JP7828292B2 - マイクロプラスチックの分析方法、その分析装置、マイクロプラスチック検出装置及びマイクロプラスチック検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、ラマン散乱光を利用したマイクロプラスチックの分析方法等に関するものである。

非特許文献１に記載されているように、マイクロプラスチックの定性分析には、ラマン分光法を用いることができる。ラマン分光法による測定は、空間分解能が非常に高いため、例えば、マイクロプラスチックを含んだ海岸の砂を試料として、これをラマン顕微鏡等によってラマン分析すれば、１μｍ以下の微小マイクロプラスチックであっても検出し、その種類を特定することができる。

しかしながら、このような微小マイクロプラスチックは肉眼や通常の光学画像では極めて識別しにくく、その位置を特定できないため、試料全体をラマンでマッピング測定しなければならない。そのため、試料測定領域の面積によっては、数時間から数日という長い時間がかかってしまう場合がある。さらに、長時間に亘るレーザ照射により、それによる熱が蓄積し、マイクロプラスチックが焦げたり溶融したりするという問題も発生し得る。

Feature Article "マイクロプラスチックに関する日本でのHORIBAグループの活動" 著者 沼田 朋子、山内 進https://www.horiba.com/uploads/media/R54J_12_061_03.pdf

本発明は上述した課題を解決すべくなされたものであり、一定程度の面積を有する試料に含まれるマイクロプラスチックを、ラマン分光法を用いながら、短時間で分析できるようにすることをその主たる所期課題としたものである。

すなわち、本発明に係るマイクロプラスチックの分析方法は、試料中のマイクロプラスチックを蛍光体で染色し、該試料に蛍光用励起光を照射して前記蛍光体から出る蛍光を検出し、該蛍光によって当該試料におけるマイクロプラスチックの位置を特定し、特定した位置にラマン用励起光を照射してラマン散乱光を検出し、該ラマン散乱光に基づいて、当該位置のマイクロプラスチックを分析することを特徴とするものである。

このような方法によれば、蛍光によって、従来の光学的な画像や肉眼では検出できない５００ｎｍオーダーのマイクロプラスチックも検出できるので、試料中のマイクロプラスチックの位置をまず特定し、その特定された位置にのみラマン用励起光を照射して、そこにあるマイクロプラスチックの組成や種類などをラマン分析できる。

したがって、試料全体に亘ってのラマンによるマッピング測定等が不要となり、必要箇所だけのラマン分析を行えばよいので、試料中に含まれるマイクロプラスチックの組成や種類などを迅速に分析することができるようになる。

マイクロプラスチックの具体的な染色方法としては、前記蛍光体を所定の溶媒に溶かした染色液に試料を浸漬し、その後、マイクロプラスチック以外の成分に付着した蛍光体を取り去ることが可能な洗浄液で当該試料を洗浄することにより、試料中のマイクロプラスチックを蛍光染色することを挙げることができる。

短時間で強度の高い蛍光を発生させるためには、前記蛍光体がナイルレッドであり、前記溶媒がトルエンであることが好ましい。また、その場合に、試料中のマイクロプラスチック以外の物質から蛍光体を洗浄除去するためには、前記洗浄液としてエタノール、メタノールまたは水を用いることが好適である。

前記蛍光のみを確実に検出するには、該蛍光は透過させ、蛍光用励起光は遮断する光学フィルタを設けておけばよい。
前記ラマン用励起光の波長が、蛍光体を励起できない波長に設定されていれば、ラマン分析における蛍光の影響を排除できる。

また本発明は、蛍光体で染色したマイクロプラスチックの分析装置であって、前記マイクロプラスチックを含んだ試料に蛍光用励起光を照射して前記蛍光体から出る蛍光を検出し、該蛍光によって当該試料におけるマイクロプラスチックの位置を特定し、特定した位置にラマン用励起光を照射してラマン散乱光を検出し、該ラマン散乱光に基づいて、当該位置のマイクロプラスチックを分析することを特徴とするものでもよい。

ところで、海岸の土砂などのような環境的な試料を分析する場合、これを採取現場からラボに持ち帰ってマイクロプラスチックの有無やその物性等をさらに詳細に調べるのは、手間がかかる。特に、多数箇所での調査となると、多くの試料の搬送が必要となる。

これを解決するためには、試料を採取したその場で、マイクロプラスチックの有無が直ちに判別できるような簡易なキットがあれば好ましい。このような簡易キットがあれば、例えば、マイクロプラスチックの有無だけの調査であれば、現場だけで結果がわかるし、ラマン分光法などによるマイクロプラスチックの物性などをさらに調べたい場合でも、マイクロプラスチックが存在すると確認された試料だけを持ち帰ればよく、無駄な搬送の手間を省けるからである。

このような課題を解決するために、本発明は、蛍光体によって染色されたマイクロプラスチックを含む試料を載置するための試料載置部と、該試料載置部に載置された試料に蛍光用励起光を照射する第１光源と、前記蛍光用励起光を照射された試料を撮像可能な位置に携帯型カメラを保持するカメラ保持部と、前記カメラ保持部に保持された携帯型カメラの前段に配置された、前記蛍光は透過させるとともに前記蛍光用励起光は遮断する光学フィルタとを備えているマイクロプラスチック検出装置でもよい。

このようなものであれば、装置そのものを携帯可能にできるうえ、検出結果を画像として残したい場合は、例えば個人のカメラ付き携帯電話などをカメラ保持部に保持させればよいだけなので、試料中のマイクロプラスチックをその採取現場で簡易に検出することができる。

また、前記携帯型カメラに、画像に写ったマイクロプラスチックの占有面積等から試料中のマイクロプラスチックの含有割合を演算する演算部を搭載しておけば、より好ましい。画像データや前記含有割合を含むデータを他の機器の送信できるようにしてもよい。

また本発明のマイクロプラスチック検出方法は、蛍光体によって染色されたマイクロプラスチックを含む試料を所定の試料載置部に載置する試料載置ステップと、前記試料載置部に載置された試料に蛍光用励起光を照射する光照射ステップと、前記蛍光用励起光を照射された試料を撮像可能な位置に携帯型カメラを保持するカメラ保持ステップと、前記携帯型カメラの前段に、前記蛍光は透過させるとともに前記蛍光用励起光は遮断する光学フィルタを配置するする光学フィルタ配置ステップと、前記試料中のマイクロプラスチックから出る蛍光を前記カメラで撮像する撮像するステップとを含むことを特徴とする。
このような検出方法であれば、上記した本発明のマイクロプラスチック検出装置と同様の作用効果を奏し得る。

また当該マイクロプラスチック検出方法では、前記蛍光体を所定の溶媒に溶かした染色液に前記試料を浸漬し、その後、マイクロプラスチック以外の成分に付着した蛍光体を取り去ることが可能な洗浄液で当該試料を洗浄することにより、試料中のマイクロプラスチックを蛍光染色する染色ステップを更に含むのが好ましい。

本発明によれば一定程度の面積を有する試料に含まれるマイクロプラスチックを、ラマン分光法を用いながら、短時間で分析できるようになる。

本発明の一実施形態におけるラマン分光分析装置の全体模式図である。 同実施形態におけるマイクロプラスチックの染色工程を説明したフローチャートである。 同実施形態における試料中のマイクロプラスチックのラマン分析工程を説明したフローチャートである。 同実施形態における試料中のマイクロプラスチックのラマン分析工程を説明したフローチャートである。 同実施形態における各波長の励起光照射に対するナイルレッドの発光特性を示すグラフである。 本発明の他の実施形態におけるマイクロプラスチック検出装置の概略断面図である。 本発明の他の実施形態におけるマイクロプラスチック検出装置の概略斜視図である。

１００・・・ラマン分光分析装置（分析装置）
Ｗ・・・試料
６・・・ロングパスフィルタ
４２・・・ショートパスフィルタ

以下、本発明の一実施形態に係るラマン分光分析装置について、図面を参照して説明する。

図１は、本実施形態のラマン分光分析装置１００の全体構成を示した概要ブロック図である。
同図中、符号Ｗは試料を示している。この試料は、例えば海岸で採取された、マイクロプラスチックを含む砂である。この試料Ｗは、円形乃至矩形の薄いセルに入れられていてその表面である分析対象領域は一定程度の面積を有している。

符号１は、前記試料Ｗの表面にラマン用励起光を照射するラマン用光源を示している。ここでは、このラマン用光源１として単色レーザ光（波長が約７８５ｎｍ）を射出するレーザ光源を用いているが、これに限られるものではない。

符号２は、前記ラマン用励起光の照射によって発生するラマン散乱光を分光する分光器を示している。ここでは、分光器としてグレーティングを用いているが、これに限られるものではない。

符号３は、前記分光器が分光した各波長の光を検知し、検知した各波長の光強度に応じた値を有するラマン検知信号を出力する光検知器を示している。この光検知器３は、例えば、ＣＣＤや光電子増倍管などの光センサと、該光センサの出力信号に、例えばインピーダンス変換処理やデジタル化処理などを施して、前記ラマン検知信号を生成する信号変換器とを備えたものである。

符号４は、約５５０ｎｍを波長の上限とするブロードな蛍光用励起光を、前記試料Ｗ表面の分析対象領域全面に照射する蛍光用光源を示している。この蛍光用光源４は、ここでは、白色ＬＥＤ４１と、その白色ＬＥＤ４１の光路上に設けられて約５５０ｎｍ以下の波長の光を透過する光学フィルタ（ショートパスフィルタ４２）とから構成してある。なお、この蛍光用光源４の波長の上限は５５０ｎｍに限られず、４００ｎｍ～６００ｎｍの範囲にあればよい。また、蛍光用励起光は、またブロードな光のみならず、ＬＥＤなどからでる単波長の光でもよい。その場合は、光学フィルタは不要である。

符号５は、試料Ｗの分析対象領域を１回で撮像してその画像データを出力する二次元エリアセンサ（ここではＣＣＤカメラ５）を示している。このＣＣＤカメラ５の前段には、約６２５ｎｍ以上の波長の光を透過する光学フィルタ（ロングパスフィルタ６）が設置されている。なお、このロングパスフィルタ６は、６００ｎｍ～７００ｎｍ以上の波長の光を透過するものであればよい。

符号７は、試料Ｗに対するラマン用励起光の照射位置を相対的に移動させる移動機構たるＸＹＺステージ７を示している。このＸＹＺステージ７は、モータなどのアクチュエータ８によって水平ＸＹ方向に移動可能なものであり、その上には試料Ｗが収容されたセルが載置される。

符号９は、前記光検知器３から出力されるラマン検知信号を受信し、これを演算処理して試料の分析等を行う情報処理装置を示している。この情報処理装置９は、ＣＰＵ、メモリ、Ｉ／Ｏポートなどを有したいわゆるコンピュータであり、前記メモリに予め格納されたプログラムに従ってＣＰＵや周辺機器が協動することによって、前処理部９１、試料分析部９２、出力部９３等としての機能を発揮する。

前記前処理部９１は、前記光検知器３から波長ごとのラマン検知信号を受信し、それらの値、すなわち波長ごとの光強度を補間したり、ベースライン補正を施したりして、分析に利用することが可能なラマンスペクトルデータを生成するものである。
前記試料分析部９２は、前記ラマンスペクトルデータに基づいて試料Ｗの物性等を分析・特定するものである。
前記出力部９３は、前記試料分析部９２による分析結果を所定の態様で出力するものである。
さらにこの実施形態では、この情報処理装置９に、位置特定部９４及びアクチュエータ制御部９５として機能を担わせている。

位置特定部９４は、前記ＣＣＤカメラ５から試料Ｗの画像データを受信し、その画像データを処理して、具体的には例えば二値化処理などを施して、蛍光が発生している位置を特定するものである。

アクチュエータ制御部９５は、前記位置特定部９４が特定した位置にラマン用励起光が照射されるように、前記アクチュエータ８に指令信号を送出し、ＸＹＺステージ７を移動させるものである。

次に、以上のような構成のラマン分光分析装置１００を用いて、試料Ｗ中のマイクロプラスチックを分析する手順を説明する。

＜染色工程＞
図２に示すように、まず脂質二重膜の染色材であるナイルレッド（C20H18N2O2）を溶媒であるトルエンに溶かしてナイルレッド溶液を生成する（ステップＳ１１）。そして、このナイルレッド溶液に試料Ｗを浸す（ステップＳ１２）。このとき、トルエンによりマイクロプラスチックの表面が若干溶融してそこにナイルレッドが潜り込む一方、その他の粒子(ガラスや石など)は、トルエンによる影響はほとんど受けず、表面にナイルレッドが付着しただけの状態になると考えられる。

次に、試料Ｗを乾燥させたうえでエタノールで洗浄する（ステップＳ１３）。このことにより、試料Ｗ中の前記その他の粒子は、表面にナイルレッドが付着しているだけと思われるので、そのナイルレッドは洗い流され、マイクロプラスチックのみがナイルレッドで染色された状態となる。なお、洗浄液としては、マイクロプラスチックをほとんど溶解しないものが好ましく、メタノールや水を使ってもかまわない。

＜位置特定工程＞
図３に示すように、上述の染色工程によってマイクロプラスチックが染色された試料Ｗをセルに入れ、ラマン分光分析装置１００にセットする（ステップＳ２１）。

そして、前記蛍光用光源４を点灯し、蛍光用励起光を前記試料Ｗ表面の分析対象領域全面に照射する（ステップＳ２２）。ナイルレッドは５５３ｎｍの光によって最大励起されるが、４００ｎｍ～６００ｎｍの光でも十分な強度の蛍光を発することができる。したがって、本実施形態のように、波長５５０ｎｍ以下の光を透過するショートパスフィルタ４２を透過した蛍光用励起光によっても蛍光する。なお、ナイルレッドの励起光との関係での蛍光波長スペクトルは、図５に示すとおりであり、その最大蛍光波長は、一般には約６３７ｎｍといわれている。

この状態で、ＣＣＤカメラ５が試料Ｗ表面の分析対象領域全面を撮像する（ステップＳ２３）。ＣＣＤカメラ５の前段には上述したように波長６２５ｎｍ以上の光を透過するロングパスフィルタ６が設けられている。しかして、前記蛍光は、波長６２５ｎｍ以上においても十分な強度を有しているから、このロングパスフィルタ６を透過する一方、蛍光用励起光は５５０ｎｍ未満の波長なので、これが試料にあたって散乱反射（レイリー散乱）した光は、ロングパスフィルタ６によって遮断される。したがって、ＣＣＤカメラ５は、この蛍光をのみを捉えて撮像することとなり、試料Ｗを撮像した画像データは、蛍光部位のみが赤く光り、他の部位は黒い（白黒であれば蛍光部位が白く、他の部位が黒い）といったものとなる。

次に、前記位置特定部９４が、前記画像データを二値化するなどして、試料における蛍光が発せられている部位（以下、蛍光部位ともいう。）を特定し、その位置データをメモリに記憶する（ステップＳ２４）。その際、蛍光部位の数や大きさ、形状等も記憶して構わない。
そして、蛍光用光源４は消灯する。

＜ラマン分析工程＞
次に、図４に示すように、前記蛍光部位にラマン用励起光が照射されるように、アクチュエータ制御部９５が、前記アクチュエータ８に指令信号を送出し、ＸＹＺステージ７を移動させる（ステップＳ３１）。
このようにして試料の位置が設定されると、ラマン用光源１が点灯し、ラマン用励起光が当該蛍光部位に照射される（ステップＳ３２）。

当該蛍光部位から出るラマン散乱光は、前記分光器２で分光され、光検知器３によって各波長ごとの光強度を示すラマン検知信号として出力される（ステップＳ３３）。

そして、前記前処理部９１が、該ラマン検知信号を受信し、ラマンスペクトルデータを生成する（ステップＳ３４）。この該ラマンスペクトルデータに基づいて、前記試料分析部９２が、当該蛍光部位における試料の物性等を分析する。このラマンスペクトルデータ及び分析データは、前記蛍光部位を示す位置データに紐づけられてメモリに記憶される（ステップＳ３５）。
このラマン分析工程は、蛍光部位の全範囲又は所望の範囲を分析するまで、繰り返し行われる（ステップＳ３６）。
その結果、各蛍光部位におけるラマンスペクトルデータ又は分析データが取得される。

なお、この実施形態では、前記出力部９３が、例えば前記ＣＣＤカメラ５による画像データに、位置データ付きの前記ラマンスペクトルデータ又は分析データを付帯させ、出力する。これを演算処理すれば、例えば、画面に表示された試料画像の蛍光部位をクリックすることにより、その部位でのマイクロプラスチックの組成やラマンスペクトルデータを表示させるなどといったことが可能になる。

しかして、このように構成した本実施形態によれば、試料Ｗ全体に亘ってのラマンによるマッピング測定等が不要となり、必要箇所だけをラマン分析すればよいので、試料Ｗ中に含まれるマイクロプラスチックの組成や種類などを迅速に分析することができるようになる。また、本実施形態の蛍光検出方法によれば５００ｎｍオーダーの微小なマイクロプラスチックも検出できるので、ラマン分析による空間分解能を十分に生かすことも可能となる。

また、染色のための蛍光体溶液（ナイルレッド溶液）の溶媒にトルエンを用いているので、染色に数秒しかかからず、この点でも分析時間の短縮に寄与し得る。他方、トルエンはプラスチックを種類によっては溶かしてしまうため、微小なサイズのマイクロプラスチックが溶融して試料中から欠落してしまう恐れがある。これを回避するには、n-Hexane（ノルマルヘキサン）などプラスチックに対する溶解力の低い有機溶媒を用いればよい。ただし、この場合は染色に数時間かかる場合がある。

さらに、蛍光は透過し、蛍光用励起光は遮断するロングパスフィルタ６をＣＣＤカメラ５の前段に設けてあるので蛍光のみを確実に検出することができる。
また、ラマン用励起光の波長が、約７８５ｎｍというナイルレッドを励起できない波長に設定されているので、ラマン分析における蛍光の影響も排除できる。

なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、蛍光用励起光の光源として、水銀ランプ等のブロードな波長のものを用いてもよい。逆に、ナローな波長の光を射出する単色ＬＥＤを用いてもよい。この場合、その単色ＬＥＤの選択によってショートパスフィルタを省略することも可能である。

また前記実施形態では蛍光体としてナイルレッドを用いていたがこれに限らない。例えばトルエン等の有機溶媒に溶解可能であれば、蛍光体として任意の蛍光物質を用いてもよく、例えば蛍光チョーク等の市販の蛍光物質等を用いてもよい。

また前記実施形態では、試料Ｗは円形乃至矩形の薄いセルに入れられていたがこれに限らない。他の実施形態では、試料Ｗは、その表面である分析対象領域が一定程度の面積を有するようにして、薄いガラス板やアクリル板等の上に載せられていてもよい。この場合、ガラス板やアクリル板における試料Ｗの載置面に、例えば両面テープ等の接着部材を設け、載置した試料Ｗの位置がずれないようにしてもよい。また、試料Ｗを載せるガラス板や接着部材における試料Ｗの載置面に目盛を設けていてもよい。

また、マイクロプラスチックの種類等は特定できないが、試料に含まれていることを蛍光によってのみ検出できるようにしてもよい。
その具体例を図６、図７に示す。

このマイクロプラスチック検出装置２００は、携帯可能な大きさ及び重さの直方体状をなす筐体２０１を備えている。
この筐体２０１の底板の上面には、蛍光体によって染色されたマイクロプラスチックを含む試料Ｗを載置するための試料載置部２０２が設けられている。

また、この筐体上板の下面における一方側には、例えば緑色ＬＥＤ４１とショートパスフィルタ４２とからなる蛍光用光源４が設けられていて、ここから射出される蛍光用励起光が、前記試料載置部２０２に載置された試料Ｗの表面に照射されるようにしてある。なお、前記緑色ＬＥＤは白色ＬＥＤ等でも構わない。また例えば緑色ＬＥＤと白色ＬＥＤとを両方設ける等して、照射する光を緑色と白色とで切り替え可能に構成してもよい。また、白色ＬＥＤを設ける代わりに、又はこれに加えて、試料Ｗを出し入れするための開閉可能な開口部を筐体２０１の壁に設け、当該開口部を開放することにより、試料Ｗを観察するための光を筐体２０１内に取り込むように構成してもよい。また、蛍光用光源４から照射された蛍光用励起光の筐体２０１内での乱反射を防ぐように、筐体２０１の内面には光吸収材をコーティングする等してもよい。

また、試料Ｗへの蛍光励起光の照射むらを低減するように、蛍光用光源４の光出射方向の前方であって試料Ｗとの間に、拡散板又は拡散シート等の光拡散部材を設けていてもよい。
また、筐体２０１内における試料Ｗの上面だけでなく側面にも蛍光用光源４を設け、試料Ｗに対して蛍光励起光を上方及び側方から照射することで、照射むらを低減するようにしてもよい。

他方、該筐体上板の他方側には、窓２０３が開けられていてその窓２０３の下には、前記実施形態同様、蛍光は透過させるが前記蛍光用励起光は遮断するロングパスフィルタ６が図示しない着脱機構により、取り外し又は移動可能に設けられている。

該筐体上板の上面には、携帯型カメラであるスマートフォンＰを載置して保持するカメラ保持部２０４が設けられている。このカメラ保持部２０４は、図６に示すように、位置決め構造であるＬ字型の突条２０７を有しており、この突条２０７にスマートフォンＰの２辺を当接させて設置すると、そのカメラ面が前記窓２０３に臨む位置となり、試料Ｗのマイクロプラスチックからでる蛍光を撮像できるように構成されている。

このようなマイクロプラスチック検出装置２００であれば、装置２００そのものが携帯可能であるうえ、検出結果を画像として残したい場合は、スマートフォンＰをカメラ保持部２０４に載置すればよいだけなので、試料中のマイクロプラスチックをその採取現場で簡易に検出することができる。

さらに、ロングパスフィルタ６は取り外し可能となっているので、これを取り外せば、試料Ｗの、蛍光がでていない通常の光学画像を撮像することができる。しかも、で、カメラ保持部２０４の突条２０７に合わせるだけで、スマートフォンＰの撮像位置を常に一定にできるので、ロングパスフィルタ６の着脱前後の試料Ｗの蛍光画像と通常光学画像とを同一視野で撮像できる。このことにより、その後の画像処理で、光学画像と蛍光画像とを例えば重ね合わせて表示するといったことが容易にできるようになる。

また、前記スマートフォンＰに、画像に写ったマイクロプラスチックの占有面積等から試料Ｗ中のマイクロプラスチックの含有割合を演算する演算部（アプリケーション）を搭載しておけば、その場で把握できる情報が増え、より好ましい。
その他、本発明の趣旨に反しない限りにおいて、種々の変形や実施形態の組合せを行ってもかまわない。

上記した本発明によれば、一定程度の面積を有する試料に含まれるマイクロプラスチックを、ラマン分光法を用いながら短時間で分析できるようになる。

Claims (4)

1. 蛍光体を所定の溶媒に溶かした染色液にマイクロプラスチックを含む試料を浸漬し、その後、マイクロプラスチック以外の成分に付着した蛍光体を取り去ることが可能な洗浄液で当該試料を洗浄することにより、前記試料中のマイクロプラスチックを蛍光染色する染色ステップと、
   蛍光体によって染色されたマイクロプラスチックを含む前記試料を所定の試料載置部に載置する試料載置ステップと、
   前記試料載置部に載置された試料に蛍光用励起光を照射する光照射ステップと、
   前記蛍光用励起光を照射された試料を撮像可能な位置に携帯型カメラを保持するカメラ保持ステップと、
   前記携帯型カメラの前段に、前記蛍光体から出る蛍光は透過させるとともに前記蛍光用励起光は遮断する光学フィルタを配置する光学フィルタ配置ステップと、
   前記試料中のマイクロプラスチックから出る蛍光を前記カメラで撮像する撮像するステップとを含むマイクロプラスチック検出方法。
2. 前記蛍光体がナイルレッドであり、前記溶媒がトルエンであり、前記洗浄液がエタノールまたはメタノールである請求項１に記載のマイクロプラスチック検出方法。
3. 前記蛍光体から出る蛍光を検出し、
   該蛍光によって前記試料におけるマイクロプラスチックの位置を特定し、
   特定した位置にラマン用励起光を照射してラマン散乱光を検出し、
   該ラマン散乱光に基づいて、当該位置のマイクロプラスチックを分析する請求項１又は２に記載のマイクロプラスチック検出方法。
4. 前記ラマン用励起光の波長が、蛍光体を励起できない波長に設定されている請求項３に記載のマイクロプラスチック検出方法。