JP7828635B2

JP7828635B2 - 特定の波長域を有する光を照射して栽培したワレモコウの抽出物を含有する皮膚外用剤及び内用剤

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Publication number: JP7828635B2
Application number: JP2022033066A
Authority: JP
Inventors: 真緒瀬岡; 宏行山羽; 勉坂井田
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2022-03-04
Filing date: 2022-03-04
Publication date: 2026-03-12
Anticipated expiration: 2042-03-04
Also published as: JP2023128614A

Description

本発明は、特定の波長域を有する１種又は２種の光を照射して栽培した、メラニン生成抑制効果、ＭＭＰ阻害効果（ＭＭＰ産生抑制効果）、ヒアルロン酸産生促進効果、細胞増殖促進効果、抗酸化効果等に優れた新規なワレモコウ及び／又はその抽出物を含有する皮膚外用剤及び内用剤に関する。

一般に、シミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。従来、色素沈着の治療には、内用や外用において、アスコルビン酸（ビタミンＣ）等が美白剤として用いられてきた（特許文献１）。

また、皮膚は紫外線の他、乾燥、寒冷、熱、薬物等の様々な物理的及び化学的ストレスに日々曝されている。その結果、皮膚の機能低下が引き起こされ、様々な皮膚の老化現象が顕在化する。皮膚の老化現象の一つにシワがある。シワには、表皮性のシワと、真皮性のシワの２種類が存在することが知られている。表皮性のシワは小ジワと呼ばれ、皮膚の乾燥により、表皮角質中の水分量が低下することによって一時的に生じるシワである。一方、真皮性のシワは、太陽光線に含まれる紫外線や加齢によって形成されるシワである。その形成メカニズムとしては、紫外線や加齢による真皮線維芽細胞におけるコラーゲン合成能の低下や、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の増加によるコラーゲンの分解促進が挙げられる。

乾燥に起因する表皮性のシワと真皮性のシワでは、組織学的形態、発症メカニズム、治療方法が異なり、紫外線や加齢により生じる真皮性のシワは、保湿効果を有する化粧品の使用によって改善することは困難である。

これまでに、紫外線によって生じる真皮性のシワを改善することを目的として、加水分解アーモンドを有効成分とする皮膚のシワ形成防止・改善剤（特許文献２）、ジョチョウケイ、テンキシ及びキセンソウの抽出物を有効成分とする紫外線照射に起因するシワの改善剤（特許文献３）が報告されている。

また、コラーゲンは、哺乳動物組織の約１／３を占める主要な構造タンパク質であり、軟骨、骨、腱、及び皮膚等の、多くのマトリックス組織の必須な成分である。ＭＭＰに属するコラゲナーゼ（ＭＭＰ１）により一箇所を切断されると、通常の組織内では安定なコラーゲン分子は、変性して一本鎖のゼラチンとなり、他の様々なプロテアーゼにより分解されるようになる。その結果、マトリックス組織の構造の完全性が失われてしまう。

コラゲナーゼの阻害活性を有する素材として、例えば、カカオ豆皮であるカカオハスク抽出物（特許文献４）、バラ科オニイチゴ抽出物（特許文献５）、ラクトフェリン（特許文献６）等が提案されている。皮膚老化や口腔衛生にますます関心が高まっている状況下で、副作用がなく、安全性が高い、コラゲナーゼ活性阻害作用の優れた素材を見出すことが求められている。

ＭＭＰに属するゼラチナーゼ（ＭＭＰ２）は、線維芽細胞や内皮細胞、ガン細胞等が産生する酵素であり、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン（動脈、腱、皮膚等の弾性組織の特殊成分をなす構造タンパク質）等の基質を分解する。従って、ゼラチナーゼに対して阻害活性を有する物質は、ガン組織における血管新生やガンの転移を抑制する効果が期待され、ガン疾患の予防、治療に有用であると考えられる。さらにＭＭＰの阻害はガン疾患のみならず、潰瘍形成、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、歯周炎等、ＭＭＰの亢進が原因で起こる各種疾患の予防、治療及び改善に有用である。

また、線維芽細胞はコラーゲン等のタンパク質及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカンを産生して真皮結合組織を形成し、皮膚のハリを保っている。この結合組織が収縮力を失い、更に弾性力を失う結果として、皮膚のシワやたるみが発生すると考えられている。

特にヒアルロン酸は結合組織に広く分布する高分子多糖体として知られており、真皮中でゲル状の形態を呈し、肌の弾力を維持している。従って、ヒアルロン酸の変質や減少が皮膚老化において重要であると考えられている。また、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを含有した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題があった。そこで、これまで、線維芽細胞を活性化することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進させることができる皮膚外用剤が模索されてきた（特許文献７）。

また、ヒアルロン酸は関節にも存在しており、関節の荷重の衝撃を和らげたり、関節の動きを滑らかにしたりする機能を果たしていることが知られている。通常、ヒトの関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍＬであるが、慢性関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬと低下し、同時に関節液の粘度も著しく低下する（非特許文献１）。また、化膿性関節炎や痛風性関節炎等でも、慢性関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている（非特許文献２）。上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆・保護、疼痛抑制及び病的関節液の改善のために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが考えられる。例えば、慢性関節リウマチの患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入法を行うと、上記の症状の改善が認められることが知られている（非特許文献３）。しかしながら、上記疾患の治療は長期に渡る。従って、日常生活の中で手軽に予防や治療等ができるように、ヒアルロン酸産生促進剤を含有させた皮膚外用剤や食品、医薬品が望まれている。

飛蚊症とは、視界内に糸くずや蚊のように見える薄い影が現れる症状で、目の内部を満たす硝子体内の混濁が網膜上に影を落とすことで発生する。飛蚊症は大きく２種類に分けることができ、加齢や紫外線、活性酸素等の影響で発症する生理的飛蚊症と、網膜剥離、網膜裂孔、硝子体出血、ぶどう膜炎等の疾患の一症状として現れる病的飛蚊症がある。生理的飛蚊症は、硝子体の主要成分であるヒアルロン酸の減少による液状化と、それに伴うコラーゲン線維の分解で硝子体内が混濁することで生じる。治療法として、硝子体切除手術やレーザー治療があるが、これらの施術は安全性の観点から日本ではあまり行われていないという実情があり、海外で治療を行うには多額の費用が必要となる。そのため、生理的飛蚊症を予防改善するためには日常的に利用可能なヒアルロン酸産生促進剤を含有させた食品や医薬品が望まれている。

一般に、加齢と共に表皮細胞の増殖・分裂能は低下し、表皮層自体は薄くなる（非特許文献４）。生体因子であるＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ／上皮細胞成長因子）や女性ホルモン（エストロゲン）は皮膚の表皮細胞増殖に働きかけるが、加齢と共にその分泌は低下する。このような加齢による表皮細胞代謝機能の低下は皮膚のターンオーバー速度を遅らせ、肌荒れや皮膚の老化の原因となる。また、角層表面から剥がれ落ちる角層細胞が滞留することで、表皮内のメラニンの排泄がスムーズに行われなくなり、色素沈着や肌のくすみの原因となる。さらに表皮の創傷治癒が遅くなること等も知られている。これらの現象の進行を防止あるいは改善するために、表皮細胞の増殖を促進させる成分の探索や、皮膚外用剤の提案が多くなされてきた。

また、皮膚は生体の最外層に位置し、紫外線等の影響により活性酸素が発生しやすい臓器であり、絶えずその酸素ストレスに曝されている。一方、皮膚細胞内には活性酸素消去酵素が存在しており、その能力を超える活性酸素が発生しない限り活性酸素の傷害から皮膚細胞を防衛している。ところが、皮膚細胞内の活性酸素消去酵素の活性は加齢と共に低下することが知られており、活性酸素による傷害がその防御反応を凌駕したとき、皮膚は酸化され、細胞機能が劣化して老化が進行すると考えられる。また、皮膚以外の臓器においても、その活性酸素消去能を超える活性酸素に曝されたとき、機能低下が起こり老化したり、ガンや心筋梗塞等様々な生活習慣病が発症したりすると考えられる。そこで、活性酸素による傷害からの防御を目的として活性酸素消去剤や抗酸化剤が検討され、ＳＯＤやカタラーゼ等の活性酸素消去酵素、ＳＯＤ様活性物質等の活性酸素消去剤や抗酸化剤を含有した食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等が開発されている（特許文献８、９）。

ワレモコウ（学名：Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）は、バラ科ワレモコウ属に属する多年生草本である。ワレモコウの公知文献としては、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害効果（特許文献１０）及び抗酸化効果（特許文献１１）等が知られている。

一方で、植物の栽培方法によって植物の薬効を高める方法として、植物体内のビタミンやポリフェノール、ルチン等の機能性物質を特徴的に増加させる方法は、既に特許文献で報告されている。特許文献１２には、大豆もやしに近紫外～青色領域波長の光を照射することにより、含有ビタミンＡ、ビタミンＥを増量させる方法が開示されており、特許文献１３には、小松菜に対して、人工紫外線照射を１日５分間行うことで、機能性物質であるα－トコフェロールやビタミンＣを増加させる栽培方法が開示され、特許文献１４には、人工光の青色光、赤色光及び遠赤色光の強度を調整することにより、小松菜、レタスのビタミンＣやビタミンＡを増加させる方法が開示されている。

特開平５－２２９９３１号公報特開２０００－１１９１２５号公報特開２００６－１９９６１１号公報特開平３－４４３３１号公報特開２００３－１３７８０１号公報特開平５－１８６３６８号公報特開２００７－１９２４号公報特開平９－１１８６３０号公報特開平９－２０８４８４号公報特開２００１－２６９３９８公報特開２００６－１０４１１７公報特開平１１－１０３６８０号公報特開２００４－３０５０４０号公報特開平８－２０５６７７号公報

"ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ"，ｖｏｌ．１０，ｐｐ３５７，１９６７「結合組成」、金原出版、４８１項、１９８４年「炎症」、日本炎症学会、１１巻、１６項、１９９１年ＶａｒａｎｉＪｅｔａｌ．，ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ，Ｖｏｌ．３，ｐｐ５７－６０，１９９８

本発明は、安全で安定性に優れ、メラニン生成抑制作用、ＭＭＰ阻害作用、ヒアルロン酸産生促進作用、細胞増殖促進作用及び抗酸化作用に優れた新規な皮膚外用剤又は内用剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、この問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、特定の波長域を有する１種又は２種の人工光を照射して栽培したワレモコウの抽出物の、メラニン生成抑制作用、ＭＭＰ阻害作用、ヒアルロン酸産生促進作用、細胞増殖促進作用及び抗酸化作用が優れていることを発見し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、以下の（１）～（３）からなる。
（１）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、４：１～２：１の人工光を照射して栽培することによって、太陽光で栽培したワレモコウと比較して、メラニン生成抑制効果、ＭＭＰ阻害効果、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果及び細胞増殖促進効果から選ばれる１種又は２種以上の効果を高めたワレモコウの抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
（２）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、４：１～２：１の人工光を照射して栽培することによって、太陽光で栽培したワレモコウと比較して、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果を高めたワレモコウの抽出物を含有することを特徴とする皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進用皮膚外用剤。
（３）波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、４：１～２：１の人工光を照射して栽培することによって、太陽光で栽培したワレモコウと比較して、メラニン生成抑制効果、ＭＭＰ阻害効果、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果及び細胞増殖促進効果から選ばれる１種又は２種以上の効果を高めることを特徴とするワレモコウの栽培方法。

本発明のワレモコウ又はその抽出物は、優れたメラニン生成抑制効果（美白効果）、ＭＭＰ阻害効果、ヒアルロン酸産生促進効果、細胞増殖促進効果及び抗酸化効果を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品及び食品の分野において貢献できるものである。

本発明に用いるワレモコウ（学名：Ｓａｎｇｕｉｓｏｒｂａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）は、別名でグレートバーネットと呼ばれ、バラ科ワレモコウ属に属する多年生草本である。耐寒性及び耐暑性があり、寒帯から温帯にかけて広く生息し、日本の山野等でみられる。本発明において、ワレモコウの抽出物は、その花、種子、葉、茎、根茎、根等の植物体の一部又は植物体全体（全草）、あるいはそれらの混合物の抽出物をいうが、本発明において抽出原料として使用する部位は、葉、茎、根茎及び根が好ましい。また、抽出には、植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行っても良い。

栽培方法としては、土を用いた栽培や水耕栽培で行うことができる。水耕栽培で行う場合には、種子を播種後、出根した状態、又は苗の状態で、水耕栽培に供することができる。栽培は、温度、光、二酸化炭素濃度が制御された施設で栽培することが好ましい。栽培温度は、１５～３０℃、好ましくは２０～２５℃である。栽培期間は、照射する条件によって異なるが、概ね１０～３０日で収穫できる。これ以上の期間で栽培することも可能である。

光源は、植物の栽培施設で用いる光源等を使用することができ、中でもＬＥＤ等の人工光が最も好ましい。人工光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザーダイオード等の光半導体素子が挙げられるが、特定の範囲の波長域が選択的に照射できる光源であれば良い。

ワレモコウの栽培において、照射する波長としては、波長域４００～５１５ｎｍの青色光、５７０～７３０ｎｍの赤色光であることが好ましく、波長域４３０～４６０ｎｍ、６３０～６８０ｎｍの光がさらに好ましい。これらの光は、同時に照射することが最も好ましい。このときの波長は、照射スペクトルの極大波長（ピーク波長）のことをいう。このような波長のピークを有する光源であれば、独自に作製したものや市販のものを使用することもできる。また、上記波長を選択的に照射できるように、光学フィルタを用いても良い。上記の２種の範囲の光に加え、太陽光や蛍光灯等の光源も使用することもできる。

照射する光量としては、光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）として表される。発光体を２種組み合わせて照射する場合には、その合計の光量を意味する。その光量は、発芽後は１０～３００μｍｏｌ・ｍ^－２ｓ^－１が好ましく、５０～２００μｍｏｌ・ｍ^－２ｓ^－１がさらに好ましい。この範囲外の光強度の場合は、生育障害、生育不良になる場合がある。照射は、ワレモコウの上部１０～５０ｃｍの位置から照射することが好ましい。照射時間は、植物の特性や目的に応じて適宜変更できるが、１日当たり６時間以上が好ましく、１２～２４時間がより好ましい。

赤色と青色の光量比においては、それぞれのＰＰＦＤの比を意味しており、収量や有効性等目的に応じて選択が可能である。

中でも、植物体の収量を高めるには、赤色と青色の光量比が８：１～２：１が好ましく、その中でも特に、赤色と青色の光量比が４：１～２：１に高い収量が得られた。

メラニン生成抑制作用においては、赤色と青色の光量比が８：１～１：１が効果の面で好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が３：１が最も好ましい。

ＭＭＰ１ｍＲＮＡ発現抑制作用においては、赤色と青色の光量比が８：１～１：１が効果の面で好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が３：１が最も好ましい。

ＭＭＰ２ｍＲＮＡ発現抑制作用においては、赤色と青色の光量比が８：１～１：１が効果の面で好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が３：１が最も好ましい。

ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）ｍＲＮＡ発現促進作用においては、赤色と青色の光量比が８：１～１：１が効果の面で好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が３：１が最も好ましい。また、太陽光で栽培した場合も効果が高く、好ましい。

細胞増殖促進作用においては、赤色と青色の光量比が８：１～２：１が効果の面で好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が３：１が最も好ましい。

活性酸素消去作用（フリーラジカル捕捉除去作用）においては、赤色と青色の光量比が８：１～１：１が効果の面で好ましい。その中でも特に、赤色と青色の光量比が３：１が最も好ましい。

以上のことを総じていえば、赤色と青色の光量比が８：１～１：１が好ましく、４：１～２：１がより好ましく、３：１が最も好ましい。

また、本願発明では、前記の人工光ではなく、太陽光等の自然光を用いて栽培することで、新規なヒアルロン酸産生促進剤を提供できる。この時の栽培方法としては、周知の方法を利用できる。

抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、又は水と有機溶媒の混合溶媒を用い、撹拌又はカラム抽出する方法等により行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良い。特に好ましい抽出溶媒としては、水、水－エタノールの混合極性溶媒又は水－１，３－ブチレングリコールの混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えばワレモコウの植物体（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であれば良いが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類や抽出時の圧力等によって適宜選択できる。

上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良いが、必要に応じて、本発明の効果を奏する範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いても良い。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。

本発明は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていても良い。

本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。

外用の場合、本発明に用いる上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。更に、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を超えると、効果の増強は認められにくく不経済である。

内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。更に、２０ｍｇ～２ｇが最も好ましい。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、実験例及び処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。製造例と処方例に示す％とは、重量％を示す。

（１）実験材料及び生育条件
市販のワレモコウの苗から土を除去したのち、根茎の塊を約１ｃｍ程度の小片に切断し、それを１片ずつスポンジに包み、水耕栽培装置を用いて、室温が２４時間２１～２５℃になるよう設定し、植物の真上３０ｃｍの位置から、赤色ＬＥＤ（ピーク波長６６０ｎｍ）及び青色ＬＥＤ（ピーク波長４５０ｎｍ）を同時に照射し、赤色と青色ＬＥＤの合計光合成光量子束密度が１００μ ｍｏｌ・ｍ^－２ｓ^－１となるように、赤色と青色の光量比を４：１～２：１にして、栽培を行った。尚、栽培中は光量比を変えなかった。また、比較例として太陽光下で栽培を行った。いずれも４週間栽培した後、収穫し、約６０℃で温風乾燥させることで、ワレモコウの乾燥物を得た（表１）。

（２）ワレモコウの抽出物の製造例
ワレモコウの抽出物を以下の通り製造した。製造例１Ａ～４Ａにおいて、抽出材料には赤色：青色＝２：１の比で栽培したワレモコウの全草を用いた。

（製造例１Ａ）ワレモコウの熱水抽出物の調製
ワレモコウの乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してワレモコウの熱水抽出物を１．６ｇ得た。

（製造例２Ａ）ワレモコウの５０％エタノール抽出物の調製
ワレモコウの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してワレモコウの５０％エタノール抽出物を１．１ｇ得た。

（製造例３Ａ）ワレモコウのエタノール抽出物の調製
ワレモコウの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してワレモコウのエタノール抽出物を０．４５ｇ得た。

（製造例４Ａ）ワレモコウの１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
ワレモコウの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し、抽出を行った。得られた抽出液を濾過して、ワレモコウの１，３－ブチレングリコール抽出物を１９２ｇ得た。

上記と同様に、赤色と青色ＬＥＤの合計光合成光量子束密度が１００μｍｏｌ・ｍ^－２ｓ^－１となるように、赤色と青色の光量比を変化させて栽培したワレモコウ及び太陽光で栽培したワレモコウを用い、上記の製造例１Ａ～４Ａと同様に抽出し、製造例１Ｂ～４Ｂ、１Ｃ～４Ｃ、製造例Ｐ～Ｓとした（表２）。

（処方例１）化粧水１
処方含有量（％）
１．ワレモコウの熱水抽出物（製造例１Ａ）２．０
２．１，３－ブチレングリコール８．０
３．グリセリン２．０
４．キサンタンガム０．０２
５．クエン酸０．０１
６．クエン酸ナトリウム０．１
７．エタノール５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）０．１
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

（処方例２）化粧水２
処方例１において、ワレモコウの熱水抽出物（製造例１Ａ）をワレモコウの熱水抽出物（製造例Ｐ）に置き換えたものを、化粧水２とした。

（比較処方例１）従来の化粧水
処方例１において、ワレモコウの熱水抽出物（製造例１Ａ）を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。

（処方例３）クリーム１
処方含有量（％）
１．ワレモコウの５０％エタノール抽出物（製造例２Ｂ）１．０
２．スクワラン５．５
３．オリーブ油３．０
４．ステアリン酸２．０
５．ミツロウ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ベヘニルアルコール１．５
９．モノステアリン酸グリセリン２．５
１０．香料０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１２．１，３－ブチレングリコール８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例４）クリーム２
処方例３において、ワレモコウの５０％エタノール抽出物（製造例２Ｂ）をワレモコウの５０％エタノール抽出物（製造例Ｑ）に置き換えたものを、クリーム２とした。

（比較処方例２）従来のクリーム
処方例３において、ワレモコウの５０％エタノール抽出物（製造例２Ｂ）を精製水に置き換えたものを、従来のクリームとした。

（処方例５）乳液
処方含有量（％）
１．ワレモコウのエタノール抽出物（製造例３Ｃ）０．０１
２．スクワラン５．０
３．オリーブ油５．０
４．ホホバ油５．０
５．セタノール１．５
６．モノステアリン酸グリセリン２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
９．香料０．１
１０．プロピレングリコール１．０
１１．グリセリン２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、さらに３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例６）ゲル剤
処方含有量（％）
１．ワレモコウの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４Ａ）１．０
２．エタノール５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）０．１
５．香料適量
６．１，３－ブチレングリコール５．０
７．グリセリン５．０
８．キサンタンガム０．１
９．カルボキシビニルポリマー０．２
１０．水酸化カリウム０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

（処方例７）パック
処方含有量（％）
１．ワレモコウの熱水抽出物（製造例１Ｃ）１．０
２．ワレモコウの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４Ｂ）５．０
３．ポリビニルアルコール１２．０
４．エタノール５．０
５．１，３－ブチレングリコール８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）０．５
８．クエン酸０．１
９．クエン酸ナトリウム０．３
１０．香料適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１１を均一に溶解し製品とする。

（処方例８）ファンデーション
処方含有量（％）
１．ワレモコウの５０％エタノール抽出物（製造例２Ｃ）１．０
２．ステアリン酸２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）１．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）２．０
５．セタノール１．０
６．液状ラノリン２．０
７．流動パラフィン３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム０．１
１０．ベントナイト０．５
１１．プロピレングリコール４．０
１２．トリエタノールアミン１．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル０．２
１４．二酸化チタン８．０
１５．タルク４．０
１６．ベンガラ１．０
１７．黄酸化鉄２．０
１８．香料適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例９）浴用剤
処方含有量（％）
１．ワレモコウのエタノール抽出物（製造例３Ａ）１．０
２．炭酸水素ナトリウム５０．０
３．黄色２０２号（１）適量
４．香料適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。

（処方例１０）軟膏
処方含有量（％）
１．ワレモコウの熱水抽出物（製造例１Ｂ）５．０
２．ワレモコウの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４Ｃ）１．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）２．０
４．モノステアリン酸グリセリン１０．０
５．流動パラフィン５．０
６．セタノール６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル０．１
８．プロピレングリコール１０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３～６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７～９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。

（処方例１１）散剤
処方含有量（％）
１．ワレモコウの熱水抽出物（製造例１Ｃ）１．０
２．乾燥コーンスターチ３９．０
３．微結晶セルロース６０．０
［製造方法］成分１～３を混合し、散剤とする。

（処方例１２）錠剤
処方含有量（％）
１．ワレモコウのエタノール抽出物（製造例３Ｂ）５．０
２．乾燥コーンスターチ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム２０．０
４．微結晶セルロース４０．０
５．ポリビニルピロリドン７．０
６．タルク３．０
［製造方法］成分１～４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

（処方例１３）錠菓
処方含有量（％）
１．ワレモコウのエタノール抽出物（製造例３Ａ）２．０
２．乾燥コーンスターチ４９．８
３．エリスリトール４０．０
４．クエン酸５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル３．０
６．香料０．１
７．精製水０．１
［製造方法］成分１～４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

（処方例１４）飲料
処方含有量（％）
１．ワレモコウの熱水抽出物（製造例１Ｂ）０．０５
２．ステビア０．０５
３．リンゴ酸５．０
４．香料０．１
５．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～３を少量の水に溶解する。次いで、成分４及び５を加えて混合する。

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。

実験例１Ｂ１６マウスメラノーマを用いたメラニン生成抑制試験
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞をφ６０ｍｍｄｉｓｈに３×１０^４個播種し、各試料を最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加した１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて５日間培養した。培養後、細胞の剥離を行い、遠心操作をして得られたペレットを超音波破砕操作によりＰＢＳ（－）に溶解させた。タンパク質定量は、Ｌｏｗｒｙ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５－２７５，１９５１）を用いて行った。また、メラニン量を測定する場合、タンパク質定量用に取った残りの細胞破砕液に４ＮＮａＯＨを加え、６０℃にて２時間加温した後、分光光度計（島津製作所）を用いて４７５ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線からメラニン量を求め、タンパク質１ｍｇ当たりのメラニン量を算出した。メラニン生成抑制率は、コントロール（試料未添加）群に対する試料添加群のメラニン量の減少量の割合から算出した。

これらの実験結果を表３に示した。その結果、本発明の特定の波長域を有する人工光を照射して栽培したワレモコウの抽出物は、優れたメラニン生成抑制効果を有していることが認められた。特に、赤色と青色の光量比が３：１のワレモコウ抽出物に製造例Ｐ～Ｓよりも高い効果が認められた。尚、他の抽出方法で得られた本発明のワレモコウの抽出物（製造例１Ａ～４Ｃ）も同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べ高い効果が認められた。また、他の光量比（赤色：青色＝８：１～１：１）で栽培した本発明のワレモコウの抽出物においても、赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べて高い効果が認められた。

実験例２ＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）ｍＲＮＡ発現量の測定
ＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ヒト皮膚線維芽細胞を６０ｍｍｄｉｓｈに１×１０^５個播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、各試料を最終濃度１及び１０μｇ／ｍＬとなるように添加したＤＭＥＭ（－）培養液にて２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２及びＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ－ａｃｔｉｎｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＭＭＰ１発現抑制率は、コントロール（試料未添加）群のＭＭＰ１ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のＭＭＰ１ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。ＭＭＰ２ｍＲＮＡ発現抑制率及びＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進率についても、同様に算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。

ＭＭＰ１用のプライマーセット
ＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣ（配列番号１）
ＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣ（配列番号２）
ＭＭＰ２用のプライマーセット
ＣＣＧＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡ（配列番号３）
ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴ（配列番号４）
ＨＡＳ２用のプライマーセット
ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＴＡ（配列番号５）
ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ（配列番号６）
β－ａｃｔｉｎ用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号７）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号８）

これらの実験結果を表４～６に示した。その結果、本発明の特定の波長域を有する人工光を照射して栽培したワレモコウの抽出物には、ＭＭＰ１ｍＲＮＡ発現抑制効果（ＭＭＰ１阻害作用）及びＭＭＰ２ｍＲＮＡ発現抑制効果（ＭＭＰ２阻害作用）において、優れた効果が認められた。特に、赤色と青色の光量比が３：１のワレモコウ抽出物において、製造例Ｐ～Ｓよりも高い効果が認められた。尚、他の抽出方法で得られた本発明のワレモコウの抽出物（製造例１Ａ～４Ｃ）においても、赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べ高い効果が認められた。また、他の光量比（赤色：青色＝８：１～１：１）で栽培した本発明のワレモコウの抽出物においても、赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べて高い効果が認められた。ＨＡＳ２ｍＲＮＡ発現促進効果（ヒアルロン酸産生促進作用）は、本発明のワレモコウ抽出物において優れた効果を示した。特に、太陽光及び赤色と青色の光量比が３：１のワレモコウ抽出物に極めて高い効果が認められた。尚、他の抽出方法で得られた本発明のワレモコウの抽出物（製造例１Ａ～４Ｃ、製造例Ｑ～Ｓ）においても同様に、高い効果が認められた。また、他の光量比（赤色：青色＝８：１～１：１）で栽培した本発明のワレモコウの抽出物においても、太陽光及び赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、高い効果が認められた。

実験例３細胞増殖促進試験
ヒト由来ケラチノサイトを、０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１×１０^３個播種し、各試料を最終濃度が０．０１μｇ／ｍＬとなるように添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下にて５日間培養した。細胞数の測定は、染色法により行った。即ち、培養終了後、培養液を除き、メタノールを用いて細胞を固定した。続いて、０．１％メチレンブルーを加え、１時間細胞の染色を行った。乾燥させた後、０．１ＮＨＣｌを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ加えてよく撹拌させ、マイクロプレートリーダーを用いて６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞増殖率は、コントロール（試料未添加）群の細胞量に対する試料添加群の細胞量の比率として算出した。

これらの実験結果を表７に示した。その結果、本発明の特定の波長域を有する人工光を照射して栽培したワレモコウは優れた細胞増殖促進効果を示した。特に、赤色と青色の光量比が３：１のワレモコウ抽出物に製造例Ｐ～Ｓよりも高い効果が認められた。尚、他の抽出方法で得られた本発明のワレモコウの抽出物（製造例１Ａ～４Ｃ）においても、赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べ高い効果が認められた。また、他の光量比（赤色：青色＝８：１～１：１）で栽培した本発明のワレモコウの抽出物においても、赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べて高い効果が認められた。

実験例４活性酸素消去作用
Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）様活性をＳＯＤＡｓｓａｙＫｉｔ－ＷＳＴ（同仁化学研究所）を用い、９６ウェルプレートにて測定した。試薬は、キットに付属のものを用いた。各ウェルに、試料液２０μＬを加えた後、ＷＳＴｗｏｒｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ加え、プレートミキサーでよく撹拌した。ブランクのウェルにはＤｉｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒを２０μＬ加えた。試料液を加えたウェルとブランクのウェルに、それぞれＥｎｚｙｍｅｗｏｒｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎを２０μＬ加えた。その後、３７℃で２０分間インキュベートし、プレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定することで、各抽出液の活性酸素消去率を求めた。試料の終濃度は、３．３３μｇ／ｍｇで行った。

これらの試験結果を表８に示した。本発明の特定の波長域を有する人工光を照射して栽培したワレモコウ抽出物は、安定で優れたフリーラジカル捕捉除去作用（抗酸化作用）を有していることが認められた。特に、赤色と青色の光量比が３：１のワレモコウ抽出物に製造例Ｐ～Ｓよりも高い効果が認められた。尚、他の抽出方法で得られた本発明のワレモコウの抽出物（製造例１Ａ～４Ｃ）においても、赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べ高い効果が認められた。また、他の光量比（赤色：青色＝８：１～１：１）で栽培した本発明のワレモコウの抽出物においても、赤色：青色の光量比が３：１の抽出物と同様に、製造例Ｐ～Ｓに比べて高い効果が認められた。

実験例５使用試験
処方例３のクリーム１、処方例４のクリーム２及び比較処方例２の従来のクリームを用いて、シワ、たるみがある５人（２５～６６歳）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シワ、たるみの程度をアンケートにより判定した。

その結果、本発明の抽出物を含有するクリームにより、シワ、たるみが軽減した。尚、試験期間中、皮膚トラブルは１人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。

また、処方例１の化粧水１、処方例２の化粧水２及び比較処方例１の従来の化粧水を用い、同様に使用試験を行った。その結果、本発明の抽出物を含有する化粧水により、シワ、たるみの軽減が認められた。

以上のことから、本発明のワレモコウの抽出物は、優れたメラニン生成抑制作用、ＭＭＰ阻害作用、ヒアルロン酸産生促進作用、細胞増殖促進作用及び抗酸化作用を有し、安定性にも優れていた。よって、本発明のワレモコウの抽出物は、皮膚の老化といった美容分野だけではなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療等といった医療分野にも利用でき、化粧品、食品、医薬部外品及び医薬品への応用が期待される。

Claims

波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、４：１～２：１の人工光を照射して栽培することによって、太陽光で栽培したワレモコウと比較して、メラニン生成抑制効果、ＭＭＰ阻害効果、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果及び細胞増殖促進効果から選ばれる１種又は２種以上の効果を高めたワレモコウの抽出物を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、４：１～２：１の人工光を照射して栽培することによって、太陽光で栽培したワレモコウと比較して、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果を高めたワレモコウの抽出物を含有することを特徴とする皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進用皮膚外用剤。
波長域５７０～７３０ｎｍと４００～５１５ｎｍとの光合成光量子束密度（ＰＰＦＤ）比が、４：１～２：１の人工光を照射して栽培することによって、太陽光で栽培したワレモコウと比較して、メラニン生成抑制効果、ＭＭＰ阻害効果、皮膚線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果及び細胞増殖促進効果から選ばれる１種又は２種以上の効果を高めることを特徴とするワレモコウの栽培方法。