JP7842389B2 - 高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用 - Google Patents
高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用Info
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Description
本発明は、遺伝子工学の技術分野に関し、特に高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組
換えベクターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用。
換えベクターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用。
水域・土壌中のヒ素汚染問題は、世界的な関心事となっている。環境中のヒ素は食物連鎖
を通じてヒトに毒性や発がん性の影響を及ぼす可能性がある。ヒ素に汚染された水域や土
壌の浄化が急務となっている。
既存のヒ素汚染水処理技術には、主に限外ろ過、沈殿、凝集、イオン交換、吸着技術など
の物理化学的方法があるが、経済コストが高く、一定の依存性がある。ヒ素汚染土壌の処
理技術には、主に土壌浸出、原位置化学酸化・還元、固化・安定化、熱処理、電気化学的
浄化などの技術がある。しかし、これらの方法は、投資額が大きく、コストが高いため、
大規模な適用を促進することが困難であるだけでなく、土壌構造の破壊、微生物活性の低
下、土壌肥沃度の低下を招き、土壌の健康に深刻な影響を及ぼすため、微量に汚染された
水田の大規模な面積の浄化には適用できない。
高蓄積植物を用いて汚染物を吸収、変換、濃縮する植物浄化技術は、新しいタイプの環境
汚染管理技術となっている。繊毛虫の砂漠草はこれまでに発見されたヒ素高蓄積植物の中
で最も効果的な植物であるが、成長・繁殖サイクルが長く、環境条件に影響されやすいと
いう欠点があるため、ヒ素汚染浄化への応用には限界がある。
を通じてヒトに毒性や発がん性の影響を及ぼす可能性がある。ヒ素に汚染された水域や土
壌の浄化が急務となっている。
既存のヒ素汚染水処理技術には、主に限外ろ過、沈殿、凝集、イオン交換、吸着技術など
の物理化学的方法があるが、経済コストが高く、一定の依存性がある。ヒ素汚染土壌の処
理技術には、主に土壌浸出、原位置化学酸化・還元、固化・安定化、熱処理、電気化学的
浄化などの技術がある。しかし、これらの方法は、投資額が大きく、コストが高いため、
大規模な適用を促進することが困難であるだけでなく、土壌構造の破壊、微生物活性の低
下、土壌肥沃度の低下を招き、土壌の健康に深刻な影響を及ぼすため、微量に汚染された
水田の大規模な面積の浄化には適用できない。
高蓄積植物を用いて汚染物を吸収、変換、濃縮する植物浄化技術は、新しいタイプの環境
汚染管理技術となっている。繊毛虫の砂漠草はこれまでに発見されたヒ素高蓄積植物の中
で最も効果的な植物であるが、成長・繁殖サイクルが長く、環境条件に影響されやすいと
いう欠点があるため、ヒ素汚染浄化への応用には限界がある。
上記問題を解決するために、本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベ
クターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用を提供する。本発明に記載の組換えベクタ
ーで作成した工学イネ植物の地上部はヒ素蓄積量が高く、ヒ素耐性が強く、バイオマスが
大きく、生育周期が短く、植栽技術が成熟であり、水耕栽培に適し、水田と乾田に適して
おり、水域・土壌重金属の減少と浄化に対して経済的で迅速かつ簡単で有効である利点が
あり、さらに、バイオマスが最大に達した籾摺期前に収穫することで、浄化周期を短縮す
るだけでなく、米の消費リスクを回避することができる。
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供し：
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターを提供し、組換え遺伝
子と植物発現ベクターを含み、前記組換え遺伝子はｐＬｓｉ１プロモーターとＰｖＡＣＲ
３遺伝子を含み、前記ｐＬｓｉ１プロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１に示され、前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に
示される。
好ましくは、前記植物発現ベクターはｐＳＮ１３０１ベクターを含む。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクターを構築するプライマーセットを提供
し、第１プライマー対と第２プライマー対を含み、前記第１プライマー対の配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示され、前記第２プライマー対の配列
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクターの構築方法を提供し、以下のステッ
プを含み：
イネ全ＤＮＡをテンプレートとし、第１ＰＣＲ増幅を行ってｐＬｓｉ１プロモーターを得
、
繊毛虫の砂漠草ｃＤＮＡを目標とし、第２ＰＣＲ増幅を行ってＰｖＡＣＲ３遺伝子を得、
前記ｐＬｓｉ１プロモーターを二重酵素消化により前記植物発現ベクターに挿入してｐＬ
ｓｉ１プロモーターを含有する形質転換ベクターを得、
前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子を相同組換え方法により前記形質転換ベクター中のｐＬｓｉ１プ
ロモーターの下流に挿入して前記組換えベクターを得る。
好ましくは、前記第１ＰＣＲ増幅のプライマー対は上記技術的解決策に記載のプライマー
セット中の第１プライマー対を含み、前記第２ＰＣＲ増幅のプライマー対は上記技術的解
決策に記載のプライマーセット中の第２プライマー対を含む。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターの
、高ヒ素蓄積性工学イネの作成における応用を提供する。
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを提供し、上記技術的解決策に記載の組換えベクターと
トランスジェニックレシピエントイネを含む。
好ましくは、前記トランスジェニックレシピエントイネの品種はＺｈｏｎｇｈｕａ１１を
含む。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターま
たは上記技術的解決策に記載の高ヒ素蓄積性工学イネの、ヒ素汚染水域および／または土
壌浄化における応用を提供する。
本発明は、ヒ素汚染水域および／または土壌の浄化方法を提供し、以下のステップを含み
：
高ヒ素蓄積性工学イネを浄化すべき水域および／または土壌に植え、籾摺期前にイネの地
上部植物を収穫する。
本発明は以下の有益な効果を有し：
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターを提供し、組換え遺伝
子と植物発現ベクターを含み、前記組換え遺伝子はｐＬｓｉ１プロモーターとＰｖＡＣＲ
３遺伝子を含み、前記ｐＬｓｉ１プロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１に示され、前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に
示される。本発明によって提供される組換えベクターは、イネ根部の特異的プロモーター
ｐＬｓｉ１を選択してイネでの繊毛虫の砂漠草ＰｖＡＣＲ３遺伝子の発現を駆動し、その
駆動下でＰｖＡＣＲ３タンパク質はイネ根部によって吸収されたヒ素を地上部に移動させ
ることができ、発現量が一般的な構成的プロモーターｐＵｂｉよりも低いため、重金属の
過剰蓄積による中毒現象を回避することができ、蓄積量と耐性のバランスを達成し、イネ
の地上部の蓄積ヒ素の増加が保証され、バイオマスも確保される。本発明に記載の組換え
ベクターを用いて作成された工学イネ植物の地上部のヒ素蓄積量が高く、ヒ素耐性が強く
、水域ヒ素と土壌の有効なヒ素除去率が高く、バイオマスが大きく、生育周期が短く、栽
培技術が成熟しており、水域・水田と乾田に適しており、重金属の減少と浄化に対して経
済的で迅速かつ簡単で有効である利点がある。
さらに、本発明は、イネの簡易収穫方法を選択し、土壌ヒ素がイネの地上部に輸送、蓄積
され、根株を除去することなく、地上部のみを収穫すればヒ素除去を達成でき、良好な作
業性を有する。
クターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用を提供する。本発明に記載の組換えベクタ
ーで作成した工学イネ植物の地上部はヒ素蓄積量が高く、ヒ素耐性が強く、バイオマスが
大きく、生育周期が短く、植栽技術が成熟であり、水耕栽培に適し、水田と乾田に適して
おり、水域・土壌重金属の減少と浄化に対して経済的で迅速かつ簡単で有効である利点が
あり、さらに、バイオマスが最大に達した籾摺期前に収穫することで、浄化周期を短縮す
るだけでなく、米の消費リスクを回避することができる。
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供し：
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターを提供し、組換え遺伝
子と植物発現ベクターを含み、前記組換え遺伝子はｐＬｓｉ１プロモーターとＰｖＡＣＲ
３遺伝子を含み、前記ｐＬｓｉ１プロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１に示され、前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に
示される。
好ましくは、前記植物発現ベクターはｐＳＮ１３０１ベクターを含む。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクターを構築するプライマーセットを提供
し、第１プライマー対と第２プライマー対を含み、前記第１プライマー対の配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示され、前記第２プライマー対の配列
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクターの構築方法を提供し、以下のステッ
プを含み：
イネ全ＤＮＡをテンプレートとし、第１ＰＣＲ増幅を行ってｐＬｓｉ１プロモーターを得
、
繊毛虫の砂漠草ｃＤＮＡを目標とし、第２ＰＣＲ増幅を行ってＰｖＡＣＲ３遺伝子を得、
前記ｐＬｓｉ１プロモーターを二重酵素消化により前記植物発現ベクターに挿入してｐＬ
ｓｉ１プロモーターを含有する形質転換ベクターを得、
前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子を相同組換え方法により前記形質転換ベクター中のｐＬｓｉ１プ
ロモーターの下流に挿入して前記組換えベクターを得る。
好ましくは、前記第１ＰＣＲ増幅のプライマー対は上記技術的解決策に記載のプライマー
セット中の第１プライマー対を含み、前記第２ＰＣＲ増幅のプライマー対は上記技術的解
決策に記載のプライマーセット中の第２プライマー対を含む。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターの
、高ヒ素蓄積性工学イネの作成における応用を提供する。
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを提供し、上記技術的解決策に記載の組換えベクターと
トランスジェニックレシピエントイネを含む。
好ましくは、前記トランスジェニックレシピエントイネの品種はＺｈｏｎｇｈｕａ１１を
含む。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターま
たは上記技術的解決策に記載の高ヒ素蓄積性工学イネの、ヒ素汚染水域および／または土
壌浄化における応用を提供する。
本発明は、ヒ素汚染水域および／または土壌の浄化方法を提供し、以下のステップを含み
：
高ヒ素蓄積性工学イネを浄化すべき水域および／または土壌に植え、籾摺期前にイネの地
上部植物を収穫する。
本発明は以下の有益な効果を有し：
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターを提供し、組換え遺伝
子と植物発現ベクターを含み、前記組換え遺伝子はｐＬｓｉ１プロモーターとＰｖＡＣＲ
３遺伝子を含み、前記ｐＬｓｉ１プロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１に示され、前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に
示される。本発明によって提供される組換えベクターは、イネ根部の特異的プロモーター
ｐＬｓｉ１を選択してイネでの繊毛虫の砂漠草ＰｖＡＣＲ３遺伝子の発現を駆動し、その
駆動下でＰｖＡＣＲ３タンパク質はイネ根部によって吸収されたヒ素を地上部に移動させ
ることができ、発現量が一般的な構成的プロモーターｐＵｂｉよりも低いため、重金属の
過剰蓄積による中毒現象を回避することができ、蓄積量と耐性のバランスを達成し、イネ
の地上部の蓄積ヒ素の増加が保証され、バイオマスも確保される。本発明に記載の組換え
ベクターを用いて作成された工学イネ植物の地上部のヒ素蓄積量が高く、ヒ素耐性が強く
、水域ヒ素と土壌の有効なヒ素除去率が高く、バイオマスが大きく、生育周期が短く、栽
培技術が成熟しており、水域・水田と乾田に適しており、重金属の減少と浄化に対して経
済的で迅速かつ簡単で有効である利点がある。
さらに、本発明は、イネの簡易収穫方法を選択し、土壌ヒ素がイネの地上部に輸送、蓄積
され、根株を除去することなく、地上部のみを収穫すればヒ素除去を達成でき、良好な作
業性を有する。
本発明の実施例または先行技術における技術的解決策をより明確に説明するために、以下
、実施例で使用される必要のある添付図面を簡単に説明する。
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス高ヒ素蓄積性工学イネ作成のフローチャートである。
ｐＬｓｉ１プロモーターとＰｖＡＣＲ３遺伝子増幅電気泳動図である。
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３バイナリー発現ベクター構築の概略図である。
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３とｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス植物ＰｖＡＣＲ３遺伝子の定量発現図である。
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス植物の汚染水域・土壌における成長マップとバイオマス測定結果を示す。
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス植物の汚染水域・土壌における蓄積ヒ素含有量の図である。
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス植物の浄化後の汚染土壌における有効なヒ素残留量の図である。
ｐＵｂｉプロモーター増幅電気泳動図である。
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３バイナリー発現ベクター構築の概略図である。
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス植物の汚染水域における生育結果の図である。
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス植物の汚染土壌における２週間培養した後の結果の図である。
、実施例で使用される必要のある添付図面を簡単に説明する。
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターを提供し、組換え遺伝
子と植物発現ベクターを含み、前記組換え遺伝子はｐＬｓｉ１プロモーターとＰｖＡＣＲ
３遺伝子を含み、前記ｐＬｓｉ１プロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１に示され、前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に
示され、具体的に以下の通りであり：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１：５’－ａａｇｔａａａａｃｃａｔｇｇｔｔａｔｔｃｔｇａａｔ
ｃｔａａａｃｇａｔｇｃｔｔｃｔｔｃａｇａｇａａｔｇｇｔｔｃａｇｇｇｃａｃｃａｔａ
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本発明において、前記植物発現ベクターは好ましくはｐＳＮ１３０１ベクターを含む。
本発明は、標的遺伝子構築組換えベクターとして、天然ヒ素高蓄積植物繊毛虫の砂漠草の
亜ヒ素酸塩トランスポータータンパク質をコードする遺伝子ＰｖＡＣＲ３を選択し、その
コードされたタンパク質はヒ素に対して高いトランスポーター効率を有し、標的遺伝子の
発現を調節するための調節エレメントとしてイネ根部特異的性プロモーターｐＬｓｉ１を
選択し、このプロモーターは標的遺伝子をイネ根部に特異的に発現させ、発現量が一般的
な構成的プロモーターｐＵｂｉよりも低く、弱いプロモーターを採用して下流の標的遺伝
子を開始することにより、重金属の過剰蓄積による中毒現象を回避することができる。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクターを構築するプライマーセットを提供
し、第１プライマー対と第２プライマー対を含み、前記第１プライマー対の配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示され、前記第２プライマー対の配列
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される。本発明に記載の
第１プライマー対はｐＬｓｉ１プロモーター配列を特異的に増幅し、前記第２プライマー
対はＰｖＡＣＲ３遺伝子を特異的に増幅することができる。
子と植物発現ベクターを含み、前記組換え遺伝子はｐＬｓｉ１プロモーターとＰｖＡＣＲ
３遺伝子を含み、前記ｐＬｓｉ１プロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
．１に示され、前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に
示され、具体的に以下の通りであり：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１：５’－ａａｇｔａａａａｃｃａｔｇｇｔｔａｔｔｃｔｇａａｔ
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本発明において、前記植物発現ベクターは好ましくはｐＳＮ１３０１ベクターを含む。
本発明は、標的遺伝子構築組換えベクターとして、天然ヒ素高蓄積植物繊毛虫の砂漠草の
亜ヒ素酸塩トランスポータータンパク質をコードする遺伝子ＰｖＡＣＲ３を選択し、その
コードされたタンパク質はヒ素に対して高いトランスポーター効率を有し、標的遺伝子の
発現を調節するための調節エレメントとしてイネ根部特異的性プロモーターｐＬｓｉ１を
選択し、このプロモーターは標的遺伝子をイネ根部に特異的に発現させ、発現量が一般的
な構成的プロモーターｐＵｂｉよりも低く、弱いプロモーターを採用して下流の標的遺伝
子を開始することにより、重金属の過剰蓄積による中毒現象を回避することができる。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクターを構築するプライマーセットを提供
し、第１プライマー対と第２プライマー対を含み、前記第１プライマー対の配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示され、前記第２プライマー対の配列
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示される。本発明に記載の
第１プライマー対はｐＬｓｉ１プロモーター配列を特異的に増幅し、前記第２プライマー
対はＰｖＡＣＲ３遺伝子を特異的に増幅することができる。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクターの構築方法を提供し、以下のステッ
プを含み：
イネ全ＤＮＡをテンプレートとし、第１ＰＣＲ増幅を行ってｐＬｓｉ１プロモーターを得
、
繊毛虫の砂漠草ｃＤＮＡを目標とし、第２ＰＣＲ増幅を行ってＰｖＡＣＲ３遺伝子を得、
前記ｐＬｓｉ１プロモーターを二重酵素消化により前記植物発現ベクターに挿入し、ｐＬ
ｓｉ１プロモーターを含有する形質転換ベクターを得、
前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子を相同組換え方法により前記形質転換ベクター中のｐＬｓｉ１プ
ロモーターの下流に挿入して前記組換えベクターを得る。
本発明において、前記第１ＰＣＲ増幅のプライマー対は好ましくは、上記技術的解決策に
記載のプライマーセット中の第１プライマー対を含み、前記第２ＰＣＲ増幅のプライマー
対は好ましくは上記技術的解決策に記載のプライマーセット中の第２プライマー対を含む
。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターの
、高ヒ素蓄積性工学イネの作成における応用を提供する。
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを提供し、上記技術的解決策に記載の組換えベクターと
トランスジェニックレシピエントイネを含む。本発明において、前記トランスジェニック
レシピエントイネの品種はＺｈｏｎｇｈｕａ１１を含む。本発明で選択されたトランスジ
ェニックレシピエント植物はイネ品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１であり、該品種は、安定して
遺伝的に形質転換されるだけでなく、バイオマスが大きく、生育周期が短く、栽培技術が
成熟しており、適応性が広く、水田と乾田に植えることができるという利点を有し、中国
の南部および北部の水田と乾田に広く普及し、適用することができ、したがって、土壌浄
化の分野において幅広い応用見込みがある。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターま
たは上記技術的解決策に記載の高ヒ素蓄積性工学イネの、ヒ素汚染水域および／または土
壌浄化における応用を提供する。
本発明は、ヒ素汚染水域および／または土壌の浄化方法を提供し、以下のステップを含み
：
高ヒ素蓄積性工学イネを浄化すべき水域および／または土壌に植え、籾摺期前にイネの地
上部植物を収穫する。
本発明では、イネの簡易収穫方法を選択し、土壌のヒ素がイネの地上部に輸送・蓄積され
、根株を除去することなく地上部のみを収穫することにより、ヒ素除去を達成することが
でき、良好な作業性を有し、さらに、バイオマスが最大に達した籾摺期前に収穫すること
により、浄化周期を短縮するだけでなく、米の消費リスクを回避することができる。
本発明をさらに説明するために、以下、添付図面および実施例と併せて本発明によって提
供される高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターおよびヒ素汚染土壌浄化
への応用を詳細に説明するが、本発明の保護範囲を限定するものとして解釈されるべきで
はない。
プを含み：
イネ全ＤＮＡをテンプレートとし、第１ＰＣＲ増幅を行ってｐＬｓｉ１プロモーターを得
、
繊毛虫の砂漠草ｃＤＮＡを目標とし、第２ＰＣＲ増幅を行ってＰｖＡＣＲ３遺伝子を得、
前記ｐＬｓｉ１プロモーターを二重酵素消化により前記植物発現ベクターに挿入し、ｐＬ
ｓｉ１プロモーターを含有する形質転換ベクターを得、
前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子を相同組換え方法により前記形質転換ベクター中のｐＬｓｉ１プ
ロモーターの下流に挿入して前記組換えベクターを得る。
本発明において、前記第１ＰＣＲ増幅のプライマー対は好ましくは、上記技術的解決策に
記載のプライマーセット中の第１プライマー対を含み、前記第２ＰＣＲ増幅のプライマー
対は好ましくは上記技術的解決策に記載のプライマーセット中の第２プライマー対を含む
。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターの
、高ヒ素蓄積性工学イネの作成における応用を提供する。
本発明は、高ヒ素蓄積性工学イネを提供し、上記技術的解決策に記載の組換えベクターと
トランスジェニックレシピエントイネを含む。本発明において、前記トランスジェニック
レシピエントイネの品種はＺｈｏｎｇｈｕａ１１を含む。本発明で選択されたトランスジ
ェニックレシピエント植物はイネ品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ１１であり、該品種は、安定して
遺伝的に形質転換されるだけでなく、バイオマスが大きく、生育周期が短く、栽培技術が
成熟しており、適応性が広く、水田と乾田に植えることができるという利点を有し、中国
の南部および北部の水田と乾田に広く普及し、適用することができ、したがって、土壌浄
化の分野において幅広い応用見込みがある。
本発明は、上記技術的解決策に記載の組換えベクター、上記技術的解決策に記載のプライ
マーセットまたは上記技術的解決策に記載の構築方法により構築された組換えベクターま
たは上記技術的解決策に記載の高ヒ素蓄積性工学イネの、ヒ素汚染水域および／または土
壌浄化における応用を提供する。
本発明は、ヒ素汚染水域および／または土壌の浄化方法を提供し、以下のステップを含み
：
高ヒ素蓄積性工学イネを浄化すべき水域および／または土壌に植え、籾摺期前にイネの地
上部植物を収穫する。
本発明では、イネの簡易収穫方法を選択し、土壌のヒ素がイネの地上部に輸送・蓄積され
、根株を除去することなく地上部のみを収穫することにより、ヒ素除去を達成することが
でき、良好な作業性を有し、さらに、バイオマスが最大に達した籾摺期前に収穫すること
により、浄化周期を短縮するだけでなく、米の消費リスクを回避することができる。
本発明をさらに説明するために、以下、添付図面および実施例と併せて本発明によって提
供される高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクターおよびヒ素汚染土壌浄化
への応用を詳細に説明するが、本発明の保護範囲を限定するものとして解釈されるべきで
はない。
実施例１
調節エレメントｐＬｓｉ１プロモーターとヒ素高蓄積遺伝子ＰｖＡＣＲ３のクローニング
：
イネＺｈｏｎｇｈｕａ１１の苗の根系を液体窒素を用いて粉末状に粉砕し、Ｎｏｖｏｚｙ
ｍｅｓ植物全ＤＮＡ抽出キットを用いてその全ゲノムＤＮＡを抽出し、イネＯｓＬｓｉ１
遺伝子の上流２５００ｂｐ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）をテンプレート増幅ｐＬｓｉ
１プロモーターとして選択し、上流と下流プライマーが北京ゲノム研究所により合成され
、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａａｇｔａａａａｃｃａｔｇｇｔｔａｔｔｃｔｇａａｔ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、
下流プライマー：５’－ｇｇｃａｇｇｔａｃｔａｇｔａｇｔｔａｃａｇｔｃｃｔ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４。
繊毛虫の砂漠草の苗を液体窒素を用いて粉末状に粉砕し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ植物全ＲＮ
Ａ抽出キットを用いてその全ＲＮＡを抽出し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ逆転写抽出キットを用
いてｃＤＮＡに逆転写し、ＮＣＢＩから提供されるＰｖＡＣＲ３遺伝子のｃＤＮＡ配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に従って、その上流と下流プライマーを設計して北京ゲノム研
究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａｔｇｇａｇａａｃｔｃａａｇｃｇｃｇｇａｇｃ－３’,ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．５、
下流プライマー：５’－ｃｔａａａｃａｇａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔｇａ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてそれぞれイネ根部全ＤＮＡと繊毛虫の砂
漠草ｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行ってｐＬｓｉ１とＰｖＡＣＲ３を得、
前記ＰＣＲ増幅の反応系は以下の通りであり：２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯ
Ｄ ２５ μｌ、ｄＮＴＰ １０ μｌ、Ｅ（ＫＯＤ×ＮＥＯ高忠実度酵素）１．２５
μｌ、上流プライマー１．２５ μｌ、下流プライマー１．２５ μｌ、テンプレート２
．５ μｌとｄｄＨ ２ Ｏ ８．７５ μｌ、前記ＰＣＲ増幅の反応手順は以下の通りであ
り：９４℃で２ｍｉｎ前変性し、９８℃で３０ｓ変性し、６０℃で１０ｓアニーリングし
、７２℃で３ｍｉｎ／ｋｂ伸長し、合計３２サイクルで、７２℃で１０ｍｉｎ反応させた
。
増幅生成物を１％のアガロースゲル電気泳動で目標バンドを分離し、オールインワンゴー
ルドゲル回収抽出キットを用いて回収し、ｐＬｓｉ１とＰｖＡＣＲ３増幅生成物の電気泳
動図が図２に示される。
その後回収生成物をｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ抽出キットを用い
てｐＥＡＳＹR－ Ｂｌｕｎｔベクターにライゲーションし、大腸菌レセプターＴｏｐ１
０に形質転換した後、シークエンシングのためにモノクローン菌株をピックし、正しくシ
ークエンシングされたモノクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で一
晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミスドを抽出し、ｐＬｓｉ１－
１９ＢとＰｖＡＣＲ３－１９Ｂを得て用意する。
実施例２
異種融合発現バイナリーベクターの構築：
カオトロピックスクリーニング遺伝子を含むｐＳＮ１３０１バイナリーベクターをバック
ボーンベクターとし、さらに異種融合発現バイナリーベクターの構築を行った。
（１）ｐＬｓｉ１プロモーターの取得：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ Ｉ消化接合部を含む
ｐＬｓｉ１プロモーターのＰＣＲ上流と下流プライマーを設計し、北京ゲノム研究所によ
り合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａａｇｃｔｔａａｇｔａａａａｃｃａｔｇｇｔｔａｔｔｃｔｇａ
ａｔｃｔａａ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、
下流プライマー：５’－ｇｔｃｇａｃｇｇｃａｇｇｔａｃｔａｇｔａｇｔｔａｃａｇｔｃ
ｃｔｃａ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてｐＬｓｉ１－１９Ｂをテンプレートとし
てＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースを用
いて電気泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約２．５ｋｂ
の大きさのバンドを回収し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ Ｉ酵素を用いてＰＣＲ回収生成
物を消化し、上記消化生成物を回収した。
ｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１バックボーンベクターの構築：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ
Ｉを用いてｐＳＮ１３０１ベクターを消化し、１％のアガロースを用いて電気泳動を来な
い、大きなバンド消化ベクターを回収し、用意したＨｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ Ｉ消化接
合部を含むｐＬｓｉ１消化生成物と消化ベクターの回収生成物をＴ４リガーゼで一晩ライ
ゲーションし、大腸菌レセプターＴｏｐ１０を形質転換し、モノクローン菌株を選択して
シークエンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンをカナマイシンを含む
ＬＢ培地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラ
ミスドを抽出して用意し、得られたベクタープラミスドｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１を形
質転換に用いるバックボーンベクターとする。
（３）ｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１の構築：：ＰｖＡＣＲ３形質転換ベクター：Ｘｂａ
ＩとＫｐｎ Ｉの相同組換え消化接合部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子のＰＣＲ上流と下流プ
ライマーを設計し、北京ゲノム研究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通
りであり：
上流プライマー：５’－ｇａｇａａｃａｃｇｇｇｇｇａｃｔｃｔａｇａａｔｇｇａｇａａ
ｃｔｃａａｇｃｇｃｇｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、
下流プライマー：５’－ｇｇｇａａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｔａａａｃａｇ
ａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてＰｖＡＣＲ３－１９Ｂをテンプレートと
してＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースを
用いて電気泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約１．２ｋ
ｂの大きさのバンドを回収して用意する。構築されたｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１プラミ
スドをＸｂａ ＩとＫｐｎ Ｉで二重消化し、消化生成物を１％のアガロースで電気泳動
し、大きな断片をオールインワンゴールドゲル回収キットで回収して用意する。
相同組換え接合部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子およびＸｂａ ＩとＫｐｎ ＩでｐＳＮ１３
０１－ｐＬｓｉ１プラミスド相同組換えを二重消化し、前記相同組換えの抽出キットはＴ
ＯＲＯＩＶＤR Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｉｘであり、反
応系は以下の通りであり：Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｉｘ
５ μｌ、二重消化後線形ベクター２００ ｎｇ、標的遺伝子２００ ｎｇ、ｄｄ Ｈ２
Ｏを１０μｌまで補充し、反応系の調製後、数回軽くふいて各成分を混合し、反応系を６
０℃に置き、６０ｍｉｎ反応させた後、反応液を氷中で冷却し、直接形質転換するか、ま
たは－２０℃で保存した。
相同組換え生成物を熱励起法により大腸菌レセプターＴｏｐ１０に形質転換し、モノクロ
ーン菌株を選択してシークエンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンを
カナマイシンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出
キットを用いてプラミスドを抽出して用意し、得られた組換えプラミスドをｐＳＮ１３０
１－ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３とし、組換えプラミスドプロフィールが図３に示される
。正しくシークエンシングされたｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３組換えプ
ラミスドを熱励起法によりアグロバクテリウム・リゾゲネスＥＨＡ１０５に形質転換し、
カナマイシンとリファンピシンを含むプレートにコーティングし、陽性モノクローナルア
グロバクテリウムを選択して保存して用意する。
実施例３
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３イネの遺伝子形質転換およびトランスジェノシス陽性苗の同
定：
実施例２で選択した陽性モノクローナルアグロバクテリウムを５０ｍｇ／Ｌリファンピシ
ンと１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に接種して一晩培養した（
２８℃、２００ｒｐｍ）。一晩培養した２ｍＬのアグロバクテリウムを採取して４０ｍＬ
の新鮮な培養液に添加し、菌液のＯＤ６００値が０．８になるまで、同様の条件下で２回
目の活性化を行った。培養したアグロバクテリウムを４０００ ｇで１０ｍｉｎ遠心分離
し、上清を除去し、沈殿を回収し、５ｍＬ ＭＳ液体培地で再懸濁した。再懸濁液に１０
０μＭアセトシリンゴンが含まれ、アグロバクテリウムＶｉｒ領域の遺伝子活性化を誘導
し、アグロバクテリウムＴ－ＤＮＡの植物ゲノムへの侵入とその統合を促進した。該懸濁
液は後の遺伝子形質転換実験に用いられる。
同時に、均一で充実したＺｈｏｎｇｈｕａ１１イネ種子を選択し、７５％アルコールで３
０ｓ消毒し、２０％次亜塩素酸ナトリウムで２０ｍｉｎ消毒し、治癒組織培地（ＭＳ培地
＋２．０ｍｇ／Ｌ ２,４－Ｄ）に置いて治癒組織を誘導する。１週間後、上記活性化し
たＥＨＡ１０５アグロバクテリウム・リゾゲネスを治癒組織に浸潤させた。０．１ｍｇ／
Ｌ ６－ＢＡ、１．０ｍｇ／Ｌ ２、４－Ｄと１００ μＭ アセトシリンゴンを含むＭ
Ｓ培地に接種して暗所環境で３日間共培養した後、３００ｍｇ／Ｌセファロスポリンを含
む減菌水でそれを洗浄し、その後スクリーニング用培地（ＭＳ培地＋３０ｍｇ／Ｌタウマ
チン＋５００ｍｇ／Ｌセファロスポリン＋１．０ｍｇ／Ｌ ２,４－Ｄ）に置いてスクリ
ーニング培養し、２週間ごとに継代培養を行ったところ、数週間後に、未形質転換体が死
滅し、形質転換体が西域を続けることができた。その後、形質転換した抵抗性治癒組織を
分化培地（ＭＳ培地＋１．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）に移植し、苗
が成長するまで培養を続けた。育苗後、発誘導培地（ＭＳ培地＋３０ｍｇ／Ｌタウマチン
＋６００ｍｇ／Ｌセファロスポリン）に移植して発根培養を行い、発根が良好な抵抗性植
物を土壌に移植して栽培し、トランスジェノシス植物を得た。
得られたトランスジェノシス植物を３:１の分離比の自己交配で３世代スクリーニングし
て単一コピー純系材料であるＴ３世代（Ｌ１とＬ２と記す）を得た。Ｔ３世代の種子を播
種した後、液体窒素を用いてイネの苗（野生型をＷＴと記す）を粉末状に粉砕し、イネの
上部と根部から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲ専用のプレミックスＨｉＳｃｒｉｐｔ
Ｑ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲを用いて逆転写するこ
とによりｃＤＮＡを取得し、ＳＹＢＲ法を用いてトランスジェノシス陽性植物のＰｖＡＣ
Ｒ３遺伝子発現量を同定し、内部参照遺伝子はＯｓＡｃｔｉｎであり、同定に用いたプラ
イマー配列は以下の通りであり：
ＰｖＡＣＲ３－Ｆ：５′－ａｔｇｇａｇａａｃｔｃａａｇｃｇｃｇｇａｇｃｇｇａ－３′
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、
ＰｖＡＣＲ３－Ｒ：５′－ｃｔａａａｃａｇａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔｇａ－３′
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８、
ＯｓＡｃｔｉｎ－Ｆ：５′－ｇａａｇａｔｃａｃｔｇｃｃｔｔｇｃｔｃｃ－３′、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１９、
ＯｓＡｃｔｉｎ－Ｒ：５′－ｃｇａｔａａｃａｇｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｃ－３′、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２０、
同定結果が図４に示される。ＰｖＡＣＲ３遺伝子はイネの地上部組織では発現しておらず
、イネの根部でのみ発現した。
実施例４
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネによる汚染水域のヒ素除去量の
測定：
得られたＴ３世代陽性トランスジェノシス植物をヒ素汚染水域に移栽して水耕実験を行っ
た。ヒ素含有試験水域は、５μＭのＮａＡｓＯ２を外来添加した１／２ホーグランド栄養
液とした。イネ移栽後、１５日間水耕培養した。収穫時のイネ成長は図５中のａと表１に
示される。
表１ 汚染水域中の野生型とトランスジェノシスイネのバイオマス（ｇ）
図５中のａと表１から分かるように、トランスジェノシスイネが該汚染水域でより優れた
ヒ素耐性を示した。
植物サンプルを採取し、水道水と脱イオン水で交互によく洗浄した後、１０５℃で３０ｍ
ｉｎ殺虫し、６５℃で一定重要になるまで乾燥させた。粉砕後、０．０５００±０．００
０５ｇサンプルを量り、５ｍｌのＨＮＯ３と２ｍｌのＨ２Ｏ２によりグラファイト消化炉
で１２０℃で清澄化するまで完全に消化した後、５０ｍＬに定容積した。ＩＣＰ－ＭＳで
野生型イネとトランスジェノシスイネの根部と地上部のヒ素蓄積濃度をそれぞれ検出し、
汚染水域ヒ素の除去量を分析した。結果が図６中のａと表２に示される。
表２ 野生型とトランスジェノシスイネによる汚染水域ヒ素の除去量
図６中のａと表２から分かるように、トランスジェノシスイネ根部組織のヒ素蓄積量が低
いが、地上部組織中のヒ素の蓄積量が野生対照組よりも有意に高く、多量のヒ素がイネの
地上部に輸送され、同時に根部の低蓄積によりヒ素中毒が低減され、イネのヒ素耐性が向
上し、その中でＬ２イネの地上部のヒ素除去能力がより高い。
実施例５
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネによる汚染土壌ヒ素除去量と土
壌有効なヒ素残留量の測定：
得られたＴ３世代陽性トランスジェノシス植物をヒ素汚染土壌に移栽してポッティング実
験を行った。試験土壌は、江蘇省徐州市のイネ土壌を採取した（ｐＨ５．１５、総ヒ素含
有量３８．５１ｍｇ／ｋｇ）。イネ移栽後、９０日間ポッティング培養し、開花籾摺期前
に収穫した。収穫時のイネ成長が図５中のｂと表３に示される。
表３ 野生型とトランスジェノシスイネのバイオマス（ｇ）
図５中のｂと表３から分かるように、トランスジェノシスイネが該汚染土壌でより優れた
ヒ素耐性を示した。
植物サンプルを採取し、水道水と脱イオン水で交互によく洗浄した後、１０５℃で３０ｍ
ｉｎ殺虫し、６５℃で一定重量になるまで乾燥させた。粉砕後、０．５０００±０．００
０５ｇサンプルを量り、５ｍｌのＨＮＯ３と２ｍｌのＨ２Ｏ２によりグラファイト消化炉
で１２０℃で清澄化するまで十分に消化した後、５０ｍＬに定容積した。ＩＣＰ－ＭＳで
野生型イネとトランスジェノシスイネの根部と地上部のヒ素蓄積濃度をそれぞれ検出し、
汚染土壌ヒ素の除去量を分析した。結果が図６中のｂと表４に示される。
表４ 野生型とトランスジェノシスイネによる汚染土壌ヒ素の除去量
図６中のｂと表４から分かるように、トランスジェノシスイネの根部組織のヒ素蓄積量が
低いが、地上部組織中のヒ素の蓄積量が野生対照組よりも有意に高く、多量のヒ素がイネ
の地上部に輸送され、同時に根部の低蓄積によりヒ素中毒が低減され、イネのヒ素耐性が
向上し、その中でＬ１イネの地上部のヒ素の除去能力がより高い。
浄化後のポッティング土壌を採取し、ＩＣＰ－ＭＳで土壌中の残留ＤＧＴ有効態ヒ素とＢ
ＣＲ段階抽出態ヒ素含有量を検出し、ＤＧＴ有効態ヒ素抽出方法は、［Ｓｕｎ, Ｑ．,
Ｃｈｅｎ, Ｊ．, Ｚｈａｎｇ, Ｈ．, Ｄｉｎｇ, Ｓ．Ｍ．, Ｌｉ, Ｚ．, Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ, Ｐ．Ｎ．, Ｃｈｅｎｇ, Ｈ．, Ｈａｎ, Ｃ．, Ｗｕ, Ｌ．Ｈ．, &
Ｚｈａｎｇ, Ｃ．Ｓ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ
ｓ ｉｎ ｔｈｉｎ ｆｉｌｍｓ (ＤＧＴ) ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａ
ｌ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ａｒｓｅｎｉｃ ｉｎ ｗａｔｅｒｓ
ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｙｄｒｏｕｓ ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ ｏｘｉｄ
ｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｌａｙｅｒ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８６
, ３０６０－３０６７ (２０１４）］を参照し、ＢＣＲ段階抽出態ヒ素抽出方法は、［
Ｐｕｅｙｏ, Ｍ．, Ｍａｔｅｕ, Ｊ．, Ｒｉｇｏｌ, Ａ．, Ｖｉｄａｌ, Ｍ．,
Ｌoｐｅｚ－Ｓaｎｃｈｅｚ, Ｊ． Ｆ．, & Ｒａｕｒｅｔ, Ｇ． Ｕｓｅ ｏｆ ｔ
ｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＢＣＲ ｔｈｒｅｅ－ｓｔｅｐ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｅｘ
ｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｒａｃ
ｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｏｉｌｓ
． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ １５２, ３３０－３４１ (２
００８)］を参照した。結果が図７と表５に示される。
表５ 異なる植物浄化後の土壌のＤＧＴ有効態ヒ素とＢＣＲ段階抽出態ヒ素含有量の結果
注：元の土壌は浄化されていない土壌を指す。
図７と表５から分かるように、対照土壌と比較すると、浄化後の土壌の有効態ヒ素濃度が
有意に低下した。
以上の結果から分かるように、本発明は、イネｐＬｓｉ１プロモーターと繊毛虫の砂漠草
ＰｖＡＣＲ３遺伝子の異種融合により作成された高ヒ素蓄積性工学イネは、高いヒ素耐性
を有するだけでなく、地上部のヒ素除去量が多く、土壌の有効なヒ素除去効果が高い。簡
便にイネの地上部を収穫することにより、根株を除去することなくヒ素汚染土壌の有効な
浄化を実現でき、ヒ素汚染土壌浄化を解決する有効な方法である。
比較例１
調節エレメントｐＵｂｉプロモータークローニング：
トウモロコシの苗を液体窒素を用いて粉末状に粉砕し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ植物全ゲノム
ＤＮＡ抽出キットを用いて全ＤＮＡを抽出し、ＮＣＢＩから提供されるトウモロコシＵｂ
ｉｑｕｔｉｎプロモーター配列に従ってｐＵｂｉ上流と下流プライマーを設計し、北京ゲ
ノム研究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ｃｔｇｃａｇｔｇｃａｇｃｇｔｇａｃｃｃｇｇｔｃｇｔ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、
下流プライマー：５’－ｃｔｇｃａｇａａｇｔａａｃａｃｃａａａｃａａｃａｇ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてトウモロコシ全ＤＮＡをテンプレートと
してｐＵｂｉを増幅した（反応系および反応手順が実施例１と同じ）。増幅生成物を１％
のアガロースゲル電気泳動で目標バンドを分離し、オールインワンゴールドゲル回収抽出
キットを用いて回収し、ｐＵｂｉ増幅生成物の電気泳動図が図８に示される。その後回収
生成物をｐＥＡＳＹR－ Ｂｌｕｎｔベクターにライゲーションし、大腸菌レセプターＴ
ｏｐ１０に形質転換し、モノクローン菌株を選択してシークエンシングし、正しくシーク
エンシングされたモノクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で一晩振
とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミスドを抽出してｐＵｂｉ－１９Ｂ
を得て用意する。
バイナリーベクター構築：
（１）ｐＵｂｉプロモーターの取得：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩ消化接合部を含むｐ
ＵｂｉプロモーターのＰＣＲ上流と下流プライマーを設計し、北京ゲノム研究所により合
成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａａｇｃｔｔｃｔｇｃａｇｔｇｃａｇｃｇｔｇａｃｃｃ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、
下流プライマー：５’－ｇｇａｔｃｃｃｔｇｃａｇａａｇｔａａｃａｃｃａａａｃａａｃ
ａｇ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてｐＵｂｉ－１９Ｂをテンプレートとして
ＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースで電気
泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約２．０ｋｂの大きさ
のバンドを回収し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩを用いてＰＣＲ回収生成物を消化し、
上記消化生成物を回収した。
ｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉバックボーンベクターの構築：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩ
を用いてｐＳＮ１３０１ベクターを消化し、１％のアガロースを用いて電気泳動を行い、
大きなバンド消化ベクターを回収し、用意したＨｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩ消化接合部
を含むｐＵｂｉ消化生成物と消化ベクターの回収生成物をＴ４リガーゼで一晩ライゲーシ
ョンし、大腸菌レセプターＴｏｐ１０に形質転換し、モノクローン菌株を選択してシーク
エンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンをカナマイシンを含むＬＢ培
地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミスド
を抽出して用意し、得られたベクタープラミスドｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉを、形質転換
に用いるバックボーンベクターとする。
（３）ｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉの構築：：ＰｖＡＣＲ３形質転換ベクター：ＢａｍＨＩ
とＫｐｎＩ相同組換え消化接合部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子のＰＣＲ上流と下流プライマ
ーを設計し、北京ゲノム研究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであ
り：
上流プライマー：５’－ｇｔｇｔｔａｃｔｔｃｔｇｃａｇｇｇａｔｃｃａｔｇｇａｇａａ
ｃｔｃａａｇｃｇｃｇｇ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、
下流プライマー：５’－ｇｇｇａａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｔａａａｃａｇ
ａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてＰｖＡＣＲ３－１９Ｂをテンプレートと
してＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースを
用いて電気泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約１．２ｋ
ｂの大きさのバンドを回収して用意する。構築したｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉプラミスド
をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで二重消化し、消化生成物を１％のアガロースで電気泳動し、大
きな断片をオールインワンゴールドゲル回収キットで回収して用意する。相同組換え接合
部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子およびＢａｍＨＩとＫｐｎＩでｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉプ
ラミスド相同組換えを二重消化した（方法が実施例２と同じ）。相同組換え生成物を熱励
起法により大腸菌レセプターＴｏｐ１０に形質転換し、モノクローン菌株を選択してシー
クエンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンをカナマイシンを含むＬＢ
培地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミス
ドを抽出して用意し、得られた組換えプラミスドがｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉ：：ＰｖＡ
ＣＲ３であり、組換えプラミスドプロフィールが図９に示される。正しくシークエンシン
グされたｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３組換えプラミスドを熱励起法により
アグロバクテリウム・リゾゲネスＥＨＡ１０５に形質転換し、カナマイシンとリファンピ
シンを含むプレートにコーティングし、陽性モノクローンを選択して保存して用意する。
比較例２
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３イネの遺伝子形質転換およびトランスジェノシス陽性苗の同定
方法は実施例３とは以下の点を除いて同様であり、実施例２で選択した陽性モノクローナ
ルアグロバクテリウムを比較例１で選択した陽性モノクローナルアグロバクテリウムに置
き換えた。同定結果が図４に示される。ＰｖＡＣＲ３遺伝子がイネの地上部と根部の両方
で発現していた。そして、ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシスイネ根部におけ
るＰｖＡＣＲ３発現量がｐＬｓｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシスイネ根部における
ＰｖＡＣＲ３発現量よりも有意高かった。
比較例３
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネのヒ素汚染水域中の生育状況：
得られたＴ３世代ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３陽性トランスジェノシス植物を３日間発芽さ
せた後、５μＭと２０μＭのＮａＡｓＯ２を含む１／２ホーグランド栄養液に移栽して１
５日間水耕処理した。１５日間後写真を撮り、表現型を記録した。結果が図１０に示され
、ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシスイネがヒ素含有水域で著しく生育が阻害
された。
比較例４
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネ在ヒ素汚染土壌中増殖状況：
比較例２で得られたＴ３世代陽性トランスジェノシス植物を実際のヒ素汚染土壌に移栽し
てポッティング実験を行った。試験土壌は、江蘇省徐州市のイネ土壌を採取した（ｐＨ５
．１５、総ヒ素含有量３８．５１ｍｇ／ｋｇ）。トランスジェノシスイネが該汚染土壌で
２週間生育した後、中毒による枯死現象を示した（図１１）。
比較例２～４の結果から分かるように、ユビキタス発現プロモーターｐＵｂｉがイネのＰ
ｖＡＣＲ３遺伝子を過剰発現させ、イネに多量のヒ素を蓄積させ、ヒ素が基準値を超えな
い土壌では、苗の段階ですでに明らかな中毒死亡現象が現れていたことが分かる。ユビキ
タス発現プロモーターｐＵｂｉがＰｖＡＣＲ３遺伝子を駆動して構築したイネ材料は、ヒ
素汚染水域・土壌の浄化には適用できない。
本発明は、イネ根部の特異的な弱いプロモーターｐＬｓｉ１を選択してＰｖＡＣＲ３遺伝
子をイネで発現させ、その駆動下でイネ根部によって吸収されたヒ素を地上部に移動させ
ることができる。しかし、ＰｖＡＣＲ３遺伝子発現量が強いプロモーターｐＵｂｉ駆動よ
りも低く、蓄積量と耐性のバランスを取る。イネの地上部蓄積ヒ素の増加とバイオマスの
増加の両方も確保される。作成された高ヒ素蓄積性工学イネは、土壌重金属の減少と浄化
に利用することができ、経済的で迅速かつ方法が簡単で効果的であるという利点を有する
。
以上、上記実施例で本発明を詳細に説明したが、それらは本発明の一部の実施例に過ぎず
、すべての実施例ではなく、当業者が、創造的な労働をすることなく本実施例に従って他
の実施例を得ることができ、これらの実施例はすべて本発明の保護範囲に含まれるものと
する。
調節エレメントｐＬｓｉ１プロモーターとヒ素高蓄積遺伝子ＰｖＡＣＲ３のクローニング
：
イネＺｈｏｎｇｈｕａ１１の苗の根系を液体窒素を用いて粉末状に粉砕し、Ｎｏｖｏｚｙ
ｍｅｓ植物全ＤＮＡ抽出キットを用いてその全ゲノムＤＮＡを抽出し、イネＯｓＬｓｉ１
遺伝子の上流２５００ｂｐ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）をテンプレート増幅ｐＬｓｉ
１プロモーターとして選択し、上流と下流プライマーが北京ゲノム研究所により合成され
、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａａｇｔａａａａｃｃａｔｇｇｔｔａｔｔｃｔｇａａｔ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、
下流プライマー：５’－ｇｇｃａｇｇｔａｃｔａｇｔａｇｔｔａｃａｇｔｃｃｔ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４。
繊毛虫の砂漠草の苗を液体窒素を用いて粉末状に粉砕し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ植物全ＲＮ
Ａ抽出キットを用いてその全ＲＮＡを抽出し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ逆転写抽出キットを用
いてｃＤＮＡに逆転写し、ＮＣＢＩから提供されるＰｖＡＣＲ３遺伝子のｃＤＮＡ配列（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に従って、その上流と下流プライマーを設計して北京ゲノム研
究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａｔｇｇａｇａａｃｔｃａａｇｃｇｃｇｇａｇｃ－３’,ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．５、
下流プライマー：５’－ｃｔａａａｃａｇａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔｇａ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてそれぞれイネ根部全ＤＮＡと繊毛虫の砂
漠草ｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行ってｐＬｓｉ１とＰｖＡＣＲ３を得、
前記ＰＣＲ増幅の反応系は以下の通りであり：２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯ
Ｄ ２５ μｌ、ｄＮＴＰ １０ μｌ、Ｅ（ＫＯＤ×ＮＥＯ高忠実度酵素）１．２５
μｌ、上流プライマー１．２５ μｌ、下流プライマー１．２５ μｌ、テンプレート２
．５ μｌとｄｄＨ ２ Ｏ ８．７５ μｌ、前記ＰＣＲ増幅の反応手順は以下の通りであ
り：９４℃で２ｍｉｎ前変性し、９８℃で３０ｓ変性し、６０℃で１０ｓアニーリングし
、７２℃で３ｍｉｎ／ｋｂ伸長し、合計３２サイクルで、７２℃で１０ｍｉｎ反応させた
。
増幅生成物を１％のアガロースゲル電気泳動で目標バンドを分離し、オールインワンゴー
ルドゲル回収抽出キットを用いて回収し、ｐＬｓｉ１とＰｖＡＣＲ３増幅生成物の電気泳
動図が図２に示される。
その後回収生成物をｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ抽出キットを用い
てｐＥＡＳＹR－ Ｂｌｕｎｔベクターにライゲーションし、大腸菌レセプターＴｏｐ１
０に形質転換した後、シークエンシングのためにモノクローン菌株をピックし、正しくシ
ークエンシングされたモノクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で一
晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミスドを抽出し、ｐＬｓｉ１－
１９ＢとＰｖＡＣＲ３－１９Ｂを得て用意する。
実施例２
異種融合発現バイナリーベクターの構築：
カオトロピックスクリーニング遺伝子を含むｐＳＮ１３０１バイナリーベクターをバック
ボーンベクターとし、さらに異種融合発現バイナリーベクターの構築を行った。
（１）ｐＬｓｉ１プロモーターの取得：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ Ｉ消化接合部を含む
ｐＬｓｉ１プロモーターのＰＣＲ上流と下流プライマーを設計し、北京ゲノム研究所によ
り合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａａｇｃｔｔａａｇｔａａａａｃｃａｔｇｇｔｔａｔｔｃｔｇａ
ａｔｃｔａａ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、
下流プライマー：５’－ｇｔｃｇａｃｇｇｃａｇｇｔａｃｔａｇｔａｇｔｔａｃａｇｔｃ
ｃｔｃａ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてｐＬｓｉ１－１９Ｂをテンプレートとし
てＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースを用
いて電気泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約２．５ｋｂ
の大きさのバンドを回収し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ Ｉ酵素を用いてＰＣＲ回収生成
物を消化し、上記消化生成物を回収した。
ｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１バックボーンベクターの構築：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ
Ｉを用いてｐＳＮ１３０１ベクターを消化し、１％のアガロースを用いて電気泳動を来な
い、大きなバンド消化ベクターを回収し、用意したＨｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌ Ｉ消化接
合部を含むｐＬｓｉ１消化生成物と消化ベクターの回収生成物をＴ４リガーゼで一晩ライ
ゲーションし、大腸菌レセプターＴｏｐ１０を形質転換し、モノクローン菌株を選択して
シークエンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンをカナマイシンを含む
ＬＢ培地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラ
ミスドを抽出して用意し、得られたベクタープラミスドｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１を形
質転換に用いるバックボーンベクターとする。
（３）ｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１の構築：：ＰｖＡＣＲ３形質転換ベクター：Ｘｂａ
ＩとＫｐｎ Ｉの相同組換え消化接合部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子のＰＣＲ上流と下流プ
ライマーを設計し、北京ゲノム研究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通
りであり：
上流プライマー：５’－ｇａｇａａｃａｃｇｇｇｇｇａｃｔｃｔａｇａａｔｇｇａｇａａ
ｃｔｃａａｇｃｇｃｇｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、
下流プライマー：５’－ｇｇｇａａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｔａａａｃａｇ
ａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてＰｖＡＣＲ３－１９Ｂをテンプレートと
してＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースを
用いて電気泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約１．２ｋ
ｂの大きさのバンドを回収して用意する。構築されたｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１プラミ
スドをＸｂａ ＩとＫｐｎ Ｉで二重消化し、消化生成物を１％のアガロースで電気泳動
し、大きな断片をオールインワンゴールドゲル回収キットで回収して用意する。
相同組換え接合部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子およびＸｂａ ＩとＫｐｎ ＩでｐＳＮ１３
０１－ｐＬｓｉ１プラミスド相同組換えを二重消化し、前記相同組換えの抽出キットはＴ
ＯＲＯＩＶＤR Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｉｘであり、反
応系は以下の通りであり：Ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｍｉｘ
５ μｌ、二重消化後線形ベクター２００ ｎｇ、標的遺伝子２００ ｎｇ、ｄｄ Ｈ２
Ｏを１０μｌまで補充し、反応系の調製後、数回軽くふいて各成分を混合し、反応系を６
０℃に置き、６０ｍｉｎ反応させた後、反応液を氷中で冷却し、直接形質転換するか、ま
たは－２０℃で保存した。
相同組換え生成物を熱励起法により大腸菌レセプターＴｏｐ１０に形質転換し、モノクロ
ーン菌株を選択してシークエンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンを
カナマイシンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出
キットを用いてプラミスドを抽出して用意し、得られた組換えプラミスドをｐＳＮ１３０
１－ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３とし、組換えプラミスドプロフィールが図３に示される
。正しくシークエンシングされたｐＳＮ１３０１－ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３組換えプ
ラミスドを熱励起法によりアグロバクテリウム・リゾゲネスＥＨＡ１０５に形質転換し、
カナマイシンとリファンピシンを含むプレートにコーティングし、陽性モノクローナルア
グロバクテリウムを選択して保存して用意する。
実施例３
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３イネの遺伝子形質転換およびトランスジェノシス陽性苗の同
定：
実施例２で選択した陽性モノクローナルアグロバクテリウムを５０ｍｇ／Ｌリファンピシ
ンと１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に接種して一晩培養した（
２８℃、２００ｒｐｍ）。一晩培養した２ｍＬのアグロバクテリウムを採取して４０ｍＬ
の新鮮な培養液に添加し、菌液のＯＤ６００値が０．８になるまで、同様の条件下で２回
目の活性化を行った。培養したアグロバクテリウムを４０００ ｇで１０ｍｉｎ遠心分離
し、上清を除去し、沈殿を回収し、５ｍＬ ＭＳ液体培地で再懸濁した。再懸濁液に１０
０μＭアセトシリンゴンが含まれ、アグロバクテリウムＶｉｒ領域の遺伝子活性化を誘導
し、アグロバクテリウムＴ－ＤＮＡの植物ゲノムへの侵入とその統合を促進した。該懸濁
液は後の遺伝子形質転換実験に用いられる。
同時に、均一で充実したＺｈｏｎｇｈｕａ１１イネ種子を選択し、７５％アルコールで３
０ｓ消毒し、２０％次亜塩素酸ナトリウムで２０ｍｉｎ消毒し、治癒組織培地（ＭＳ培地
＋２．０ｍｇ／Ｌ ２,４－Ｄ）に置いて治癒組織を誘導する。１週間後、上記活性化し
たＥＨＡ１０５アグロバクテリウム・リゾゲネスを治癒組織に浸潤させた。０．１ｍｇ／
Ｌ ６－ＢＡ、１．０ｍｇ／Ｌ ２、４－Ｄと１００ μＭ アセトシリンゴンを含むＭ
Ｓ培地に接種して暗所環境で３日間共培養した後、３００ｍｇ／Ｌセファロスポリンを含
む減菌水でそれを洗浄し、その後スクリーニング用培地（ＭＳ培地＋３０ｍｇ／Ｌタウマ
チン＋５００ｍｇ／Ｌセファロスポリン＋１．０ｍｇ／Ｌ ２,４－Ｄ）に置いてスクリ
ーニング培養し、２週間ごとに継代培養を行ったところ、数週間後に、未形質転換体が死
滅し、形質転換体が西域を続けることができた。その後、形質転換した抵抗性治癒組織を
分化培地（ＭＳ培地＋１．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）に移植し、苗
が成長するまで培養を続けた。育苗後、発誘導培地（ＭＳ培地＋３０ｍｇ／Ｌタウマチン
＋６００ｍｇ／Ｌセファロスポリン）に移植して発根培養を行い、発根が良好な抵抗性植
物を土壌に移植して栽培し、トランスジェノシス植物を得た。
得られたトランスジェノシス植物を３:１の分離比の自己交配で３世代スクリーニングし
て単一コピー純系材料であるＴ３世代（Ｌ１とＬ２と記す）を得た。Ｔ３世代の種子を播
種した後、液体窒素を用いてイネの苗（野生型をＷＴと記す）を粉末状に粉砕し、イネの
上部と根部から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲ専用のプレミックスＨｉＳｃｒｉｐｔ
Ｑ Ｓｅｌｅｃｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲを用いて逆転写するこ
とによりｃＤＮＡを取得し、ＳＹＢＲ法を用いてトランスジェノシス陽性植物のＰｖＡＣ
Ｒ３遺伝子発現量を同定し、内部参照遺伝子はＯｓＡｃｔｉｎであり、同定に用いたプラ
イマー配列は以下の通りであり：
ＰｖＡＣＲ３－Ｆ：５′－ａｔｇｇａｇａａｃｔｃａａｇｃｇｃｇｇａｇｃｇｇａ－３′
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、
ＰｖＡＣＲ３－Ｒ：５′－ｃｔａａａｃａｇａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔｇａ－３′
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８、
ＯｓＡｃｔｉｎ－Ｆ：５′－ｇａａｇａｔｃａｃｔｇｃｃｔｔｇｃｔｃｃ－３′、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１９、
ＯｓＡｃｔｉｎ－Ｒ：５′－ｃｇａｔａａｃａｇｃｔｃｃｔｃｔｔｇｇｃ－３′、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２０、
同定結果が図４に示される。ＰｖＡＣＲ３遺伝子はイネの地上部組織では発現しておらず
、イネの根部でのみ発現した。
実施例４
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネによる汚染水域のヒ素除去量の
測定：
得られたＴ３世代陽性トランスジェノシス植物をヒ素汚染水域に移栽して水耕実験を行っ
た。ヒ素含有試験水域は、５μＭのＮａＡｓＯ２を外来添加した１／２ホーグランド栄養
液とした。イネ移栽後、１５日間水耕培養した。収穫時のイネ成長は図５中のａと表１に
示される。
表１ 汚染水域中の野生型とトランスジェノシスイネのバイオマス（ｇ）
図５中のａと表１から分かるように、トランスジェノシスイネが該汚染水域でより優れた
ヒ素耐性を示した。
植物サンプルを採取し、水道水と脱イオン水で交互によく洗浄した後、１０５℃で３０ｍ
ｉｎ殺虫し、６５℃で一定重要になるまで乾燥させた。粉砕後、０．０５００±０．００
０５ｇサンプルを量り、５ｍｌのＨＮＯ３と２ｍｌのＨ２Ｏ２によりグラファイト消化炉
で１２０℃で清澄化するまで完全に消化した後、５０ｍＬに定容積した。ＩＣＰ－ＭＳで
野生型イネとトランスジェノシスイネの根部と地上部のヒ素蓄積濃度をそれぞれ検出し、
汚染水域ヒ素の除去量を分析した。結果が図６中のａと表２に示される。
表２ 野生型とトランスジェノシスイネによる汚染水域ヒ素の除去量
図６中のａと表２から分かるように、トランスジェノシスイネ根部組織のヒ素蓄積量が低
いが、地上部組織中のヒ素の蓄積量が野生対照組よりも有意に高く、多量のヒ素がイネの
地上部に輸送され、同時に根部の低蓄積によりヒ素中毒が低減され、イネのヒ素耐性が向
上し、その中でＬ２イネの地上部のヒ素除去能力がより高い。
実施例５
ｐＬｓｉ１：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネによる汚染土壌ヒ素除去量と土
壌有効なヒ素残留量の測定：
得られたＴ３世代陽性トランスジェノシス植物をヒ素汚染土壌に移栽してポッティング実
験を行った。試験土壌は、江蘇省徐州市のイネ土壌を採取した（ｐＨ５．１５、総ヒ素含
有量３８．５１ｍｇ／ｋｇ）。イネ移栽後、９０日間ポッティング培養し、開花籾摺期前
に収穫した。収穫時のイネ成長が図５中のｂと表３に示される。
表３ 野生型とトランスジェノシスイネのバイオマス（ｇ）
図５中のｂと表３から分かるように、トランスジェノシスイネが該汚染土壌でより優れた
ヒ素耐性を示した。
植物サンプルを採取し、水道水と脱イオン水で交互によく洗浄した後、１０５℃で３０ｍ
ｉｎ殺虫し、６５℃で一定重量になるまで乾燥させた。粉砕後、０．５０００±０．００
０５ｇサンプルを量り、５ｍｌのＨＮＯ３と２ｍｌのＨ２Ｏ２によりグラファイト消化炉
で１２０℃で清澄化するまで十分に消化した後、５０ｍＬに定容積した。ＩＣＰ－ＭＳで
野生型イネとトランスジェノシスイネの根部と地上部のヒ素蓄積濃度をそれぞれ検出し、
汚染土壌ヒ素の除去量を分析した。結果が図６中のｂと表４に示される。
表４ 野生型とトランスジェノシスイネによる汚染土壌ヒ素の除去量
図６中のｂと表４から分かるように、トランスジェノシスイネの根部組織のヒ素蓄積量が
低いが、地上部組織中のヒ素の蓄積量が野生対照組よりも有意に高く、多量のヒ素がイネ
の地上部に輸送され、同時に根部の低蓄積によりヒ素中毒が低減され、イネのヒ素耐性が
向上し、その中でＬ１イネの地上部のヒ素の除去能力がより高い。
浄化後のポッティング土壌を採取し、ＩＣＰ－ＭＳで土壌中の残留ＤＧＴ有効態ヒ素とＢ
ＣＲ段階抽出態ヒ素含有量を検出し、ＤＧＴ有効態ヒ素抽出方法は、［Ｓｕｎ, Ｑ．,
Ｃｈｅｎ, Ｊ．, Ｚｈａｎｇ, Ｈ．, Ｄｉｎｇ, Ｓ．Ｍ．, Ｌｉ, Ｚ．, Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓ, Ｐ．Ｎ．, Ｃｈｅｎｇ, Ｈ．, Ｈａｎ, Ｃ．, Ｗｕ, Ｌ．Ｈ．, &
Ｚｈａｎｇ, Ｃ．Ｓ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ
ｓ ｉｎ ｔｈｉｎ ｆｉｌｍｓ (ＤＧＴ) ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａ
ｌ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ａｒｓｅｎｉｃ ｉｎ ｗａｔｅｒｓ
ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｙｄｒｏｕｓ ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ ｏｘｉｄ
ｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｌａｙｅｒ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８６
, ３０６０－３０６７ (２０１４）］を参照し、ＢＣＲ段階抽出態ヒ素抽出方法は、［
Ｐｕｅｙｏ, Ｍ．, Ｍａｔｅｕ, Ｊ．, Ｒｉｇｏｌ, Ａ．, Ｖｉｄａｌ, Ｍ．,
Ｌoｐｅｚ－Ｓaｎｃｈｅｚ, Ｊ． Ｆ．, & Ｒａｕｒｅｔ, Ｇ． Ｕｓｅ ｏｆ ｔ
ｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＢＣＲ ｔｈｒｅｅ－ｓｔｅｐ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｅｘ
ｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｒａｃ
ｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｓｏｉｌｓ
． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ １５２, ３３０－３４１ (２
００８)］を参照した。結果が図７と表５に示される。
表５ 異なる植物浄化後の土壌のＤＧＴ有効態ヒ素とＢＣＲ段階抽出態ヒ素含有量の結果
注：元の土壌は浄化されていない土壌を指す。
図７と表５から分かるように、対照土壌と比較すると、浄化後の土壌の有効態ヒ素濃度が
有意に低下した。
以上の結果から分かるように、本発明は、イネｐＬｓｉ１プロモーターと繊毛虫の砂漠草
ＰｖＡＣＲ３遺伝子の異種融合により作成された高ヒ素蓄積性工学イネは、高いヒ素耐性
を有するだけでなく、地上部のヒ素除去量が多く、土壌の有効なヒ素除去効果が高い。簡
便にイネの地上部を収穫することにより、根株を除去することなくヒ素汚染土壌の有効な
浄化を実現でき、ヒ素汚染土壌浄化を解決する有効な方法である。
比較例１
調節エレメントｐＵｂｉプロモータークローニング：
トウモロコシの苗を液体窒素を用いて粉末状に粉砕し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ植物全ゲノム
ＤＮＡ抽出キットを用いて全ＤＮＡを抽出し、ＮＣＢＩから提供されるトウモロコシＵｂ
ｉｑｕｔｉｎプロモーター配列に従ってｐＵｂｉ上流と下流プライマーを設計し、北京ゲ
ノム研究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ｃｔｇｃａｇｔｇｃａｇｃｇｔｇａｃｃｃｇｇｔｃｇｔ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、
下流プライマー：５’－ｃｔｇｃａｇａａｇｔａａｃａｃｃａａａｃａａｃａｇ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてトウモロコシ全ＤＮＡをテンプレートと
してｐＵｂｉを増幅した（反応系および反応手順が実施例１と同じ）。増幅生成物を１％
のアガロースゲル電気泳動で目標バンドを分離し、オールインワンゴールドゲル回収抽出
キットを用いて回収し、ｐＵｂｉ増幅生成物の電気泳動図が図８に示される。その後回収
生成物をｐＥＡＳＹR－ Ｂｌｕｎｔベクターにライゲーションし、大腸菌レセプターＴ
ｏｐ１０に形質転換し、モノクローン菌株を選択してシークエンシングし、正しくシーク
エンシングされたモノクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して３７℃で一晩振
とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミスドを抽出してｐＵｂｉ－１９Ｂ
を得て用意する。
バイナリーベクター構築：
（１）ｐＵｂｉプロモーターの取得：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩ消化接合部を含むｐ
ＵｂｉプロモーターのＰＣＲ上流と下流プライマーを設計し、北京ゲノム研究所により合
成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであり：
上流プライマー：５’－ａａｇｃｔｔｃｔｇｃａｇｔｇｃａｇｃｇｔｇａｃｃｃ－３’,
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、
下流プライマー：５’－ｇｇａｔｃｃｃｔｇｃａｇａａｇｔａａｃａｃｃａａａｃａａｃ
ａｇ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてｐＵｂｉ－１９Ｂをテンプレートとして
ＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースで電気
泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約２．０ｋｂの大きさ
のバンドを回収し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩを用いてＰＣＲ回収生成物を消化し、
上記消化生成物を回収した。
ｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉバックボーンベクターの構築：Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩ
を用いてｐＳＮ１３０１ベクターを消化し、１％のアガロースを用いて電気泳動を行い、
大きなバンド消化ベクターを回収し、用意したＨｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨＩ消化接合部
を含むｐＵｂｉ消化生成物と消化ベクターの回収生成物をＴ４リガーゼで一晩ライゲーシ
ョンし、大腸菌レセプターＴｏｐ１０に形質転換し、モノクローン菌株を選択してシーク
エンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンをカナマイシンを含むＬＢ培
地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミスド
を抽出して用意し、得られたベクタープラミスドｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉを、形質転換
に用いるバックボーンベクターとする。
（３）ｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉの構築：：ＰｖＡＣＲ３形質転換ベクター：ＢａｍＨＩ
とＫｐｎＩ相同組換え消化接合部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子のＰＣＲ上流と下流プライマ
ーを設計し、北京ゲノム研究所により合成され、そのヌクレオチド配列は以下の通りであ
り：
上流プライマー：５’－ｇｔｇｔｔａｃｔｔｃｔｇｃａｇｇｇａｔｃｃａｔｇｇａｇａａ
ｃｔｃａａｇｃｇｃｇｇ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、
下流プライマー：５’－ｇｇｇａａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｔａａａｃａｇ
ａａｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６。
プライマー合成後、ＫＯＤ高忠実度酵素を用いてＰｖＡＣＲ３－１９Ｂをテンプレートと
してＰＣＲ増幅を行い（反応系および反応手順が実施例１と同じ）、１％のアガロースを
用いて電気泳動を行い、オールインワンゴールドゲル回収抽出キットを用いて約１．２ｋ
ｂの大きさのバンドを回収して用意する。構築したｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉプラミスド
をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで二重消化し、消化生成物を１％のアガロースで電気泳動し、大
きな断片をオールインワンゴールドゲル回収キットで回収して用意する。相同組換え接合
部を含むＰｖＡＣＲ３遺伝子およびＢａｍＨＩとＫｐｎＩでｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉプ
ラミスド相同組換えを二重消化した（方法が実施例２と同じ）。相同組換え生成物を熱励
起法により大腸菌レセプターＴｏｐ１０に形質転換し、モノクローン菌株を選択してシー
クエンシングし、正しくシークエンシングされたモノクローンをカナマイシンを含むＬＢ
培地に接種して３７℃で一晩振とう培養し、プラミスドミニ抽出キットを用いてプラミス
ドを抽出して用意し、得られた組換えプラミスドがｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉ：：ＰｖＡ
ＣＲ３であり、組換えプラミスドプロフィールが図９に示される。正しくシークエンシン
グされたｐＳＮ１３０１－ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３組換えプラミスドを熱励起法により
アグロバクテリウム・リゾゲネスＥＨＡ１０５に形質転換し、カナマイシンとリファンピ
シンを含むプレートにコーティングし、陽性モノクローンを選択して保存して用意する。
比較例２
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３イネの遺伝子形質転換およびトランスジェノシス陽性苗の同定
方法は実施例３とは以下の点を除いて同様であり、実施例２で選択した陽性モノクローナ
ルアグロバクテリウムを比較例１で選択した陽性モノクローナルアグロバクテリウムに置
き換えた。同定結果が図４に示される。ＰｖＡＣＲ３遺伝子がイネの地上部と根部の両方
で発現していた。そして、ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシスイネ根部におけ
るＰｖＡＣＲ３発現量がｐＬｓｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシスイネ根部における
ＰｖＡＣＲ３発現量よりも有意高かった。
比較例３
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネのヒ素汚染水域中の生育状況：
得られたＴ３世代ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３陽性トランスジェノシス植物を３日間発芽さ
せた後、５μＭと２０μＭのＮａＡｓＯ２を含む１／２ホーグランド栄養液に移栽して１
５日間水耕処理した。１５日間後写真を撮り、表現型を記録した。結果が図１０に示され
、ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシスイネがヒ素含有水域で著しく生育が阻害
された。
比較例４
ｐＵｂｉ：：ＰｖＡＣＲ３トランスジェノシス陽性イネ在ヒ素汚染土壌中増殖状況：
比較例２で得られたＴ３世代陽性トランスジェノシス植物を実際のヒ素汚染土壌に移栽し
てポッティング実験を行った。試験土壌は、江蘇省徐州市のイネ土壌を採取した（ｐＨ５
．１５、総ヒ素含有量３８．５１ｍｇ／ｋｇ）。トランスジェノシスイネが該汚染土壌で
２週間生育した後、中毒による枯死現象を示した（図１１）。
比較例２～４の結果から分かるように、ユビキタス発現プロモーターｐＵｂｉがイネのＰ
ｖＡＣＲ３遺伝子を過剰発現させ、イネに多量のヒ素を蓄積させ、ヒ素が基準値を超えな
い土壌では、苗の段階ですでに明らかな中毒死亡現象が現れていたことが分かる。ユビキ
タス発現プロモーターｐＵｂｉがＰｖＡＣＲ３遺伝子を駆動して構築したイネ材料は、ヒ
素汚染水域・土壌の浄化には適用できない。
本発明は、イネ根部の特異的な弱いプロモーターｐＬｓｉ１を選択してＰｖＡＣＲ３遺伝
子をイネで発現させ、その駆動下でイネ根部によって吸収されたヒ素を地上部に移動させ
ることができる。しかし、ＰｖＡＣＲ３遺伝子発現量が強いプロモーターｐＵｂｉ駆動よ
りも低く、蓄積量と耐性のバランスを取る。イネの地上部蓄積ヒ素の増加とバイオマスの
増加の両方も確保される。作成された高ヒ素蓄積性工学イネは、土壌重金属の減少と浄化
に利用することができ、経済的で迅速かつ方法が簡単で効果的であるという利点を有する
。
以上、上記実施例で本発明を詳細に説明したが、それらは本発明の一部の実施例に過ぎず
、すべての実施例ではなく、当業者が、創造的な労働をすることなく本実施例に従って他
の実施例を得ることができ、これらの実施例はすべて本発明の保護範囲に含まれるものと
する。
［配列表］
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="高ヒ素蓄積性工学イネを作成する
ための組換えベクターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用.xml" softwareName="WIPO
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<InventionTitle languageCode="ja">高ヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベク
ターおよびヒ素汚染水域・土壌浄化への応用</InventionTitle>
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cctcatgccaatgcgctagtctcatctcaggcagcacaagctgtcttttcatcctgtagatcgtgcaaaataaggtgctg
gttctaaacgtgccccagaaagcgctctctgtttgcacatgtgtgtatttagtggtatttttcagtaccaatatccattt
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aatgtagttagattcatacacacaaaagtgattaacaagaactacactagtggcctgaggagcgcagacaaaagaagatc
aataatcagcgaaggtaattatgccagcttctggatggatggtgcatctgtgattgattcactgatctgatcgctcactc
gtcagctatcttggttccatgcctctcatgaaaagctaaggggttgcagagaagcgtggattttccctcttgtggcctgg
cctcatgccaatgcgctagtctcatctcaggcagcacaagctgtcttttcatcctgtagatcgtgcaaaataaggtgctg
gttctaaacgtgccccagaaagcgctctctgtttgcacatgtgtgtatttagtggtatttttcagtaccaatatccattt
attttcatttaatttgctttgctcgtaaagtagttcttgattctacatgtatacatctacaaagtattgatgagtgctca
ttacagaaggcatctcaaatcaataaattatctgcatttttgcgaaagaaacctgattgaaacacctcgtgaacgaaata
cctagcaaactctgtaaggcctgagattttcaccaagtcgagtggctgatctgcaacgagctgtaccgatcaaaatatgg
gttctttcattctttgtgatgtgtgctgattttccaatcgaaaatcattgtggcaagattttgtcagggcatcgccgtcc
acactctgctcccccaccggggatgcctaccaagggaagaagaggcgtcataactgccatacacttgtgctgtctacggc
catcagagcattgaccatacgggcctacttcacagaacatgattgacctgtaaaaatcagcttcagactttgagttccga
atcctgttgatttttcattgagtttaattaggagtaggtggcattgctcttcagatgatatgtcgatttctggcattgct
ctttttaatacaaggtgatgaaaattcagctgcctgaattggagttttgttttcctgaactgtagtatctgaactctgaa
gacagttactgatagtggtagtacaagatagtactccctccgttttgaaatgtttgacgccgttgactttttatcacatg
tttgatcattcgtcttattcaaaaaatttaagtaattattaattattttcctatcatttgattcattattaaatatattt
ttatgtagacatataattttacatatctcacaaaagtttttgaataagacgaacagttaaacatgtgctaaaaagtcaac
ggtgtcaaacatttcgaactggagggagtatcctacaggtacagtacggcaaaaaaagaaaaactgaatgtgagctaagc
tcaatgagagaagctaggattgcaaattgctgaagtactccaactgacatgagatttttcaatagtagcaggtcagtttt
gacagtgaccatccaagtgcaacgtcctctgctctgacattgcttagcattgctaaccgaagcatgcacactgcgtaata
gagtggttaggataaccccttattgtaatgtcacctttgcaaatccttaactgctcggatatttcaatttggtcaccaga
gatggcaatcctacaattgaaaatttgttcagttgccacggatccatcattaatctggcaatggcggcaacctctgacag
ggacaatggcaaattcggccaatagtaaatttcggtacggtttatcctagttggcattggcacacatggttcgtctcttc
tacgagtatagattatgaaaaatgtcaacttacaacaggtgacgaatttcgcaaaaaaaacgtattaacattcggcatgg
aaaacgtacgtagaatgaccaaaaatatccatccctatagtatcatttctttcaggggagcccccaatctacaaaagaaa
aagaatttgttcgtcacccatatatcggcgtcatgacctcgacgtcgcgctttatccaggcatatagtttacaacacctt
gtgaattgaaaacccacaattatttcagtctaacagcagacagaggcaacgttgctctcgttgtcgttcacggggggatg
acgcgcggttttatgccctcgacgagaatacaaaatcaagtatgcgtttctgtttctcggccaatgctgatccgacaacg
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tcatagtcatggcagtgtccatcatctttgggtactatgtcaagggtgtgaagaaggcgttccaagtagcggagataaca
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Claims (4)
- 組換え遺伝子と植物発現ベクターを含み、前記組換え遺伝子はｐＬｓｉ１プロモーターと
ＰｖＡＣＲ３遺伝子を含み、前記ｐＬｓｉ１プロモーターのヌクレオチド配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１に示され、前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２に示され、
前記植物発現ベクターはｐＳＮ１３０１ベクターを含み、
組換えベクターの構築方法は、
イネ全ＤＮＡをテンプレートとし、第１ＰＣＲ増幅を行ってｐＬｓｉ１プロモーターを
得るステップと、
第１プライマー対と第２プライマー対を含み、前記第１プライマー対の配列はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示され、
５’－ａａｇｃｔｔａａｇｔａａａａｃｃａｔｇｇｔｔａｔｔｃｔｇａａｔｃｔａａ
－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７
５’－ｇｔｃｇａｃｇｇｃａｇｇｔａｃｔａｇｔａｇｔｔａｃａｇｔｃｃｔｃａ－３
’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８
繊毛虫の砂漠草ｃＤＮＡをテンプレートとし、第２ＰＣＲ増幅を行ってＰｖＡＣＲ３遺
伝子を得るステップと、
前記第２プライマー対の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
１０に示され、
５’－ｇａｇａａｃａｃｇｇｇｇｇａｃｔｃｔａｇａａｔｇｇａｇａａｃｔｃａａｇ
ｃｇｃｇｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９
５’－ｇｇｇａａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｃｔａａａｃａｇａａｇｇｃｃ
ｃｃｔｔｃｃｔｃ－３’,ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０
前記ｐＬｓｉ１プロモーターを二重酵素消化により前記植物発現ベクターに挿入し、ｐ
Ｌｓｉ１プロモーターを含有する形質転換ベクターを得るステップと、
前記ＰｖＡＣＲ３遺伝子を相同組換え方法により前記形質転換ベクター中のｐＬｓｉ１
プロモーター下流に挿入して、前記組換えベクターを得るステップと、含む、
ことを特徴とするヒ素蓄積性工学イネを作成するための組換えベクター。 - 請求項１に記載の組換えベクターとトランスジェニックレシピエントイネを含む、ことを
特徴とするヒ素蓄積性工学イネ。 - 前記トランスジェニックレシピエントイネの品種はＺｈｏｎｇｈｕａ１１を含む、ことを
特徴とする請求項２に記載のヒ素蓄積性工学イネ。 - 請求項２に記載のヒ素蓄積性工学イネに基づくヒ素汚染水域および／または土壌の浄化方
法であって、
前記ヒ素蓄積性工学イネを浄化すべき水域および／または土壌に植え、籾摺期前にイネの
地上部植物を収穫するステップを含む、ことを特徴とする浄化方法。
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| CHAUDHARY Bhawna，Brassinosteroid Mediated Modulation in the Gene Expression Analysis of Genes Associated with Arsenic Uptake and Transport in Rice (Oryza sativa L.) for Effective Mitigation of Arsenic，Journal of Plant Growth Regulation，2023年07月26日，vol. 43，pp. 3159-3170 |
| CHEN Yanshan et al.，Engineering Arsenic Tolerance and Hyperaccumulation in Plants for Phytoremediation by a PvACR3 Transgenic Approach，Environ. Sci. Technol.，2013年，vol. 47，pp. 9355-9362 |
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