JP7832011B2

JP7832011B2 - プライマーセット、ならびにテンサイ黒根病の検診キット及び検診方法

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Publication number: JP7832011B2
Application number: JP2022023335A
Authority: JP
Inventors: 一登小田; 浩克内野
Original assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2022-02-17
Filing date: 2022-02-17
Publication date: 2026-03-17
Anticipated expiration: 2042-02-17
Also published as: JP2023120116A

Description

本発明は、ＬＡＭＰ法により、アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット、当該プライマーセットを含むテンサイ黒根病の検診キット、及び、当該プライマーセット等を用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてアファノミセス・コクリオイデスを検出する工程を含む、テンサイ黒根病の検診方法に関する。

テンサイ黒根病（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｒｏｏｔｒｏｔ）は、アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）によるテンサイの重要病害の一つである。テンサイ黒根病に罹病したテンサイ（甜菜、サトウダイコン、ＢｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓＬ.）には、主根に浅く細かな亀裂を生じる粗皮症状が発生し、その症状が激しいものでは内部組織が腐敗してしまう（非特許文献１）。

アファノミセス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ）属は、「ミズカビ」とも呼ばれ、卵菌類の一種であり、主に卵胞子の状態で植物残渣や土壌中に耐久して生存する（非特許文献２）。例えば、テンサイやホウレンソウなどのヒユ科の他、マメ科、アブラナ科、ナス科など、農作物として栽培されているものを含む広範囲の高等植物の他、原生動物やコイ、フナなどの水生動物にも寄生する。

アファノミセス・コクリオイデスが感染したテンサイは、収量の減少とともに品質も低下することから、耕作者にとって、直接、収入の減少につながるとともに、製糖業者にとっても作業効率が低下する大きな要因となり、また、収穫されてから製糖工程に入るまでのパイル貯蔵期間中に、腐敗が進行して品質が低下する場合があり、多方面で大きな問題となっている。さらに、アファノミセス・コクリオイデスは、幼苗の胚軸部が腐敗して苗が立ち枯れる苗立枯病や、主根が腐敗する黒根病の病原菌である他、連作障害の一因でもある。

テンサイ黒根病は、高温・多湿の雰囲気下、排水不良などによりテンサイ根への感染を活発に繰り返すとされているが（非特許文献３）、病状が進行した罹病個体に対して特効性を示す薬剤による防除方法は確立しておらず、さらには当該病害の罹患部位が根部であることから、薬剤が十分に行き渡らないといった問題を呈している。

そこで、本病害による被害を緩和するために、早期に病害を発見して病状が進行する前に防除することが求められる。例えば、分子生物学的手法としては、ＰＣＲ法を用いて、感染が疑われる土壌や植物中のアファノミセス・コクリオイデスの存否を検出する方法を挙げることができる（特許文献１）。ＰＣＲ法による検出法では、土壌や植物などを含む試料から核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）を抽出し、抽出した核酸を鋳型として、原因菌に特異的な塩基配列を有する核酸を、精密な温度制御と迅速な温度変化を要するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して、必要に応じて転写、逆転写、増幅などを行った産物を検出することによって、試料における原因菌の有無を検出する。

しかしながら、ＰＣＲ法では温度の制御が不可欠となり、サーマルサイクラーや電気泳動装置が必須となる。また、多段階の工程を経る必要がある他、検出までに時間を要するうえに、操作には一定の技術習得も必要である。

その他、本病害を発見する方法として、「アファノミセス選択分離培地」を用いてテンサイの罹病組織から検出する方法を挙げることができる（非特許文献４）。「アファノミセス選択分離培地」とは、アファノミセスが生育する人工培地に、抗生物質などの薬剤を数種類加用して、アファノミセス以外の糸状菌や細菌類の生育を抑制し、アファノミセスの罹病組織からの純粋分離を容易にした培地である。

しかしながら、アファノミセス選択分離培地を用いた方法によれば、罹病組織の切片を当該培地上に置いてから検出を終えるまで、４～７日要する。また、当該方法によれば、リゾクトニア属やピシウム属といった雑菌や細菌類の生育は抑制されるものの、フザリウム属や接合菌類など、生育抑制効果が低い菌群も存在することから、判定に際しては、大抵、顕微鏡による形態観察を要してしまう。さらに、培地中の抗生物質の影響を受けて、アファノミセスの生育もある程度は抑制されてしまうと考えられることから、検出精度に限界があると考えられている。

特開２００３－２７４９５１号公報

てん菜研究会報，１９９９，４１：６７－７２てん菜研究会報，２００３，４５：２７－３２ＨＡＲＶＥＳＯＮ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄＲＵＳＨ，Ｃ．Ｍ．（１９９３）：ＡｎＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｔｏＭｏｎｉｔｏｒｔｈｅｅｆｆｅｃｔＡｐｈａｎｏｍｙｃｅｓＲｏｏｔｒｏｔａｎｄＲｈｉｚｏｍａｎｉａｏｎＳｕｇａｒＢｅｅｔ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，８３（１１），１２２０－１２２３．日植病報，５１：１６－２１

そこで、本発明は、テンサイ黒根病の病原菌であるアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセット、当該プライマーセットを含むテンサイ黒根病の検診キット、ならびに、当該プライマーセット及び当該検診キットの少なくともいずれかを用いて、被験体から得られた検体においてアファノミセス・コクリオイデスを検出する工程を含むテンサイ黒根病の検診方法を提供する。

本発明者らは、鋭意研究の結果、テンサイ黒根病の病原菌であるアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸に特異的に反応するＬＡＭＰプライマーを設計し、ＬＡＭＰプライマーセットを完成させ、そして、当該ＬＡＭＰプライマーセットを用いたテンサイ黒根病の検診キットや、当該ＬＡＭＰプライマーセットや当該検診キットを用いた、ＬＡＭＰ法によりテンサイ黒根病を検診する方法を見出し、下記の各発明を完成した。

（１）ＬＡＭＰ法により、アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含むプライマーセット；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。

（２）前記ポリヌクレオチドがアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域に由来する、（１）に記載のプライマーセット。

（３）リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を増幅しない、（１）または（２）に記載のプライマーセット。

（４）アファノミセス・クラドガムス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｌａｄｏｇａｍｕｓ）由来の核酸を増幅しない、（１）から（３）のいずれか一項に記載のプライマーセット。

（５）（１）から（４）のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、テンサイ黒根病の検診キット。

（６）（１）から（４）のいずれか一項に記載のプライマーセット及び請求項５に記載の検診キットの少なくともいずれかを用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）を検出する工程を含む、テンサイ黒根病の検診方法。

本発明によれば、ＬＡＭＰ法を用いてアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を特異的に増幅することができる新規のプライマーセットが提供される。当該プライマーセットを用いることにより、農場現場において、テンサイ黒根病の病原菌であるアファノミセス・コクリオイデスを即時に高感度で検出し得るうえに、感染初期の個体を正確に検診できることから早期に防除や排水対策などを講じることができ、その結果、当該病害の進行を効果的に抑制することができる。

アファノミセス・コクリオイデスのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列における、アファノミセス・コクリオイデス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。実施例１におけるＬＡＭＰ反応後の反応チューブの色の変化を示す写真である。

以下、本発明に係るプライマーセット、テンサイ黒根病の検診キット、及び、テンサイ黒根病の検診方法について詳細に説明する。

本発明に係るプライマーセットは、ＬＡＭＰ法により、アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含む；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。

ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、納富らによって開発され、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法で不可欠とされる温度制御を不要とする核酸の増幅方法であり、日本特許第３３１３３５８号公報に報告されている。一般的に、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べて短時間で簡易に遺伝子を増幅できるうえ、特異性が高く、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で目的の核酸の増幅を行うことが可能である。

ＬＡＭＰ法は、６つの遺伝子領域を認識する４つのプライマーを用いて、鋳型となるヌクレオチドに当該プライマーの３‘末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とする。また、プライマーの３’末端が、常に試料に由来する領域に対してアニールしており、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することとなり、高感度かつ特異性の高い核酸増幅反応を可能とする。

ＬＡＭＰ法では、２本鎖の鋳型ＤＮＡの一方の鎖の３‘末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３と称する領域をそれぞれ規定し、これらの領域の塩基配列に基づいて設計されるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと称する４種類で１セットとなるプライマーを使用する。

Ｆ３プライマーは、Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。ＦＩＰプライマーは、Ｆ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。ＢＩＰプライマーは、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１領域と相補的な塩基配列であるＢ１ｃ領域の塩基配列を持つように設計する。Ｂ３プライマーは、Ｂ３領域の塩基配列を持つように設計する。

これらのプライマーのうち、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーをインナープライマーと、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーをアウタープライマーと称される。ここで、インナープライマーは、標的領域上の特定の塩基配列領域を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するポリヌクレオチドである。このインナープライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域の間、またはＢ２領域とＢ１ｃ領域の間に、塩基数０～５０のいずれかの長さの任意の塩基配列を有していてもよい。

一方、アウタープライマーは、標的領域上の特定の塩基配列領域の３'末端側に存在する配列領域を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するポリヌクレオチドである。

ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応は、インナープライマーを起点に合成されたＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡから一本鎖として剥がすために用いられる２種類のアウタープライマーにより生成する、ステムループ構造を持つダンベル型の構造を起点とし、伸長反応と鎖置換型伸長反応を繰り返すことにより進行する。また、ダンベル構造の５’末端側のループの一本鎖部分に相補的な配列を持つ２種類のループプライマーを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やし、反応時間を短縮することが可能となる。

以下、ＬＡＭＰ法によるアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）の検出について、（１）検体からの核酸の抽出、（２）プライマーセットの設計、（３）核酸の増幅、（４）増幅産物の有無の確認の順に説明する。

（１）検体からの核酸の抽出
本発明において、検体としては、アファノミセス・コクリオイデスを含有するものすべてを対象とすることができるが、テンサイ（甜菜、サトウダイコン、ＢｅｔａｖｕｌｇａｒｉｓＬ.）の根、葉、茎、苗などを用いることが好ましい。特に検出に適しているのはテンサイの根であり、検出率を高めることができる。

その他、土壌を検体とすることができる。アファノミセス・コクリオイデスは、土壌中にも広く存在し、土壌を介して感染することから、土壌を検体としてアファノミセス・コクリオイデスの有無を確認することにより、テンサイ黒根病の発生や拡大を未然に防ぐことができる。

検体からＤＮＡを調製する方法としては、アファノミセス・コクリオイデスの検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出による精製や、市販の抽出キットを用いた精製によって、核酸の純度を高めて使用することができる。

（２）プライマーセットの設計
＜プライマーセット＞
本発明に係るプライマーセットは、アファノミセス・コクリオイデスに特異的であり、かつ、種保存性が高いリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域（ＩｎｔｅｒｎａｌＴｒａｎｓｃｒｉｂｅｄＳｐａｃｅｒｓ）に基づいて設計される。当該標的領域は、アファノミセス・コクリオイデスの多様性をカバーし得る塩基配列領域である。

本発明におけるプライマーは、係る標的塩基配列を増幅対象として設計しうる限り特に限定されるものではなく、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などの核酸増幅方法に用いる際のプライマーとして使用することができるが、ＬＡＭＰプライマーであることが好ましい。

本発明に係るプライマーセットは、次のように設計する。まず、ＣｌｕｓｔａｌＸなどのアラインメントソフトを用いて、複数のアファノミセス・コクリオイデスのリボゾームＤＮＡのＩＴＳ領域における塩基配列のアライメントを行う。次に、得られたアライメント情報をもとに、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒＶ５（栄研化学株式会社製）等のソフトを用いて保存性の高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選定し、ＬＡＭＰ法のプライマーを設計する。従って、本発明に係るプライマーセットは、ＬＡＭＰプライマーセットであることが好ましい。

各プライマーにおいては、ＬＡＭＰ法におけるプライマー機能を有する限り、１または数個（例えば、１～１０個）の塩基が欠失、置換または付加した塩基配列を有するプライマーを代替的に用いることができる。

本発明に係るプライマーセットとして、アファノミセス・コクリオイデスの特異的な塩基配列であり、配列番号１の配列により示される当該菌体のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域（図１）をコードする塩基配列を標的とし、その塩基配列の一部と相補的となるように化学合成されたポリヌクレオチドであって、配列番号２～５の配列により示されるプライマーセットを選定した。

アファノミセス・コクリオイデス検出用のプライマーセット（塩基配列（５’－３’））
ＦＩＰ（配列番号２）ＡＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＡＴＧＡＣＴＧＡＡＣＴＡＴＣＴＡＧＣＡＴ
ＢＩＰ（配列番号３）ＧＧＣＴＣＧＣＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＧＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＴＣＡＣＴ
Ｆ３（配列番号４）ＡＣＣＧＡＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＣＴＴ
Ｂ３（配列番号５）ＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＡＣＣＣＧＡ

すなわち、本発明に係るプライマーセットは、アファノミセス・コクリオイデス由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含むプライマーセットである；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。

そしてそれ故、前記ポリヌクレオチドは、アファノミセス・コクリオイデスのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域に由来する。

ここで、本発明において、「アファノミセス・コクリオイデス由来の核酸を特異的に増幅する」とは、アファノミセス・コクリオイデス由来の核酸については、通常の条件で核酸増幅反応を行ったときに増幅が可能であるが、アファノミセス・コクリオイデス以外の他の菌体由来の核酸については実質的に増幅しない（増幅したとしても検出限界以下である）ことを意味する。実際のところ、本発明に係るプライマーセットは、アファノミセス・コクリオイデスの近縁種である、アファノミセス・クラドガムス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｌａｄｏｇａｍｕｓ）由来の核酸を増幅しない。

ただし、本発明に係るプライマーセットは、例外として、近縁種のアファノミセス・エウテイケス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｅｕｔｅｉｃｈｅｓ）由来の核酸を非特異的に増幅する。アファノミセス・エウテイケスは、主にマメ科作物にアファノミセス根腐病を引き起こす菌として知られている。なお、アファノミセス・エウテイケスはテンサイを宿主としないため、テンサイ黒根病の検診において、アファノミセス・エウテイケスが影響を与えることはない。

また、本発明に係るプライマーセットは、テンサイ根腐病の原因菌であるリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を増幅しない。このことは、テンサイ黒根病と原因菌の種類が全く異なるにもかかわらず、病徴のみから判別することが困難なテンサイ根腐病と、テンサイ黒根病を判別することができることを示している。

（３）核酸の増幅
ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応においては、検体から抽出された核酸、及びプライマーセット、ならびにＤＮＡ増幅試薬として、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素などのＤＮＡポリメラーゼと、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩またはマンガン塩等）、及び酵素や鋳型を安定化する保護剤を、等温で一定時間静置すればよい。

酵素活性に適した温度は、６０～７０℃、好ましくは６３～６５℃にてＤＮＡの増幅反応を行う。反応時間は、１５分以上であればＤＮＡの増幅を検出することができるが、好ましくは３０分～１２０分、より好ましくは６０～９０分の範囲に設定することができる。

核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えば、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントなどを挙げることができ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を好適な酵素として挙げることができる。また、上記ＤＮＡ増幅試薬は、等温核酸増幅法用キットとして市販されており、例えば、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社製）、ＬＡＭＰ法用ＤＮＡ増幅試薬セット-動物種・植物病検査専用Ａ－(ニッポンジーン)などを使用することができる。

ＤＮＡ増幅するための反応液は以下の組成が一般的に用いられる。
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９）１０ｍＭ～２５ｍＭ
ＫＣｌ５ｍＭ～１５ｍＭ
ＭｇＳＯ_４５ｍＭ～４０ｍＭ
界面活性剤０．１％～０．４％
ベタイン０．５～１Ｍ
ｄＮＴＰｓ各１ｍＭ～１．５ｍＭ
鎖置換型核酸伸長酵素０．２～０．６Ｕ／μＬ

（４）増幅産物の有無の確認
＜病原菌の検出＞
核酸増幅反応後の溶液において増幅されたＤＮＡの存在を確認する。被験試料中にアファノミセス・コクリオイデスが含まれている場合、核酸増幅反応によりリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域における標的領域上のＤＮＡが増幅される。逆に、被験試料中にアファノミセス・コクリオイデスが含まれていなければ、核酸増幅反応によって正常なＤＮＡ増幅は進行しない。

核酸増幅反応により増幅されたＤＮＡの有無の判定には公知の技術が適用できる。例えば、目視による判定方法として、核酸合成の副産物であるピロリン酸マグネシウムにより生成される濁度の肉眼での確認や、反応液にあらかじめＨＮＢ試薬やマラカイトグリーンを添加すること、目視検出試薬があらかじめ添加されたＤＮＡ増幅試薬キットを用いたＬＡＭＰ反応による該反応液の変色によりＤＮＡの増幅の判定を容易にする方法を挙げることができる。当該ＤＮＡ増幅試薬キットとして、例えば、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＬＡＭＰ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）などを挙げることができる。増幅されたＤＮＡの有無の判定方法として他に、リアルタイム濁度測定装置（例えば、栄研化学株式会社製のＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡ）で光学的に確認する方法や、Ｌｏｏｐａｍｐ(登録商標)蛍光・目視検出試薬（栄研化学株式会社製）などの蛍光インターカレーターを添加して増幅反応させた液をＵＶ照射して、核酸の増幅を示す発光を目視により検出する方法を挙げることができる。

さらに、当該増幅産物の有無の判断は、本発明に係るプライマーセットの代わりに水を加えた陰性対照（ネガティブコントロール）との対比で行うことも好ましい。陰性対照を用いることにより、偽陽性に基づく判断を防止することができる。また、本発明のプライマーセットによってＬＡＭＰ反応が正常に進行する系となっていることを確認するために陽性対照（ポジティブコントロール）を用いてもよい。

次に、本発明に係るプライマーセットは、単独で、またはＬＡＭＰに必要な試薬とともに、テンサイ黒根病の検診キットとして提供することができる。ＬＡＭＰに必要な試薬としては、例えば、上述した鎖置換型核酸伸長酵素、ｄＮＴＰ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９）などの緩衝液、滅菌水、反応生成物の検出に必要な試薬などを挙げることができる。

さらに、本発明は、以上に説明した本発明に係るプライマーセットまたはテンサイ黒根病の検診キットの少なくともいずれかを用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）を検出する工程を含む、テンサイ黒根病の検診方法に関する。本発明に係る方法により、当該テンサイ黒根病の検診を可能とする。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕ＬＡＭＰプライマーによるアファノミセス・コクリオイデスの検出
（１）プライマーセットの設計
ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）からアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）のリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ領域の塩基配列データを収集し、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いたアラインメント解析により、ＩＴＳ領域上におけるアファノミセス・コクリオイデスの特異的な塩基配列を抽出した。

得られたアラインメント情報をもとに、配列番号１の８８塩基から３０２塩基領域を用いＬＡＭＰ法プライマーを設計した（図１）。ＬＡＭＰ法プライマーの設計には、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒＶ５（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／）を用いた。設計したＬＡＭＰプライマーを下掲の表１に示す。

［表１］

（２）病原菌からのＤＮＡ抽出
アファノミセス・コクリオイデスからのＤＮＡ抽出は、次の手順により行った。まず、腐敗したテンサイ根の黒変部と健全部の境界部を切り出し、水洗した後、１．５ｍＬのチューブに入れ、ジルコニアビーズと振盪破砕機を用いて組織を破砕した。次に、破砕組織片からＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＤＮＡＰｌａｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてからＤＮＡを抽出した。

（３）ＬＡＭＰ法による病原菌の検出
本実施例（２）で抽出したＤＮＡは、１０μｇ／ｍＬの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。ＬＡＭＰ反応は、下掲の表２の通り、鋳型ＤＮＡ溶液、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標）ＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＬＡＭＰ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）、滅菌蒸留水、及び、上掲の表１に記載の各プライマーセットを混合して調整した反応液を６３℃で６０分間反応させることにより行った。一方、ネガティブコントロールとして、当該鋳型ＤＮＡ溶液に代えて滅菌蒸留水を添加したものを用いた。

［表２］

（４）ＤＮＡ増幅の確認
病原菌のＤＮＡの増幅評価は、目視により行った。その結果を図２に示す。図２に示す通り、アファノミセス・コクリオイデスから抽出したＤＮＡの反応液では、赤色から黄色に変色（黄色に呈色）したのに対し（図２の右側）、ネガティブコントロールでは、反応液の色調の変化がなく赤色であった（赤色に呈色；図２の左側）。これより、ポジティブコントロールでのみＤＮＡの増幅反応が生じたことが示された。

〔実施例２〕腐敗テンサイ根を使用した従来の検出方法（アファノミセス選択分離培地による培養物の検鏡による検出法）との検出感度の比較
腐敗テンサイ根３５個体を使用して、アファノミセス選択分離培地を用いた検出方法（以下、「従来法」という。）と、実施例１のＬＡＭＰ法を用いた検出方法（以下、単に「ＬＡＭＰ法」という。）との検出感度を比較した。

従来法は、次の手順より行った。腐敗したテンサイ根の黒変部と健全部の境界部分を切り出し、流水と滅菌水で洗浄した。滅菌ろ紙を用いて組織片の水分を十分に取り除いた後、アファノミセス選択分離培地（ＣＭＡ培地（コーンミール寒天培地））に、殺菌剤としてメタラキシル（フェニルアミド殺菌剤）、チオファネートメチル（メチルベンゾイミダゾールカーバメート殺菌剤）、イプロジオン（ジカルボキシイミド殺菌剤）、クロラムフェニコールを所定量加えた培地）に置床した。４～７日後に菌叢が生えた培地の培養物をＣＭＡ培地に移して培養後、検鏡して同定した。従来法とＬＡＭＰ法の結果を下掲の表３に示す。

［表３］

上掲の表３に示すように、従来法では、３５個体中５個体がテンサイ黒根病と判定された。一方、ＬＡＭＰ法では、３５個体中８個体がテンサイ黒根病と判定された。従来法で陽性と判定された個体が、ＬＡＭＰ法で陰性判定となることはなかった。また、検診にかかる時間は、従来法では早くとも１週間以上を要していたのに対し、ＬＡＭＰ法では１～２日で完了した。

以上の結果から、腐敗症状を呈したテンサイ根からＤＮＡを抽出し、ＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ法を行うことで、従来法と比較して精度よく、迅速にテンサイ黒根病の検診を行うことができると示唆された。

〔実施例３〕ＬＡＭＰプライマーによる他の菌体の検出
ＬＡＭＰ法を用いて、アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）の近縁種である、アファノミセス・クラドガムス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｌａｄｏｇａｍｕｓ）由来の核酸、アファノミセス・コクリオイデスの近縁種である、アファノミセス・エウテイケス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｅｕｔｅｉｃｈｅｓ）由来の核酸、テンサイ黒根病と原因菌の種類が全く異なるにもかかわらず、病徴のみから判別することが困難なテンサイ根腐病の原因菌であるリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸、同リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸、及び、その他のリゾクトニア・ソラニ（ＡＧ１，ＡＧ２－１，ＡＧ３，ＡＧ４及びＡＧ５）由来の核酸について、増幅が可能であるか否かの検討を行った。その手順は実施例１（１）～（４）に従った。その結果を下掲の表４に示す。

［表４］

上掲の表４に示すように、実施例１（１）で設計したプライマーセット、すなわち本発明に係るプライマーセットは、アファノミセス・コクリオイデスの近縁種である、アファノミセス・クラドガムス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｌａｄｏｇａｍｕｓ）由来の核酸、テンサイ根腐病の原因菌であるリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸、及び、その他のリゾクトニア・ソラニ（ＡＧ１，ＡＧ２－１，ＡＧ３，ＡＧ４及びＡＧ５）由来の核酸のいずれも、増幅しないことが明らかとなった。一方、アファノミセス・コクリオイデスの近縁種である、アファノミセス・エウテイケス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｅｕｔｅｉｃｈｅｓ）由来の核酸については、非特異的な核酸増幅が確認されたものの、アファノミセス・コクリオイデスの核酸増幅反応と比較して、核酸増幅が進んでおらず、また、反応液の変色の程度も小さいことから、本発明に係るプライマーセットは、例外として、アファノミセス・コクリオイデスの近縁種である、アファノミセス・エウテイケス由来の核酸を非特異的に増幅することが明らかとなった。

Claims

ＬＡＭＰ法により、アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含むプライマーセット；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。
前記ポリヌクレオチドがアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域に由来する、請求項１に記載のプライマーセット。
リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を増幅しない、請求項１または請求項２に記載のプライマーセット。
アファノミセス・クラドガムス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｌａｄｏｇａｍｕｓ）由来の核酸を増幅しない、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、テンサイ黒根病の検診キット。
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のプライマーセット及び請求項５に記載の検診キットの少なくともいずれかを用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）を検出する工程を含む、テンサイ黒根病の検診方法。