭｅｔ及び抗ＣＤＨ３バリアントの品質評価
実施例１０の精製された試料を、以下に記載されるようにＵＰＬＣ－ＳＥＣ及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって純度及び試料均質性について評価した。
方法
非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、２μＬの試料を１０μＬのＰＢＳで希釈し、次いで、４μＬの４Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と混合した。次いで、試料を９５℃で５分間加熱し、付属のＴｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液中、ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ４－２０％ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ （ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上を走らせた後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ－２５０で染色し、脱染色し、画像化した。ＵＰＬＣ－ＳＥＣならびに非還元及び還元ＣＥ－ＳＤＳを実施例３に記載のとおりに実施した。
結果
図１１Ａ～Ｊにおける分取ＳＥＣ精製後の試料のＵＰＬＣ－ＳＥＣトレースは、８５％～９８％の正しい種を含有していた均質な試料を示した。主要種と比較した短保持時間での小さなピークの存在は、すべての試料において少量の高分子量種、例えば、オリゴマー及び凝集物の存在を示している。これらの高分子量種は、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ｃ－Ｍｅｔ及びＣＤＨ３を標的とした試料と比較して、ＣＤ１９及びＥＧＦＲを標的とした試料でより顕著であった。
非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＣＥ－ＳＤＳの分析（図１１Ｋ、Ｌ）では、すべてのバリアントで単一の主要な種が示された。特に、この種の見かけの分子量は、予期されたものよりも有意に高い（＞２５０ｋＤａ対２００ｋＤａ）。ｃ－Ｍｅｔ及びＣＤＨ３に対して標的指向化された代表的なバリアントの還元ＣＥ－ＳＤＳは、インタクトな重鎖及び軽鎖に対応するバンドのみを示した。これらは、実施例３に示されるのと同じ高い見かけの分子量を示している。設計におけるＰＤ１及びＰＤ－Ｌ１部位の両方のグリコシル化は、見かけの分子量の増加を引き起こす可能性が高い（Ｔａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌｏｏｐ ｉｎ ＰＤ－１ ｄｏｍｉｎａｔｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｎｉｖｏｌｕｍａｂ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８，１４３６９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４３６９（２０１７）、Ｌｉ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ－１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７，１２６３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２６３２（２０１６））。
実施例１３ マスクされた抗ＥＧＦＲ、抗メソテリン、抗ＴＦ、抗ＣＤ１９、抗ｃＭｅｔ及び抗ＣＤＨ３バリアントのｕＰａ切断
リンカー中の意図されたプロテアーゼ部位の切断による、いくつかの異なるパラトープのＦａｂからのマスクの一部またはすべての放出を評価するために、実施例１１で産生された選択した試料をｉｎ ｖｉｔｒｏでｕＰａで処置した。反応を以下のように還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニタリングした。
方法
異なるエピトープを標的とする修飾されたバリアントの分取切断アッセイを、実施例５に記載のとおりに設定し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、試料の変性に還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を使用することを除き、実施例１２に記載されるように設定した。還元緩衝液は、４Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に１０％β－ＭＥを添加することによって得た。
結果
ｕＰａ切断配列を含有しないバリアントは、試験した条件下でいかなるプロセシングも示さなかったが、ＰＤ－Ｌ１部位とＦａｂのＶＬとの間にｕＰａ特異的配列を含むバリアントはすべて、完全な切断（図１２）及び軽鎖からのＰＤ－Ｌ１ドメインの放出を示した。これは、保護されていないカッパ軽鎖について予想されるように、ｕＰａ処置後にＬＣの見かけのＭＷが約２５ｋＤａに減少していることによって認められた。異種グリコシル化（Ｌｉ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ－１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７，１２６３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２６３２（２０１６））及び低分子量（約１３ｋＤａ）に起因する可能性が高いが、ＥＧＦＲ及びＴＦに対して標的指向化されたバリアントでは、遊離ＰＤ－Ｌ１部位は検出されなかった。ＭＳＬＮ及びＣＤ１９では、見かけの分子量１５～２０ｋＤａの種を示す、かすかなバンドが検出された。
実施例１４ 抗ＥＧＦＲ、抗メソテリン、抗ＴＦ、抗ＣＤ１９、抗ｃＭｅｔ及び抗ＣＤＨ３バリアントのマスキング／マスク解除
異なるパラトープ／エピトープ対の標的結合を、実施例１１で産生され、実施例１３のｕＰａで処置された試料について、ＳＰＲ及びフローサイトメトリーによって以下のように評価した。
方法
フローサイトメトリーによるネイティブ結合
目的のものを含有する表面タンパク質を発現する様々ながん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＯＶＣＡＲ３、ＭＤＡ－ＭＢ４６８、Ｒａｊｉ）を、加湿＋５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃でＬ－グルタミン及び適切な濃度の血清が補充された推奨培養培地（完全培地）中で維持した。
異なるエピトープに対して標的指向化された修飾されたバリアントを完全培地で２倍希釈し、続いて、冷えた完全培地で３倍連続希釈し、３００ｎＭまたは１５０ｎＭから始まる合計８～１０の濃度点とした。
培地はすべて４℃に維持し、インキュベートはすべて濡れた氷上で行った。アッセイの日に、指数関数的に増殖する細胞を温かい非酵素的細胞解離溶液を使用して回収し、遠心分離し、２Ｅ＋０６細胞ｓ／ｍＬの細胞密度で完全培地中に再懸濁した。５０μＬ／ウェルの細胞をポリプロピレンｖ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に分配した。等体積の２Ｘ試験抗体または対照を細胞に添加し、２時間インキュベートした。次いで、細胞を遠心分離により２回洗浄し、上清を除去した。結合したバリアントの検出は、蛍光標識したＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）と１時間さらにインキュベートすることによって達成した。細胞を遠心分離により２回洗浄し、細胞ペレットをヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む完全培地中に再懸濁し、ポアサイズ０．６０μｍの９６ウェルフィルタープレート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して濾過し、ＨＴＳ自動化サンプラーユニット（ＢＤ－ＬＳＲＩＩまたはＢＤ－ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａに搭載）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。試料あたり２０００個の生／単一細胞のイベントを取得した。
陰性対照（バックグラウンド）のＭＦＩ値を差し引くことにより、各試料ポイントの特異的ＭＦＩを算出した。結合曲線（特異的ＭＦＩに対する線形または対数抗体濃度）を、ヒルスロープを用いた１部位特異的４パラメータ非線形回帰曲線フィッティングモデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてフィッティングして、各試験品についてのＢｍａｘ及び見かけのＫｄ値を決定した。
ＳＰＲ
修飾したｍＡｂバリアントに対する異なる抗原（ＥＧＦＲ、ＴＦ、メソテリン）のサブセットのカイネティクス及び親和性を決定するＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）結合アッセイは、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）ランニング緩衝液を用いて２５℃の温度でＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）で実施した。ＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサーチップ、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングキット（ＮＨＳ、ＥＤＣ及び１Ｍエタノールアミン）及び１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液はすべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳランニング緩衝液（ＰＢＳ－Ｔ）は、Ｔｅｋｎｏｖａ Ｉｎｃ．（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。ヤギポリクローナル抗ヒトＦｃ抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。ヒトＥＧＦＲ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ＃Ｚ０３１９４－５０）及び成熟ヒトメソテリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃３２６５－ＭＳ－０５０）の細胞外ドメインの組換えタンパク質を購入し、アナライトの純度及び均質性を確実にするために、ＳＰＲ分析の前にＳＥＣにより精製した。ヒトＴＦの組換えタンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、アニオン交換（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製し、続いて、ＳＥＣ精製を行った後、ＳＰＲに使用した。
異なる抗原への結合についてのｍＡｂバリアントのスクリーニングは、抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体表面上のｍＡｂバリアントの間接的捕捉と、それに続く、５つの濃度のＳＥＣ精製抗原の注入の２段階で行った。抗ヒトＦｃ表面は、製造元（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって記載される標準的なアミンカップリング法によって、ＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサーチップ上に調製した。簡潔に述べると、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化の直後に、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ中の抗ヒトＦｃの２５μｇ／ｍＬ溶液（ｐＨ４．５）を、およそ４５００レゾナンスユニット（ＲＵ）が４つのフローセルすべてで固定化されるまで、１０μＬ／分の流速で７分間注入した。残存する活性基は、１Ｍエタノールアミンを１０ｕＬ／分で７分間注入することによってクエンチした。分析のためのＭＡｂは、２～２０μｇ／ｍＬの溶液を１０μＬ／分の流速で６０秒間注入することによって抗Ｆｃ表面上に間接的に捕捉させ（フローセル２～４）、ｍＡｂバリアントに応じて１３０～４７０ＲＵの範囲のｍＡｂ捕捉レベルを得た。シングルサイクルカイネティクスを使用して、５濃度の２倍希釈系列の抗原を、リファレンスフローセル１を含むすべてのフローセルに４０μＬ／分で順次注入し、すべてのフローセルに対する緩衝液ブランク注入を対照とした。アナライトの濃度範囲ならびに接触及び解離時間に関する詳細は、表５３を参照されたい。抗ヒトＦｃ表面は、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０μＬ／分で１２０秒の１パルスによって、次の注入サイクルのために再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．０を使用して二重参照を差し引いたセンサーグラムを分析し、次いで、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。
（表Ｄ）
結果
図１３は、すべての非切断性バリアント（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨ３に対してそれぞれ３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２、２８６４７、２８６６４のバリアント）の抗原結合が、対応するマスクされていない対照（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９、ｃＭｅｔ、ＣＤＨに対してそれぞれ３２４７４、１６４１７、６３２３、４３７２、１７６０６、１７２１４のバリアント）と比較して、細胞結合試験において決定した場合、３０～１９０倍減少したことが示されている。切断性バリアントが含まれる場合、試料は、ｕＰａ処置なし（－ｕＰａ）及びｕＰａ処置あり（＋ｕＰａ）で試験した。非切断性バリアント（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９に対してそれぞれ３１７２２、３１７２８、３１７３６、３１７３２）は、非切断試料とｕＰａ処置された試料との間で、わずかな差異しか示さなかったが、切断性試料（ＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＴＦ、ＣＤ１９に対してそれぞれ３１７２３、３１７２９、３１７３７、３１７３３）は、ｕＰａ処置すると、有意に結合を回復した。具体的には、プロテアーゼに供する前の結合レベルは、非切断性バリアントと同様であったが、ｕＰａで切断すると、結合は、マスクされていない対照の１．３～８５倍以内に回復した。利用可能な場合（ＥＧＦＲ、ＴＦ、メソテリン）、ＳＰＲ結合結果は、マスキング及び切断後の結合回復について、同じ傾向を示している。
実施例１５ マスクされた抗ＥＧＦＲバリアントの機能分析
実施例１１で産生され、実施例１３のｕＰａで処置され、実施例１４の標的結合について試験したＥＧＦＲ標的指向化バリアントの機能に対するマスクの影響をセルベースアッセイで調査するために、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞における成長阻害試験を以下のように実施した。
方法
このアッセイのために、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞を、７５ｃｍ２（Ｔ７５）フラスコ中、３７℃＋５％ＣＯ２で常法的に培養し、抗生物質を添加しないＦＢＳ培養培地で週に２回継代した。細胞を、抗体を添加する前日に、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３５７０）で、１ｍＬあたり１０００単位のペニシリン、１０００μｇのストレプトマイシン、及び２．５μｇのアンホテリシンＢを添加した培養培地中、３００、１０００及び１２５細胞／２５μＬ／ウェルで播種した。アッセイ日に、抗体及び対照を１１点の用量反応曲線で所望の最終濃度の６倍に連続希釈し、次いで、表５に記載される最終インキュベート濃度でプレーティングした細胞に添加した。バリアント濃度範囲。３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした後、細胞増殖に対する効果を測定した。非標的に対する細胞傷害を評価するために、無関係の抗体（２２２７７）とのインキュベートを使用した。代謝的に活性な細胞の存在を示す各ウェルに存在するＡＴＰの定量に基づいて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、細胞生存率を決定した。シグナル出力は、積分時間０．１秒に設定したルミネセンスプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。積分時間を調整して、高ＡＴＰ濃度でのシグナル飽和を最小限にする。
相対発光量（ＲＬＵ）で表されるデータは、未処理の対照ウェルに対して正規化し、次式に従って算出される生存率として表される：
生存率（％）＝ＲＬＵ Ａｂ／ＲＬＵ 未処理×１００。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、用量反応曲線を作成して、有効性（高濃度で観察される最大飽和成長阻害反応）及び効力（相対ＩＣ５０、最大効果の半分に達するために必要な濃度）を測定した。
（表Ｅ）
結果
図１４に示されるように、セツキシマブベースの抗ＥＧＦＲ抗体（３２４７４）は、０．１１ｎＭのＩＣ５０でＮＣＩ－Ｈ２９２細胞の成長を阻害した。ｕＰａでの処置は、この機能にほとんど影響を与えなかった。ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたバリアント（３１７２２、３１７２３）は、ｕＰａで処置しない場合、効力が弱かった（ＩＣ５０の４０～８０倍の増加）。ｕＰａで処置した場合、非切断性のバリアント３１７２２は、依然として機能が著しく阻害されるが（１００倍）、切断性３１７２３は、マスクされていないｖ３２４７４の２．５倍以内の機能の回復を示した。無関係の抗体（２２２７７）は、成長阻害アッセイで機能を示さなかった。
実施例１６ マスクとしてのＢ７：ＣＤ２８ファミリーリガンド受容体対－ＣＴＬＡ４：ＣＤ８０
Ｂ７：ＣＤ２８ファミリーの他のメンバーがＦａｂの効率的なマスキングに利用できるかどうかを決定するために、以下のように、実施例１のＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃ抗体のＣＴＬＡ４：ＣＤ８０でマスクされたバージョンを作製し、ＣＤ３結合について評価した。
方法
マスクされたＣＴＬＡ４：ＣＤ８０ ＣＤ３ Ｆａｂを、実施例１のＰＤ１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたバリアントと同様に設計した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ８０及びＣＴＬＡ４のＩｇＶドメインの配列（Ｗｅｓｔ，Ｓ．Ｍ．＆ Ｄｅｎｇ，Ｘ．Ａ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ Ｂ７－ＣＤ２８ ａｓ ａ ｆａｍｉｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ），１５３５３７０２１９８５５９７０，ｄｏｉ：１０．１１７７／１５３５３７０２１９８５５９７０（２０１９）；配列番号２５、２６）を、実施例１及び実施例１０に記載されるリンカーの組み合わせのうちの１つを使用して、ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端にそれぞれ付加した。具体的には、ＣＴＬＡ４ ＩｇＶドメインは、ｕＰａ切断性配列でＬＣに融合され、ＣＤ８０部位は、プロテアーゼによって除去されないようにした。調査したバリアントの構造の概略図は、図１５に示されている。また、先に記載されているＣＤ８０を介したホモ二量化を減少させるために（Ｃ．Ｃ．Ｓｔａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７－１／ＣＴＬＡ－４ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０，６０８－６１１（２００１））、いくつかのバリアントでは、変異をＣＤ８０部位に導入した。バリアントの個々の鎖の配列は、表Ｆに列挙されている。抗体の産生、その試料純度及びｕＰａによる切断の評価、ＣＤ３保有Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合の評価を、それぞれ実施例２、実施例３、実施例５及び実施例６と同様に行った。
（表Ｆ）
結果
ＣＴＬＡ４：ＣＤ８０ベースのマスクを保有する修飾されたＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃバリアント（３０４４４）の産生により、分取ＳＥＣ後、６．７ｍｇが得られ、実施例２における同等のＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１マスクされたバリアントと類似の量であった。プロテインＡ精製後のＵＰＬＣ－ＳＥＣ分析（図１６Ａ）は、主要な種として二量体を示し、これは、ＣＤ８０とＣＴＬＡ４のホモ二量化界面がヘテロ二量体界面と離れていることと一致する（Ｔｒａｎｇ，Ｖ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｍａｓｋｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７，７６１－７６５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０１９－０１３５－ｘ（２０１９））。アグリゲート及びオリゴマーなどの高分子量種も相当量観察され、これらの望ましくない粒子を除去するために、分取ＳＥＣを実施した。最終のＳＥＣで精製した試料のＵＰＬＣ－ＳＥＣ（図１６Ｂ）は、二量体種８４％及び単量体種９％を示した。さらに、７％の高分子量種がまだ存在した。非還元ＣＥ－ＳＤＳ（図１６Ｃ）は、インタクトな分子に対して予期されるものよりも有意に高い分子量である単一の主要な種に対応するプロファイルを示した。修飾された重鎖及び軽鎖のバンドは、還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルにおいて、予想よりも有意に高い見かけの分子量を示している。実施例３におけるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースの修飾と同様に、これは、ＣＤ８０及びＣＴＬＡ４の広範なグリコシル化によって生じた可能性が高い（Ｓｔａｍｐｅｒ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７－１／ＣＴＬＡ－４ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０，６０８－６１１，ｄｏｉ：１０．１０３８／３５０６９１１８（２００１））。ＣＤ８０部位のホモ二量化界面に変異を導入した場合、プロテインＡ精製後のＵＰＬＣ－ＳＥＣに見られる二量体種の量は、１９～５９％に減少したのに対し、単量体種の量は、２８～６６％に増加した（図１６Ｄ～Ｆ）。
ｕＰａで処置した場合、ＣＴＬＡ４部位は、図１７で見られるように、軽鎖から効果的に除去された。ここでは、切断によって、修飾された軽鎖に対応するバンドが消失し、マスクされていない軽鎖の分子量に対応するバンドが出現した。放出されたＣＴＬＡ４成分は、切断後に検出されなかったが、これはサイズが小さく、グリコシル化によって不均質になったことに起因すると思われる。
Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合の評価を実施例６に記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価すると（図１８）、ＣＤ８０：ＣＴＬＡ４ベースの修飾（ｖ３０４４４）が標的結合を約８０倍減少させたことを示した。これは、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを含む同等のバリアントで見られたものと同様である（実施例６、ここでは参照のためにｖ３０４３０が含まれる）。ＣＴＬＡ４部位をｕＰａで切断すると、ＣＤ３結合は、部分的に回復する（ＷＴの約４倍以内）。
実施例１７ マスクされた免疫調節因子－Ｆｃ融合体に基づいた条件付き活性免疫調節因子
本実施例において、免疫調節性対（例えば、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１（表Ｇ）、ＣＤ８０：ＣＴＬＡ－４）は、標的指向化されていない、条件付き活性化分子として使用される。ここで、免疫調節性対は、特定のパラトープに関してマスキング機能を果たすのではなく、以下のようにＦｃに直接融合している。
方法
ここで調査した構築物は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１などの免疫調節因子対のＩｇＶドメインに基づき、これらは、ヘテロ二量体ＩｇＧ ＦｃのヒンジにＮ末端で融合している。これらの構築物のＦｃ部分は、前述のように２つの鎖のヘテロ二量体対合を促進させる変異をＣＨ３ドメインに含有する（例えば、Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｏ ａｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐａｂｉｌｉｔｙ：ｑｕａｌｉｔｙ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ．ＭＡｂｓ ５，６４６－６５４，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｍａｂｓ．２５６３２（２０１３）；配列番号４，５；他のヘテロ二量体Ｆｃ形成変異も文献で入手可能である）。一実施形態では、変異はまた、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、両方のＣＨ２ドメインに導入される（配列番号６）。１つの免疫調節因子ＩｇＶドメイン（例えば、ＰＤ－１の高親和性バージョン、Ｍａｕｔｅ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＰＤ－１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏ－ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１２，Ｅ６５０６－６５１４，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５１９６２３１１２（２０１５）、配列番号９）がＩｇＧヒンジのＮ末端に直接融合され、ｕＰａ（ＭＳＧＲＳＡＮＡ）によって認識され切断されるアミノ酸配列が他の鎖上のヒンジと他の免疫調節性ＩｇＶドメイン（例えば、ＷＴ ＰＤ－Ｌ１、配列番号８）の間に導入される。
この設計により、プロテアーゼ切断性ペプチドリンカーを介してＩｇＧ Ｆｃに直接融合された、条件付きで活性となる一価のＰＤ－Ｌ１ターゲティング分子がもたらされる（図１９）。ｕＰａがない場合、高親和性ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１二量体は、分子内で形成され、望ましくないＰＤ－Ｌ１への全身的な結合が阻止される。例えば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において、ｕＰａに曝されると、ＰＤ－Ｌ１が放出され、ＰＤ－１部位が腫瘍細胞上に発現するＰＤ－Ｌ１に結合する。それによって、ＴＭＥにおいて、チェックポイント活性が選択的にブロックされ、腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞に対する感受性が高まる。ＣＤ８０：ＣＴＬＡ－４またはＳＩＲＰａ：ＣＤ４７などの他の免疫制御性リガンド受容体対もマスクとして使用される。ＣＤ８０：ＣＴＬＡ－４の場合、右のＴＭＥ関連プロテアーゼの存在下でのみ、ＣＴＬＡ－４が放出され、残存するＣＤ８０がＴ細胞上のＣＤ２８またはＣＴＬＡ－４に結合して、その免疫調節性機能を発揮することができる。ＳＩＲＰａ：ＣＤ４７マスクの場合、ＣＤ４７部位は、ＴＭＥにおけるタンパク質分解切断によって放出され、ＳＩＲＰαは、マクロファージ上のＣＤ４７に自由に結合できるように残されるため、チェックポイント活性が阻害され、貪食及び腫瘍細胞殺傷が増加する。
ｕＰａで処置したまたは処置しないバリアントを、実施例８に記載するように、フローサイトメトリーによってＰＤ－Ｌ１への結合について試験する。同じ試料をＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害に対して感受性のレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）で試験する（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）。ＲＧＡは、ＰＤ－Ｌ１を発現しＴＣＲ指向性であるＣＨＯ細胞を、製造業元のプロトコルに従って改変Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞とともに使用することを除き、実施例９のＲＧＡと同様に実施される。
（表Ｇ）
結果
ｕＰａで処置しない場合、ＺＷ Ｆｃ１は、フローサイトメトリーアッセイでＰＤ－Ｌ１に結合しない。これは、Ｆｃアセンブリにおける、ＰＤ－１ ＩｇＶドメインの高親和性バージョンとＰＤ－Ｌ１との強固な分子内相互作用による。ｕＰａで処置した場合、ＺＷ Ｆｃ１は、ＳＰＲ及びフローサイトメトリーアッセイでＰＤ－Ｌ１に強固に結合する。これは、リンカー中のｕＰａ特異的配列が切断された後、ＰＤ－Ｌ１部位が放出され、Ｆｃ上に残存するＰＤ－１ドメインがアッセイでＰＤ－Ｌ１と自由に結合するためと予想される。同様に、ｕＰａによる切断がないＺＷ Ｆｃ１は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ ＲＧＡにおいて活性を有さないが、ｕＰａで処置すると強固な活性を示す。
実施例１８ 抗ＣＤ４０システムにおけるマスキング技術の評価
実施例１～１５に記載されるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクをＣＤ４０標的指向化パラトープに適用し、得られたバリアントの試料品質、標的結合及び機能に対するマスクの影響を以下のように評価した。
方法
バリアントの設計及び産生
先に記載されている抗ＣＤ４０パラトープを含有するフルサイズ抗体（Ｒ． Ｈ． Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＰ－８７０，８９３， ａ ｎｏｖｅｌ ＣＤ４０ ａｇｏｎｉｓｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２５， ８７６－８８３ （２００７））のＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１マスクバージョンを実施例１０に記載されるように構築した。得られた構築物及びその配列を表Ｈにまとめる。
（表Ｈ）
所望のバリアントの重鎖及び軽鎖配列を発現ベクターに導入し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞で発現させ、実施例１１に記載される２段階精製プロセスを使用して精製した。次いで、精製された試料を、実施例３に記載されるようにＵＰＬＣ－ＳＥＣ及び非還元ゲル電気泳動によって純度及び試料均質性について評価した。精製後、試料をｕＰａで処置し、そのプロセシングを実施例５に記載されるように非還元ＣＥ－ＳＤＳによって評価した。次いで、ｕＰａ－で処置されていない試料及びｕＰａで処置された試料の両方を、実施例１４に記載されるようにフローサイトメトリーによってＲａｊｉ細胞に対する標的結合について評価した。
ＣＤ４０ ＲＧＡ
ｕＰａで処置されていない（－ｕＰＡ）バリアント及びｕＰａで処置された（＋ｕＰＡ）バリアントを機能的に評価するために、ＣＤ４０レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を実施した。ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ，ｈｋｂ－ｃｄ４０ Ｌｏｔ ３８－０１－ｈｋｂｃｄ４０）細胞をＰＢＳで剥離し、次いで、２．７８×１０５細胞／ｍＬで、予め温めた試験培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＳ，ＵＳＡ，１１９５－０４０）＋１０％熱不活化Ｇｉｂｃｏ（商標）ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＳ，ＵＳＡ，１２４８３－０２０ Ｌｏｔ １９９６１６０）（５６℃、３０分）及び１００Ｕ／ｍＬのＧｉｂｃｏ（商標）Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＳ，ＵＳＡ，１５０７０－０６３ Ｌｏｔ １９８９５１０））中に再懸濁した。ＷＴ－ＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１，Ｌｏｔ ７００１４３１０）及びＦｃｇＲ２Ｂ－ＣＨＯＫ１細胞（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ，７９５１１，Ｌｏｔ １９１１０４－４１）をトリプシンで剥離し、５．５６×１０５細胞／ｍＬで試験培地を用いて再懸濁した。次いで、２５，０００個のＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＣＤ４０細胞（９０μＬ）を、試験培地で連続希釈した（１０μｇ／ｍＬ～０．０００００１μｇ／ｍＬ）バリアント２０μＬに添加し、続いて、５０，０００個のＷＴ－ＣＨＯＫ１細胞、ＦｃＹＲ２Ｂ－ＣＨＯＫ１細胞（９０μＬ）または９０μＬの試験培地を添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２０～２４時間インキュベートした後、２０μＬの上清を１８０μＬのＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合し、３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートし、ＯＤ６２０ｎｍを測定した。試験品には、ｕＰａで処置されていない及びｕＰａで処置されたＣＤ４０標的指向化バリアントだけでなく、陰性対照及び陽性対照としてそれぞれＲＳＶ及びＣＤ４０Ｌ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対して標的指向化された無関係の対照抗体も含まれた。
結果
図２０Ａ～Ｃに示されるように、ＳＥＣ精製後、抗ＣＤ４０バリアントは、ＵＰＬＣ－ＳＥＣにおいて、９２％～１００％の純度で１つの主要な種を示し、マスクされたバリアントｖ３２４７８及びｖ３２４７９では、少量の高分子量種（７～８％）が存在した。非還元ＣＥ－ＳＤＳ分析（図２０Ｄ）でも、すべてのバリアントで単一の主要な種が示された。マスクされていないｖ３２４７７の主要な種の見かけの分子量は、予想されたように約１５０ｋＤａであったが、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたバリアントｖ３２４７８及びｖ３２４７９は、著し高い見かけの分子量（＞２５０ｋＤａ）を示し、これは、実施例３及び実施例１２において同じマスキングドメインを使用した構築物で見られたように、グリコシル化に起因するものと思われる。還元ＣＥ－ＳＤＳ（図２０Ｄ）は、すべてのバリアントで重鎖及び軽鎖に対応する明確な分子量の２種を示した。マスクされたバリアントｖ３２４７８及びｖ３２４７９の場合も、重鎖及び軽鎖の両方の見かけの分子量は、予想よりも高く（ＨＣについては約１００ｋＤａ対６３ｋＤａ、ＬＣについては約５０ｋＤａ対３７ｋＤａ）、これは、実施例３及び実施例１２において見られたように、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１のグリコシル化に起因するものと思われる。
ここで調査した３つの抗ＣＤ４０バリアントは、産生後にｕＰａで処置し、還元ＣＥ－ＳＤＳによって切断をモニタリングした（図２０Ｅ）。ｖ３２４７７及びｖ３２４７８は、特異的な切断部位の欠如がないことから、ｕＰａとのインキュベートでいかなる変化も示さなかったが、ｖ３２４７９の軽鎖にはプロセシングが見られた。ここでは、ＰＤ－Ｌ１のＣ末端とＶＬドメインのＮ末端との間のリンカー中のｕＰａ特異的配列を切断することによって、ＰＤ－Ｌ１部位を除去した。これにより、切断後の還元ＣＥ－ＳＤＳにおいて、３つの断片が検出された：ｕＰａ部位を欠いた未変化のＰＤ－１マスク重鎖、カッパ軽鎖のＶＬ－ＣＬに相当する鎖、及び放出されたＰＤ－Ｌ１部位に相当する鎖。
ｕＰａで処置した及び処置していない試料を、フローサイトメトリーによってＲａｊｉ細胞上のＣＤ４０に対する結合について試験した。図２０Ｆに示されるように、マスクされていないｖ３２４７７は、ＥＣ５０値が１ｎＭの結合曲線を示したが、マスクされたｖ３２４７８では、結合が４０～７０倍減少した。両バリアントは、ｕＰａ切断部位を欠くため、結合は、ｕＰａ処置による影響を受けなかった。処置されていないｖ３２４７９では、結合が１４倍減少したが、ｕＰａで処置した場合、５倍以内に回復した。
これらの傾向は、ＣＤ４０特異的ＲＧＡにおいて同じ試料をその機能について調査した場合にも再現された（図２０Ｇ）。ｖ３２４７７は、ＦｃγＲ２Ｂ－ＣＨＯＫ１によってさらに向上され得る強固な独立した活性を示したが、ｖ３２４７８では、９０～１１０倍減少した機能が見られた。どちらのバリアントもｕＰａ切断部位を欠くため、ＲＧＡ実験ではｕＰａ処置の有無にかかわらず同じ活性を示した。ｕＰａによって処置されていないｖ３２４７９では、ｖ３２４７８と同様の活性のマスキングが見られた（５５倍）。ｖ３２４７７の２倍以内の活性がｕＰａで処置されたｖ３２４８７において検出することができた。陽性対照のＣＤ４０Ｌは、ＦｃγＲ２Ｂの存在に関係なくＣＤ４０活性を誘導し、陰性対照（ｖ２２２７７）は、アッセイにおいてＣＤ４０を活性化することができなかった。ＦｃｇＲ２Ｂ陽性細胞株が存在する場合、アッセイで試験したバリアントに見られる活性の最大レベル（Ｂｍａｘ）は、二次細胞株上にＦｃｇＲ２Ｂが存在しない場合とは対照的に、より大きかった。ＣＤ４０Ｌで処置すると、ＦｃｇＲ２Ｂ陽性細胞株がない場合であっても、同じようにＢｍａｘが増加した。
実施例１９ マスクとしてのＳＩＲＰａ：ＣＤ４７免疫調節性対
Ｂ７：ＣＤ２８ファミリー以外の免疫調節性対がＦａｂの効率的なマスキングに利用できるかどうかを決定するために、以下のように、実施例１０に記載される抗ＥＧＦＲ抗体のＣＤ４７：ＳＩＲＰａでマスクされたバージョンを作製し、ＥＧＦＲについて評価した。
方法
ＣＤ４７：ＳＩＲＰａでマスクされた抗ＥＧＦＲ抗体を、実施例１０に記載されるＰＤ１：ＰＤ－Ｌ１でマスクされたバリアントと同等になるように設計した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ４７のＩｇＶドメインの配列及びヒトＳＩＲＰａの修飾された親和性増加バリアント（Ｋ．Ｗｅｉｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＳＩＲＰａｌｐｈａ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｔｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１，８８－９１（２０１３））を、実施例１及び実施例１０に記載されるｕＰａ切断性リンカーを使用して、抗ＥＧＦＲ Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端にそれぞれ付加した。調査したバリアントの構造の概略図は、図２７に示されている。バリアントの個々の鎖の配列は、表Ｉに列挙されている。抗体の産生、その試料純度及びｕＰａによる切断の評価を、それぞれ実施例２、実施例３及び実施例５と同様に行った。次いで、ＥＧＦＲ保有Ｈ２９２細胞への結合を定量蛍光顕微鏡によって評価した。
（表Ｉ）
蛍光顕微鏡によるＨ２９２細胞へのネイティブ結合
ＥＧＦＲを発現するＮＣＩ－Ｈ２９２細胞株を、加湿＋５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃でＬ－グルタミン及び１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ－１６４０（完全培地）中で維持した。アッセイの前日に、指数関数的に増殖する細胞を０．０５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を使用して回収し、１．２×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で完全培地中に再懸濁した。５０μＬの細胞をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ハーフアリアウェル透明平底黒ポリスチレンＴＣ処置済みマイクロプレート（Ｃｏｄｅ ３８８２，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）において６０００細胞／ウェルの最終濃度になるように分配し、加湿＋５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートした。実験日に、細胞の入ったプレートを４℃まで３０分間冷却してからアッセイを実施した。修飾されたバリアントを、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含有する冷ＤＰＢＳ（Ｗｉｓｅｎｔ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ，Ｓｔ－Ｂｒｕｎｏ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）で最終濃度の２倍に希釈し、続いて、３倍連続希釈を行い、１００ｎＭから始まる合計１１の濃度点とした。溶液はすべて４℃に維持し、インキュベートはすべて４℃で行った。等体積の２Ｘ試験バリアントまたは対照を細胞に添加し、２時間インキュベートした。次いで、細胞を、ＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５セレクトプレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）でＣａ２＋及びＭｇ２＋を含有する冷ＤＰＢＳで１５０μＬ／ウェル／サイクルの３サイクル洗浄により洗浄し、２５ｕＬの残留最終体積とした。結合したバリアントの検出は、ＦＢＳ（Ｗｉｓｅｎｔ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ，Ｓｔ－Ｂｒｕｎｏ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の存在下、ＡＦ４８８標識したヒトＦｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）、Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＣｅｌｌＭａｓｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を含有する蛍光標識ミックスと１時間さらにインキュベートすることによって達成した。細胞をＢｉｏＴｅｋ ＥＬ４０５ｓｅｌｅｃｔ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）プレートウォッシャーで２回洗浄した（３サイクル、各回１５０μＬ／ウェルの洗浄）。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、透過光、ＤＡＰＩ（青チャンネル）、Ｃｙ５（遠赤チャンネル）及びＦＩＴＣ（緑チャンネル）を使用して、画像を撮影した。画像解析は、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ解析ソフトウェアＣｕｓｔｏｍ Ｍｏｄｕｌｅ Ｅｄｉｔｏｒ（ＣＭＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。各ウェルについて、細胞で覆われたウェル領域における総緑色蛍光強度を測定し、次いで、細胞面積に正規化した。この正規化された値である「細胞面積あたりの合計強度」をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）におけるカーブフィッティング分析に使用した。ベースライン値は、対照ウェル（二次抗体の蛍光標識ミックスのみとインキュベートしたウェル）の平均正規化緑色バックグラウンド蛍光シグナルを用いて算出した。各プレートのベースライン値を、非線形フィットモデルを適用する前に、すべてのデータから指し引いた。細胞面積あたりの特異的合計強度（ベースライン補正済み）に対する対数抗体濃度を、各試験品について「ヒルスロープを用いた１部位結合」非線形回帰曲線フィッティングモデルを用いてフィッティングした。
結果
ＣＤ４７：ＳＩＲＰａベースのマスクを保有する修飾された抗ＥＧＦＲバリアント（３４１６４）の産生により、分取ＳＥＣ後、０．３３ｍｇが得られた。プロテインＡ精製後のＵＰＬＣ－ＳＥＣ分析は、主要な種に加えて、アグリゲート及びオリゴマーなどの高分子量種も相当量示され、これらの望ましくない粒子を除去するために、分取ＳＥＣを実施した。最終のＳＥＣで精製した試料のＵＰＬＣ－ＳＥＣ（図２８Ａ）は、９１％の所望の種を示した。非還元ＣＥ－ＳＤＳ（図２８Ｂ）は、インタクトな分子に対して予期されるものよりも有意に高い分子量である単一の主要な種に対応するプロファイルを示した。ＣＤ４７で修飾された軽鎖のバンドは、還元ＣＥ－ＳＤＳプロファイルにおいて、予想よりも有意に高い見かけの分子量を示しており、修飾された重鎖と重なっている。実施例３におけるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースの修飾と同様に、これは、ＣＤ４７の広範なグリコシル化によって生じた可能性が高い（Ｗ．Ｊ．Ｍａｗｂｙ，Ｃ．Ｈ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｊ．Ａｎｓｔｅｅ，Ｆ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４７ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ａ ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）ａｎｄ ｔｈｅ ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｍａｒｋｅｒ ＯＡ３．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３０４（ Ｐｔ ２），５２５－５３０（１９９４））。
ｕＰａで処置した場合、ＣＤ４７及びＳＩＲＰａ部位はいずれも、図２９で見られるように、軽鎖から効果的に除去された。ここでは、切断によって、修飾された重鎖及び軽鎖に対応するバンドが消失し、マスクされていない重鎖及び軽鎖の分子量に対応するバンドが出現した。放出されたＣＤ４７及びＳＩＲＰａの成分は、切断後に一意に同定することはできなかった。これは、サイズが小さく、グリコシル化によって不均質になったことに起因すると思われる。
ハイコンテント分析によって評価したＨ２９２細胞上のＥＧＦＲへの結合（図３０）は、ｖ３４１６４のＣＤ４７：ＳＩＲＰａベースマスクが標的結合を３７倍減少させたことを示した。これは、実施例１４においてＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを含む同等のバリアントで見られたものと同様である。両マスク成分をｕＰａで切断すると、ＥＧＦＲ結合は、ＷＴの１．１倍以内に回復した。
実施例２０ 抗ＣＤ３三重特異性バリアントによる標的の共係合及び架橋
実施例１～９に記載される抗ＣＤ３バリアントによってＰＤ－Ｌ１、Ｈｅｒ２及びＣＤ３が同時に係合し得るかどうかを決定するために、Ｈｅｒ２－ＰＤ－Ｌ１共係合及びＴ細胞架橋試験を以下のように実施した。
方法
フローサイトメトリーによるＨｅｒ２及びＰＤ－Ｌ１の同時結合の評価
１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地中で培養したＪＩＭＴ－１（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ｔ－１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内でインキュベーターにおいて３７℃で５％二酸化炭素で水平に維持した。抗体を、１００ｎＭから１．７ｐＭまで９６ウェルｖ底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）においてＦＡＣＳ緩衝液－２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中１：３の希釈率で合計２０ｕＬ／ウェルでタイトレーションした。腫瘍細胞をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でリンスし、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて回収し、培地で希釈し、自動細胞計数器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して計数した。腫瘍細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、９６ウェルプレートにウェルあたり５０，０００細胞で添加した。細胞をバリアントと４℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬの二次抗体ＡＦ６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、１０００倍に希釈した生死判定色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）とともにウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。アッセイの読み取りには、ＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でのフローサイトメトリーによって、ＡＰＣ蛍光の幾何平均を測定した。生データをＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。Ｍａｃ ＯＳ Ｘ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してグラフを生成した。
ＣＤ３／Ｈｅｒ２／ＰＤ－Ｌ１結合アッセイ
１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地中で培養したＪＩＭＴ－１（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ｔ－１７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内でインキュベーターにおいて３７℃で５％二酸化炭素で水平に維持した。腫瘍細胞をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でリンスし、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて回収し、ＰＢＳで希釈し、ＰＢＳで２回洗浄した。初代ヒトＰａｎ－Ｔ細胞（ＢｉｏＩＶＴ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）のバイアルを３７℃の水浴中で解凍し、１０％ウシ胎仔血清が補充されたＡＴＣＣ改変ＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からなる成長培地で洗浄し、その後ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。Ｔ細胞及び腫瘍細胞をＣｏｕｎｔｅｓｓ自動細胞計数器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して計数し、５Ｍ／ｍＬでＰＢＳ中に再懸濁した。Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ－ｅＦ６７０ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を腫瘍細胞に１．２５ｕＭで添加した。Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）をＴ細胞に２ｕＭで添加した。Ｔ細胞及び腫瘍細胞を３７℃で２０分間暗所でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液－２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で２回洗浄した。抗体を、１０ｎＭから０．２ｐＭまでｖ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）においてＦＡＣＳ緩衝液中１：６の希釈率で合計５０ｕＬ／ウェルでタイトレーションした。Ｐａｎ Ｔ細胞を腫瘍細胞と５：１のエフェクター対標的比で１．４４Ｅ６細胞／ｍＬで混合した。５０ｕＬの混合細胞懸濁液をタイトレーションされたバリアントを含有するプレートに添加した。細胞をバリアントと４℃で１時間インキュベートした。アッセイの読み取りには、ＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でのフローサイトメトリーによって、細胞の二重陽性集団を測定した。生データをＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。Ｍａｃ ＯＳ Ｘ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してグラフを生成した。
結果
内因性Ｈｅｒ２＋／ＰＤ－Ｌ１＋がん細胞株（ＪＩＭＴ－１、Ｈｅｒ２及びＰＤ－Ｌ１受容体の定量については実施例７を参照されたい）への結合をフローサイトメトリーによって測定した（図３０Ａ）。重鎖に付加されたＰＤ－１のみを有し（３１９２９）、マスクされたバリアント３０４３０の完全にマスクされていないバージョンを表す、三重特異性（ＰＤ－１－ＣＤ３－Ｈｅｒ２）バリアントは、二重特異性対照（ｖ３２４９７（ＣＤ３－Ｈｅｒ２）、ｖ３３５５１（ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３））と比較して高いＭＦＩを示す。同じフォーマットで二重特異性対照を実現するために、ｖ３２４９７ではＰＤ－Ｌ１結合を無効にする変異をＰＤ－１部位に導入し、ｖ３３５５１ではＨｅｒ２を標的とするｓｃＦｖをヘマグルチニンを標的とする無関係のｓｃＦｖに置き換えた。これは、ＰＤ－Ｌ１とＨｅｒ２の両方が三重特異性バリアントによってがん細胞上で同時に結合するという証拠である。
さらに、Ｈｅｒ２＋／ＰＤＬ１＋がん細胞株及びＰａｎ Ｔ細胞の抗体依存性架橋を、フローサイトメトリーにおいて、二重陽性シグナル（Ｔ細胞及び標的細胞の両方の同時の蛍光シグナル）の存在によって評価した（図３０Ｂ）。三重特異性（ＰＤ－１－ＣＤ３－Ｈｅｒ２）バリアント（ｖ３１９２９）では二重特異性対照（ｖ３２４９７（ＣＤ３－Ｈｅｒ２）、ｖ３３５５１（ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３））と比較して二重陽性シグナルのパーセンテージが高いことから、ここで記載されるバリアントは、Ｔ細胞とがん細胞を架橋することが可能であり、ｖ３１９２９による３つの標的の同時係合により、このＴ細胞架橋が増加したことを示している。
実施例２１ 抗ＣＤ３×抗ＨＥＲ２ Ｔ細胞エンゲージャー融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ機能評価
実施例１～９に記載されるＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ ＦｃバリアントがＨｅｒ２保有腫瘍細胞の殺傷のためにＴ細胞に係合し、それを活性化する能力に対するＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクの機能的影響を、以下のようにヒト化マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験で評価した。
方法
マウス（ＮＳＧ［ＮＯＤ－ｓｃｉｄ－ガンマ］）にヒトＨｅｒ２＋腫瘍株（ＪＩＭＴ－１）由来の５×１０６細胞を皮下移植し、同時に健康なヒトドナー由来の１×１０７個のＰＢＭＣを静脈内移植する。腫瘍の生着及びおよそ１５０～２００ｍｍ３までの初期成長の後、実施例１～９に記載され産生された抗体バリアントをマウスに静脈内投与する。マウスは、試験期間中、週に２回、体重及び腫瘍成長（ノギスによる測定）の両方をモニターする。
結果
実施例６～９のＣＤ３への結合及び機能性試験においてマスクされた及びマスクされていないＣＤ３×Ｈｅｒ２ Ｆａｂ×ｓｃＦｖ Ｆｃバリアントに見られた傾向は、同じ試料の抗腫瘍活性について、健康なドナー由来のＰＢＭＣ及びＨｅｒ２陽性ヒトがん細胞株を移植したヒト化マウスモデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験で調査すると、再現される。薬物なしまたは無関係な対照抗体（２２２７７）で処置された動物では腫瘍は急激に成長するが、重鎖に非機能性ＰＤ－Ｌ１ドメインのみが結合したバリアント（３２４９７）は、殺傷のためにＴ細胞を動員する能力により、強固な腫瘍成長阻害を示す。同じバリアントを抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせてペアリングした場合（３２４９７＋３３４４９）、さらなるチェックポイント活性により、さらなる阻害を見ることができる。機能性ＰＤ－１ドメインを有するバリアント（３１９２９）もまた、非機能性ＰＤ－１ドメインを含む同等の構築物（３２４９７）と比較して、さらなる腫瘍成長阻害を示す。完全なＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１ベースのマスクを含むバリアントを評価すると、両方の付加ドメイン上に非切断性のリンカーを含む構築物（３０４２３）は、急速な腫瘍成長を示す。逆に、ＦａｂとＰＤ－Ｌ１（３０４３０）との間に切断性リンカーを含む構築物は、高い抗腫瘍活性を示し、これは、関連するプロテアーゼを高発現する腫瘍細胞株をモデルに使用する場合のマスクされていない三重特異性対照（３１９２９）と同様である。プロテアーゼの発現が少ない腫瘍細胞株を使用する場合、同切断性バリアント（３０４３０）は、非切断性の構築物（３０４３０）と同様に、急速な腫瘍成長を示す。
実施例２２ マスクとしてのＣＤ８０－ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０－ＣＤ２８、及びＣＤ８０－ＰＤ－Ｌ１リガンド－受容体対
ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、及びＰＤ－Ｌ１に対するＣＤ８０親和性は、それぞれ０．２ｕＭ、４ｕＭ、及び１．７ｕＭである（Ｂｕｔｔｅ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１ ｌｉｇａｎｄ １ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂ７－１ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２７，１１１－１２２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００７．０５．０１６（２００７））。ＣＤ８０のＣＤ２８に対する優先的な結合を誘導するために、ＣＤ２８に対する親和性を選択的に増加させることが知られている変異をＣＤ８０ ＩｇＶドメインに導入する（特許：ＵＳ２０２１０１５５６６８Ａ１）。「片側」ＣＤ８０マスクフォーマットでは、Ｔ細胞活性化を最適に強化する形状を評価するために、複数の構築物を設計した。簡潔に述べると、ＣＤ８０ホモ二量体化を防ぐ変異を含むヒトＣＤ８０のＩｇＶドメイン（上記のとおり）及び／またはＣＤ２８に対する親和性を増加させることが予測される変異を含むＣＤ８０を、（ＥＡＡＡＫ）２リンカーを使用して抗ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖または軽鎖のＮ末端に付加し、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖ×Ｆｃとのヘテロ二量体Ｆｃフォーマットで対合させる。あるいは、ＣＤ８０ ＩｇＶドメインを抗ＴＡＡ Ｆａｂの重鎖または軽鎖のＮ末端に（ＥＡＡＡＫ）２リンカーを使用して付加し、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ×Ｆｃとのヘテロ二量体Ｆｃフォーマットで対合させる。上記のフォーマットは、表Ｊに例示されている。
ＣＤ８０は、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、及びＰＤ－Ｌ１に結合することができるため、３つすべてが二量体マスクパートナーとして使用される（ＣＤ８０：ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０：ＣＤ２８、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１）。得られたマスクされた構築物は、ＣＤ８０ホモ二量体化を防ぐ変異及びＣＤ２８に対する親和性を増加させることが知られている変異を含むＣＤ８０ ＩｇＶドメインを使用して設計した。すべての場合において、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、またはＰＤ－Ｌ１ ＩｇＶドメインは、重鎖または軽鎖にプロテアーゼ切断性配列で融合されているが、ＣＤ８０部位は、軽鎖または重鎖に内因性プロテアーゼによって除去されないように設計されたアルファヘリカルペプチドリンカー配列で融合されている。ＣＤ８０：ＣＴＬＡ－４のマスク設計では、ＣＤ８０ ＩｇＶドメインの高親和性バージョン及び野生型ヒトＣＴＬＡ－４ ＩｇＶドメインをペプチドリンカーを使用して抗ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端にそれぞれ付加し、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖ Ｆｃと対合させる。ＣＤ８０：ＣＤ２８のマスクでは、ＣＤ８０ ＩｇＶドメインの高親和性バージョン及び野生型ヒトＣＤ２８ ＩｇＶドメインをペプチドリンカーを使用して抗ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端にそれぞれ付加し、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖ Ｆｃと対合させる。最後に、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１マスクでは、ＣＤ８０ホモ二量体化を防ぐ変異とＣＤ２８及びＰＤ－Ｌ１に対する親和性を増加することが予測される変異（特許：ＵＳ２０２１０１５５６６８Ａ１）を含むＣＤ８０ ＩｇＶドメインならびに野生型ヒトＰＤ－Ｌ１ ＩｇＶドメインをペプチドリンカーを使用して抗ＣＤ３ Ｆａｂの重鎖及び軽鎖のＮ末端にそれぞれ付加し、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖ Ｆｃと対合させる。さらに、ＣＤ８０含有マスク（ＣＤ８０：ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０：ＣＤ２８またはＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１）を使用して抗ＴＡＡ Ｆａｂパラトープをブロックし、その鎖を抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと対合させた分子も設計する。上記のマスクされたバリアントは、表Ｊに例示されている。
上記の実施例において、構築物は、抗ＣＤ３アーム（ＦａｂまたはｓｃＦｖ）及び抗ＴＡＡアーム（ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含む分子で使用される片側または二量体ＣＤ８０ベースのマスク（ＣＤ８０：ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８０：ＣＤ２８、ＣＤ８０：ＰＤ－Ｌ１）で記載される。これらの設計は、様々な抗ＣＤ３パラトープ及び任意のＴＡＡパラトープとのプラットフォームとして機能することができる。
（表Ｊ）
当業者に明らかな本明細書に記載される特定の実施形態の変更は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
本明細書の本文中で引用される発行された特許及び特許出願のすべての文献は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
配列
（表ＡＡパート１）
（表ＡＡパート２）
（表ＢＢ）
（表ＣＣ）

Claims (33)

  1. 生物学的に機能的なタンパク質、リガンド－受容体対、第１のペプチドリンカー及び第２のペプチドリンカーを含む、融合タンパク質であって、
    前記生物学的に機能的なタンパク質は、抗体または抗原結合抗体断片であり、少なくとも第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、かつ
    前記リガンド－受容体対は、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含み、
    前記第１のポリペプチドが第１のＶＨポリペプチドを含み、前記第２のポリペプチドが第１のＶＬポリペプチドを含み、前記第１のＶＨ及びＶＬポリペプチドは第１の抗原結合ドメインを形成し、前記リガンドは、前記第１のＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方に前記第１のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記受容体は、前記第１のＶＨまたはＶＬポリペプチドの他方に前記第２のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記リガンド－受容体対は、前記第１の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害し、
    前記第１及び第２のペプチドリンカーは、前記リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、前記第１及び第２のペプチドリンカーのうちの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含む、
    前記融合タンパク質。
  2. 前記第１の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合が、前記リガンド－受容体対と融合していない親の抗原結合ドメインと比較して、１０倍以上減少する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記第１の抗原結合ドメインがＦａｂである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記第１の抗原結合ドメインが、がん細胞または免疫細胞上に発現する抗原に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記第１の抗原結合ドメインが、Ｔ細胞上に発現する抗原に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記第１の抗原結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記第１の抗原結合ドメインが、分化抗原群３（ＣＤ３）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、組織因子（ＴＦ）、分化抗原群１９（ＣＤ１９）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ）、及びカドヘリン３（ＣＤＨ３）からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記生物学的に機能的なタンパク質が、第２のＶＨポリペプチド及び第２のＶＬポリペプチドを含む第２の抗原結合ドメインを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記融合タンパク質が、第２のリガンド－受容体対を含み、前記第２のリガンド－受容体対の前記リガンドは、前記第２のＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方に第３のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記第２のリガンド－受容体対の前記受容体は、前記第２のＶＨまたはＶＬポリペプチドの他方に第４のペプチドリンカーを介して融合されており、前記第３及び第４のペプチドリンカーのうちの少なくとも１つは、プロテアーゼ切断部位を含み、かつ前記リガンド－受容体対は、前記第２の抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. ２つの異なる抗原に結合し、かつ一方の抗原は、Ｔ細胞によって発現される抗原であり、かつ他方の抗原は、がん細胞によって発現される抗原である、請求項８または９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記Ｔ細胞によって発現される抗原がＣＤ３である、請求項５または１０に記載の融合タンパク質。
  12. ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むＶＨと、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む、抗ＣＤ３パラトープであって、
    （ａ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２０７、２０８及び２０９に示されるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２１１、２１２及び２１４に示されるアミノ酸配列を含むか、
    （ｂ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２２４、２２５及び２２６に示されるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２２８、２２９及び２３０に示されるアミノ酸配列を含むか、
    （ｃ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２３２、２３３及び２３４に示されるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２３６、２３７及び２３８に示されるアミノ酸配列を含むか、または
    （ｄ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４０、２４１及び２４２に示されるアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２４４、２４５及び２４６に示されるアミノ酸配列を含む、
    前記抗ＣＤ３パラトープ
    を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 前記生物学的に機能的なタンパク質が二量体Ｆｃ領域を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記二量体Ｆｃ領域がヘテロ二量体Ｆｃである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記リガンド－受容体対が、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＰＤ１－ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８０、ＣＤ２８－ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８６、ＰＤＬ１－ＣＤ８０、ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ、ＮＣＲＳＲＬＧ１－ＮＫｐ３０及びＣＤ４７－ＳＩＲＰａからなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記リガンド－受容体対が、ＰＤ１－ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、またはＣＤ４７－ＳＩＲＰａである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  17. 前記リガンド－受容体対がＰＤ１－ＰＤＬ１であり、かつ
    （ａ）前記リガンドＰＤＬ１が、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、及び／または
    （ｂ）前記受容体ＰＤ１が、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項１６に記載の融合タンパク質。
  18. 前記リガンド－受容体対が、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０であり、かつ
    （ａ）前記リガンドＣＤ８０が、配列番号２５、配列番号１８５、配列番号１８７または配列番号１８９に示されるアミノ酸配列を含む、及び／または
    （ｂ）前記受容体ＣＴＬＡ４が、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項１６に記載の融合タンパク質。
  19. 前記リガンド－受容体対が、ＣＴＬＡ４－ＣＤ８０、ＰＤＬ１－ＣＤ８０及びＣＤ２８－ＣＤ８０からなる群から選択され、前記リガンドＣＤ８０が、（ａ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ及びＤ９０Ｇ；（ｂ）Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｎ４８Ｋ、Ｉ６１Ｓ、Ｋ８９Ｎ；（ｃ）Ｅ３５Ｄ、Ｄ４６Ｖ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｄ９０Ｇ、Ｋ９３Ｅ；（ｄ）Ｈ１８Ｙ、Ａ２６Ｅ、Ｅ３５Ｄ、Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓ、Ｖ６８Ｍ、Ａ７１Ｇ、Ｄ９０Ｇ；（ｅ）Ｉ５８Ｓ、Ｖ６８Ｓ、Ｌ７０Ｓ；（ｆ）Ｍ４７Ｓ、Ｉ６１Ｓまたは（ｇ）Ｖ２２Ｓからなる群から選択される変異を有する配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
  20. 前記受容体及び前記リガンドが、前記第１及び第２のポリペプチドの各Ｎ末端に融合されている、請求項１～１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  21. 前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８（コラゲナーゼ４）、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、アダマリシン、セラリシン、アスタシン、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、カスパーゼ１４、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ（ＧＢ）、ヘプシン、エラスターゼ、レグマイン、マトリプターゼ、マトリプターゼ２、メプリン、ニューロシン、ＭＴ－ＳＰ１、ネプリライシン、プラスミン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＴＡＣＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ｕＰＡ、カルパイン、ＦＡＰ及びＫＬＫからなる群から選択される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  22. 前記プロテアーゼが、ｕＰＡまたはマトリプターゼである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  23. 前記プロテアーゼ切断部位が、アミノ酸配列ＭＳＧＲＳＡＮＡ（配列番号２８）を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  24. 前記ペプチドリンカーの各々が独立して、３～５０または５～２０アミノ酸長である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  25. 前記第１または第２のペプチドリンカーのうちの１つが、プロテアーゼ切断部位を含まない、請求項１～２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  26. 前記ペプチドリンカーの各々が独立して、
    （ａ）（ＧｌｙｎＳｅｒ）リンカーを含み、ここで、（ＧｌｙｎＳｅｒ）リンカーは、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）１（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１～５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、または
    （ｂ）（ＥＡＡＡＫ）ｎリンカー（式中、ｎは、１～５の整数である）を含むか、または
    （ｃ）ポリプロリンリンカーを含み、任意で、ＰＰＰもしくはＰＰＰＰ、またはグリシン－プロリンリンカー、任意で、ＧＰＰＰＧ、ＧＧＰＰＰＧＧ、ＧＰＰＰＰＧもしくはＧＧＰＰＰＰＧＧであるか、または
    （ｄ）野生型免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列と比較して、最大３０パーセントまでのアミノ酸配列同一性の差を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリンヒンジ領域配列を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  27. 前記ペプチドリンカーの少なくとも１つが、アミノ酸配列ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号３８）を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  28. 以下：
    Ｆａｂ領域及びＦｃ領域であって、
    前記Ｆａｂ領域が、抗原結合ドメインを形成するＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含む、
    前記Ｆａｂ領域及びＦｃ領域；ならびに
    免疫グロブリンスーパーファミリー受容体の細胞外部分及びその同族リガンドまたはその受容体結合断片を含む、リガンド－受容体対であって、
    前記リガンドが、前記ＶＨまたはＶＬポリペプチドの一方のＮ末端に第１のペプチドリンカーを介して融合されており、かつ前記受容体が、他方のＶＨまたはＶＬポリペプチドのＮ末端に第２のペプチドリンカーを介して融合されており、
    前記第１及び第２のペプチドリンカーが、前記リガンドと受容体の対合を可能にするのに十分な長さであり、
    前記第１及び第２のペプチドリンカーの少なくとも１つが、プロテアーゼ切断部位を含み、かつ
    前記リガンド－受容体対が、前記抗原結合ドメインの、その同族抗原への結合を立体的に阻害する、
    前記リガンド－受容体対
    を含む、融合タンパク質。
  29. 追加のＦａｂ領域またはｓｃＦｖをさらに含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
  30. がんを治療するための、請求項１～２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
  31. 免疫応答を調節するための、請求項１～２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
  32. 請求項１～２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、１つまたは複数のベクター。
  33. 請求項３２に記載の１つまたは複数のベクターを含む、細胞。
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