JP7842011B2

JP7842011B2 - ヘテロ二量体タンパク質

Info

Publication number: JP7842011B2
Application number: JP2022519303A
Authority: JP
Inventors: ダン・シッダールタ・チャンド; ザーラ・ジャワド; ヴァロニカ・フランシスカ・イルコウ
Original assignee: アジェナスインコーポレイテッド
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2026-04-07
Anticipated expiration: 2040-09-28
Also published as: WO2021062382A1; CA3151574A1; JP2022549351A; US20240360249A1; MX2022003149A; AU2020355253A1; EP4034570A4; CN114787186B; CN114787186A; KR20220069935A; EP4034570A1; US20210130495A1; IL291618A; BR112022004789A2

Description

関連出願
本出願は、２０１９年９月２７日に出願された米国仮出願第６２／９０６，９１８号の利益を主張するものであり、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

１．技術分野
本開示は、ヘテロ二量体タンパク質（例えば、多特異性抗体）およびそれを作製する方法に関する。

２．背景技術
２つ以上の結合特異性を含む多重特異性結合分子（例えば、多重特異性抗体）は、インビボで複数の標的の活性を調節するこれらの分子の能力を理由に、治療薬として大きな可能性を秘めている。多重特異性抗体を産生するための１つの一般的な方法は、２つの異なる抗体の重鎖をヘテロ二量体化することである。このヘテロ二量体化を促進するために、２つの抗体のＣＨ３ドメインを操作して、ホモ二量体化よりも重鎖ヘテロ二量体化に対して選好を生じさせる相補的な変異セットを含ませる（例えば、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＲｉｄｇｗａｙＪ．Ｂ．ｅｔａｌ．，１９９６，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．，９：６１７－６２１、および米国特許第９，４０９，９８９号を参照されたい）。

ある特定の例では、ヒトＦｃガンマ受容体ＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）に対する多重特異性抗体のＦｃ領域の結合を、対応する天然由来の抗体のＦｃ領域の結合と比べて強化することが望ましい。この強化されたＦｃγＲＩＩＩＡ結合を達成する１つの方法は、多重特異性抗体のＦｃ領域を操作して、ＥＵインデックスに従うＦｃ領域のアミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、特異的アミノ酸変異を含めることである（例えば、Ｌａｚａｒ，Ｇ．Ａ．ｅｔａｌ．，２００６，ＰＮＡＳ，１０３（１１）：４００５－４０１０を参照されたい）。しかしながら、出願人は、これらのＦｃ変異を、ＥＵインデックスに従うアミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位でヘテロ二量体化を強化するＦｃ変異と組み合わせることにより、これらの変異を含む多重特異性抗体の製造可能性に悪影響が生じ得ることを発見した。

したがって、ＦｃγＲＩＩＩＡへの強化された結合を呈すると同時に、良好な製造可能性を保持する、改善された多重特異性抗体が当該技術分野で必要とされている。

３．発明の概要
本開示は、天然由来の抗体と比べて、ＦｃγＲＩＩＩＡへの強化された結合を呈し、良好な製造可能性を呈するヘテロ二量体タンパク質（例えば、多重特異性抗体）を提供する。ヘテロ二量体タンパク質は、概して、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３３２位、および３６６位に含む、第１のＦｃポリペプチドと、アスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に含むが、グルタミン酸をアミノ酸３３２位に含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含み、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、およびトリプトファンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、および３６６位に含む、第１のＦｃポリペプチドと、アスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に含むが、ロイシンおよびグルタミン酸を、それぞれ、アミノ酸３３０位および３３２位に含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含み、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。かかるヘテロ二量体タンパク質は、多重特異性結合タンパク質（例えば、多重特異性抗体）として特に有用である。また、これらのヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物、これらのヘテロ二量体タンパク質をコードする核酸、ならびにこれらのヘテロ二量体タンパク質を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。理論に拘束されることを意図するものではないが、出願人は、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチドは、ＥＵインデックスに従って番号付けされたアミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に変異を含む対応するＦｃポリペプチドと比べて、熱安定性が改善されたと考える。

したがって、一態様では、本開示はヘテロ二量体タンパク質を提供する。

ある特定の実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含み、第１のＦｃポリペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３３２位、および３６６位に含み、第２のＦｃポリペプチドは、アスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に含むが、グルタミン酸をアミノ酸３３２位に含まず、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３０位にロイシンをさらに含み、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。ある特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３０位にロイシンを含まず、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、第１の抗原結合部分を含み、かつ／または第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗原結合部分を含む。ある特定の実施形態では、第１および／または第２の抗原結合部分は、抗体可変ドメイン、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、可溶性Ｔ細胞受容体（例えば、内在性膜貫通領域および細胞質領域を欠くＴ細胞受容体）、またはリガンドを含む。ある特定の実施形態では、第１および／または第２の抗原結合部分は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ＶＨ／ＶＬ対、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、および／またはＦａｂを含む。ある特定の実施形態では、細胞表面受容体は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体、血管内皮成長因子受容体、または形質転換成長因子受容体である。ある特定の実施形態では、可溶性Ｔ細胞受容体は、１つ以上の操作されたジスルフィド結合によって安定化されたＴ細胞受容体の細胞外抗原結合部分を含む。ある特定の実施形態では、可溶性Ｔ細胞受容体は、可撓性リンカー（例えば、ペプチドリンカー）によって一緒に連結されたＴ細胞受容体の可変領域を含む一本鎖Ｔ細胞受容体を含む。ある特定の実施形態では、リガンドはホルモンまたは成長因子である。ある特定の実施形態では、第１および第２の抗原結合部分は、同じまたは異なる標的分子に特異的に結合する。

ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２のＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインを含む。ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｃポリペプチドは抗体重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域の一部を欠く。ある特定の実施形態では、抗体重鎖は完全長抗体重鎖である。ある特定の実施形態では、抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２重鎖である。

ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｃポリペプチドは、抗体軽鎖をさらに含む。ある特定の実施形態では、抗体軽鎖は、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖である。

ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含み、かつ／または第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む。ある特定の実施形態では、第１および第２の半抗体は、異なる標的分子、または同じ標的分子の異なる領域に結合する。

ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１～３、６～７、１０～１１、２４～２７、４８～５１、および６２～６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一（任意選択で、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含み、かつ／または第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１～３、５、１２～１３、３６～３７、６０～６１、および６６～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一（任意選択で、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１～３、６～７、１０～１１、２４～２７、４８～５１、および６２～６５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一（任意選択で、少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１～３、５、６～７、１２～１３、３６～３７、６０～６１、および６６～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一（任意選択で、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号１～３、６～７、１０～１１、２４～２７、４８～５１、および６２～６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号１～３、５、１２～１３、３６～３７、６０～６１、および６６～６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、配列番号２４および３６、２４および３７、２５および３６、２５および３７、２６および３６、２６および３７、２７および３６、２７および３７、４８および６０、４８および６１、４９および６０、４９および６１、５０および６０、５０および６１、５１および６０、５１および６１、６２および６６、６２および６７、６３および６６、６３および６７、６４および６６、６４および６７、６５および６６、または６５および６７のアミノ酸配列と、少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、配列番号２４および３６、２４および３７、２５および３６、２５および３７、２６および３６、２６および３７、２７および３６、２７および３７、４８および６０、４８および６１、４９および６０、４９および６１、５０および６０、５０および６１、５１および６０、５１および６１、６２および６６、６２および６７、６３および６６、６３および６７、６４および６６、６４および６７、６５および６６、または６５および６７のアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５１に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号４９に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号４９に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６１に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６５に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６７に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６５に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６７に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６７に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６３に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６７に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む。

別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本医薬組成物は、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。

別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＦｃポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、およびＦｃポリペプチドを含む組換え宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１および第２のＦｃポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１および第２のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

ある特定の実施形態では、本組換え宿主細胞は、
ａ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１および第２のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｂ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１および第２のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、
ｃ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、
ｄ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクター、
ｅ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドの第１の抗体重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド、および本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチドの第２の抗体重鎖をコードする第２のポリヌクレオチド、および任意選択で、第１のＦｃポリペプチドの第１の抗体軽鎖をコードする第３のポリヌクレオチド、および／または第２のＦｃポリペプチドの第２の抗体軽鎖をコードする第４のポリヌクレオチド
（第１のＦｃポリペプチドは、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む）、あるいは
ｆ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドの第１の抗体重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチドの第２の抗体重鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクター、および任意選択で、第１のＦｃポリペプチドの第１の抗体軽鎖をコードする第３のポリヌクレオチドを含む第３のベクター、および／または第２のＦｃポリペプチドの第２の抗体軽鎖をコードする第４のポリヌクレオチドを含む第４のベクター
（第１のＦｃポリペプチドは、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む）、を含む。

別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を産生するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本方法は、細胞内で、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを、ヘテロ二量体タンパク質が産生される条件下で発現させることを含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、細胞内で、
ａ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドの第１の抗体重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチドの第２の抗体重鎖をコードする第２のポリヌクレオチドと、
ｃ）第１のＦｃポリペプチドの第１の抗体軽鎖をコードする第３のポリヌクレオチドと、
ｄ）第２のＦｃポリペプチドの第２の抗体軽鎖をコードする第４のポリヌクレオチドとを、
ヘテロ二量体タンパク質が産生される条件下で発現させることを含み、
第１のＦｃポリペプチドは、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、
ａ）第１の細胞内で、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを、第１のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｂ）第２の細胞内で、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質のうちのいずれかの第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを、第２のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）で産生された第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドがヘテロ二量体化してヘテロ二量体タンパク質を産生する条件下で接触させることと、を含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、
ａ）第１の細胞内で、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドの、第１の抗体重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび第１の抗体軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを、第１のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｂ）第２の細胞内で、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチドの、第２の抗体重鎖をコードする第３のポリヌクレオチドおよび第２の抗体軽鎖をコードする第４のポリヌクレオチドを、第２のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）で産生された第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドがヘテロ二量体化してヘテロ二量体タンパク質を産生する条件下で接触させることと、を含み、
第１のＦｃポリペプチドは、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む。

ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドがヘテロ二量体化してヘテロ二量体タンパク質を産生する条件下で接触させることを含む。

４．図面の簡単な説明
表３に記載されるＦｃポリペプチドのサブセットの発現レベルを示すグラフである。熱変性遷移を測定することにより決定した、ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、およびＢＡ１１４（図２Ａ、「抗標的１抗体」）、ならびにＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８（図２Ｂ、「抗標的２抗体」）の熱安定性を示すグラフである。高レベルの細胞表面標的１を発現するように操作したＪｕｒｋａｔ細胞へのヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ＢＡ１１９、およびＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体の結合を示すグラフである。各事例において、蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値によって評価したＪｕｒｋａｔ細胞への結合の程度を、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質（「抗体」）の濃度に対してプロットする。高レベルの細胞表面標的２を発現するように操作したＣＨＯ細胞へのヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、ＢＡ１２０、およびＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体の結合を示すグラフである。各事例において、蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値によって評価したＣＨＯ細胞への結合の程度を、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質（「抗体」）の濃度に対してプロットする。ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ＢＡ１１９、またはＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体を使用した、標的１遮断から生じるＴ細胞活性化の相対量を測定するＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示すグラフである。ＩＬ－２遺伝子活性化のためのサロゲートマーカーであるルシフェラーゼ発現（平均ＲＬＵで測定）を、ヘテロ二量体タンパク質（「抗体」）濃度に対してプロットする。ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、ＢＡ１２０、またはＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体を使用した、標的２遮断から生じるＴ細胞活性化の相対量を測定するＩＬ－２ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示すグラフである。ＩＬ－２遺伝子活性化のためのサロゲートマーカーであるルシフェラーゼ発現（平均ＲＬＵで測定）を、ヘテロ二量体タンパク質（「抗体」）濃度に対してプロットする。３つの異なるドナーである、ドナー１（図７Ａ～７Ｄおよび図７Ｉ～７Ｌ）、ドナー２（図７Ｅ～７Ｈ）、およびドナー３（図７Ｍ～７Ｐ）において、ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ＢＡ１１９、および参照ホモ二量体タンパク質２が、ＳＥＡで刺激したＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を誘導する能力を示すグラフである。Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異（「Ｆｃ強化」）を含むホモ二量体アイソタイプタンパク質を、アイソタイプ対照として使用した。ＩＬ－２濃度は、ヘテロ二量体タンパク質（「抗体」）濃度に対してプロットする。３つの異なるドナーである、ドナー１（図８Ａ～８Ｄおよび８Ｍ～８Ｐ）、ドナー２（図８Ｉ～８Ｌおよび８Ｕ～８Ｘ）、およびドナー３（図８Ｅ～８Ｈおよび８Ｑ～８Ｔ）において、ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、および参照ホモ二量体タンパク質１が、ＳＥＡで刺激したＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を誘導する能力を示すグラフである。Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異（「Ｆｃ強化」）を含むホモ二量体アイソタイプタンパク質を、アイソタイプ対照として使用した。ＩＬ－２濃度は、ヘテロ二量体タンパク質（「抗体」）濃度に対してプロットする。細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＶ／Ｖを発現するＣＨＯ細胞（図９Ａ）または細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＦ／Ｆを発現するＣＨＯ細胞（図９Ｂ）へのヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、およびＢＡ１１４の結合を示す一式のグラフである。蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均によって評価した細胞へのヘテロ二量体タンパク質結合のレベルを、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質（「Ａｂ」）の濃度に対してプロットした。細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＶ／Ｖを発現するＣＨＯ細胞（図１０Ａ）または細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＦ／Ｆを発現するＣＨＯ細胞（図１０Ｂ）へのヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８の結合を示す一式のグラフである。蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均によって評価した細胞へのヘテロ二量体タンパク質結合のレベルを、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質（「Ａｂ」）の濃度に対してプロットした。細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＦ／Ｆを発現するＣＨＯ細胞への抗標的１ヘテロ二量体タンパク質の結合を示す一式のグラフである。蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均によって評価した細胞へのヘテロ二量体タンパク質結合のレベルを、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質の濃度に対してプロットした。細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＦ／Ｆを発現するＣＨＯ細胞への抗標的２ヘテロ二量体タンパク質の結合を示す一式のグラフである。蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均によって評価した細胞へのヘテロ二量体タンパク質結合のレベルを、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質の濃度に対してプロットした。

５．発明を実施するための形態
天然由来の抗体と比べて、ＦｃγＲＩＩＩＡへの強化された結合を呈し、良好な製造可能性を呈するヘテロ二量体タンパク質（例えば、多重特異性抗体）が本明細書に提供される。ヘテロ二量体タンパク質は、概して、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３３２位、および３６６位に含む、第１のＦｃポリペプチドと、アスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に含むが、グルタミン酸をアミノ酸３３２位に含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含み、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、およびトリプトファンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、および３６６位に含む、第１のＦｃポリペプチドと、アスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に含むが、ロイシンおよびグルタミン酸を、それぞれ、アミノ酸３３０位および３３２位に含まない、第２のＦｃポリペプチドと、を含み、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。かかるヘテロ二量体タンパク質は、多重特異性結合タンパク質（例えば、多重特異性抗体）として特に有用である。また、これらのヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物、これらのヘテロ二量体タンパク質をコードする核酸、ならびにこれらのヘテロ二量体タンパク質を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。

５．１定義
本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体タンパク質」という用語は、２つの非同一Ｆｃポリペプチドの共有結合二量体または非共有結合二量体を含むタンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃポリペプチド」という用語は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを指し、ＣＨ２ドメインのＣ末端は、ＣＨ３ドメインのＮ末端に（直接的にまたは間接的に）連結する。「Ｆｃポリペプチド」という用語には、ジスルフィド結合によって（例えば、半抗体を形成するために）抗体軽鎖に連結した抗体重鎖が含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、抗体重鎖の第１の定常ドメイン（例えば、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ_１のアミノ酸１１８～２１５位）を指す。本用語には、天然由来のＣＨ１ドメイン、および天然由来のＣＨ１ドメインの操作されたバリアント（例えば、天然由来のＣＨ１ドメインと比べて１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含むＣＨ１ドメイン）が含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、抗体重鎖の第２の定常ドメイン（例えば、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ_１のアミノ酸２３１～３４０位）を指す。本用語には、天然由来のＣＨ２ドメイン、および天然由来のＣＨ２ドメインの操作されたバリアント（例えば、天然由来のＣＨ２ドメインと比べて１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含むＣＨ２ドメイン）が含まれる。

本明細書で使用される場合、「ＣＨ３ドメイン」という用語は、抗体重鎖の第３の定常ドメイン（例えば、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ_１のアミノ酸３４１～４４７位）を指す。本用語には、天然由来のＣＨ３ドメイン、および天然由来のＣＨ２ドメインの操作されたバリアント（例えば、天然由来のＣＨ３ドメインと比べて１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含むＣＨ３ドメイン）が含まれる。

本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」という用語は、インタクトな抗体中で２つの重鎖間のジスルフィド結合を媒介する、システイン残基（例えば、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ_１のアミノ酸２２６位および２２９位のシステイン残基）を含む抗体重鎖の部分を指す。本用語には、天然由来のヒンジ領域、および天然由来のヒンジ領域の操作されたバリアント（例えば、天然由来のヒンジ領域と比べて１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含むヒンジ領域）が含まれる。例示的な全長ＩｇＧ_１ヒンジ領域は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ_１のアミノ酸２１６～２３０位を含む。

本明細書で使用される場合、「ＥＵインデックス」という用語は、各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎ，ＧＭ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５（１９６９、およびＫａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，５ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１に記載されるように、抗体の定常領域のＥＵ番号付け慣例を指す。本明細書で使用されるＦｃポリペプチドまたはその断片のアミノ酸位置のすべての番号付けは、ＥＵインデックスに従う。

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する分子を指し、かかる結合は当業者によって理解されるとおりである。例えば、抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ３０００ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＳａｐｉｄｙｎｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）、または当該技術分野において既知の他のアッセイにより決定して、概してより低い親和性で他の分子に結合する。ある特定の実施形態では、抗原に特異的に結合する抗原結合部分は、分子が別の抗原に非特異的に結合するときのＫ_Ａより少なくとも２ｌｏｇ（例えば、１０倍）、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、またはそれ以上であるＫ_Ａで抗原に結合する。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、全長抗体、全長抗体の抗原結合断片、ならびに抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域、および／またはＶＬ領域を含む分子を含む。抗体の例には、モノクローナル抗体、組換えで産生された抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖および２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖対、細胞内抗体、ヘテロ複合体抗体、抗体－薬物コンジュゲート、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のうちのいずれかの抗原結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａまたはＩｇＧ_２ｂ）のものであり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ抗体、あるいはそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ_１もしくはＩｇＧ_４）またはサブクラスである。

本明細書で使用される場合、「ＶＨ」および「ＶＬ」という用語は、それぞれ、全体が参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔｅｔａｌ．，（１９９１）ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に記載されるように、抗体重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを指す。

本明細書で使用される場合、「ＶＨＨ」という用語は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＨａｍｅｒｓ－ＣａｓｔｅｒｍａｎＣ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３：４４６－８．１０．１０３８／３６３４４６ａ０に記載されるように、ラクダの重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）およびそのヒト化バリアントの重鎖可変ドメインを指す。

本明細書で使用される場合、「ＶＨ／ＶＬ対」という用語は、抗原の結合部位を一緒に形成するＶＨとＶＬとの組合せを指す。

本明細書で使用される場合、「重鎖」という用語は、抗体に関して使用されるとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）を指してもよく、これは、それぞれ、ＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、およびＩｇＧ_４を含む、抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭクラスを生じる。

本明細書で使用される場合、「全長抗体重鎖」という用語は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨ、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む抗体重鎖を指す。

本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、抗体に関して使用されるとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）を指し得る。軽鎖アミノ酸配列は、当該技術分野において周知である。具体的な実施形態では、軽鎖はヒト軽鎖である。

本明細書で使用される場合、「半抗体」という用語は、インタクトな野生型免疫グロブリンの重鎖および軽鎖と同じ様式で互いに連結した抗体重鎖および抗体軽鎖を指す。ある特定の実施形態では、半抗体は、全長抗体のヒンジ領域の重鎖間ジスルフィド結合の減少によって産生される。ある特定の実施形態では、半抗体は、細胞内での本明細書に開示されるＦｃポリペプチドの発現によって産生される。

５．２ヘテロ二量体タンパク質
一態様では、本開示は、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３３２位、および３６６位に含み、第２のＦｃポリペプチドは、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを、それぞれ、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に含むが、アミノ酸であるグルタミン酸をアミノ酸３３２位に含まず、アミノ酸位置は、その都度、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンをさらに含み、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンをさらに含み、第２のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３６６位にアミノ酸であるトリプトファンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、および３６６位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、およびトリプトファンを含み、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸２３９位、３３０位、および３６６位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびトリプトファンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３０位、３３２位、および３６６位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、およびトリプトファンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸２３９位、３３２位、および３６６位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、およびトリプトファンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸２３９位および３６６位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびトリプトファンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３０位および３６６位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびトリプトファンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

別の態様では、本開示は、第１および第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質を提供し、第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸３３２位および３６６位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸およびトリプトファンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、第２のＦｃポリペプチドは、
（ａ）アミノ酸３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるセリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位、３３０位、および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、およびグルタミン酸を含まず、
（ｂ）アミノ酸２３９位、３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、ロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３２位にアミノ酸であるグルタミン酸を含まず、
（ｃ）アミノ酸３３０位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位にアミノ酸であるアスパラギン酸を含まず、
（ｄ）アミノ酸２３９位、３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にアミノ酸であるロイシンを含まず、
（ｅ）アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシンおよびグルタミン酸を含まず、
（ｆ）アミノ酸３３０位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるロイシン、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３２位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸を含まず、
（ｇ）アミノ酸３３２位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれ、アミノ酸であるグルタミン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸２３９位および３３０位に、それぞれ、アミノ酸であるアスパラギン酸およびロイシンを含まず、
アミノ酸位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

本明細書に記載されるＦｃポリペプチドは、概して、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインのＣ末端は、ＣＨ３ドメインのＮ末端に（直接的にまたは間接的に）連結する。任意の天然由来またはバリアント型のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドで使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体重鎖、例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体重鎖からの天然由来のＣＨ２またはＣＨ３ドメインである。ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、同じ抗体重鎖に由来しても、異なる抗体重鎖に由来してもよい。ある特定の実施形態では、本Ｆｃポリペプチドは、単一抗体重鎖由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン含有部分を含む。ある特定の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、それぞれ、天然由来のＣＨ２またはＣＨ３ドメインのバリアントである。ある特定の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、それぞれ、天然由来のＣＨ２またはＣＨ３ドメインと比べて、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含むバリアントである。ある特定の実施形態では、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、それぞれ、１つ以上のＣＨ２またはＣＨ３ドメインのキメラである。ある特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＥＵインデックスに従って、天然由来のヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ_１）のアミノ酸２３１～３４０位を含む。ある特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、天然由来のヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ_１）のアミノ酸３４１～４４７位を含む。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドは、ヒンジ領域をさらに含み、ヒンジ領域のＣ末端は、（直接的にまたは間接的に）ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結する。例えば、ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体重鎖、例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体重鎖からの天然由来のヒンジ領域である。ヒンジ領域は、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインと同じ抗体重鎖に由来しても、異なる抗体重鎖に由来してもよい。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、それぞれ、天然由来のヒンジ領域と比べて、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含むバリアントである。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、１つ以上のヒンジ領域のキメラである。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＥＵインデックスに従って、天然由来のヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ_１）のアミノ酸２２６～２２９位を含む。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＥＵインデックスに従って、天然由来のヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ_１）のアミノ酸２１６～２３０位を含む。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＥＵインデックスに従って、天然由来のヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ_１）のアミノ酸２１６～２３０位を含む。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ＥＵインデックスに従って、アミノ酸２２８位にセリン（Ｓ）を含む、バリアント型ＩｇＧ_４ヒンジ領域である。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドは、ＣＨ１ドメインをさらに含み、ＣＨ１ドメインのＣ末端は、（直接的にまたは間接的に）ヒンジ領域のＮ末端に連結する。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体重鎖、例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体重鎖からの天然由来のＣＨ１ドメインである。ＣＨ１ドメインは、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインと同じ抗体重鎖に由来しても、異なる抗体重鎖に由来してもよい。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、天然由来のＣＨ１ドメインと比べて、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含むバリアントである。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、１つ以上のＣＨ１ドメインのキメラである。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、ＥＵインデックスに従って、天然由来のヒンジ領域（例えば、ヒトＩｇＧ_１）のアミノ酸１１８～２１５位を含む。

例示的なＦｃポリペプチドまたはその部分のアミノ酸配列を、本明細書の表１に示す。

ある特定の実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、配列番号２４、２５、２６、２７、４８、４９、５０、５１、６２、６３、６４、または６５のアミノ酸配列と、少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む第１のＦｃポリペプチド、および／あるいは配列番号３６、３７、６０、６１、６６、または６７のアミノ酸配列と、少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一）であるアミノ酸配列を含む第２のＦｃポリペプチド、を含む。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリヌクレオチドは、配列番号２４、２５、２６、２７、４８、４９、５０、５１、６２、６３、６４、または６５のアミノ酸配列を含み、かつ／あるいは第２のＦｃポリヌクレオチドは、３６、３７、６０、６１、６６、または６７のアミノ酸配列を含む。ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のＦｃポリペプチドに組み込むことができるアミノ酸配列の例示的な対を、本明細書の表２に示す。ある特定の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、表２のいずれかの行の第１および第２の列に示すアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号７５のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番２８のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番６９のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番７０のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号３０、３４、３６、７１、７２、７３、または７４のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号８４のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号８３のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号８５のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号６６、７９、８０、８１、８２、８６、または８７のアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｃポリペプチドは、１つ以上の抗原結合部分をさらに含む。抗原結合部分は、Ｆｃポリペプチドの任意の部分に（直接的または間接的に）連結し得る。例えば、抗原結合部分は、ＦｃポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に（直接的にまたは間接的に）連結し得る。加えてまたはあるいは、抗原結合部分は、Ｆｃポリペプチド中で直列に一緒に連結し得る。

ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質中の第１および第２のＦｃポリペプチドは、各々、１つ以上の抗原結合部分を含む。かかる実施形態では、抗原結合部分の各々は、同じ抗原に結合することも、異なる抗原に結合することもできる。ある特定の実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含む第２のＦｃポリペプチドとを含み、第１の抗原と第２の抗原とは異なっている（例えば、異なる分子または同じ分子の異なる領域である）。

Ｆｃポリペプチドに連結し得るいずれの種類の結合部分も、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質における使用に好適である。ある特定の実施形態では、結合部分は、抗体可変ドメインを含む。抗体可変ドメインを含む例示的な結合部分は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ＶＨ／ＶＬ対、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦａｂを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、結合部分は、リガンドを含む。例示的なリガンドには、ホルモンおよび成長因子、ならびにその類似体および模倣体が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、結合部分は、細胞表面受容体の細胞外ドメインを含む。例示的な細胞表面受容体には、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体、血管内皮成長因子受容体、または形質転換成長因子受容体が含まれるが、これらに限定されない。細胞表面受容体のかかる細胞外ドメインは、受容体の天然リガンドを隔離するのに有用であることが当該技術分野で周知である。本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質における使用に好適な他の結合部分には、リポカリン（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｅｂａｕｅｒＭ．ｅｔａｌ．，２０１２，ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙｍｏｌ５０３：１５７－１８８を参照されたい）、アドネクチン（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＬｉｐｏｖｓｅｋＤ．，２０１１，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ２４：３－９）、アビマー（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｉｌｖｅｒｍａｎＪ，ｅｔａｌ．，２００５，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２３：１５５６－１５６１を参照されたい）、フィノマー（例えば、ＳｃｈｌａｔｔｅｒＤ，ｅｔａｌ．，２０１２，ｍＡｂｓ４：４９７－５０８を参照されたい）、クニッツドメイン（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＨｏｓｓｅＲ．Ｊ．ｅｔａｌ．，２００６，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ１５：１４－２７を参照されたい）、ノッチン（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｉｎｔｚｉｎｇＪ．Ｒ．ｅｔａｌ．，２０１６，ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｈｅｍＢｉｏｌ３４：１４３－１５０を参照されたい）、アフィボディ（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｅｌｄｗｉｓｃｈＪ．ｅｔａｌ．，２０１０ＪＭｏｌＢｉｏｌ３９８：２３２－２４７を参照されたい）、およびＤＡＲＰｉｎ（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＰｌｕｃｋｔｈｕｎＡ．，２０１５，ＡｎｎｕＲｅｖＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ５５：４８９－５１１を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質中の第１および／または第２のＦｃポリペプチドは、各々、抗体重鎖を含む。抗体重鎖は、天然由来の全長抗体重鎖と比べて、１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、または修飾を含む、全長抗体重鎖またはバリアント型抗体重鎖であり得る。ある特定の実施形態では、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメインを欠くか、または抗体軽鎖との重鎖の会合を防止するＣＨ１ドメインもしくは重鎖可変ドメイン中の変異を含む。ある特定の実施形態では、抗体重鎖は、ヒンジ領域の一部を欠く。

抗体重鎖のいずれの種およびアイソタイプも、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質に使用することができる。ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体の重鎖またはそのバリアントを含む。ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｃポリペプチドは、１つ以上のヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２抗体重鎖のキメラである抗体重鎖を含む。

ある特定の実施形態では、第１および／または第２のＦｃポリペプチドは、抗体重鎖および抗体軽鎖（例えば、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖）を含む。軽鎖は、抗体重鎖の任意の部分に（直接的または間接的に）連結し得る。ある特定の実施形態では、抗体重鎖および抗体軽鎖は、半抗体を形成するようにジスルフィド結合によって互いに連結する。

ある特定の実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、第１の半抗体を形成する第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１のＦｃポリペプチドと、第２の半抗体を形成する第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２のＦｃポリペプチドと、を含む。第１および第２の半抗体は、同じ抗原に結合することも、異なる抗原（例えば、異なる分子または同じ分子の異なる領域）に結合することもできる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示される第１および／または第２のＦｃポリペプチドのうちのいずれかのＣＨ３ドメインは、Ｃ末端リジンをさらに含む。例えば、ある特定の実施形態では、表１に開示されるＣＨ３ドメイン含有アミノ酸配列のうちのいずれか１つは、ＣＨ３ドメインのＣ末端にリジンをさらに含み得る。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質は、対応する先行技術のヘテロ二量体タンパク質（例えば、多重特異性抗体）と比べて、改善された生物物理特性（例えば、発現レベル、溶解性、熱安定性、製造可能性、および／または免疫原性）を呈する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質は、改善された熱安定性および製造可能性を呈する。

５．３医薬組成物
生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤中で所望の程度の純度を有するヘテロ二量体タンパク質を含む組成物が、本明細書で提供される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、リン酸などの緩衝剤、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

具体的な実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に、本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質、および任意選択で１つ以上の追加の予防薬または治療薬を含む。具体的な実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に、有効量の本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質、および任意選択で１つ以上の追加の予防薬または治療薬を含む。ある特定の実施形態では、本ヘテロ二量体タンパク質は、医薬組成物に含まれる唯一の活性成分である。本明細書に記載される医薬組成物は、がんまたは感染症などの状態を治療するのに有用であり得る。一実施形態では、本発明は、医薬品として使用するための本発明のヘテロ二量体タンパク質を含む本発明の医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、がんまたは感染症の治療のための方法における使用のための本発明の医薬組成物に関する。

非経口調製物に使用される薬学的に許容される担体には、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤、またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容される物質が含まれる。水性ビヒクルの例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロースおよび乳酸リンゲル注射液が挙げられる。非水性非経口ビヒクルには、植物起源の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、およびラッカセイ油が含まれる。静菌濃度または静真菌濃度の抗微生物剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムを含む複数回用量容器にパッケージングされた非経口調製物に添加され得る。等張剤には、塩化ナトリウムおよびデキストロースが含まれる。緩衝剤には、リン酸塩およびクエン酸塩が含まれる。抗酸化剤には、二硫酸ナトリウムが含まれる。局所麻酔剤には、プロカイン塩酸塩が含まれる。懸濁剤および分散剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤には、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が含まれる。金属イオン封鎖剤またはキレート剤には、ＥＤＴＡが含まれる。医薬担体にはまた、水混和性ビヒクル用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸が含まれる。

医薬組成物は、対象へのいずれの投与経路に対して製剤化されてもよい。投与経路の具体的な例には、鼻腔内、経口、肺、経皮、皮内、および非経口が挙げられる。皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射のいずれかを特徴とする非経口投与も本明細書で企図される。注射剤は、液体溶液または懸濁剤として、注射前の液体中の溶液または懸濁剤に好適な固体形態として、またはエマルションとしてのいずれかで、従来形態で調製され得る。注射剤、溶液、およびエマルションはまた、１つ以上の賦形剤を含む。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。さらに、所望される場合、投与される医薬組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解性エンハンサー、および例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、およびシクロデキストリンなどの他のかかる薬剤などの、少量の非毒性補助物質を含み得る。

ヘテロ二量体タンパク質の非経口投与のための調製物には、注射の準備ができている滅菌溶液、皮下注射用錠剤を含む、使用直前に溶媒と混合される準備ができている凍結乾燥粉末などの滅菌乾燥可溶性生成物、注射の準備ができている滅菌懸濁剤、使用直前にビヒクルと混合される準備ができている滅菌乾燥不溶性生成物、および滅菌エマルションが含まれる。溶液は、水性または非水性のいずれであってもよい。

静脈内投与される場合、好適な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、グルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールなどの増粘剤および可溶化剤、ならびにそれらの混合物を含む溶液とが含まれる。

ヘテロ二量体タンパク質を含む局所混合物は、局所および全身投与について記載されるように調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁剤、エマルションなどであってもよく、クリーム、ゲル、軟膏、エマルション、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、発泡体、エアロゾル、灌注剤、スプレー、坐剤、包帯、皮膚パッチ、または局所投与に好適な任意の他の製剤として製剤化され得る。

本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質は、吸入などによって、局所適用のためのエアロゾルとして製剤化され得る（例えば、炎症性疾患、特に喘息の治療に有用なステロイド送達のためのエアロゾルを記載し、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，０４４，１２６号、第４，４１４，２０９号、および第４，３６４，９２３号を参照されたい）。気道への投与のためのこれらの製剤は、ネブライザー用のエアロゾルもしくは溶液の形態で、または吹送用の微細粉末として、単独でまたはラクトースなどの不活性担体と組み合わせてもよい。このような場合、製剤の粒子は、一実施形態では、５０ミクロン未満、一実施形態では、１０ミクロン未満の直径を有する。

本明細書に開示されるヘテロ二量体タンパク質は、ゲル、クリーム、およびローションの形態で、皮膚および眼などの粘膜への局所適用、ならびに眼への適用、または嚢内もしくは脊髄内適用のためなど、部分的または局所的適用のために製剤化され得る。局所投与は、経皮送達、および眼もしくは粘膜への投与、または吸入療法も企図する。ヘテロ二量体タンパク質の鼻腔溶液を単独でまたは他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて投与することもできる。

イオン電気泳動および電気泳動装置を含む経皮パッチは、当業者に周知であり、ヘテロ二量体タンパク質を投与するために使用することができる。例えば、かかるパッチは、米国特許第６，２６７，９８３号、第６，２６１，５９５号、第６，２５６，５３３号、第６，１６７，３０１号、第６，０２４，９７５号、第６，０１０，７１５号、第５，９８５，３１７号、第５，９８３，１３４号、第５，９４８，４３３号、および第５，８６０，９５７号に開示されており、それらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物は、溶液、エマルション、および他の混合物としての投与のために再構成され得る凍結乾燥粉末である。また、これは固形分またはゲルとして再構成および製剤化されてもよい。凍結乾燥粉末は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質、またはその薬学的に許容される誘導体を好適な溶媒に溶解することによって調製される。ある特定の実施形態では、凍結乾燥粉末は、滅菌である。溶媒は、粉末または粉末から調製された再構成溶液の安定性または他の薬理学的成分を改善する賦形剤を含んでもよい。使用してもよい賦形剤には、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の好適な薬剤が含まれるが、これらに限定されない。溶媒はまた、一実施形態では、ほぼ中性ｐＨで、クエン酸塩、ナトリウム、もしくはリン酸カリウムなどの緩衝剤、または当業者に既知の他のかかる緩衝剤を含んでもよい。溶液のその後の滅菌濾過、それに続く当業者に既知の標準条件下での凍結乾燥により、所望の製剤が得られる。一実施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアルに分配される。各バイアルは、化合物の単回用量または複数回用量を含む。凍結乾燥粉末は、約４℃～室温などの適切な条件下で保存することができる。この凍結乾燥粉末を注射用水で再構成することにより、非経口投与に使用するための製剤が得られる。再構成のためには、凍結乾燥粉末を滅菌水または他の好適な担体に加える。正確な量は、選択される化合物により左右される。かかる量は、経験的に決定することができる。

本明細書に提供されるヘテロ二量体タンパク質および他の組成物は、治療される対象の身体の特定の組織、受容体、または他の領域を標的とするように製剤化することもできる。多くのかかる標的化方法は、当業者に周知である。すべてのかかる標的化方法が、本組成物における使用のために本明細書で企図される。標的化方法の非限定的な例については、例えば、すべて全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３１６，６５２号、第６，２７４，５５２号、第６，２７１，３５９号、第６，２５３，８７２号、第６，１３９，８６５号、第６，１３１，５７０号、第６，１２０，７５１号、第６，０７１，４９５号、第６，０６０，０８２号、第６，０４８，７３６号、第６，０３９，９７５号、第６，００４，５３４号、第５，９８５，３０７号、第５，９７２，３６６号、第５，９００，２５２号、第５，８４０，６７４号、第５，７５９，５４２号、および第５，７０９，８７４号を参照されたい。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質は、腫瘍を標的とする。

インビボ投与のため使用されるべき組成物は、滅菌であり得る。これは、例えば、無菌濾過膜を通した濾過により容易に成し遂げられる。

５．４ヘテロ二量体タンパク質を産生するポリヌクレオチド、ベクター、および方法
別の態様では、本明細書に記載のＦｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、およびベクター、例えば、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物細胞）における組換え発現のためのかかるポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書に提供される。本明細書に提供されるヘテロ二量体タンパク質の第１および／または第２のＦｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにかかるポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞におけるそれらの効率的発現のための発現ベクターが、本明細書に提供される。

本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然の供給源に（例えば、マウスまたはヒトに）存在する他の核酸分子から分離されるものである。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術により産生されるとき、他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まない可能性があるか、または化学的に合成されるとき、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。例えば、専門用語「実質的に含まない」は、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（特に、約１０％未満）の他の材料、例えば、細胞材料、培地、他の核酸分子、化学前駆体および／または他の化学物質を有する、ポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードする核酸分子（複数可）は、単離または精製される。

特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。ある特定の態様では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１および／または第２のＦｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。

また、例えば、コドン／ＲＮＡ最適化、異種性シグナル配列での代置、およびｍＲＮＡ不安定性エレメントの除去により最適化されるＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本明細書に提供される。ｍＲＮＡにおいてコドン変更を導入すること、および／もしくは阻害性領域を除外することによる、組換え発現のためのＦｃポリペプチドをコードする最適化された核酸を生成する方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号、第６，１７４，６６６号、第６，２９１，６６４号、第６，４１４，１３２号、および第６，７９４，４９８号（それらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される最適化方法を適切に適用することにより実施することができる。例えば、ＲＮＡ内の可能性のあるスプライス部位および不安定性エレメント（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕリッチエレメント）は、組換え発現のためＲＮＡの安定性を増大するために核酸配列によりコードされるアミノ酸を変更することなく、変異誘発され得る。変更は、例えば、同一のアミノ酸の代替コドンを使用する、遺伝子コードの縮重を利用する。ある特定の実施形態では、保存的変異、例えば、元々のアミノ酸と同様の化学構造ならびに特性および／または機能を有する同様のアミノ酸をコードするように、１つ以上のコドンを変更することが望ましい場合がある。かかる方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによりコードされるＦｃポリタンパク質の発現と比べて、Ｆｃポリタンパク質の発現を、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍以上増加させることができる。

ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドをコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば、相補的）ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードする最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードする最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードする最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドに、高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は説明されており、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００４８５４９（例えば、段落７２～７３）を参照されたい。

当該技術分野で既知の任意の方法により、ポリヌクレオチドを得ることができ、またポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本明細書に記載されるＦｃポリペプチドおよびこれらのＦｃポリペプチドの修飾バージョンをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で周知の方法を使用して決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンは、Ｆｃポリペプチドをコードする核酸を生成するようにアセンブリされる。Ｆｃポリペプチドをコードするかかるポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブリすることができ（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＫｕｔｍｅｉｅｒＧｅｔａｌ．，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２－６に記載されるとおり）、これは簡潔に言えば、Ｆｃポリペプチドをコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびにその後のＰＣＲによるライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅を伴う。

あるいは、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法（例えば、ＰＣＲおよび他の分子クローニング方法）を使用して、好適な供給源由来の核酸から生成することができる。ＰＣＲ増幅法を使用して、ヘテロ二量体タンパク質の第１および／または第２のＦｃポリペプチドをコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅された核酸は、宿主細胞における発現のため、およびさらなるクローニングのために、ベクターにクローニングすることができる。

特定のＦｃポリペプチドをコードする核酸を含むクローンが利用できないが、Ｆｃポリペプチド分子の配列は分かっている場合、Ｆｃポリペプチドをコードする核酸は、配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングし、例えば、ＦｃポリペプチドをコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを特定することによって、化学的に合成されるか、または好適な供給源（例えば、任意の組織、またはＦｃポリペプチドを発現する細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリー、またはそれらから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得ることができる。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸を、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来的な手順を使用して（例えば、ヘテロ二量体タンパク質をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に置き、次いでこれをＥ．ｃｏｌｉ細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯＧＳＳｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞）、または別様にはＦｃポリペプチドを産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中のＦｃポリペプチドの合成を得ることができる。

高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に提供されるヘテロ二量体タンパク質の第１および／または第２のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。

ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において説明されており、当業者には既知である。例えば、ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、フィルター結合したＤＮＡへの、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）における約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける約５０～６５℃での１回または複数回の洗浄を含んでもよく、高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、フィルター結合した核酸への、６×ＳＳＣにおける約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにおける約６８℃での１回または複数回の洗浄を含んでもよい。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者に既知であり、説明されている。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８９）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋの６．３．１～６．３．６および２．１０．３頁を参照されたい。

ある特定の態様では、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドを発現する（例えば、組換えで）細胞（例えば、宿主細胞）、および関連するポリヌクレオチド、および発現ベクターが提供される。宿主細胞における、好ましくは、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）における組換え発現のためのＦｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）が本明細書に提供される。また、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドを組換え発現させるためのかかるベクターを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の態様では、宿主細胞からかかるＦｃポリペプチドを発現させることを含む、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドを産生するための方法が本明細書に提供される。

本明細書に記載されるＦｃポリペプチドの組換え発現は、概して、Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を伴う。本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得たら、Ｆｃポリペプチド分子の製造のためのベクターを、当該技術分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ技術により製造することができる。よって、ヌクレオチド配列をコードするＦｃポリペプチドを含むポリヌクレオチドを発現させることにより、タンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載される。当業者に周知である方法を使用して、Ｆｃポリペプチドコード配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。また、プロモーターに動作可能に連結した本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターが提供される。

発現ベクターは、従来の技法により細胞（例えば、宿主細胞）に導入することができ、次に、得られた細胞を従来の技法により培養して、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドを産生することができる。よって、宿主細胞中のかかる配列の発現のためにプロモーターに動作可能に連結した本明細書に記載されるＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドの両方を個々にコードするベクターは、以下に詳述するように、ヘテロ二量体タンパク質全体の発現のために宿主細胞内で共発現され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドの両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、２つの異なるベクターを含み、第１のベクターは、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、ヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、以下の４つのベクター、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１の半抗体の第１の抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２の半抗体の第２の抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクター、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１の半抗体の第１の抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第３のベクター、および本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２の半抗体の第２の抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第４のベクター、を含む。ある特定の実施形態では、第１の半抗体の第１の抗体重鎖、第２の半抗体の第２の抗体重鎖、第１の半抗体の第１の抗体軽鎖、および第２の半抗体の第２の抗体軽鎖を個々にコードするベクターが宿主細胞内で共発現されて、ヘテロ二量体タンパク質を産生し得る。

他の実施形態では、第１の宿主細胞は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。具体的な実施形態では、第１の細胞によって発現される第１のＦｃポリペプチドは、第２の細胞の第２のＦｃポリペプチドと会合して、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を形成する。ある特定の実施形態では、第１の宿主細胞は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１の半抗体の第１の抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１の半抗体の第１の抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含み、第２の宿主細胞は、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２の半抗体の第２の抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第３のベクターと、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２の半抗体の第２の抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第４のベクターとを含む。ある特定の実施形態では、第１の細胞によって発現される第１の半抗体は、第２の細胞の第２の半抗体と会合して、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を形成する。ある特定の実施形態では、かかる第１の宿主細胞およびかかる第２の宿主細胞を含む宿主細胞の集団が、本明細書に提供される。

様々な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドを発現させることができる（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。かかる宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルを示すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換されるか、またはトランスフェクトされると、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質分子をインサイツで発現し得る細胞も示す。これらには、例えば、ヘテロ二量体タンパク質コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；例えば、ヘテロ二量体タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＰｉｃｈｉａ）；例えば、ヘテロ二量体タンパク質コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；例えば、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、もしくは例えば、ヘテロ二量体タンパク質コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの緑藻）；または例えば、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、およびＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、およびＢＭＴ１０細胞）が含まれるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を発現させるための細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＣＨＯＧＳＳｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）からのＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を発現させるための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉまたは真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）などの細菌細胞が、ヘテロ二量体タンパク質の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間早期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せた、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞は、抗体などのタンパク質のための有効な発現系である（各々全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＦｏｅｃｋｉｎｇＭＫ＆ＨｏｆｓｔｅｔｔｅｒＨ（１９８６）Ｇｅｎｅ４５：１０１－５、およびＣｏｃｋｅｔｔＭＩｅｔａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８（７）：６６２－７）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質は、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞により産生される。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって調節される。

細菌系では、発現されるヘテロ二量体タンパク質に意図される使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、ヘテロ二量体タンパク質の医薬組成物の生成のために、かかるタンパク質を大量に産生する場合、精製が容易な高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。かかるベクターには、これらに限定されないが、融合タンパク質が産生されるように、タンパク質コード配列が、ｌａｃＺコード領域を有するフレーム内のベクター内に個別にライゲーションされ得るＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（ＲｕｅｔｈｅｒＵ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ－ＨｉｌｌＢ（１９８３）ＥＭＢＯＪ２：１７９１－１７９４）、ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅＳ＆ＩｎｏｕｙｅＭ（１９８５）ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１３：３１０１－３１０９、ＶａｎＨｅｅｋｅＧ＆ＳｃｈｕｓｔｅｒＳＭ（１９８９）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２４５５０３－５５０９）などが含まれ、それらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。概して、かかる融合タンパク質は可溶性であり、吸着およびマトリックスグルタチオンアガロースビーズへの結合によって溶解細胞から容易に精製され、その後、遊離グルタチオンの存在下で溶出され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。

昆虫系では、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するベクターとして使用することができる。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ内で成長する。タンパク質コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれてもよい。

哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションし得る。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域ＥｌまたはＥ３）での挿入は、感染した宿主において生存可能かつヘテロ二量体タンパク質を発現することができる組換えウイルスをもたらす（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｇａｎ＆ＳｈｅｎｋＴ（１９８４）ＰＮＡＳ８１（１２）：３６５５－９を参照されたい）。挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調している必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって強化することができる（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｉｔｔｅｒＧｅｔａｌ．，（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４を参照されたい）。

加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後処理ならびに修飾の特徴的かつ特異的な機序を有する。適当な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的で、遺伝子産物の最初の転写、グリコシル化、およびリン酸化の適当なプロセシングのための細胞機構を保有する真核生物宿主細胞を使用することができる。かかる哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（任意の免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０、およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞内で産生される。

具体的な実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質は、フコース含量が低減しているか、またはフコースを含有しない。かかるタンパク質は、当業者に既知の技法を使用して製造することができる。例えば、本Ｆｃポリペプチドは、フコシル化する能力が不足または欠如している細胞中で発現され得る。具体的な例において、α１，６－フコシルトランスフェラーゼの両対立遺伝子のノックアウトを有する細胞株を使用して、フコース含量が低減したＦｃポリペプチドを製造することができる。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、フコース含量が低減したＦｃポリペプチドを産生するために使用することができる、かかるシステムの例である。

組換えタンパク質の長期間の高収率の産生のために、安定した発現細胞を生成し得る。例えば、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドを安定して発現する細胞株を操作することができる。具体的な実施形態では、本明細書に提供される細胞は、会合して本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を形成する第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを安定して発現する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される第１の細胞は、第１のＦｃポリペプチドを安定して発現し、本明細書に提供される第２の細胞は、第２のＦｃポリペプチドを安定して発現する。ある特定の実施形態では、第１の細胞によって発現される第１のＦｃポリペプチドは、第２の細胞の第２のＦｃポリペプチドと会合して、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質を形成する。

ある特定の態様では、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞を富化培地中で１～２日間増殖させた後、選択培地に切り換え得る。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、増殖して病巣を形成することを可能にし、それによりクローン化されて細胞株に拡大される。この方法を有利に利用して、本明細書に記載されるＦｃポリペプチドを発現する細胞株を操作することができる。かかる操作された細胞株は、Ｆｃポリペプチドと直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。

それぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔ、またはａｐｒｔ細胞中の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＷｉｇｌｅｒＭｅｔａｌ．，（１９７７）Ｃｅｌｌ１１（１）：２２３－３２）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａＥＨ＆ＳｚｙｂａｌｓｋｉＷ（１９６２）ＰＮＡＳ４８（１２）：２０２６－２０３４）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＬｏｗｙＩｅｔａｌ．，（１９８０）Ｃｅｌｌ２２（３）：８１７－２３）遺伝子を含むがこれらに限定、いくつかの選択系を使用することができ、それらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（ＷｉｎｇｌｅｒＭｅｔａｌ．，（１９８０）ＰＮＡＳ７７（６）：３５６７－７０、Ｏ’ＨａｒｅＫａｔａｌ．，（１９８１）ＰＮＡＳ７８：１５２７－３１）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（ＭｕｌｌｉｇａｎＲＣ＆ＢｅｒｇＰ（１９８１）ＰＮＡＳ７８（４）：２０７２－６）、アミノグリコシドＧ－４１８（ＷｕＧＹ＆ＷｕＣＨ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７－９５、ＴｏｌｓｔｏｓｈｅｖＰ（１９９３）ＡｎｎＲｅｖＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ３２：５７３－５９６、ＭｕｌｌｉｇａｎＲＣ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６－９３２、およびＭｏｒｇａｎＲＡ＆ＡｎｄｅｒｓｏｎＷＦ（１９９３）ＡｎｎＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ６２：１９１－２１７、ＮａｂｅｌＧＪ＆ＦｅｌｇｎｅｒＰＬ（１９９３）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１１（５）：２１１－５）に対する耐性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（ＳａｎｔｅｒｒｅＲＦｅｔａｌ．，（１９８４）Ｇｅｎｅ３０（１－３）：１４７－５６）に対する選択の基準として使用することができる。組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般的に既知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、かかる方法は、例えば、ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、ＫｒｉｅｇｌｅｒＭ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉＮＣｅｔａｌ．，（ｅｄｓ），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）の第１２章および第１３章、Ｃｏｌｂｅｒｅ－ＧａｒａｐｉｎＦｅｔａｌ．，（１９８１）ＪＭｏｌＢｉｏｌ１５０：１－１４に記載されており、それらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

タンパク質の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概説については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎＣＲ＆ＨｅｎｔｓｃｈｅｌＣＣＧ，ＴｈｅｕｓｅｏｆｖｅｃｔｏｒｓｂａｓｅｄｏｎｇｅｎｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｉｎＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。Ｆｃポリペプチドを発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルの増加により、マーカー遺伝子のコピー数が増加することになる。増幅領域はＦｃポリペプチド遺伝子と関連しているため、Ｆｃポリペプチドの産生も増加することになる（全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＣｒｏｕｓｅＧＦｅｔａｌ．，（１９８３）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ３：２５７－６６）。

宿主細胞は、本明細書に記載される２つ以上の発現ベクター、第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のベクター、および第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のベクターで共トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、第１および第２のＦｃポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含み得る。宿主細胞は、異なる量の２つ以上の発現ベクターで共トランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞は、第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターの以下の比：約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、または１：５０のうちのいずれか１つでトランスフェクトすることができる。

あるいは、ヘテロ二量体タンパク質の第１および第２のＦｃポリペプチドの両方をコードし、それらを発現することができる単一ベクターを使用することができる。第１および第２のＦｃポリペプチドのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。発現ベクターは、モノシストロニックであることもマルチシストロニックであることもできる。マルチシストロニック核酸構築物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、もしくはそれ以上の遺伝子／ヌクレオチド配列、または２～５個、５～１０個、もしくは１０～２０個の範囲の遺伝子／ヌクレオチド配列をコードし得る。例えば、二相性核酸構築物は、以下の順序で、プロモーター、第１の遺伝子（例えば、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第１のＦｃポリペプチド）、および第２の遺伝子（例えば、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質の第２のＦｃポリペプチド）を含み得る。かかる発現ベクターでは、両方の遺伝子の転写はプロモーターによって駆動され得るが、第１の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性の走査機構によって行われ得、第２の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、例えば、ＩＲＥＳによるキャップ非依存性の機構によって行われ得る。

本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質またはＦｃポリペプチドが組換え発現により産生されたら、これを、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイズ分類カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法により精製し得る。さらに、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質およびＦｃポリペプチドを、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野で既知の異種ポリペプチド配列に融合させて、精製が促進してもよい。

具体的な実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質またはＦｃポリペプチドは、単離または精製される。概して、単離されたタンパク質は、他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質である。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質またはＦｃポリペプチドの調製物は、細胞材料および／または化学前駆体を実質的に含まない。専門用語「細胞材料を実質的に含まない」は、タンパク質が、それが単離されるか、または組換え産生される元となる細胞の細胞成分から分離している、タンパク質の調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％（乾燥重量による）未満の、異種タンパク質（本明細書では「混在タンパク質」とも称される）を有するタンパク質、および／またはタンパク質のバリアント、例えば、タンパク質の異なる翻訳後修飾形態もしくはタンパク質の他の異なるバージョン（例えば、タンパク質断片）の調製物を含む。タンパク質が組換え産生されるとき、これはまた、概して、培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満を表す。タンパク質が化学合成により産生されるとき、これは、概して、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、これは、タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離している。したがって、タンパク質のかかる調製物は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満の、目的のタンパク質以外の化学前駆体または化合物を有する。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質およびＦｃポリペプチドは、単離または精製される。

本明細書に記載されるヘテロ二量体タンパク質およびＦｃポリペプチドは、例えば、化学合成または組換え発現技法によって、タンパク質を合成するための当該技術分野で既知の任意の方法によって産生され得る。本明細書に記載される方法は、別段に示されない限り、分子生物学、マイクロ生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当該技術の内にある関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、例えば、本明細書において引用される参考文献中で記載され、文献中で十分に説明される。例えば、すべて全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭａｎｉａｔｉｓＴａｔａｌ．，（１９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＳａｍｂｒｏｏｋＪｅｔａｌ．，（１９８９），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＳａｍｂｒｏｏｋＪａｔａｌ．，（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ、ＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７および年次更新）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７および年次更新）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ、ＢｉｒｒｅｎＢｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｒｏｔｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照されたい。

６．実施例
実施例は、例解を目的として与えられ、制限を目的とするものではない。

６．１実施例１：Ｆｃポリペプチドの合成およびヘテロ二量体化
この実施例は、標的１または標的２（ヒトＴ細胞の表面上に存在する２つの異なる抗原）に特異的なＦｃポリペプチドの合成およびヘテロ二量体化を説明する。

６．１．１Ｆｃポリペプチド合成
１２個のＦｃポリペプチド（各々、標的１または標的２のいずれかに特異的な半抗体を含む）をＣＨＯ細胞中で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。１２個のＦｃポリペプチドの各々についての抗原結合部分の結合特異性および重鎖定常領域のアミノ酸配列を、表３に記載する。

Ｆｃポリペプチド＃４、５、２、１０、１１、および８のタンパク質発現レベルを測定し、比較した。図１に示されるように、Ｆｃポリペプチド４および１０（Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異の両方を含む）は、試験した他のＦｃポリペプチドと比べて無視できるレベルで発現した。

６．１．２Ｆｃポリペプチドのヘテロ二量体化
表３に示されるＦｃポリペプチドをヘテロ二量体化して、表４に記載されるヘテロ二量体タンパク質を形成した。簡潔に述べると、表４に示される第１のＦｃポリペプチドと第２のＦｃポリペプチドとを、等モル量で、５０ｍＭの還元剤（２－ＭＥＡ）の存在下で少なくとも２時間混合して、重鎖鎖間ジスルフィド結合を減少させた。次いで、Ｆｃポリペプチドの混合物を、脱塩ＰＤ－１０カラムを使用して再酸化緩衝液（ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１１５ｍＭＮａＣｌ）中に緩衝液交換して還元剤を除去し、室温で２４時間インキュベートして、第１および第２のＦｃポリペプチドの二量体化を促進した。次いで、得られたＦｃポリペプチド混合物を、貯蔵緩衝液（ｐＨ６の１０ｍＭヒスチジン、および１１５ｍＭＮａＣｌ）中に緩衝液交換した。純度および品質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定し、二量体形成およびヘテロ二量体化率を、絶対サイズ排除クロマトグラフィー（ＡＳＥＣ）により評価した。

６．１．３熱安定性
ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８の熱的安定性を評価した。１μＬのＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＤｙｅ（５倍の最終Ｓｙｐｒｏ濃度）を、ＰＢＳで希釈した４μｇのタンパク質に加えた。ＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ蛍光を、１０℃～９５℃で開始する熱勾配を使用してサーマルサイクラー（ＢｉｏｒａｄＣＦＸ９６Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍＣ１０００ＰＣＲＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）で分析し、タンパク質熱シフトをＣＦＸＭａｅｓｔｒｏソフトウェアで分析した。棒グラフをプリズムで作成した。

図２Ａは、抗標的１ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、およびＢＡ１１４についての融解温度を示す。ＢＡ１１４の融解温度は、ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、またはＢＡ１１３よりも低い。

図２Ｂは、抗標的２ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８についての融解温度を示す。ＢＡ１１８の融解温度は、ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、またはＢＡ１１７よりも低い。

６．２実施例２：標的結合
この実施例は、表４に示されるヘテロ二量体タンパク質がそれらの意図された標的に結合する能力を示す。

６．２．１標的１
ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ホモ二量体タンパク質ＢＡ１１９（ＷＴＩｇＧ_１）、およびＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体が標的１に結合する能力を評価した。

簡潔に述べると、ヒト標的１を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞の凍結アリコートを３７℃で解凍し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を３７℃および５％ＣＯ２で補充したＲＰＭＩ培地中で一晩培養した。細胞を計数し、それらの生存率を、細胞の２０μｌアリコートを３８０μｌの生死判別色素と混合することによって、Ｍｕｓｅ装置（ＬｕｍｉｎｅｘＣｏｒｐ．）を使用して評価した。次に、細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレット化し、２％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を補充した１倍リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に、最終濃度１×１０^６細胞／ｍＬまで再懸濁した。細胞を、９６ウェルのＵ底組織培養プレートに、ウェル当たり１×１０^５細胞の密度で播種し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。

５０μｇ／ｍｌ～０．０００００５μｇ／ｍｌの範囲の標準希釈を合計８回行って、ヘテロ二量体タンパク質をＦＡＣＳ緩衝液で１：１０に連続希釈した。細胞を、５０μｌのヘテロ二量体タンパク質溶液に再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。

ヘテロ二量体タンパク質結合を検出するために、細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を１：２００の最終希釈で含有し、生／死染色溶液を１：１０００最終希釈で含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に、細胞を３０分間４℃でインキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ、およびＳＳＣ－Ａ対生－死に順次ゲーティングを行うことによって、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン１０、ＦＬＯＷＪＯ）ソフトウェアを使用して分析した。ＦＩＴＣ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅＩｎｃ．）を使用してデータをプロットした。

図３に示されるように、ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、およびＢＡ１１９は、標的１発現細胞に対する強力かつ同等な結合を示した。

６．２．２標的２
ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、ホモ二量体タンパク質ＢＡ１２０（ＷＴＩｇＧ_１）、およびＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体が標的２に結合する能力を評価した。

簡潔に述べると、標的２を発現するように操作されたＣＨＯ細胞の凍結アリコートを３７℃で解凍し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を３７℃および５％ＣＯ２で補充したＦ－１２培地中で一晩培養した。細胞を計数し、それらの生存率を、Ｖｉ－ＸＣｅｌｌ装置を使用して評価した。次に、細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによってペレット化し、２％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を補充した１倍リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に、最終濃度１×１０^６細胞／ｍＬまで再懸濁した。細胞を、９６ウェルのＵ底組織培養プレートに、ウェル当たり１×１０^５細胞の密度で播種し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。

３０μｇ／ｍｌ～０．０１３７１７μｇ／ｍｌの範囲の標準希釈を合計８回行って、ヘテロ二量体タンパク質をＦＡＣＳ緩衝液で１：３に連続希釈した。細胞を、５０μｌのヘテロ二量体タンパク質溶液に再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。

ヘテロ二量体タンパク質結合を検出するために、細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を１：２００の最終希釈で含有し、生／死染色溶液を１：１０００最終希釈で含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に、細胞を３０分間４℃でインキュベートし、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ、およびＳＳＣ－Ａ対生－死に順次ゲーティングを行うことによって、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。ＦＩＴＣ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータをプロットした。

図４に示されるように、ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、およびＢＡ１２０は、標的２発現細胞に対する強力かつ同等な結合を示した。

６．３実施例３：標的遮断
この実施例は、表４に示されるヘテロ二量体タンパク質がそれらの意図された標的を発現する細胞中でシグナル伝達を遮断する能力を示す。

６．３．１標的１
ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ホモ二量体タンパク質ＢＡ１１９（ＷＴＩｇＧ_１）、およびＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体が標的１に結合することによりシグナル伝達を遮断する能力を、Ｊｕｒｋａｔレポーターアッセイを使用して評価した。

簡潔に述べると、活性化を抑制するＴＣＲ活性化および阻害性コレセプターシグナル伝達の両方に応答することができる天然プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを用いてヒト標的１を発現するように操作されたヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者のプロトコルに従って９６ウェルの平底白色プレートにプレーティングし、５０μｇ／ｍｌ～０．０１５μｇ／ｍｌで培養培地中１対２．５に連続希釈した用量漸増のＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ＢＡ１１９、およびＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体で処理した。示されるヘテロ二量体タンパク質の機能的活性を評価するために、標的１の天然リガンドを発現するように操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞、および抗原非依存的にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を活性化するように設計した操作された細胞表面タンパク質を、ヘテロ二量体タンパク質で処理したＪｕｒｋａｔレポーター細胞株とともに、６時間、３７℃および５％ＣＯ２で共培養した。ヘテロ二量体タンパク質が標的１のその天然リガンドとの相互作用を遮断し、Ｔ細胞活性化遺伝子活性を強化する能力を評価するために、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬およびＥｎｖｉｓｉｏｎプレート読取り照度計を使用して、ルシフェラーゼ発現を定量した。

図５に示されるように、細胞株を共培養した結果、標的１の阻害性コレセプター（Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現）がその天然リガンドＣＤ８０およびＣＤ８６（Ｒａｊｉ細胞上で発現）と係合し、これにより、ルシフェラーゼ発現の欠如によって示されるように、Ｔ細胞活性化が阻害された。この阻害は、漸増濃度のＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、またはホモ二量体タンパク質ＢＡ１１９を加えると軽減された。ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、およびＢＡ１１９は、ＩＬ－２レポーター遺伝子活性によって決定して、Ｔ細胞活性化の強化において機能的に同等であった。

６．３．２標的２
ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、ホモ二量体タンパク質ＢＡ１２０（ＷＴＩｇＧ_１）、およびＩｇＧ_１アイソタイプ対照抗体が標的２に結合することによりシグナル伝達を遮断する能力を、Ｊｕｒｋａｔレポーターアッセイを使用して評価した。

簡潔に述べると、標的２の阻害性コレセプターを内因的に発現するヒトＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）を操作して、細胞表面標的２、およびＩＬ－２プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を構成的に発現するようにした。細胞を、製造業者のプロトコルに従って９６ウェルの平底白色プレートにプレーティングし、漸増用量の示される抗標的２ヘテロ二量体タンパク質またはアイソタイプ対照ＩｇＧ_１抗体で処理した。ヘテロ二量体タンパク質を、５０μｇ／ｍｌ～０．０１５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、培養培地中１：２．５に連続希釈した。標的２の天然リガンドを内因的に発現し、独自のＴ細胞活性化因子を発現するように操作された抗原提示細胞株（Ｒａｊｉ）を製造業者の指示に従って調製し、ヘテロ二量体タンパク質で処理したＪｕｒｋａｔ細胞とともに、６時間、３７℃および５％ＣＯ２で共培養した。ヘテロ二量体タンパク質が標的２の相互作用を遮断し、ＩＬ－２レポーター遺伝子活性を強化する能力を評価するために、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬およびＥｎｖｉｓｉｏｎプレート読取り照度計を使用して、ルシフェラーゼ発現を定量した。

図６に示されるように、２つの細胞株を共培養した結果、標的２の阻害性コレセプター（Ｊｕｒｋａｔ細胞上で発現）がその天然リガンド（Ｒａｊｉ細胞上で発現）と係合し、これにより、ルシフェラーゼ発現の欠如によって示されるように、Ｔ細胞活性化が阻害された。この阻害は、漸増濃度のＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、またはホモ二量体タンパク質ＢＡ１２０を加えると軽減された。ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、およびＢＡ１２０は、ＩＬ－２レポーター遺伝子活性によって決定して、Ｔ細胞活性化の強化において機能的に同等であった。

６．４実施例４：ＳＥＡ刺激アッセイ
この実施例は、ヘテロ二量体タンパク質ＳＥＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を励起する能力を実証する。

６．４．１標的１
標的１に特異的なヘテロ二量体タンパク質がＳＥＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を励起する能力を調査した。

簡潔に述べると、ドナー当たり３回の反復に十分な量のヘテロ二量体タンパク質の５倍濃縮中間原液を、１．２ｍＬのブレットチューブ中で調製した。まず、５００μｇ／ｍＬの各ヘテロ二量体タンパク質４２０μＬを、Ｒ１０培地中で調製した。次に、ヘテロ二量体タンパク質を、合計８回の希釈で１対１０に連続希釈した後、２０μｌのヘテロ二量体タンパク質混合物を丸底９６ウェルプレートの対応するウェルに加えた。ヒトＰＢＭＣの凍結アリコートを液体窒素から取り出し、３７℃の水で直ちに解凍した。細胞を、９ｍＬの予め加温したＲ１０培地に移し、２０００ｒｐｍで２分間直ちに遠心分離した。次に、細胞を計数し、生存率を評価した。細胞を２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、再懸濁した。

１０μｇ／ｍＬのＳＥＡ１０μＬを９０μＬのＲ１０に加えて１μｇ／ｍＬの中間濃縮物を作製することにより、ＳＥＡの中間原液濃縮物を作製した。細胞を刺激するために、１μｇ／ｍＬのＳＥＡ中間原液３５μＬを２８ｍＬの細胞に加えた。細胞とＳＥＡとの混合物８０μＬを対応するウェルに加え、３７℃および５％ＣＯ_２で４日間、加湿チャンバ内でインキュベートした。合計０．１×１０^６細胞／ウェル、および最終濃度１ｎｇ／ｍＬのＳＥＡを使用した。

４日間インキュベートした後、プレートをインキュベーターから取り出し、手で穏やかに撹拌した後、２分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。サイトカイン分析のために、５μＬの上清を３８４ウェルのＡｌｐｈａＬＩＳＡプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移した。ＩＬ－２の測定には、ＡｌｐｈａＬＩＳＡキットを製造業者の指示に従って使用した。簡潔に述べると、アッセイ緩衝液を、２．５ｍＬの１０倍ＡｌｐｈａＬＩＳＡＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＢｕｆｆｅｒを２２．５ｍＬの水に加えることによって調製した。ヒトＩＬ－２分析物を使用し、製造業者の指示に従って標準希釈物を調製した。１．６倍ＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＩＬ－２アクセプタービーズとビオチン化抗ＩＬ－２抗体との混合物を、アッセイ緩衝液中で調製した。８μＬを各ウェルに加え、５００ｒｐｍで９０分間回転させながら、室温の暗所でインキュベートした。２．３倍ストレプトアビジンドナービーズ中間原液を、アッセイ緩衝液中で調製した。１０μＬを各ウェルに加え、５００ｒｐｍで２０分間回転させながら、室温の暗所でインキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡプレートを２０００ｒｐｍで手短に遠心分離した。相対光単位（ＲＬＵ）を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー上でＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎプロトコルを使用して測定した。

図７Ａ～７Ｐに示されるように、ＢＡ１１３は、同様に標的１に特異的である参照ホモ二量体タンパク質２に匹敵して、用量依存的様式でＩＬ－２分泌を有力に強化した。ＢＡ１１３は、ＢＡ１１２およびＢＡ１１１と比較して優れた機能的活性を示した。ＢＡ１１１は、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異（「Ｆｃ強化」）を含むホモ二量体アイソタイプ対照タンパク質で処置した細胞に有意なレベルのＩＬ－２分泌を誘導せず、アイソタイプ対照として使用した。ＢＡ１１４は、ＢＡ１１３と比較して、ＩＬ－２分泌の強化における効果が明らかに低かった。図７Ａ～７Ｐに提示する結果は、３つの異なるドナーである、ドナー１（図７Ａ～７Ｄおよび図７Ｉ～７Ｌ）、ドナー２（図７Ｅ～７Ｈ）、およびドナー３（図７Ｍ～７Ｐ）からのＰＢＭＣを使用して得たものである。

６．４．２標的２
標的２に特異的なヘテロ二量体タンパク質がＳＥＡ刺激ＰＢＭＣによるＩＬ－２分泌を励起する能力を調査した。

実験は、ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、および参照ホモ二量体タンパク質１を利用して、上記の実施例６．４．１に記載したとおりに実施した。Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異（「Ｆｃ強化」）を含むホモ二量体アイソタイプタンパク質を、アイソタイプ対照として使用した。

図８Ａ～８Ｘに示されるように、ＢＡ１１７は、同様に標的２に特異的であるＢＡ１１６およびＢＡ１１５ならびに参照ホモ二量体タンパク質１と比較して、用量依存的様式でＩＬ－２分泌を有力に強化し、優れた機能的活性を示した。ＢＡ１１５は、ＢＡ１１７、ＢＡ１１８、またはＢＡ１１６と比較して、効力が有意に低かった。ＢＡ１１５およびＢＡ１１８バリアントは、ＳＥＡ刺激ＰＢＭＣドナーからのＩＬ－２分泌の強化に対する機能的活性が同等であった。

６．５実施例５：Ｆｃ結合
６．５．１ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）結合
６．５．１．１標的１
ＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、およびＢＡ１１４がＦｃγＲＩＩＩＡに結合する能力を、細胞結合アッセイを使用して評価した。

簡潔に述べると、ｈＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ／Ｖ）またはｈＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ／Ｆ）を発現するＣＨＯ細胞を凍結状態から解凍し、５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＤＰＢＳ、ＢＳＡ０．５％、アジド０．０５％）に、４×１０^６細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。細胞を、９６ウェルのＵ底組織培養プレートに２×１０^５細胞／ウェルの密度で分注し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した６０μｇ／ｍＬ～７ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＡ１１１、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、およびＢＡ１１４の連続希釈物とともに、４５分間４℃でインキュベートした。抗体染色のため、細胞を、冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１：８００の希釈でヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Ｆ（ａｂ）２抗Ｆｃ）（ＪＩＲ、カタログ＃１０９－１１６－０９８）を含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。４℃で４５分間インキュベーションした後、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞をフローサイトメトリー（ＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター）により分析した。データを、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－Ｈ対ＳＳＣ－Ａ、および計数対ＰＥに対して順次ゲーティングを行うことによって、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）値を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアによってデータをプロットした。データは３つの別々の実験に由来し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。

図９Ａおよび図９Ｂに示されるように、ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、およびＢＡ１１４は、ＣＨＯ細胞上で発現されるＦｃγＲＩＩＩＡＶ／Ｖ（図９Ａ）およびＦ／Ｆ（図９Ｂ）に結合する。ＢＡ１１３は、ＢＡ１１１と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡＶ／Ｖ（図９Ａ）およびＦ／Ｆ（図９Ｂ）への強化された結合を示す。

６．５．１．２標的２
ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８がＦｃγＲＩＩＩＡに結合する能力を、細胞結合アッセイを使用して評価した。

実験は、ヘテロ二量体タンパク質ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８を６０μｇ／ｍＬ～７ｎｇ／ｍＬの濃度で使用したことを除いて、６．５．１．１項に記載したとおりに実施した。データは３つの実験に由来し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。

図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８は、ＣＨＯ細胞上で発現されるＦｃγＲＩＩＩＡＶ／Ｖ（図１０Ａ）およびＦ／Ｆ（図１０Ｂ）に結合する。ＢＡ１１７は、ＢＡ１１５と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡＶ／Ｖ（図１０Ａ）およびＦ／Ｆ（図１０Ｂ）への強化された結合を示す。

６．５．２他のＦｃ受容体
ＢＡ１１２、ＢＡ１１３、ＢＡ１１４、ＢＡ１１５、ＢＡ１１６、ＢＡ１１７、およびＢＡ１１８がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａＨ／Ｈ、ＦｃγＲＩＩａＲ／Ｒ、およびＦｃγＲＩＩｂに結合する能力も細胞結合アッセイを使用して評価したが、有意な差異は観察されなかった。

６．５．３追加のヘテロ二量体タンパク質に対するＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）結合
この実施例は、標的１または標的２（ヒトＴ細胞の表面上に存在する２つの異なる抗原）に特異的な追加のＦｃポリペプチドの合成、ヘテロ二量体化、およびＦｃ受容体結合を説明する。

追加のＦｃポリペプチド（各々、標的１または標的２のいずれかに特異的な半抗体を含む）をＣＨＯ細胞中で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。１２個のＦｃポリペプチドの各々についての抗原結合部分の結合特異性および重鎖定常領域のアミノ酸配列を、表５に記載する。

表３および／または５に示されるＦｃポリペプチドをヘテロ二量体化して、表６に記載される単一特異性ヘテロ二量体タンパク質を形成した。ヘテロ二量体化は、実施例６．１．２に記載したとおりに行った。

表６のヘテロ二量体タンパク質がＦｃγＲＩＩＩＡＦ／Ｆに結合する能力を、図１１および表７に示される抗標的１ヘテロ二量体タンパク質の評価に使用した検出抗体がＦｃγ断片特異的なヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＪＩＲ、カタログ＃１０９－５４６－０９８）であったことを除いて実施例６．５．１に記載したとおりに、細胞結合アッセイを使用して評価した。図１１および図１２の両方で使用した希釈範囲は、１：４の段階希釈で１００μｇ／ｍｌ～０μｇ／ｍｌであった。各事例において、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異（Ｆｃ強化）を含む参照ホモ二量体タンパク質を、比較のために使用した。

様々なＦｃポリペプチドを有する抗標的１ヘテロ二量体タンパク質が細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＦ／Ｆを発現するＣＨＯ細胞に結合する能力を、図１１Ａ～１１Ｇに示す。蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均によって評価した細胞へのヘテロ二量体タンパク質結合のレベルを、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質の濃度に対してプロットした。各ヘテロ二量体タンパク質の曲線下面積を表７に提示する。

様々なＦｃポリペプチドを有する抗標的２ヘテロ二量体タンパク質が細胞表面ヒトＦｃγＲＩＩＩＡＦ／Ｆを発現するＣＨＯ細胞に結合する能力を、図１２Ａ～１２Ｇに示す。蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均によって評価した細胞へのヘテロ二量体タンパク質結合のレベルを、細胞とともにインキュベートしたヘテロ二量体タンパク質の濃度に対してプロットした。各ヘテロ二量体タンパク質の曲線下面積を表８に提示する。

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態により、範囲が制限されるものではない。実際に、記載されるものに加えて、本明細書に開示される様々な変更が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかとなる。このような変更は、添付の請求の範囲内であることが意図される。

本明細書で引用されるすべての参考文献（例えば、公報または特許または特許出願）は、それぞれ個々の参考文献（例えば、公報または特許または特許出願）が、あらゆる目的のために全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、全体が参照によりあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims

改善された熱安定性を呈し、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質であって、
ａ）前記第１のＦｃポリペプチドが、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸２３９位、３３０位、３３２位、および３６６位に、それぞれアスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、およびトリプトファンを含み、
ｂ）前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、アミノ酸２３９位、３６６位、３６８位、および４０７位に、それぞれアスパラギン酸、セリン、アラニン、およびバリンを含むが、アミノ酸３３０位にロイシンおよびアミノ酸３３２位にグルタミン酸を含まず、
アミノ酸位置が、ＥＵインデックスに従って番号付けされる、ヘテロ二量体タンパク質。
前記第１のＦｃポリペプチドが、第１の抗原結合部分を含み、かつ／または前記第２のＦｃポリペプチドが、第２の抗原結合部分を含む、請求項１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
前記第１および／または第２の抗原結合部分が、抗体可変ドメイン、細胞表面受容体の細胞外ドメイン、可溶性Ｔ細胞受容体、またはリガンドを含む、請求項２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
ａ）前記第１および／または第２の抗原結合部分が、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ＶＨ／ＶＬ対、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、および／またはＦａｂを含む、
ｂ）前記細胞表面受容体が、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体、血管内皮成長因子受容体、または形質転換成長因子受容体である、または
ｃ）前記リガンドがホルモンまたは成長因子であり、
前記第１および第２の抗原結合部分が、同じまたは異なる標的分子に特異的に結合する、請求項３に記載のヘテロ二量体タンパク質。
前記第１および／または第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２のＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
前記第１および／または第２のＦｃポリペプチドが抗体重鎖を含む、請求項５に記載のヘテロ二量体タンパク質。
ａ）前記抗体重鎖が、ＣＨ１ドメイン、および／またはヒンジ領域の一部を欠く、
ｂ）前記抗体重鎖が全長抗体重鎖である、
ｃ）前記抗体重鎖が、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、またはＩｇＡ_２重鎖である、および／または
ｄ）前記第１および／または第２のＦｃポリペプチドが抗体軽鎖をさらに含み、前記抗体軽鎖が、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖である、
請求項６に記載のヘテロ二量体タンパク質。
ａ）前記第１のＦｃポリペプチドが、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含む、
ｂ）前記第２のＦｃポリペプチドが、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む、または
ｃ）前記第１のＦｃポリペプチドが、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体を含む、
請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
前記第１および第２の半抗体が、異なる標的分子、または同じ標的分子の異なる領域に結合する、請求項８に記載のヘテロ二量体タンパク質。
請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１のＦｃポリペプチドおよび前記第２のＦｃポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
組換え宿主細胞であって、
ａ）請求項１１に記載のポリヌクレオチド、
ｂ）請求項１２に記載のベクター、
ｃ）請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、または
ｄ）請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクター、
を含む、組換え宿主細胞。
ヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、前記方法が、
細胞内で、
ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドと、
ｂ）請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドとを、
前記ヘテロ二量体タンパク質が産生される条件下で発現させることを含む、方法。
ヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、前記方法が、
ａ）第１の細胞内で、請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１のＦｃポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドを、前記第１のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｂ）第２の細胞内で、請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第２のＦｃポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドを、前記第２のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）で産生された前記第１のＦｃポリペプチドおよび前記第２のＦｃポリペプチドを、前記第１のＦｃポリペプチドおよび前記第２のＦｃポリペプチドがヘテロ二量体化して前記ヘテロ二量体タンパク質を産生する条件下で接触させることと、を含む、方法。
ヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、前記方法が、
ａ）第１の細胞内で、請求項８に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１の抗体重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドおよび請求項８に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１の抗体軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを、前記第１のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｂ）第２の細胞内で、請求項８に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第２の抗体重鎖をコードする第３のポリヌクレオチドおよび請求項８に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第２の抗体軽鎖をコードする第４のポリヌクレオチドを、前記第２のＦｃポリペプチドが産生される条件下で発現させることと、
ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）で産生された前記第１のＦｃポリペプチドおよび前記第２のＦｃポリペプチドを、前記第１のＦｃポリペプチドおよび前記第２のＦｃポリペプチドがヘテロ二量体化して前記ヘテロ二量体タンパク質を産生する条件下で接触させることと、を含む、方法。
ヘテロ二量体タンパク質を産生する方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質の前記第１のＦｃポリペプチドおよび前記第２のＦｃポリペプチドを、前記第１のＦｃポリペプチドおよび前記第２のＦｃポリペプチドがヘテロ二量体化して前記ヘテロ二量体タンパク質を産生する条件下で接触させることを含む、方法。