JP7828280B2 - 新規分解関連相互作用の検出 - Google Patents

新規分解関連相互作用の検出

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Description

本発明は、とりわけ蛋白質／蛋白質相互作用または蛋白質／低分子相互作用、および／または新規低分子の検出および同定に関する。
関連する出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月１７日付けで出願された米国仮出願番号第６２／９４９，０２６号に基づく優先権を主張するものである。その優先出願の開示内容全体が本明細書に組み入れられる。
電子提出のテキストファイルについての説明
本明細書に付帯する電子提出のテキストファイルの内容は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる：配列表のコンピューター可読性形態のコピー（ファイル名：「ＯＲＮ－０６４ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；作成日：２０２０年１２月７日；ファイルサイズ：１０，３６５バイト）。
蛋白質／蛋白質相互作用および蛋白質／低分子相互作用などの分子相互作用は、全ての生物学的過程ではなくとも、多くの生物学的過程にとっては重要な部分である。分子相互作用の促進または阻害は治療方略として用いることができるが、臨床的に意義のある分子相互作用の判定が問題となることが多い。
蛋白質／蛋白質相互作用（ＰＰＩ）の役割に関する理解が深まったため、蛋白質間相互作用を壊したりその酵素活性を阻害したりする化学物質ではなく、蛋白質間相互作用を安定化させる／誘導する化学物質の探索が行われるようになった。分子糊は低分子ＰＰＩ安定化剤を指し、蛋白質に結合して分子表面を変化させ、それによって新たな蛋白質を動員すること、あるいは弱い蛋白質／蛋白質相互作用を安定化することを可能にする。これらの化合物のうちで、とりわけ注目すべきは、Ｅ３リガーゼ蛋白質セレブロン（ＣＲＢＮ）と相互作用し下流の蛋白質分解を作動させる免疫調節薬剤のレナリドミドであり、各種癌の治療において卓越した効能を示す。また分子糊のなかには、蛋白質／蛋白質相互作用界面のところに形成される構造に特異的に結合して弱い蛋白質／蛋白質相互作用を安定化させることにより作用するものもある。この場合は、レナリドミドなどの分子糊がまず１種類の蛋白質に結合した後、他の蛋白質（複数可）との複合体形成を誘導または促進するという本明細書で概説するような状況とは対照的に、両方の蛋白質が相互作用している構造にのみ分子糊が結合する。
すなわち、分子相互作用を検出するための、より安定した新規の方法に対する必要性が依然として存在する。
本発明は部分的には、細胞を基盤とした、様々な分子相互作用を検出するシステムに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、標準的アッセイを用いた場合には検出可能ではない分子相互作用（例えば、蛋白質／蛋白質、蛋白質／低分子、および／または低分子によって調節される蛋白質／蛋白質相互作用）の検査／識別を可能にする方法を提供する。いくつかの実施態様においては、本明細書に開示の方法は、疾患に対する治療法の開発に利用することのできる、臨床的に意義のある、または臨床的に有意な蛋白質間分子相互作用の同定を可能にする。
いくつかの実施態様においては、本明細書に開示の方法は、単一のベイト蛋白質と複数のプレイ蛋白質を含む。そのような方法は、ベイト蛋白質と複数のプレイ蛋白質または個々のプレイ蛋白質との間の分子相互作用を識別するために用いるのであってもよい。いくつかの実施態様において、本発明は哺乳動物の蛋白質／蛋白質相互作用捕捉（ＭＡＰＰＩＴ）アッセイを利用する（ＭＡＰＰＩＴに関しては、Ｅｙｃｋｅｒｍａｎらの「サイトカイン受容体を基盤とする相互作用捕捉の設計と応用（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂａｓｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒａｐ）」 Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００１ Ｄｅｃ；３（１２）：１１１４－９；およびＬｉｅｖｅｎｓらの「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの２蛋白質インタラクトミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １５．１２ （２０１６）： ３６２４－３６３９）を参照のこと；これらの参考文献はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。しかし、本明細書中に記載のＭＡＰＰＩＴ派生型アッセイは、ベイトまたはプレイ蛋白質と相互作用する低分子を利用することによって、ならびにいくつかの実施態様においては他の特徴を利用することによって、その性能が増大するのである。いくつかの実施態様においては、低分子（本明細書においては、「化合物」または「リガンド」または「薬剤」とも記載される）によって、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との間の分子相互作用が促進／誘導される。実施態様においては、当該低分子はハイブリッドリガンドではない化学物質である。実施態様においては、当該低分子は単一の化学物質である。実施態様においては、当該低分子はリンカーを有していない。実施態様においては、当該低分子はベイトまたはプレイ蛋白質のうちの一方のみと直接相互作用する。実施態様においては、当該低分子は、ＣＲＢＮ結合分子、ＰＥＧリンカー、および低分子のうちの１種類以上を有するハイブリッドリガンドである化学物質である。
様々な実施態様において、本発明は分子相互作用を検出する方法に関するが、該方法は：
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）該第１の受容体または第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した細胞内Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質を有し、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：シグナル伝達因子および転写活性化因子）の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片である、
発現させること；
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、低分子のＥ３リガーゼ基質結合サブユニットへの結合によって、プレイ蛋白質への結合が促進され、また足場蛋白質、低分子と共に複合体を形成するＥ３リガーゼ基質結合サブユニット、およびプレイ蛋白質を含む蛋白質複合体の形成が促進される。
いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質を受容体断片に融合する。いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質を受容体断片のＮ末端またはＣ末端に融合する。実施態様においては、プレイ蛋白質をｇｐ１３０またはその断片に融合する。実施態様においては、プレイ蛋白質をｇｐ１３０またはその断片のＮ末端またはＣ末端に融合する。
実施態様においては、該第１の受容体および第２の受容体は同一の受容体である。
実施態様においては、Ｅ３リガーゼ基質は内因性であるか、または導入遺伝子によって発現させる。
様々な実施態様において、本発明は分子相互作用を検出する方法に関するが、該方法は：
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）該第１の受容体または第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した足場蛋白質を有し、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：シグナル伝達因子および転写活性化因子）の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片である、
発現させること；
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、該足場蛋白質はＥ３リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、また足場蛋白質とＥ３リガーゼ基質結合サブユニットとの間の複合体はプレイと相互作用する。
いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員されるので、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達が回復し、ＳＴＡＴ分子の活性化が起こる。いくつかの実施態様において、該細胞はＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、活性化ＳＴＡＴ分子は核内に移行してＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導する；レポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出および／または発見が可能になることもある。
いくつかの実施態様において、検出される相互作用は、ベイトおよび／またはプレイの２量体、３量体またはさらに高次の蛋白質複合体への動員である。
いくつかの実施態様において、該分子相互作用は蛋白質／蛋白質相互作用である。いくつかの実施態様において、該分子相互作用は低分子が仲介する蛋白質／蛋白質相互作用である（例えば、該方法はプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む）。具体的には、いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用である。例えば、本法は複合体形成を検出するものであってもよい。いくつかの実施態様において、該低分子はプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との相互作用を可能にするプレイ蛋白質またはベイト蛋白質の疎水性表面あるいは結合部位の露出を誘導する。いくつかの実施態様においては、該低分子は分子糊または二価ハイブリッドリガンド分子である（例えば、ＰＲＯＴＡＣが挙げられるが、これのみに限定されるものではない）。
一例を挙げれば、いくつかの実施態様においては、検出する相互作用は、限定するものではないが例えば、免疫調節薬剤（ＩＭｉＤ）、例えば、サリドマイド、レナリドミドおよびポマリドミド、およびそれに関連する化合物あるいは同等または類似の構造ポケットおよび通常ＩＭｉＤ化合物およびそれに関連する化合物によって占有されるような低分子結合部位に結合する化合物に接触しているＥ３リガーゼ蛋白質を含む。
いくつかの実施態様においては、Ｅ３リガーゼ基質結合ベイト蛋白質としてＶＨＬを用いる際に本法が利用可能である。ＣＲＢＮと同様に、ＶＨＬはＥ３リガーゼの基質結合サブユニットである。したがって、ベイトとしてのＥ３リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのＶＨＬにも同様に当てはまる。
実施態様において、Ｅ３リガーゼの代わりに、ＦＫＢＰ１２蛋白質またはこのファミリーの構成員をベイトとして用いる際に本法が利用可能である（したがって、ベイトとしてのＥ３リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのＦＫＢＰ蛋白質またはこのファミリーの構成員、例えばＦＫＢＰ１２（これのみに限定されるものではない）にも同様に当てはまる）。
いくつかの実施態様において、本法は受容体融合蛋白質として発現していないベイト蛋白質の提示を可能にする。この場合には、ベイト蛋白質と相互作用し得る別の蛋白質、すなわち足場蛋白質を受容体蛋白質に融合する。そのような蛋白質とベイトとの相互作用によって、複合体の一部としてベイト蛋白質を効果的に提示する蛋白質複合体が形成される。これによって、受容体への融合を必要としない形態でベイト蛋白質を提示する新規アプローチが提供される。一例を挙げれば（また本明細書中でも具体的に記載されているのであるが）、例えば、ＤＤＢ１（またはＥ３リガーゼの基質認識要素と天然に相互作用する他の足場蛋白質）などのＥ３リガーゼ蛋白質複合体の別の構成要素を該受容体に融合する。ＤＤＢ１については、この蛋白質を受容体融合物として発現させ、次いで、（例えば、非融合蛋白質として）別途発現させたＣＲＢＮベイト蛋白質に対して相互作用させ、Ｅ３リガーゼによって基質に提示する天然の様式を模倣して提示させる。分子糊および複数のプレイ蛋白質への同時曝露によって、ＩＭｉＤなどの分子糊に対するＣＲＢＮの結合に応答して、ＤＤＢ１／ＣＲＢＮ複合体と相互作用するプレイ蛋白質の発見が可能になる。同様に類推として、いくつかの実施態様においては、ＣＲＢＮ以外のリガンド結合性ベイト蛋白質（ＶＨＬまたは他のＥ３リガーゼ構成要素など）であって、発現受容体融合蛋白質ではないリガンド結合性ベイト蛋白質を含む複数蛋白質の複合体を、このような方法でベイトとして提示することができる。
いくつかの実施態様においては、ベイトおよび／または化合物との相互作用について、複数のプレイ蛋白質のスクリーニングに本法を利用することができる。
様々な実施態様において、本法は、例えば、各種のプレイ蛋白質をコードするｃＤＮＡが表面上にスポットされているアレイ型形態に関連する。様々な実施態様において、本法は、例えば、プレイ蛋白質のライブラリーを細胞に導入して、平均的には各細胞が単一プレイを発現するようにした細胞集団を基盤とした方法に関連する。そのような実施態様においては、化合物および／またはベイトと相互作用した場合に、当該コードｃＤＮＡを同定してその相互作用を明らかにする。実施態様においては、そのような同定にＦＡＣＳまたは微量流体分離を用いる。
いくつかの実施態様において、プレイ蛋白質および／またはベイト蛋白質との相互作用について、複数の化合物（例えば、化合物ライブラリー）のスクリーニングに本法を利用することができる。化合物がリンカーを含んでいない（例えば、ハイブリッドリガンドではない）実施態様においては、本法によって、リンカー付加に起因する化合物相互作用部分の妨害の可能性のないスクリーニングが可能となる。
いくつかの実施態様においては、Ｅ３リガーゼ基質結合ベイト蛋白質としてＶＨＬを用いる際に本法が利用可能である。ＣＲＢＮと同様に、ＶＨＬはＥ３リガーゼの基質結合サブユニットである（したがって、ベイトとしてのＥ３リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのＶＨＬにも同様に当てはまる）。
いくつかの実施態様において、Ｅ３リガーゼの代わりに、ＦＫＢＰまたはこのファミリーの構成員を受容体融合物ではないベイトとして用いる場合には、本法が利用可能である（したがって、受容体融合物ではないベイトとしてのＥ３リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのＦＫＢＰまたはこのファミリーの構成員、例えば、ＦＫＢＰ１２にも同様に当てはまる）。
本ＭＡＰＰＩＴ派生的概念を説明する非限定的な模式図を示す。図１Ａにおいて、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質（「Ｂ」）はキメラ受容体のＣ末端に融合している。このキメラ受容体は、例えば、Ｉ型サイトカイン受容体（「ＣＹＴ」）の細胞外部分、ならびに突然変異生成によってＳＴＡＴ動員が不全となるように作成された受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する。このキメラ受容体はシグナル伝達欠損である。機能性ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片に融合しているプレイ蛋白質（「Ｐ」）を共発現した場合に、その受容体複合体は機能的に相補して、場合によってはサイトカインリガンド刺激時に（Ｌ）、ＳＴＡＴシグナル伝達を回復する。ＳＴＡＴ分子が活性化して核内に移行し、ＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導する。図１Ｂは、図１Ａに類似の模式的図であるが、受容体融合物ではない形態でベイト蛋白質を提示することを含む、本ＭＡＰＰＩＴ派生的概念を説明する図である。網掛け表示のセグメントは足場蛋白質である。 本ＭＡＰＰＩＴ派生的概念を説明する非限定的な模式図を示す。図１Ａにおいて、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質（「Ｂ」）はキメラ受容体のＣ末端に融合している。このキメラ受容体は、例えば、Ｉ型サイトカイン受容体（「ＣＹＴ」）の細胞外部分、ならびに突然変異生成によってＳＴＡＴ動員が不全となるように作成された受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを有する。このキメラ受容体はシグナル伝達欠損である。機能性ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片に融合しているプレイ蛋白質（「Ｐ」）を共発現した場合に、その受容体複合体は機能的に相補して、場合によってはサイトカインリガンド刺激時に（Ｌ）、ＳＴＡＴシグナル伝達を回復する。ＳＴＡＴ分子が活性化して核内に移行し、ＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導する。図１Ｂは、図１Ａに類似の模式的図であるが、受容体融合物ではない形態でベイト蛋白質を提示することを含む、本ＭＡＰＰＩＴ派生的概念を説明する図である。網掛け表示のセグメントは足場蛋白質である。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて選択基質を動員するＣＲＢＮ結合化合物の評価。表示のＣＲＢＮ基質パネルのＣＲＢＮ ＩＭｉＤリガンド（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）によって誘導される動員をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した。ＭＡＰＰＩＴは、以前に報告のある２ハイブリッド技術システムの変法であり（Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）、実施例１においてより具体的に概説する。本アッセイでは、ｇｐ１３０を融合した基質融合物と共にＣＲＢＮベイト受容体融合物を共形質導入することが必須である。ＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用を促進する能力、すなわち、表示のネオ基質（ＩＫＺＦ１、ＧＳＰＴ１、ＧＳＰＴ２）および未開示基質の動員についてモニターを行うために、被検化合物の濃度を増加させながら被検化合物の活性を測定した（用量応答試験）。それによって得られた結果は、図から分かるように、本明細書に記載するような異なる技術によって得られている文献的公知のデータを再現している。例えば、表示の化合物はいずれもＩＫＺＦ１を動員するが、ＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２はＣＣ－８８５によってのみ動員される。 ＣＲＢＮ ＭＡＰＰＩＴ派生的受容体の複数の構築物が化合物依存性基質相互作用の検出を可能にする。実施例２においてより具体的に説明されるように、複数の受容体融合構造が本明細書に記載するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて利用可能である。典型的な融合蛋白質は、変異レプチン受容体の膜貫通部分および細胞内部分に融合したＥＰＯ受容体の細胞外ドメインから成る（図３Ａ～Ｂ）。しかし、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインをレプチン受容体の細胞外ドメインで代替することもでき、それによってＥＰＯではなくレプチンで活性化するアッセイシステムが得られる（図３Ｃ～Ｄ）。同様に、部分的ｇｐ１３０ドメインを目的蛋白質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合することができる場合には、ｇｐ１３０融合蛋白質を代替として利用することが可能である。ここでは、本発明者らは、複数種類のＣＲＢＮベイト受容体融合構築物および基質ｇｐ１３０融合を用いて、ＣＲＢＮのＩＫＺＦ１およびＧＳＰＴ１基質に対するＣＣ－２２０依存性およびＣＣ－８８５依存性相互作用を調べた。ＥＰＯ受容体を基盤とするＣＲＢＮ受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびレプチン受容体を基盤とする変異体（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）で、同様の結果が得られた。また、それとは別にｇｐ１３０融合型のＮ末端またはＣ末端融合物でも類似のデータが得られる。さらに、複数種類の基質蛋白質、例えばＩＫＺＦ１イソ型１に対してイソ型７、あるいはＧＳＰＴ１イソ型１（完全長）に対してドメイン２および３のみを含む部分構築物でも同様の結果が得られることを、発明者らは示している。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭ、その右隣のバーは０．１μＭ、さらにその右隣のバーは１μＭ、また最も右のバーが１０μＭを表す。 ＣＲＢＮ ＭＡＰＰＩＴ派生的受容体の複数の構築物が化合物依存性基質相互作用の検出を可能にする。実施例２においてより具体的に説明されるように、複数の受容体融合構造が本明細書に記載するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて利用可能である。典型的な融合蛋白質は、変異レプチン受容体の膜貫通部分および細胞内部分に融合したＥＰＯ受容体の細胞外ドメインから成る（図３Ａ～Ｂ）。しかし、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインをレプチン受容体の細胞外ドメインで代替することもでき、それによってＥＰＯではなくレプチンで活性化するアッセイシステムが得られる（図３Ｃ～Ｄ）。同様に、部分的ｇｐ１３０ドメインを目的蛋白質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合することができる場合には、ｇｐ１３０融合蛋白質を代替として利用することが可能である。ここでは、本発明者らは、複数種類のＣＲＢＮベイト受容体融合構築物および基質ｇｐ１３０融合を用いて、ＣＲＢＮのＩＫＺＦ１およびＧＳＰＴ１基質に対するＣＣ－２２０依存性およびＣＣ－８８５依存性相互作用を調べた。ＥＰＯ受容体を基盤とするＣＲＢＮ受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびレプチン受容体を基盤とする変異体（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）で、同様の結果が得られた。また、それとは別にｇｐ１３０融合型のＮ末端またはＣ末端融合物でも類似のデータが得られる。さらに、複数種類の基質蛋白質、例えばＩＫＺＦ１イソ型１に対してイソ型７、あるいはＧＳＰＴ１イソ型１（完全長）に対してドメイン２および３のみを含む部分構築物でも同様の結果が得られることを、発明者らは示している。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭ、その右隣のバーは０．１μＭ、さらにその右隣のバーは１μＭ、また最も右のバーが１０μＭを表す。 ＣＲＢＮ ＭＡＰＰＩＴ派生的受容体の複数の構築物が化合物依存性基質相互作用の検出を可能にする。実施例２においてより具体的に説明されるように、複数の受容体融合構造が本明細書に記載するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて利用可能である。典型的な融合蛋白質は、変異レプチン受容体の膜貫通部分および細胞内部分に融合したＥＰＯ受容体の細胞外ドメインから成る（図３Ａ～Ｂ）。しかし、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインをレプチン受容体の細胞外ドメインで代替することもでき、それによってＥＰＯではなくレプチンで活性化するアッセイシステムが得られる（図３Ｃ～Ｄ）。同様に、部分的ｇｐ１３０ドメインを目的蛋白質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合することができる場合には、ｇｐ１３０融合蛋白質を代替として利用することが可能である。ここでは、本発明者らは、複数種類のＣＲＢＮベイト受容体融合構築物および基質ｇｐ１３０融合を用いて、ＣＲＢＮのＩＫＺＦ１およびＧＳＰＴ１基質に対するＣＣ－２２０依存性およびＣＣ－８８５依存性相互作用を調べた。ＥＰＯ受容体を基盤とするＣＲＢＮ受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびレプチン受容体を基盤とする変異体（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）で、同様の結果が得られた。また、それとは別にｇｐ１３０融合型のＮ末端またはＣ末端融合物でも類似のデータが得られる。さらに、複数種類の基質蛋白質、例えばＩＫＺＦ１イソ型１に対してイソ型７、あるいはＧＳＰＴ１イソ型１（完全長）に対してドメイン２および３のみを含む部分構築物でも同様の結果が得られることを、発明者らは示している。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭ、その右隣のバーは０．１μＭ、さらにその右隣のバーは１μＭ、また最も右のバーが１０μＭを表す。 ＣＲＢＮ ＭＡＰＰＩＴ派生的受容体の複数の構築物が化合物依存性基質相互作用の検出を可能にする。実施例２においてより具体的に説明されるように、複数の受容体融合構造が本明細書に記載するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイにおいて利用可能である。典型的な融合蛋白質は、変異レプチン受容体の膜貫通部分および細胞内部分に融合したＥＰＯ受容体の細胞外ドメインから成る（図３Ａ～Ｂ）。しかし、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインをレプチン受容体の細胞外ドメインで代替することもでき、それによってＥＰＯではなくレプチンで活性化するアッセイシステムが得られる（図３Ｃ～Ｄ）。同様に、部分的ｇｐ１３０ドメインを目的蛋白質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合することができる場合には、ｇｐ１３０融合蛋白質を代替として利用することが可能である。ここでは、本発明者らは、複数種類のＣＲＢＮベイト受容体融合構築物および基質ｇｐ１３０融合を用いて、ＣＲＢＮのＩＫＺＦ１およびＧＳＰＴ１基質に対するＣＣ－２２０依存性およびＣＣ－８８５依存性相互作用を調べた。ＥＰＯ受容体を基盤とするＣＲＢＮ受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびレプチン受容体を基盤とする変異体（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）で、同様の結果が得られた。また、それとは別にｇｐ１３０融合型のＮ末端またはＣ末端融合物でも類似のデータが得られる。さらに、複数種類の基質蛋白質、例えばＩＫＺＦ１イソ型１に対してイソ型７、あるいはＧＳＰＴ１イソ型１（完全長）に対してドメイン２および３のみを含む部分構築物でも同様の結果が得られることを、発明者らは示している。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭ、その右隣のバーは０．１μＭ、さらにその右隣のバーは１μＭ、また最も右のバーが１０μＭを表す。 ＣＲＢＮ化合物依存性基質相互作用は、ＤＤＢ１受容体融合物を利用する、代替的ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイ構成を用いて検出することができる。代替的ＣＲＢＮ基質結合アッセイを試験したが、ここではＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物にＤＤＢ１を融合し（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１）、非融合ＣＲＢＮベイト蛋白質を基質ｇｐ１３０融合蛋白質、すなわちＩＫＺＦ１（ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１）または未開示の基質蛋白質（ｇｐ１３０－標的Ｘ）のいずれかと一緒に共発現した。ＣＲＢＮ共発現が非存在（「ＣＲＢＮなし」）の場合には、レナリドミド（ＬＥＮ）誘導性シグナルは観察できなかった。しかし、非融合ＣＲＢＮ発現構築物を共形質転換した場合には、ＩＫＺＦ１との相互作用および標的Ｘとの相互作用の両方について、ＬＥＮ依存性シグナルが得られた。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭのＬＥＮ、その右隣のバーは０．１μＭのＬＥＮ、さらにその右隣のバーは１μＭのＬＥＮ、また最も右のバーが１０μＭのＬＥＮを表す。 非融合ＤＤＢ１の共発現が、ＭＡＰＰＩＴ派生的な化合物依存性のＣＲＢＮ基質相互作用アッセイの感度を高める。分子糊誘導性ＣＲＢＮ／ＩＫＺＦ１相互作用についてのＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイ設定において、非融合ＤＤＢ１発現構築物を共形質転換することの効果を評価した。そのアッセイ構成は、付加的なＤＤＢ１発現ベクターの存在下または非存在下でＣＲＢＮベイト受容体構築物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）とＩＫＺＦ１（イソ型７）ｇｐ１３０融合構築物とを共発現した、図２Ａ～Ｌにおいて用いたアッセイ構成に類似する。ＤＤＢ１共発現の存在下または非存在下のいずれかにおいて、試験した各分子糊（図２Ａ～Ｌで用いたパネルと同一のパネル）について、レポーターシグナルの化合物濃度依存性誘導が観察された。興味深いことに、ＤＤＢ１過剰発現の設定で最大シグナルと比較して、試験した低濃度でシグナルの増加が認められたが、このことはＤＤＢ１共発現の非存在下よりもアッセイ感度が高くなることを示している。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭ、その右隣のバーは０．１μＭ、さらにその右隣のバーは１μＭ、また最も右のバーが１０μＭを表す。 ＤＤＢ１／ＣＲＢＮのＭＡＰＰＩＴ派生的受容体融合が、化合物依存性基質動員の検出を可能にする。ここでは、ＤＤＢ１／ＣＲＢＮ遺伝子融合物をＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物に連結し（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１－ＣＲＢＮ）、分子糊（図２Ａ～Ｌで用いたパネルと同一のパネル）のパネル濃度を増加させながらｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１（イソ型７）基質融合に対する試験を行うアッセイ構成について調べた。またこのアッセイ構成では、化合物用量依存性に化合物誘導性ＣＲＢＮ／ＩＫＺＦ１複合体形成を再現することができた。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭ、その右隣のバーは０．１μＭ、さらにその右隣のバーは１μＭ、また最も右のバーが１０μＭを表す。 ＢＲＤ４基質のＣＲＢＮへのＡＲＶ－８２５ ＰＲＯＴＡＣ依存性動員を、ＭＡＰＰＩＴで検出することができる。図３Ａ～Ｄにおいて試験した、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）またはレプチン受容体細胞外ドメイン（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）のいずれかを含む代替的ＭＡＰＰＩＴ派生的ＣＲＢＮベイト受容体融合物を、ＢＲＤ４（イソ型３）のＮ末端またはＣ末端ｇｐ１３０融合物と組み合わせた。両方のアッセイにおいて、ＡＲＶ－８２５ ＰＲＯＴＡＣ（ＣＲＢＮ結合リガンドとＢＲＤ４結合性化合物との化学的融合物）は、用量依存性ルシフェラーゼレポーターシグナルを誘導した。ヒストグラムの各セットにおいて、左から右に、バーはそれぞれ以下を表している：０μＭのＡＲＶ－８２５；０．０００３μＭのＡＲＶ－８２５；０．００３μＭのＡＲＶ－８２５；０．０３μＭのＡＲＶ－８２５；０．３μＭのＡＲＶ－８２５；３μＭのＡＲＶ－８２５；および３０μＭのＡＲＶ－８２５。 ＢＲＤ４基質のＣＲＢＮへのＡＲＶ－８２５ ＰＲＯＴＡＣ依存性動員を、ＭＡＰＰＩＴで検出することができる。図３Ａ～Ｄにおいて試験した、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）またはレプチン受容体細胞外ドメイン（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）のいずれかを含む代替的ＭＡＰＰＩＴ派生的ＣＲＢＮベイト受容体融合物を、ＢＲＤ４（イソ型３）のＮ末端またはＣ末端ｇｐ１３０融合物と組み合わせた。両方のアッセイにおいて、ＡＲＶ－８２５ ＰＲＯＴＡＣ（ＣＲＢＮ結合リガンドとＢＲＤ４結合性化合物との化学的融合物）は、用量依存性ルシフェラーゼレポーターシグナルを誘導した。ヒストグラムの各セットにおいて、左から右に、バーはそれぞれ以下を表している：０μＭのＡＲＶ－８２５；０．０００３μＭのＡＲＶ－８２５；０．００３μＭのＡＲＶ－８２５；０．０３μＭのＡＲＶ－８２５；０．３μＭのＡＲＶ－８２５；３μＭのＡＲＶ－８２５；および３０μＭのＡＲＶ－８２５。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイは、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲまたはカルシニューリンとの間の化合物依存性相互作用の検出を可能にする。ＦＫＢＰ１Ａと公知の標的蛋白質との化合物依存性相互作用を、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）ｇｐ１３０融合蛋白質またはカルシニューリンＰＰＰ３ＣＡ触媒サブユニットｇｐ１３０融合蛋白質と組み合わせたＦＫＢＰ１Ａベイト受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）を用いて評価した。図から分かるように、ＭＴＯＲの化合物誘導性動員は、ラパマイシンおよびエベロリムスの両方で検出される。同様に、ＰＰＰ３ＣＡのＦＫ５０６依存性結合またはピメクロリムス依存性結合をモニターすることも可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、シグナル窓が有意に増加することである。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイは、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲまたはカルシニューリンとの間の化合物依存性相互作用の検出を可能にする。ＦＫＢＰ１Ａと公知の標的蛋白質との化合物依存性相互作用を、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）ｇｐ１３０融合蛋白質またはカルシニューリンＰＰＰ３ＣＡ触媒サブユニットｇｐ１３０融合蛋白質と組み合わせたＦＫＢＰ１Ａベイト受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）を用いて評価した。図から分かるように、ＭＴＯＲの化合物誘導性動員は、ラパマイシンおよびエベロリムスの両方で検出される。同様に、ＰＰＰ３ＣＡのＦＫ５０６依存性結合またはピメクロリムス依存性結合をモニターすることも可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、シグナル窓が有意に増加することである。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイは、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲまたはカルシニューリンとの間の化合物依存性相互作用の検出を可能にする。ＦＫＢＰ１Ａと公知の標的蛋白質との化合物依存性相互作用を、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）ｇｐ１３０融合蛋白質またはカルシニューリンＰＰＰ３ＣＡ触媒サブユニットｇｐ１３０融合蛋白質と組み合わせたＦＫＢＰ１Ａベイト受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）を用いて評価した。図から分かるように、ＭＴＯＲの化合物誘導性動員は、ラパマイシンおよびエベロリムスの両方で検出される。同様に、ＰＰＰ３ＣＡのＦＫ５０６依存性結合またはピメクロリムス依存性結合をモニターすることも可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、シグナル窓が有意に増加することである。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイは、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲまたはカルシニューリンとの間の化合物依存性相互作用の検出を可能にする。ＦＫＢＰ１Ａと公知の標的蛋白質との化合物依存性相互作用を、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）ｇｐ１３０融合蛋白質またはカルシニューリンＰＰＰ３ＣＡ触媒サブユニットｇｐ１３０融合蛋白質と組み合わせたＦＫＢＰ１Ａベイト受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）を用いて評価した。図から分かるように、ＭＴＯＲの化合物誘導性動員は、ラパマイシンおよびエベロリムスの両方で検出される。同様に、ＰＰＰ３ＣＡのＦＫ５０６依存性結合またはピメクロリムス依存性結合をモニターすることも可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、シグナル窓が有意に増加することである。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイは、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲまたはカルシニューリンとの間の化合物依存性相互作用の検出を可能にする。ＦＫＢＰ１Ａと公知の標的蛋白質との化合物依存性相互作用を、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）ｇｐ１３０融合蛋白質またはカルシニューリンＰＰＰ３ＣＡ触媒サブユニットｇｐ１３０融合蛋白質と組み合わせたＦＫＢＰ１Ａベイト受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）を用いて評価した。図から分かるように、ＭＴＯＲの化合物誘導性動員は、ラパマイシンおよびエベロリムスの両方で検出される。同様に、ＰＰＰ３ＣＡのＦＫ５０６依存性結合またはピメクロリムス依存性結合をモニターすることも可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、シグナル窓が有意に増加することである。 ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイは、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）とＭＴＯＲまたはカルシニューリンとの間の化合物依存性相互作用の検出を可能にする。ＦＫＢＰ１Ａと公知の標的蛋白質との化合物依存性相互作用を、ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）ｇｐ１３０融合蛋白質またはカルシニューリンＰＰＰ３ＣＡ触媒サブユニットｇｐ１３０融合蛋白質と組み合わせたＦＫＢＰ１Ａベイト受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）を用いて評価した。図から分かるように、ＭＴＯＲの化合物誘導性動員は、ラパマイシンおよびエベロリムスの両方で検出される。同様に、ＰＰＰ３ＣＡのＦＫ５０６依存性結合またはピメクロリムス依存性結合をモニターすることも可能である。注目すべきは、カルシニューリン結合の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、シグナル窓が有意に増加することである。 ハイブリッドリガンド誘導性の、ＶＨＬへのＢＲＤ４基質動員を、ＭＡＰＰＩＴによって検出することができる。ここでは、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＶＨＬ）またはレプチン受容体細胞外ドメイン（ｐＣＬＧ－ＶＨＬ）を含むＭＡＰＰＩＴ派生的キメラ受容体構築物にＶＨＬベイト蛋白質を融合した。これらの構築物を、図７で用いたものと同一のＢＲＤ４（イソ型３）のＮ末端またはＣ末端ｇｐ１３０融合物、あるいは非融合ｇｐ１３０陰性対照構築物と組み合わせた。ＶＨＬ構築物およびＢＲＤ４構築物の両方を発現する細胞を、ある濃度範囲のＭＺ１（ＶＨＬとＢＲＤ４リガンドとの間の化学的融合物）で処理した；その結果、用量依存性ＭＡＰＰＩＴシグナルが誘導された。非融合ｇｐ１３０対照構築物で試験した場合には、何らのシグナルも得られなかった。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭのＭＺ１、その右隣のバーは０．１μＭのＭＺ１、さらにその右隣のバーは１μＭのＭＺ１、また最も右のバーが１０μＭのＭＺ１を表す。 ハイブリッドリガンド誘導性の、ＶＨＬへのＢＲＤ４基質動員を、ＭＡＰＰＩＴによって検出することができる。ここでは、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＶＨＬ）またはレプチン受容体細胞外ドメイン（ｐＣＬＧ－ＶＨＬ）を含むＭＡＰＰＩＴ派生的キメラ受容体構築物にＶＨＬベイト蛋白質を融合した。これらの構築物を、図７で用いたものと同一のＢＲＤ４（イソ型３）のＮ末端またはＣ末端ｇｐ１３０融合物、あるいは非融合ｇｐ１３０陰性対照構築物と組み合わせた。ＶＨＬ構築物およびＢＲＤ４構築物の両方を発現する細胞を、ある濃度範囲のＭＺ１（ＶＨＬとＢＲＤ４リガンドとの間の化学的融合物）で処理した；その結果、用量依存性ＭＡＰＰＩＴシグナルが誘導された。非融合ｇｐ１３０対照構築物で試験した場合には、何らのシグナルも得られなかった。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０μＭのＭＺ１、その右隣のバーは０．１μＭのＭＺ１、さらにその右隣のバーは１μＭのＭＺ１、また最も右のバーが１０μＭのＭＺ１を表す。 化合物集合体のスクリーニングによって、ＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへの動員を可能にする新規分子糊を同定する。ＣＲＢＮベイト受容体構築物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびＩＫＺＦ１（イソ型７）ｇｐ１３０融合構築物を共発現した図２Ａ～Ｌに記載のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを、９６種類のＩＭｉＤおよびＩＭｉＤ類似化合物の集合体のスクリーニングに用いた。第１スクリーニングでは、化合物を３種類の用量（低濃度、中濃度、および高濃度）で試験して、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１０Ａ～Ｃに示す曲線（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示している。化合物処理試料の曲線は２峰性であり、右にシフトしたピークは、ＤＭＳＯ処理対照よりも高いレポーターシグナルを示す化合物に相当する。応答性を示し、したがってＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへの動員を誘導する化合物であることを示す３種類の化合物に関して、用量応答性であること（ヒットしたこと）の確認を右パネルに示す。第１スクリーニングの各試験濃度に対応するシグナルを、用量応答曲線（点線、破線または実線）で用いたものに対応する線種の直線で示す。これらの試料曲線は、このアプローチが広範な効力範囲に渡って分子糊を同定可能であることを示している。 化合物集合体のスクリーニングによって、ＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへの動員を可能にする新規分子糊を同定する。ＣＲＢＮベイト受容体構築物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびＩＫＺＦ１（イソ型７）ｇｐ１３０融合構築物を共発現した図２Ａ～Ｌに記載のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを、９６種類のＩＭｉＤおよびＩＭｉＤ類似化合物の集合体のスクリーニングに用いた。第１スクリーニングでは、化合物を３種類の用量（低濃度、中濃度、および高濃度）で試験して、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１０Ａ～Ｃに示す曲線（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示している。化合物処理試料の曲線は２峰性であり、右にシフトしたピークは、ＤＭＳＯ処理対照よりも高いレポーターシグナルを示す化合物に相当する。応答性を示し、したがってＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへの動員を誘導する化合物であることを示す３種類の化合物に関して、用量応答性であること（ヒットしたこと）の確認を右パネルに示す。第１スクリーニングの各試験濃度に対応するシグナルを、用量応答曲線（点線、破線または実線）で用いたものに対応する線種の直線で示す。これらの試料曲線は、このアプローチが広範な効力範囲に渡って分子糊を同定可能であることを示している。 化合物集合体のスクリーニングによって、ＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへの動員を可能にする新規分子糊を同定する。ＣＲＢＮベイト受容体構築物（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびＩＫＺＦ１（イソ型７）ｇｐ１３０融合構築物を共発現した図２Ａ～Ｌに記載のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを、９６種類のＩＭｉＤおよびＩＭｉＤ類似化合物の集合体のスクリーニングに用いた。第１スクリーニングでは、化合物を３種類の用量（低濃度、中濃度、および高濃度）で試験して、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１０Ａ～Ｃに示す曲線（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示している。化合物処理試料の曲線は２峰性であり、右にシフトしたピークは、ＤＭＳＯ処理対照よりも高いレポーターシグナルを示す化合物に相当する。応答性を示し、したがってＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへの動員を誘導する化合物であることを示す３種類の化合物に関して、用量応答性であること（ヒットしたこと）の確認を右パネルに示す。第１スクリーニングの各試験濃度に対応するシグナルを、用量応答曲線（点線、破線または実線）で用いたものに対応する線種の直線で示す。これらの試料曲線は、このアプローチが広範な効力範囲に渡って分子糊を同定可能であることを示している。 ＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、新規の分子糊誘導性ＣＲＢＮネオ基質を検出する。ここでは、公知のＩＭｉＤ薬剤でありＣＲＢＮリガンドであるＣＣ－２２０に応答して、ＣＲＢＮへと動員される標的について、ヒトＯＲＦ（ｅｏｍｅ）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする、細胞マイクロアレイを基盤とするスクリーニング形態にＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを利用した。細胞内の蛋白質と低分子の相互作用を、アレイ形態の細胞クラスター内でアッセイした。細胞マイクロアレイの各スポットは、ＣＲＢＮとのリガンド誘導性（この場合には、ＣＣ－２２０誘導性）相互作用に関する単一の被検ＯＲＦ／蛋白質候補を発現する、かかる細胞クラスターに対応する。正の相互作用は細胞の蛍光の増加として測定される。多数の個々のＯＲＦ／標的蛋白質候補に渡る／関する細胞マイクロアレイ・スクリーニングの蛍光強度データをドットプロットしたものを示す。Ｘ軸は粒子数を示し、Ｙ軸はマイクロアレイにおける各細胞クラスターの積分強度を示す。図から分かるように、ＯＲＦ ｃＤＮＡの数についてシグナルの有意な誘導が認められる。応答を示し、それゆえにＣＣ－２２０分子糊（矢印で示される）によってＣＲＢＮへと動員される蛋白質であることが示される４種類のＯＲＦ ｃＤＮＡについて、ＣＲＢＮへのＣＣ－２２０用量依存性結合を確認する目的で用量応答曲線を作成した。これらの例は、このＭＡＰＰＩＴ派生的スクリーニングアプローチがＣＲＢＮの新規分子糊誘導性基質の同定を可能にすることを示している。 ＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、新規の分子糊誘導性ＣＲＢＮネオ基質を検出する。ここでは、公知のＩＭｉＤ薬剤でありＣＲＢＮリガンドであるＣＣ－２２０に応答して、ＣＲＢＮへと動員される標的について、ヒトＯＲＦ（ｅｏｍｅ）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする、細胞マイクロアレイを基盤とするスクリーニング形態にＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを利用した。細胞内の蛋白質と低分子の相互作用を、アレイ形態の細胞クラスター内でアッセイした。細胞マイクロアレイの各スポットは、ＣＲＢＮとのリガンド誘導性（この場合には、ＣＣ－２２０誘導性）相互作用に関する単一の被検ＯＲＦ／蛋白質候補を発現する、かかる細胞クラスターに対応する。正の相互作用は細胞の蛍光の増加として測定される。多数の個々のＯＲＦ／標的蛋白質候補に渡る／関する細胞マイクロアレイ・スクリーニングの蛍光強度データをドットプロットしたものを示す。Ｘ軸は粒子数を示し、Ｙ軸はマイクロアレイにおける各細胞クラスターの積分強度を示す。図から分かるように、ＯＲＦ ｃＤＮＡの数についてシグナルの有意な誘導が認められる。応答を示し、それゆえにＣＣ－２２０分子糊（矢印で示される）によってＣＲＢＮへと動員される蛋白質であることが示される４種類のＯＲＦ ｃＤＮＡについて、ＣＲＢＮへのＣＣ－２２０用量依存性結合を確認する目的で用量応答曲線を作成した。これらの例は、このＭＡＰＰＩＴ派生的スクリーニングアプローチがＣＲＢＮの新規分子糊誘導性基質の同定を可能にすることを示している。 ハイブリッドリガンド化合物のスクリーニングによって、目的とする標的蛋白質の公知および新規のリガンドを同定する。目的とする標的蛋白質の結合について、トリメトプリム（ＴＭＰ）融合ハイブリッドリガンド分子の集合体をスクリーニングする目的で、ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いた。このアッセイでは、ＴＭＰハイブリッドリガンドをＤＨＦＲ受容体融合に連結してＴＭＰ連結化合物をベイトとして提示するために、ＤＨＦＲに対するＴＭＰの高親和性を利用する。図１２Ａでは、ＥＳＲ１の公知リガンドであるタモキシフェン（ＴＡＭ）のＴＭＰ融合物と混合した、３２０種類の構成員から成る多様なハイブリッドリガンドセット（それぞれがＰＥＧリンカーによってＴＭＰに連結される多様な集合体の化合物を含む）のスクリーニングに、ＤＨＦＲ受容体融合（この場合には、レプチン受容体の細胞外ドメインを含む受容体融合蛋白質；ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）をエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）のｇｐ１３０融合物と一緒に共発現するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いた。単一用量で化合物のスクリーニングを行い、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１２Ａに示す曲線（左パネル）は化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示している。多様なセットについて予想されるように、化合物処理シグナルがＤＭＳＯ対照シグナルよりも高い少数の化合物を除いて、両者の分布はかなり重複するものであった。これらヒットしたもののうち１種類がＴＭＰ－ＴＡＭに一致した（頻度曲線上に実線で示す）。文献に報告されているように、低ナノモル範囲のＥＣ５０で、ＥＳＲ１に対するＴＭＰ－ＴＡＭの結合について得られたシグナルであることを、用量応答分析によって確認した。検証済み癌標的蛋白質であるＭＤＭ４の新規リガンドを同定するために、同様のスクリーニング設定を利用した。図１２Ｂに示すハイブリッドリガンドスクリーニングにおいて単一ヒットが得られ、この同定物は用量応答追跡実験で確認することができた。これらの例は、ここで用いたＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイが、目的とする特定標的蛋白質の新規リガンドの同定に利用可能であることを示している。 ハイブリッドリガンド化合物のスクリーニングによって、目的とする標的蛋白質の公知および新規のリガンドを同定する。目的とする標的蛋白質の結合について、トリメトプリム（ＴＭＰ）融合ハイブリッドリガンド分子の集合体をスクリーニングする目的で、ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いた。このアッセイでは、ＴＭＰハイブリッドリガンドをＤＨＦＲ受容体融合に連結してＴＭＰ連結化合物をベイトとして提示するために、ＤＨＦＲに対するＴＭＰの高親和性を利用する。図１２Ａでは、ＥＳＲ１の公知リガンドであるタモキシフェン（ＴＡＭ）のＴＭＰ融合物と混合した、３２０種類の構成員から成る多様なハイブリッドリガンドセット（それぞれがＰＥＧリンカーによってＴＭＰに連結される多様な集合体の化合物を含む）のスクリーニングに、ＤＨＦＲ受容体融合（この場合には、レプチン受容体の細胞外ドメインを含む受容体融合蛋白質；ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）をエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）のｇｐ１３０融合物と一緒に共発現するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いた。単一用量で化合物のスクリーニングを行い、ルシフェラーゼレポーターシグナルを判定した。図１２Ａに示す曲線（左パネル）は化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方についてのルシフェラーゼ・シグナル頻度分布を示している。多様なセットについて予想されるように、化合物処理シグナルがＤＭＳＯ対照シグナルよりも高い少数の化合物を除いて、両者の分布はかなり重複するものであった。これらヒットしたもののうち１種類がＴＭＰ－ＴＡＭに一致した（頻度曲線上に実線で示す）。文献に報告されているように、低ナノモル範囲のＥＣ５０で、ＥＳＲ１に対するＴＭＰ－ＴＡＭの結合について得られたシグナルであることを、用量応答分析によって確認した。検証済み癌標的蛋白質であるＭＤＭ４の新規リガンドを同定するために、同様のスクリーニング設定を利用した。図１２Ｂに示すハイブリッドリガンドスクリーニングにおいて単一ヒットが得られ、この同定物は用量応答追跡実験で確認することができた。これらの例は、ここで用いたＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイが、目的とする特定標的蛋白質の新規リガンドの同定に利用可能であることを示している。 アレイを基盤とするＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる、新規ハイブリッドリガンド標的の同定。ここでは、図１２Ａ～Ｂに記載するようなＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いて、ＴＭＰ融合ハイブリッドリガンドの標的に関するヒトＯＲＦ（ｅｏｍｅ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに、図１１Ａ～Ｂに記載するような細胞マイクロアレイを基盤とするスクリーニングアプローチを応用した。目的化合物（ここでは、標的が未知である、強力な抗腫瘍表現型を有する未開示化合物）を、ＤＨＦＲ受容体融合物に連結したＴＭＰハイブリッドリガンドベイトとして提示して、アレイ化ＯＲＦ ｃＤＮＡのｇｐ１３０融合物にコードされる蛋白質との相互作用を、アレイ上の対応スポットの細胞蛍光増加として検出した。図に示すドットプロットは、多数の個々のＯＲＦ／標的蛋白質候補に渡る／関する細胞マイクロアレイ・スクリーニングの蛍光データを表す。Ｘ軸は粒子数を示し、Ｙ軸はマイクロアレイにおける各細胞クラスターの積分強度を示す。図から分かるように、特異的ＯＲＦ ｃＤＮＡ（矢印で示される）に強いシグナルが観察され、またこの相互作用は用量応答分析によって確認することができた。このデータは、ここに記載のＭＡＰＰＩＴ派生的スクリーニングアプローチが、ＴＭＰ誘導体化リガンド融合分子を用いた、リガンドに関する新規標的の同定を可能にすることを示している。 アレイを基盤とするＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる、新規ハイブリッドリガンド標的の同定。ここでは、図１２Ａ～Ｂに記載するようなＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いて、ＴＭＰ融合ハイブリッドリガンドの標的に関するヒトＯＲＦ（ｅｏｍｅ）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに、図１１Ａ～Ｂに記載するような細胞マイクロアレイを基盤とするスクリーニングアプローチを応用した。目的化合物（ここでは、標的が未知である、強力な抗腫瘍表現型を有する未開示化合物）を、ＤＨＦＲ受容体融合物に連結したＴＭＰハイブリッドリガンドベイトとして提示して、アレイ化ＯＲＦ ｃＤＮＡのｇｐ１３０融合物にコードされる蛋白質との相互作用を、アレイ上の対応スポットの細胞蛍光増加として検出した。図に示すドットプロットは、多数の個々のＯＲＦ／標的蛋白質候補に渡る／関する細胞マイクロアレイ・スクリーニングの蛍光データを表す。Ｘ軸は粒子数を示し、Ｙ軸はマイクロアレイにおける各細胞クラスターの積分強度を示す。図から分かるように、特異的ＯＲＦ ｃＤＮＡ（矢印で示される）に強いシグナルが観察され、またこの相互作用は用量応答分析によって確認することができた。このデータは、ここに記載のＭＡＰＰＩＴ派生的スクリーニングアプローチが、ＴＭＰ誘導体化リガンド融合分子を用いた、リガンドに関する新規標的の同定を可能にすることを示している。 ＦＫＢＰ蛋白質とＭＴＯＲとの間のラパマイシン誘導性結合の同定。ＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）の動員に関して、ＦＫＢＰ蛋白質ファミリーの異なる構成員（ＦＫＢＰ１Ａ／ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ４およびＦＫＢＰ５）をＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイで評価した；ここではＦＫＢＰ蛋白質をＥｐｏ受容体の細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰｘ）として発現し、ＭＴＯＲ（ＦＲＢ）はｇｐ１３０に融合した。図から分かるように、試験したＦＫＢＰ蛋白質のそれぞれについて、ラパマイシン用量依存性シグナルが得られたが、これらは既報に一致するものであった。ヒストグラムの各セットにおいて、最も左のバーは０ｎＭのラパマイシン、その右隣のバーは１ｎＭのラパマイシン、さらにその右隣のバーは１０ｎＭのラパマイシン、また最も右のバーが１００ｎＭのラパマイシンを表す。
本開示は、細胞を基盤とするシステムおよび方法であって、標準的アッセイを用いた場合には検出可能ではない分子相互作用（例えば、蛋白質／蛋白質、蛋白質／低分子、および／または低分子によって調節される蛋白質／蛋白質相互作用）の検査を可能にするシステムおよび方法の発見に部分的には基づくものである。
一局面において、本法は分子相互作用を検出する方法を可能にし、該方法は：
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が：
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）該第１の受容体または第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した細胞内Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質を有し、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ動員を低減または排除する変異を含む、
該第１の受容体または第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片である、
発現させること；
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
を含む。
様々な実施態様において、本発明は分子相互作用を検出する方法に関するが、該方法は：
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第１の受容体または第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、およびそれに融合した足場蛋白質を有する膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ（シグナル伝達因子および転写活性化因子）動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン
を含み；
（ｂ）受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片である、
発現させること；
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、該足場蛋白質はＥ３リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、該足場蛋白質とＥ３リガーゼ基質結合サブユニットの間の複合体はプレイと相互作用する。
いくつかの局面において、本法は分子相互作用を検出する方法を可能にし、該方法は：
（ａ）リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が：
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）そのような第１の受容体または第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した１種類の蛋白質（または複数種類の蛋白質）を有し、
細胞内Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質と相互作用可能であり、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含み；
（ｂ）受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む受容体断片である、
発現させること；
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
を含む。実施態様においては、該ベイト蛋白質が足場蛋白質およびＥ３リガーゼ基質結合サブユニットベイトに会合する。実施態様においては、該ベイト蛋白質を該膜貫通蛋白質に直接的に融合する。
いくつかの実施態様においては、本明細書中に記載のようなシステムにおけるプレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、プレイ蛋白質に融合した受容体断片を含む蛋白質複合体の形成が起こる。そのような受容体断片の複合体への動員によって、受容体結合ＪＡＫキナーゼ（例えば、ＪＡＫ２）の利用可能な基質として配置されるので、リガンド依存性受容体シグナル伝達およびＳＴＡＴ分子の活性化を回復する。いくつかの実施態様において、該細胞はＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、活性化したＳＴＡＴ分子は核内に移行してＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導し、場合によっては、該レポーター遺伝子シグナルにより分子相互作用の検出および／または発見が可能になることもある。
いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は蛋白質／蛋白質相互作用である。いくつかの実施態様においては、ベイトおよびプレイはいずれも蛋白質である。
本発明はまた、化合物ライブラリーを分析することを含む。実施態様においては、ベイトが化合物に結合するが、このベイト／化合物複合体はプレイと相互作用するのであってもよい。したがって、実施態様において、本法は化合物仲介性の新規の蛋白質／蛋白質相互作用および／または新規の蛋白質／化合物相互作用の検出および／または発見を可能にする。実施態様において、本法は分子糊として働く新規化合物の検出および／または発見を可能にする。実施態様において、本法は弱いベイト／プレイ相互作用を強いベイト／プレイ相互作用に変換する新規化合物の検出および／または発見を可能にする。
いくつかの実施態様において、ベイトはユビキチンプロテアソームシステムを調節する蛋白質であるか、または調節する蛋白質を含む。いくつかの実施態様において、ベイトはＥ３リガーゼ蛋白質またはＥ３リガーゼ蛋白質を調節する蛋白質であるか、またはＥ３リガーゼ蛋白質またはＥ３リガーゼ蛋白質を調節する蛋白質を含む。いくつかの実施態様において、ベイトはカリンリングリガーゼ（ＣＲＬ）蛋白質またはＣＲＬ蛋白質を調節する蛋白質であるか、またはカリンリングリガーゼ（ＣＲＬ）蛋白質またはＣＲＬ蛋白質を調節する蛋白質を含む。様々な実施態様において、ベイトはＣＲＬ４蛋白質またはＣＲＬ４蛋白質を調節する蛋白質であるか、またはＣＲＬ４蛋白質またはＣＲＬ４蛋白質を調節する蛋白質を含む。いくつかの実施態様においては、ベイトはＤＤＢ１－ＣＵＬ４－関連因子（ＤＣＡＦ）蛋白質またはＤＣＡＦを調節する蛋白質であるか、またはＤＤＢ１－ＣＵＬ４－関連因子（ＤＣＡＦ）蛋白質またはＤＣＡＦを調節する蛋白質を含む。
いくつかの実施態様において、ベイトはセレブロン（ＣＲＢＮ）およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）のうちの１種類以上であるか、あるいは１種類以上を含む。
実施態様においては、ＣＲＢＮまたはＶＨＬを本明細書中に記載のような膜貫通ドメインに融合させる。実施態様においては、ＣＲＢＮまたはＶＨＬを本明細書中に記載のような膜貫通ドメインには融合させない；例えば、本明細書中に記載のような膜貫通ドメインに融合した足場蛋白質と相互作用した時に、ベイトとして働く。
実施態様において、ベイトはＥ３リガーゼ基質結合サブユニットである。
実施態様においては、該Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットは以下の遺伝子によってコードされる蛋白質から選択される：
ＡＭＦＲ、ＡＮＡＰＣ１１、ＡＰＧ１６Ｌ、ＡＲＩＨ１、ＡＲＩＨ２、ＡＲＰＣ１Ａ、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＡＳＢ２、ＡＳＢ２、ＡＴＧ１６Ｌ１、ＢＡＦ２５０、ＢＡＲＤ１、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ４、ＢＩＲＣ７、ＢＭＩ１、ＢＲＡＰ、ＢＲＣＡ１、ｂＴｒＣＰ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＬＬ１、ＣＣＩＮ、ＣＣＩＮ、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＲＢＮ、ＣＨＦＲ、ＣＨＩＰ、ＣＮＯＴ４、ＣＯＰ１、ＣＳＡ、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ１０、ＤＣＡＦ１１、ＤＣＡＦ１２、ＤＣＡＦ１３、ＤＣＡＦ１４、ＤＣＡＦ１５、ＤＣＡＦ１６、ＤＣＡＦ１７、ＤＣＡＦ１９、ＤＣＡＦ２、ＤＣＡＦ３、ＤＣＡＦ４、ＤＣＡＦ５、ＤＣＡＦ６、ＤＣＡＦ７、ＤＣＡＦ８、ＤＣＡＦ９、Ｄｄａ１、ＤＤＢ２、ＤＥＴ１、ＤＮＡＩ２、ＤＴＸ３、ＤＺＩＰ３、Ｅ６ＡＰ、ＥＤＤ、ＥＥＤ、ＥＮＣ１、ＥＮＣ１、ＦＡＮＣＬ、ＦＢＸＬ１、ＦＢＸＬ１０、ＦＢＸＬ１１、ＦＢＸＬ１２、ＦＢＸＬ１３、ＦＢＸＬ１４、ＦＢＸＬ１５、ＦＢＸＬ１６、ＦＢＸＬ１７、ＦＢＸＬ１８、ＦＢＸＬ１９、ＦＢＸＬ２０、ＦＢＸＬ２１、ＦＢＸＬ２２、ＦＢＸＬ３、ＦＢＸＬ４、ＦＢＸＬ５、ＦＢＸＬ７、ＦＢＸＬ８、ＦＢＸＯ１、ＦＢＸＯ１０、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＯ１２、ＦＢＸＯ１３、ＦＢＸＯ１４、ＦＢＸＯ１５、ＦＢＸＯ１６、ＦＢＸＯ１７、ＦＢＸＯ１８、ＦＢＸＯ１９、ＦＢＸＯ２、ＦＢＸＯ２０、ＦＢＸＯ２１、ＦＢＸＯ２２、ＦＢＸＯ３、ＦＢＸＯ４、ＦＢＸＯ５、ＦＢＸＯ６、ＦＢＸＯ７、ＦＢＸＯ８、ＦＢＸＷ１、ＦＢＸＷ１０、ＦＢＸＷ１１、ＦＢＸＷ１２、ＦＢＸＷ５、ＦＢＸＷ７、ＦＢＸＷ８、ＦＢＸＷ９、ＦＥＭ１Ａ、ＦＥＭ１Ｂ、ＦＥＭ１Ｃ、ＧＡＮ、ＧＡＮ、ＧＮＢ１、ＧＮＢ２、ＧＮＢ５、ＧＲＷＤ１、ＧＴＦ２Ｈ２、ＧＴＦ３Ｃ２、ＨＡＣＥ１、ＨＥＣＴＤ１、ＨＥＣＴＤ２、ＨＥＣＴＤ３、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＬＴＦ、ＨＯＩＰ、ＨＵＷＥ１、ＩＢＲＤＣ２、ＩＢＲＤＣ３、ＩＦＲＧ１５、ＩＰＰ、ＩＰＰ、ＩＴＣＨ、ＩＶＮＳ１ＡＢＰ、ＩＶＮＳ１ＡＢＰ、ＫＡＴＮＢ１、ＫＢＴＢＤ１０、ＫＢＴＢＤ１０、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＢＴＢＤ１１、ＫＢＴＢＤ１２、ＫＢＴＢＤ１２、ＫＢＴＢＤ１３、ＫＢＴＢＤ１３、ＫＢＴＢＤ２、ＫＢＴＢＤ２、ＫＢＴＢＤ３、ＫＢＴＢＤ３、ＫＢＴＢＤ４、ＫＢＴＢＤ４、ＫＢＴＢＤ５、ＫＢＴＢＤ５、ＫＢＴＢＤ６、ＫＢＴＢＤ６、ＫＢＴＢＤ７、ＫＢＴＢＤ７、ＫＢＴＢＤ８、ＫＢＴＢＤ８、ＫＣＴＤ５、ＫＥＡＰ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ０３１７、ＫＩＡＡ０６１４、ＫＬＨＤＣ５、ＫＬＨＬ１、ＫＬＨＬ１、ＫＬＨＬ１０、ＫＬＨＬ１０、ＫＬＨＬ１１、ＫＬＨＬ１１、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１２、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１３、ＫＬＨＬ１４、ＫＬＨＬ１４、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ１５、ＫＬＨＬ１７、ＫＬＨＬ１７、ＫＬＨＬ１８、ＫＬＨＬ１８、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ２、ＫＬＨＬ２０、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２１、ＫＬＨＬ２２、ＫＬＨＬ２２、ＫＬＨＬ２３、ＫＬＨＬ２３、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ２４、ＫＬＨＬ２５、ＫＬＨＬ２５、ＫＬＨＬ２６、ＫＬＨＬ２６、ＫＬＨＬ２８、ＫＬＨＬ２８、ＫＬＨＬ２９、ＫＬＨＬ２９、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ３、ＫＬＨＬ３０、ＫＬＨＬ３０、ＫＬＨＬ３１、ＫＬＨＬ３１、ＫＬＨＬ３２、ＫＬＨＬ３２、ＫＬＨＬ３３、ＫＬＨＬ３３、ＫＬＨＬ３４、ＫＬＨＬ３４、ＫＬＨＬ３５、ＫＬＨＬ３５、ＫＬＨＬ３６、ＫＬＨＬ３６、ＫＬＨＬ３８、ＫＬＨＬ３８、ＫＬＨＬ４、ＫＬＨＬ４、ＫＬＨＬ５、ＫＬＨＬ５、ＫＬＨＬ６、ＫＬＨＬ６、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ７、ＫＬＨＬ８、ＫＬＨＬ８、ＫＬＨＬ９、ＫＬＨＬ９、ＬＩＮＣＲ、ＬＮＸ１、ＬＲＲ１、ＬＲＲＣ４１、ＬＲＳＡＭ１、ＬＺＴＲ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＢ１８、ＭＡＧＥ－Ｂ１８、ＭＡＧＥＢ２、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥＣ２、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＬＩＮ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ１１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ５、ＭＡＲＣＨ６、ＭＡＲＣＨ７、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＸ、ＭＧＲＮ１、ＭＩＢ１、ＭＩＢ２、ＭＩＤ１、ＭＫＲＮ１、ＭＮＡＴ１、ＭＵＦ１、ＭＵＬＡＮ、ＭＵＲＦ、ＭＹＣＢＰ２、ＭＹＬＩＰ、Ｎｅｄｄ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＮＥＤＬ１、ＮＥＤＬ２、ＮＥＵＲＬ、ＮＥＵＲＬ２、ＮＬＥ１、ＮＵＰ４３、ＯＳＴＭ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＫ２、ＰＣＧＦ１、ＰＣＧＦ２、ＰＤＺＲＮ３、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ７、ＰＪＡ１、ＰＪＡ２、ＰＯＣ１Ａ、ＰＰＩＬ２、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＰＦ１９、ＰＷＰ１、ＲＡＣＫ１、ＲＡＤ１８、ＲＡＥ１、ＲＡＧ１、ＲＢＢＰ４、ＲＢＢＰ５、ＲＢＢＰ６、ＲＢＢＰ７、ＲＢＣＫ１、ＲＢＸ１、ＲＣＨＹ１、ＲＦＦＬ、ＲＦＰＬ４Ａ、ＲＦＷＤ２、ＲＩＮＧ１、ＲＮＦ１０３、ＲＮＦ１１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ１１４、ＲＮＦ１２、ＲＮＦ１２３、ＲＮＦ１２５、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ１３０、ＲＮＦ１３３、ＲＮＦ１３５、ＲＮＦ１３８、ＲＮＦ１３９、ＲＮＦ１４、ＲＮＦ１４４Ａ、ＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１６８、ＲＮＦ１８０、ＲＮＦ１８１、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ１９、ＲＮＦ２、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２１６、ＲＮＦ２５、ＲＮＦ３４、ＲＮＦ４、ＲＮＦ４０、ＲＮＦ４１、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ５、ＲＮＦ６、ＲＮＦ７、ＲＮＦ８、ＲＮＦ８５、ＲＰＴＯＲ、ＳＣＡＰ、ＳＨ３ＲＦ１、ＳＨＰＲＨ、ＳＩＡＨ１、ＳＩＡＨ２、ＳＭＵ１、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＰＯＰ、ＳＰＳＢ１、ＳＰＳＢ１、ＳＰＳＢ２、ＳＰＳＢ２、ＳＰＳＢ４、ＳＰＳＢ４、ＳＴＸＢＰ５Ｌ、ＳＹＶＮ１、ＴＡＦ５Ｌ、ＴＢＬ１Ｙ、ＴＨＯＣ３、ＴＬＥ１、ＴＬＥ２、ＴＬＥ３、ＴＯＰＯＲＳ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ７、ＴＲＡＩＰ、ＴＲＩＡＤ３、ＴＲＩＭ１、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１２、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１４、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１６、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ１８、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２２、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ２９、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３６、ＴＲＩＭ３７、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４０、ＴＲＩＭ４１、ＴＲＩＭ４４、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４７、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４、ＴＲＩＭ５５、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６２、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６６、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ７１、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＰ１２、ＴＲＰＣ４ＡＰ、ＴＳＳＣ１、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ３、ＵＢＲ４、ＵＨＲＦ１、ＵＨＲＦ２、ＶＨＬ、ＶＰＳ１８、ＷＤＲ１２、ＷＤＲ２３、ＷＤＲ２６、ＷＤＲ３、ＷＤＲ３１、ＷＤＲ３７、ＷＤＲ３９、ＷＤＲ４、ＷＤＲ４７、ＷＤＲ４８、ＷＤＲ５、ＷＤＲ５１Ｂ、ＷＤＲ５３、ＷＤＲ５７、ＷＤＲ５９、ＷＤＲ５Ｂ、ＷＤＲ６１、ＷＤＲ７６、ＷＤＲ７７、ＷＤＲ８２、ＷＤＲ８３、ＷＤＲ８６、ＷＳＢ１、ＷＳＢ２、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＺＮＦ２９４、ＺＮＦ３１３、ＺＮＦ３６４、ＺＮＲＦ１、ＺＮＲＦ２、ＺＹＧ１１Ａ、ＺＹＧ１１Ｂ、またはＺＹＧ１１ＢＬ。
実施態様において、該Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットはＣＲＢＮまたはＶＨＬである。
実施態様において、該足場蛋白質はＥ３リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、該足場蛋白質とＥ３リガーゼ基質結合サブユニットとの間の複合体はプレイと相互作用する。
実施態様において、該足場は以下から選択される：
ＢＩＲＣ６、ＣＵＬ３、ＤＤＢ１、ＥＬＯＢ、ＥＬＯＣ、ＲＢＸ１、ＳＫＰ１、ＵＢＣＨ５Ａ、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｂ、ＵＢＥ２Ｂ２、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＢＥ２Ｄ１、ＵＢＥ２Ｄ２、ＵＢＥ２Ｄ３、ＵＢＥ２Ｄ４、ＵＢＥ２Ｅ１、ＵＢＥ２Ｅ２、ＵＢＥ２Ｅ３、ＵＢＥ２Ｆ、ＵＢＥ２Ｇ１、ＵＢＥ２Ｇ２、ＵＢＥ２Ｈ、ＵＢＥ２Ｊ１、ＵＢＥ２Ｊ２、ＵＢＥ２Ｋ、ＵＢＥ２Ｌ３、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＢＥ２Ｍ、ＵＢＥ２Ｎ、ＵＢＥ２ＮＬ、ＵＢＥ２Ｏ、ＵＢＥ２Ｑ１、ＵＢＥ２Ｑ２、ＵＢＥ２ＱＬ、ＵＢＥ２Ｒ１、ＵＢＥ２Ｒ２、ＵＢＥ２Ｓ、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＢＥ２Ｕ、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｖ１、ＵＢＥ２Ｖ２、およびＵＢＥ２Ｗ。
いくつかの実施態様において、該足場蛋白質は、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、およびカリン１の制御因子（ＲＯＣ１）から選択される。
様々な実施態様において、ベイトは、セレブロン（ＣＲＢＮ）、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、カリン１の制御因子（ＲＯＣ１）、およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）のうちの１種類以上を含む。
いくつかの実施態様において、プレイはＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質である。実施態様において、ＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、ｉの側鎖とｉ＋３のバックボーンＮＨとの間、およびｉのバックボーンのカルボニル酸素とｉ＋４のバックボーンＮＨとの間に水素結合を有するＡｓｘまたはＳＴモチーフなどの、水素結合受容体を有する側鎖を含むｉ－残基を有するｂ－ヘアピンａ－ターンを含む。実施態様において、ｉ＋４残基はグリシンである（ＧＳＰＴ１、ＣＫ１ａが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）。実施態様において、ＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、システインである残基ｉおよびｉ＋３ならびにグリシンであるｉ＋４残基を含むｂ－ヘアピンａ－ターンを有する。該２つのＣｙｓ残基は亜鉛イオンに結合して、ターンの形態を強化する（ＩＫＺＦ１、ＺｎＦ６９２および以下の参考文献に報告されている全ての基質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない：「ＣＲＢＮによってサリドマイド類似体の標的となるヒトＣ２Ｈ２ジンクフィンガーデグロムを絞り込む（Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｃ２Ｈ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｄｅｇｒｏｍｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＲＢＮ）」、Ｓｉｅｖｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３６２、Ｉｓｓｕｅ ６４１４、ＤＯＩ： １ ０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ． ａａｔ０５７２ （２０１８）；本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる）。実施態様においては、ＣＲＢＮの基質および／またはネオ基質は、ｉ＋３の位置にグリシンを含むｂ－ヘアピンｂ－ターンである「偽性ループ」を有する。ターン構造は、ｉ－１の側鎖の水素結合受容体とｉ＋３グリシンのカルボニルとの間の水素結合によって強化され得る。
実施態様においては、ＣＲＢＮは、ヒトＣＲＢＮ蛋白質（例えば、ヒトＣＲＢＮイソ型１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０５７３８６）；またはヒトＣＲＢＮイソ型２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１１６６９５３）など、いずれかのＣＲＢＮのアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチド（そのＳＮＰ変異体を含む）を指す；上記の各参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。関連ＣＲＢＮポリペプチドは、対立遺伝子変異体（例えば、ＳＮＰ変異体）；スプライス変異体；断片；誘導体；置換、欠失、および挿入変異体；融合ポリペプチド；および生物種相同体を含み、これらは、特定の実施態様においては、ＣＲＢＮ活性を保持し、および／または抗ＣＲＢＮ免疫応答を充分起こし得るものである。
いくつかの実施態様において、プレイは、イカロス（Ｉｋａｒｏｓ）（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（Ａｉｏｌｏｓ）（ＩＫＺＦ３）、Ｅｏｓ（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ）（ＩＫＺＦ５）、ＳＡＬＬ４、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１のうちの１種類以上である。様々な実施態様において、プレイは、イカロス（Ｉｋａｒｏｓ）（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（Ａｉｏｌｏｓ）（ＩＫＺＦ３）、Ｅｏｓ（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ）（ＩＫＺＦ５）、ＳＡＬＬ４、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１のうちの１種類以上である。いくつかの実施態様においては、プレイは、イカロス（Ｉｋａｒｏｓ）（ＩＫＺＦ１）、ヘリオス（Ｈｅｌｉｏｓ）（ＩＫＺＦ２）、アイオロス（Ａｉｏｌｏｓ）（ＩＫＺＦ３）、Ｅｏｓ（ＩＫＺＦ４）、ペガサス（Ｐｅｇａｓｕｓ）（ＩＫＺＦ５）、ＳＡＬＬ４、ＣＳＮＫ１Ａ、ＣＫ１ａ、およびＺＦＰ９１のうちの１種類以上である。
いくつかの実施態様において、本法は、１種類以上のＥ３リガーゼ基質結合サブユニット（ＣＲＢＮおよびＶＨＬなどが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）をベイト（またはＤＤＢ１、ＣＵＬ４Ａ、およびＲＯＣ１などの足場蛋白質と会合し、ＣＲＢＮまたはＶＨＬに接触しているベイト）として含み、該ベイトと相互作用する蛋白質プレイを発見するために、該ベイトを本明細書中に記載の化合物（例えば、１種類以上のＥ３リガーゼ基質結合サブユニット（ＣＲＢＮおよびＶＨＬなどが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）に結合する化合物（例えば、ＩＭｉＤ）に接触させる；その理由は、ベイトが該化合物によって調節されるからである。例えば、該方法では、該化合物によって調節されるベイトに接触し相互作用するプレイを同定する。いくつかの実施態様においては、ベイトとの相互作用により、該プレイが動員および／または分解される。そのような実施態様おいては、プレイが該化合物と直接に相互作用するのではないことが挙げられるが、それのみに限定されるものではない。
いくつかの実施態様において、本法はＣＲＢＮの新規の基質またはネオ基質の同定を可能にする。
いくつかの実施態様において、本法は、１種類以上のＥ３リガーゼ基質結合サブユニット（ＣＲＢＮおよびＶＨＬなどが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）をベイト（またはＤＤＢ１、ＣＵＬ４Ａ、およびＲＯＣ１などの足場蛋白質と会合し、ＣＲＢＮまたはＶＨＬに接触しているベイト）として含み、低分子によって調節される新規の蛋白質／蛋白質相互作用を検出するために、該ベイト（例えば、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットの基質またはネオ基質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）と相互作用する蛋白質プレイの存在下で、該ベイトを被検化合物に接触させる。例えば、該方法では、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットの基質またはネオ基質を含む、そのようなベイトとの複合体において、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットベイトと相互作用可能なものとして、化合物を同定する。例えば、該方法では、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットベイトと相互作用可能で、第２の蛋白質（例えば、プレイ、例えば、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットの基質またはネオ基質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない）の動員および／またはユビキチン化および／または分解を調節可能なものとして、化合物を同定する。
いくつかの実施態様において、本発明のベイト蛋白質はＥ３リガーゼ基質結合サブユニットである。Ｅ３リガーゼ（ユビキチンリガーゼともよばれる）は、多様な一群の蛋白質であり、機能的にはいずれも標的蛋白質を認識して、標的蛋白質とユビキチン部分との間の共有結合を仲介する。これらの蛋白質は、標的特異性とユビキチン化プロセスの固有性を提供する。Ｅ３リガーゼは、ユビキチンが負荷されたＥ２ユビキチン結合酵素を動員し、標的蛋白質を認識して、Ｅ２から蛋白質基質へのユビキチン転移を支援または直接的に触媒する。
本発明に記載の方法は、当該技術分野で公知のＥ３リガーゼを用いて実施することができる。いくつかの実施態様においては、本発明のＥ３リガーゼは、Ｅ２ユビキチンチオエステルおよび基質蛋白質の両者と相互作用し標的蛋白質のリジン残基（ポリユビキチン鎖開始）への効率的なユビキチン転移またはユビキチン伸長鎖のユビキチンへの効率的なユビキチン転移を触媒する蛋白質を含む。いくつかの実施態様においては、本発明の方法はＥ３リガーゼのサブユニットを含む。本発明のＥ３リガーゼサブユニットは、機能的Ｅ３リガーゼまたは機能的Ｅ３リガーゼの非機能的部分であり得る。
いくつかの実施態様においては、本発明のＥ３リガーゼまたはそのサブユニットは、セレブロン（ＣＲＢＮ）およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）から選択される。
一実施態様においては、本発明のＥ３リガーゼは、セレブロンまたはそのサブユニットである。
いくつかの実施態様においては、該足場蛋白質は、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、カリン１の制御因子（ＲＯＣ１）、ＳＫＰ１、ＳＫＰ１相互作用パートナー（ＳＫＩＰ２）、βトランスデューシン反復配列含有蛋白質（β－ＴｒＣＰ）、二重微小染色体４蛋白質（ＭＤＭ４）、Ｘ連鎖アポトーシス抑制因子（ＸＩＡＰ）、ＤＤＢ１およびＣＵＬ４関連因子１５（ＤＣＡＦ１５）、およびＷＤリピートドメイン１２（ＷＤＲ１２）またはそのサブユニットである。
いくつかの実施態様において、本法は、新規相互作用パートナー、例えば、化合物に結合する蛋白質の基質またはネオ基質の同定を可能にするが、ここで該蛋白質は、該化合物のグルタルイミド環と、例えば、水素結合によって相互作用することのできる、カゴ（ｃａｇｅ）状配置をとる３つのトリプトファン残基を有する。いくつかの実施態様において、該相互作用パートナー（例えば、基質および／またはネオ基質）は、表面β－ヘアピンループを有し、該表面β－ヘアピンループは、ターンの先端に３つのバックボーン水素結合受容体とそれに続くグリシン残基の配置を有するのであってもよい。いくつかの実施態様において、該相互作用パートナー（例えば、基質および／またはネオ基質）はデグロンモチーフを有する（Ｍｅｓｚａｒｏｓら、Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７：１０、４７０を参照のこと；本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる）。
いくつかの実施態様において、該ベイトは、該化合物（免疫調節薬剤または免疫調節性イミド薬剤（ＩＭｉＤ）など）のグルタルイミド環と、例えば、水素結合によって相互作用することのできる、カゴ（ｃａｇｅ）状配置をとる３つのトリプトファン残基を有する蛋白質である。
いくつかの実施態様においては、該プレイ（例えば、基質および／またはネオ基質）は、表面β－ヘアピンループを有し、該表面β－ヘアピンループは、ターンの先端に３つのバックボーン水素結合受容体とそれに続くグリシン残基の配置を有するのであってもよい。いくつかの実施態様においては、該プレイ（例えば、基質および／またはネオ基質）はデグロンモチーフを有する（Ｍｅｓｚａｒｏｓら、Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７：１０、４７０を参照のこと；本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる）。
様々な実施態様においては、本開示の方法によって、低分子のプレイ蛋白質またはベイトとの結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。いくつかの実施態様において、該方法は、プレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む。いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と結合することによって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用である。
いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と結合することによって仲介される２種類以上の蛋白質／蛋白質相互作用である。一実施態様において、該低分子はベイト蛋白質に結合し、この結合によってベイト蛋白質に変化が生じるが、該低分子との結合後にベイト蛋白質がプレイ蛋白質に結合することができるようになる。例えば、一実施態様においては、該低分子のベイト蛋白質への結合によって、ベイト蛋白質にコンフォメーション変化が起こる；例えば、プレイ蛋白質がベイト蛋白質に結合できるようにベイト蛋白質の結合部位が接触可能になる。別の一実施態様においては、該低分子のベイト蛋白質への結合によって、ベイト蛋白質内部の疎水性結合部位が開く、または露出するので、プレイ蛋白質がベイト蛋白質の疎水性結合部位に結合可能になる。
他の実施態様においては、該低分子がプレイ蛋白質に結合し、この結合によってプレイ蛋白質に変化が生じるが、それによってプレイ蛋白質はベイト蛋白質に相互作用／結合できるようになる。いくつかの実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質への結合によって、プレイ蛋白質にコンフォメーション変化が起こり、それによってプレイ蛋白質の結合部位がベイト蛋白質に接触できるようになり、ベイト蛋白質がプレイ蛋白質に結合可能となる。他の実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質への結合によって、プレイ蛋白質内部の疎水性結合部位が開く、または露出するので、ベイト蛋白質がプレイ蛋白質の疎水性結合部位に結合可能になる。
さらに別の実施態様において、本法は、ベイト蛋白質にもプレイ蛋白質にも結合しないが、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との間の複合体には結合する低分子を含む。例えば、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との間の相互作用によって、低分子結合部位が再構成または形成され得る。いくつかの実施態様においては、該低分子結合部位がベイト蛋白質に存在し、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との複合体形成によってその部位が露出する。他の実施態様においては、該低分子結合部位がプレイ蛋白質に存在し、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との複合体形成によってその部位が露出する。いくつかの実施態様においては、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との相互作用によって、既存の低分子結合部位が露出する、あるいは該相互作用が低分子結合部位の形成を誘導する。
いくつかの実施態様において、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用は、蛋白質／蛋白質界面の部位、または該蛋白質内部におけるプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と低分子との間の直接結合である。例えば、一実施態様においては、該低分子が、ベイト蛋白質／低分子複合体を直接形成するベイト蛋白質に結合できる。別の一実施態様においては、該低分子が、プレイ蛋白質／低分子複合体を直接形成するプレイ蛋白質に結合できる。
本発明ではまた、該低分子、プレイ蛋白質およびベイト蛋白質が互いに同時に相互作用する分子相互作用についても意図する。例えば、一実施態様においては、該低分子がベイト蛋白質およびプレイ蛋白質の両方に直接結合する。いくつかの実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用は、プレイ蛋白質またはベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される。いくつかの実施態様においては、該低分子のベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用は、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される。
いくつかの実施態様においては、該低分子がベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによってプレイ蛋白質との相互作用が可能になる。いくつかの実施態様においては、該低分子がプレイ蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによってベイト蛋白質との相互作用が可能になる。
いくつかの実施態様においては、該低分子は分子糊である。分子糊は、場合によっては、蛋白質の非天然の会合であって治療効果を発揮する会合を促進する分子のこともある。いくつかの実施態様においては、分子糊はリンカーによって２種類の低分子が一緒に連結された分子である。例えば、実施態様において、該化合物は、ＣＲＢＮ、ＶＨＬ、およびＦＫＢＰの１種類と相互作用する化合物を含むハイブリッドリガンドである。
他の実施態様において、分子糊は単一の低分子であって、該低分子を他の低分子に連結するリンカーを有していない低分子である。いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は複合体形成である。いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は低分子／蛋白質相互作用である。
いくつかの実施態様において、該低分子または化合物は免疫調節物質である。いくつかの実施態様において、該化合物は、グルタルイミド環を含み、かつ任意選択的にフタルイミド環を含んでいてもよいグルタミン酸誘導体である。いくつかの実施態様において、該フタルイミド環は化学的に修飾される。いくつかの実施態様において、該グルタミン酸誘導体は本開示の実施態様にしたがう特性を有する合成誘導体であり得る。いくつかの実施態様において、該化合物は免疫調節薬剤または免疫調節性イミド薬剤（ＩＭｉＤ）として知られる化合物群の構成員である。実施態様において、該化合物はＩＭｉＤ様グルタルイミド環を含むが、それ以外は化学構造的に異なっており、ＣＲＢＮのグルタルアミド－ＩＭｉＤ（ＣＲＢＮのＩＭｉＤ結合ポケット）と同一の低分子結合ポケットに結合する。実施態様において、該化合物はグルタルアミド環を含まずにＣＲＢＮのＩＭｉＤポケットに結合することができる。実施態様において、該化合物はＣＲＢＮに結合するがＩＭｉＤポケットには結合しない。実施態様においては、ＩＭｉＤポケットがＣＲＢＮのＣＵＬＴ（細胞リガンドとサリドマイドを結合する、活性未知のセレブロンドメイン（ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ））ドメイン内部に含まれる；ＰＤＢのエントリー：４ＴＺ４、５ＦＱＤ、５ＨＸＢ、５Ｖ３Ｏ、６Ｈ０Ｆ、および６Ｈ０Ｇ、ならびにＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ． ２０１５ Ｊａｎ； １１（１）： ｅ１００４０２３を参照のこと；これらの各参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施態様において、該化合物は、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＣ－２２０、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体である。
いくつかの実施態様において、該化合物は、アバドミド、エンドミド、イベルドミド、レナリドミド、ミチンドミド、ポマリドミド、およびサリドマイド、またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、はたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体である。
様々な実施態様において、該第１の受容体および第２の受容体は同一の受容体である。様々な実施態様において、該第１の受容体および第２の受容体は異なる受容体である。
いくつかの実施態様において、該リガンド結合ドメインはサイトカイン受容体に由来する。いくつかの実施態様において、該リガンド結合ドメインは１型サイトカイン受容体（ＣＲ）に由来する。他の実施態様においては、該リガンド結合ドメインはエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）またはレプチン受容体（ＬＲ）に由来する。いくつかの実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体に由来する。
いくつかの実施態様において、該ベイトは、該第１の受容体および／または第２の受容体断片に対して異種である。いくつかの実施態様において、該細胞内ドメインはＪＡＫ結合部位を含む。いくつかの実施態様において、該細胞内ドメインは糖蛋白質１３０（ｇｐ１３０）を含む。いくつかの実施態様において、該受容体断片は糖蛋白質１３０（ｇｐ１３０）を含む。いくつかの実施態様において、該ＳＴＡＴはＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３から選択される。
いくつかの実施態様において、ＳＴＡＴの動員を低減または排除する変異は、１か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる。いくつかの実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体に由来し、該変異はＹ９８５、Ｙ１０７７、およびＹ１１３８の位置のうちの１か所以上である。いくつかの実施態様において、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体に由来し該変異はＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆである。いくつかの実施態様において、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体のＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆと機能的に同等の変異を有する。
いくつかの実施態様においては、膜貫通ドメインの欠失が提供されるが、ＪＡＫ結合については保持される。
マウスレプチン受容体のアミノ酸配列は以下である：
ＭＭＣＱＫＦＹＶＶＬＬＨＷＥＦＬＹＶＩＡＡＬＮＬＡＹＰＩＳＰＷＫＦＫＬＦＣＧＰＰＮＴＴＤＤＳＦＬＳＰＡＧＡＰＮＮＡＳＡＬＫＧＡＳＥＡＩＶＥＡＫＦＮＳＳＧＩＹＶＰＥＬＳＫＴＶＦＨＣＣＦＧＮＥＱＧＱＮＣＳＡＬＴＤＮＴＥＧＫＴＬＡＳＶＶＫＡＳＶＦＲＱＬＧＶＮＷＤＩＥＣＷＭＫＧＤＬＴＬＦＩＣＨＭＥＰＬＰＫＮＰＦＫＮＹＤＳＫＶＨＬＬＹＤＬＰＥＶＩＤＤＳＰＬＰＰＬＫＤＳＦＱＴＶＱＣＮＣＳＬＲＧＣＥＣＨＶＰＶＰＲＡＫＬＮＹＡＬＬＭＹＬＥＩＴＳＡＧＶＳＦＱＳＰＬＭＳＬＱＰＭＬＶＶＫＰＤＰＰＬＧＬＨＭＥＶＴＤＤＧＮＬＫＩＳＷＤＳＱＴＭＡＰＦＰＬＱＹＱＶＫＹＬＥＮＳＴＩＶＲＥＡＡＥＩＶＳＡＴＳＬＬＶＤＳＶＬＰＧＳＳＹＥＶＱＶＲＳＫＲＬＤＧＳＧＶＷＳＤＷＳＳＰＱＶＦＴＴＱＤＶＶＹＦＰＰＫＩＬＴＳＶＧＳＮＡＳＦＨＣＩＹＫＮＥＮＱＩＩＳＳＫＱＩＶＷＷＲＮＬＡＥＫＩＰＥＩＱＹＳＩＶＳＤＲＶＳＫＶＴＦＳＮＬＫＡＴＲＰＲＧＫＦＴＹＤＡＶＹＣＣＮＥＱＡＣＨＨＲＹＡＥＬＹＶＩＤＶＮＩＮＩＳＣＥＴＤＧＹＬＴＫＭＴＣＲＷＳＰＳＴＩＱＳＬＶＧＳＴＶＱＬＲＹＨＲＲＳＬＹＣＰＤＳＰＳＩＨＰＴＳＥＰＫＮＣＶＬＱＲＤＧＦＹＥＣＶＦＱＰＩＦＬＬＳＧＹＴＭＷＩＲＩＮＨＳＬＧＳＬＤＳＰＰＴＣＶＬＰＤＳＶＶＫＰＬＰＰＳＮＶＫＡＥＩＴＶＮＴＧＬＬＫＶＳＷＥＫＰＶＦＰＥＮＮＬＱＦＱＩＲＹＧＬＳＧＫＥＩＱＷＫＴＨＥＶＦＤＡＫＳＫＳＡＳＬＬＶＳＤＬＣＡＶＹＶＶＱＶＲＣＲＲＬＤＧＬＧＹＷＳＮＷＳＳＰＡＹＴＬＶＭＤＶＫＶＰＭＲＧＰＥＦＷＲＫＭＤＧＤＶＴＫＫＥＲＮＶＴＬＬＷＫＰＬＴＫＮＤＳＬＣＳＶＲＲＹＶＶＫＨＲＴＡＨＮＧＴＷＳＥＤＶＧＮＲＴＮＬＴＦＬＷＴＥＰＡＨＴＶＴＶＬＡＶＮＳＬＧＡＳＬＶＮＦＮＬＴＦＳＷＰＭＳＫＶＳＡＶＥＳＬＳＡＹＰＬＳＳＳＣＶＩＬＳＷＴＬＳＰＤＤＹＳＬＬＹＬＶＩＥＷＫＩＬＮＥＤＤＧＭＫＷＬＲＩＰＳＮＶＫＫＦＹＩＨＤＮＦＩＰＩＥＫＹＱＦＳＬＹＰＶＦＭＥＧＶＧＫＰＫＩＩＮＧＦＴＫＤＡＩＤＫＱＱＮＤＡＧＬＹＶＩＶＰＩＩＩＳＳＣＶＬＬＬＧＴＬＬＩＳＨＱＲＭＫＫＬＦＷＤＤＶＰＮＰＫＮＣＳＷＡＱＧＬＮＦＱＫＰＥＴＦＥＨＬＦＴＫＨＡＥＳＶＩＦＧＰＬＬＬＥＰＥＰＩＳＥＥＩＳＶＤＴＡＷＫＮＫＤＥＭＶＰＡＡＭＶＳＬＬＬＴＴＰＤＰＥＳＳＳＩＣＩＳＤＱＣＮＳＡＮＦＳＧＳＱＳＴＱＶＴＣＥＤＥＣＱＲＱＰＳＶＫＹＡＴＬＶＳＮＤＫＬＶＥＴＤＥＥＱＧＦＩＨＳＰＶＳＮＣＩＳＳＮＨＳＰＬＲＱＳＦＳＳＳＳＷＥＴＥＡＱＴＦＦＬＬＳＤＱＱＰＴＭＩＳＰＱＬＳＦＳＧＬＤＥＬＬＥＬＥＧＳＦＰＥＥＮＨＲＥＫＳＶＣＹＬＧＶＴＳＶＮＲＲＥＳＧＶＬＬＴＧＥＡＧＩＬＣＴＦＰＡＱＣＬＦＳＤＩＲＩＬＱＥＲＣＳＨＦＶＥＮＮＬＳＬＧＴＳＧＥＮＦＶＰＹＭＰＱＦＱＴＣＳＴＨＳＨＫＩＭＥＮＫＭＣＤＬＴＶ（配列番号：１）。
いくつかの実施態様において、該ドメインはマウスレプチン受容体に由来し、マウスレプチン受容体の配列のアミノ酸８３９～１１６２に由来するものである。
いくつかの実施態様において、該プレイ蛋白質は核外搬出配列（ＮＥＳ）を含む。例えば、実施態様において、該プレイ蛋白質は核内蛋白質であるが、該ＮＥＳによって細胞質中に存在可能となる（すなわち、ベイトが利用できる場合には、ベイトと接触させることができる）。したがって、実施態様においては、強力な核局在化シグナルが存在する場合であっても、該ＮＥＳシグナルは、プレイポリペプチドが細胞質内に存在する状態を支援するので、ベイト蛋白質との相互作用が促進される。
いくつかの実施態様においては、該ＮＥＳは１～４個の疎水性残基を有する。いくつかの実施態様においては、該疎水性残基はロイシンである。いくつかの実施態様においては、該ＮＥＳは配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有するが、ここでＬは疎水性残基であり、ｘは他の任意のアミノ酸である。いくつかの実施態様においては、該ＮＥＳは配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有するが、ここでＬはロイシンであり、ｘは他の任意のアミノ酸である。
いくつかの実施態様において、該ＮＥＳは、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼの熱安定阻害因子のアミノ酸３７～４６を含むが、これは強力な核局在化シグナルを無効化することが示されている（Ｗｉｌｅｙら、（１９９９）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：６３８１－６３８７；本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる）。
いくつかの実施態様においては、ベイト蛋白質、低分子およびプレイ蛋白質の間の相互作用、またはそれらの組み合わせを、プロテアソーム阻害剤の存在下でモニターまたは検出する。一実施態様において、該方法はプロテアソーム阻害剤を細胞に提供することを含む。いくつかの実施態様においては、Ｅ３リガーゼ構成要素を含むベイト蛋白質とプレイ蛋白質とが相互作用した時にプレイ蛋白質が修飾を受ける場合に、そのような事象におけるプレイ蛋白質の潜在的分解を、該プロテアソーム阻害剤が阻害する。本明細書に開示の方法に利用するプロテアソーム阻害剤は、カルフィルゾミブ（カイプロリス：Ｋｙｐｒｏｌｉｓ）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、イキサゾミブ（Ｎｉｎｌａｒｏ）、およびマリゾミブから選択することができる。一実施態様において、該プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）である。
様々な実施態様において、本法は新規分子相互作用を同定する。様々な実施態様において、本法は新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。様々な実施態様においては、本法は低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。
様々な実施態様において、本法は分子相互作用を同定するが、その際ハイブリッドリガンド（または低分子または化合物）または２種類の低分子物質がリンカーで共に連結されているリガンドの利用を必要とはしない。実施態様において、該低分子は単一の化学物質である。実施態様において、該低分子はリンカーを有していない。
実施態様において、該低分子はベイトまたはプレイ蛋白質のうちの一方のみに直接相互作用する。実施態様において、ベイトまたはプレイ蛋白質の存在下でのみ、該低分子はベイトおよび／またはプレイ蛋白質と直接相互作用する；例えば、ベイト蛋白質の存在下でのみ、該低分子はプレイ蛋白質と直接相互作用する、あるいは該低分子は、プレイ蛋白質の存在下でのみ、ベイト蛋白質と直接相互作用する、あるいは該低分子は、ベイトまたはプレイ蛋白質の存在下でのみ、ベイトまたはプレイ蛋白質の両方と直接相互作用する。
いくつかの実施態様においては、Ｅ３リガーゼ基質結合ベイト蛋白質としてＶＨＬを用いる際に本法が利用可能である。ＣＲＢＮと同様に、ＶＨＬはＥ３リガーゼの基質結合サブユニットである。したがって、ベイトとしてのＥ３リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのＶＨＬにも同様に当てはまる。
実施態様においては、Ｅ３リガーゼの代わりに、ＦＫＢＰ１２蛋白質またはこのファミリーの構成員（例えば、ＦＫ５０６結合蛋白質）をベイトとして用いる際に本法が利用可能である（したがって、ベイトとしてのＥ３リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのＦＫＢＰ１２蛋白質またはこのファミリーの構成員にも同様に当てはまる）。
ＦＫＢＰ１２は免疫抑制剤分子であるタクロリムス（ＦＫ５０６）に結合することが知られている。実施態様において、該低分子は、ＦＫ５０６またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体である。
以下の非限定的例によって本発明をさらに説明する。
実施態様においては、分子相互作用を検出する方法を提供するが、該方法は：
（ａ）リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンド依存性キメラ受容体が、
（ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
（ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内ベイト蛋白質、
ここで該第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインがＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：シグナル伝達因子および転写活性化因子）の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること；
（ｂ）受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む、
発現させること、
および
（ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質がＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）である、
シグナルを検出すること、
を含む。
実施態様においては、プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員されるので、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達が回復し、ＳＴＡＴ分子の活性化が起こる。
実施態様においては、該細胞はＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む。
実施態様においては、活性化したＳＴＡＴ分子は核内に移行してＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導するので、このレポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる。
実施態様において、該ＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）はＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ３８およびＦＫＢＰ５２から選択される。
実施態様において、該方法は、プレイ蛋白質および／またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む。
実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用である。
実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される２種類以上の蛋白質／蛋白質相互作用である。
実施態様において、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用は、蛋白質／蛋白質界面の部位におけるプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と該低分子との間の直接結合である。
実施態様において、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用は、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される。
実施態様において、該低分子はベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、該プレイ蛋白質との相互作用を可能にする。
実施態様において、該低分子は分子糊である。
実施態様において、該分子相互作用は複合体形成である。
実施態様において、該分子相互作用は低分子／蛋白質相互作用である。
実施態様において、該第１の受容体および第２の受容体は同一の受容体である。
実施態様において、該第１の受容体および第２の受容体は異なる受容体である。
実施態様において、該第１の受容体および／または第２の受容体は多量体化受容体である。
実施態様において、該リガンド結合ドメインはサイトカイン受容体に由来する。
実施態様においては、該リガンド結合ドメインは１型サイトカイン受容体（ＣＲ）に由来する。
実施態様においては、該リガンド結合ドメインはエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）またはレプチン受容体（ＬＲ）に由来する。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来する。
実施態様においては、該ベイトは、該第１の受容体および／または第２の受容体断片に対して異種である。
実施態様においては、該細胞内ドメインはＪＡＫ結合部位を含み、および／または該受容体断片はｇｐ１３０を含む。
実施態様においては、該ＳＴＡＴはＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３から選択される。
実施態様においては、ＳＴＡＴの動員を低減または排除する変異は、１か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来し、該変異はＹ９８５、Ｙ１０７７、およびＹ１１３８の位置のうちの１か所以上である。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来し該変異はＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆである。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体（ＬＲ）のＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆと機能的に同等の変異を有する。
実施態様においては、該プレイ蛋白質は核外搬出配列（ＮＥＳ）を含む。
実施態様においては、該ＮＥＳは１～４個の疎水性残基を有する。
実施態様においては、該疎水性残基はロイシンである。
実施態様においては、該ＮＥＳは配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有するが、ここでＬは疎水性残基であり、ｘは他の任意のアミノ酸である。
実施態様においては、該ＮＥＳは配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有するが、ここでＬはロイシンであり、ｘは他の任意のアミノ酸である。
実施態様においては、該プレイ蛋白質との相互作用前に、該ベイトが化合物に接触している。
実施態様においては、該化合物は、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体；あるいはＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）またはその誘導体または類似体と同一のＦＫＢＰベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される。
実施態様において、該方法は、低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する。
実施例
実施例１：分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質相互作用の検出に関するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイ構成の評価
本実施例では、リガンド誘導性ＣＲＢＮ基質またはネオ基質を同定する目的で、Ｌｅｍｍｅｎｓら、「ＭＡＰＰＩＴ、蛋白質／蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物２ハイブリッド法（ＭＡＰＰＩＴ， ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎ－ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１５；１２７８：４４７－５５に記載の方法を利用するＭＡＰＰＩＴアッセイの派生法を用いる。従来型のＭＡＰＰＩＴアッセイは蛋白質／蛋白質相互作用をモニターするために用いられていた。ベイト蛋白質（蛋白質Ａ）を融合蛋白質として発現するが、該融合蛋白質では蛋白質Ａが、レプチン受容体の工学的に改変した細胞内受容体ドメインと遺伝子的に融合されており、該細胞内受容体ドメインはそれ自身がエリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体の細胞外ドメインに融合されている。該Ｅｐｏ受容体構成要素にＥｐｏリガンドが結合することによって、受容体結合細胞内ＪＡＫ２を活性化する。しかし、活性化ＪＡＫ２は、ＳＴＡＴ３結合およびそのリン酸化を引き起こすレプチン受容体を活性化できない；理由は、正常であれば活性化ＪＡＫ２によってリン酸化されるそのチロシン残基に変異が導入されているからである。代わりに蛋白質Ｂと蛋白質Ａの相互作用によって、ＪＡＫ２リン酸化可能ＳＴＡＴ３ドッキング部位の再構成を行う；これにより、蛋白質Ｂはｇｐ１３０受容体の細胞内ドメインに融合する（活性化ＪＡＫ２キナーゼが認識する適正なチロシン残基を含むことになる）。すなわち、蛋白質Ａと蛋白質Ｂの物理的相互作用によって、ＥＰＯが惹起するＪＡＫ２－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路の活性化が再構成される。ＳＴＡＴ３の活性化は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子または蛍光マーカー（ＧＦＰまたは他の種類の蛍光蛋白質（ＥＧＦＰなど）など）をコードする遺伝子を含むＳＴＡＴ３応答性レポーター遺伝子を導入することによってモニターできる。このようにして、ＭＡＰＰＩＴアッセイは無損傷細胞におけるそのような組換え蛋白質／蛋白質相互作用を評価する汎用アッセイを提供する。
本実施例１では、本発明者らが開発した、特にＣＲＢＮリガンド誘導性蛋白質相互作用の判定に用いる（すなわち、特異的なＣＲＢＮベイト蛋白質を利用し、蛋白質複合体形成のリガンド依存性誘導についてアッセイする）ＭＡＰＰＩＴアッセイ派生法を用いた。ＣＲＢＮベイト蛋白質をＭＡＰＰＩＴキメラ膜受容体との融合物として発現し、相互作用する標的蛋白質は細胞内ｇｐ１３０受容体断片（ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１（イソ型７）、ｇｐ１３０－標的Ｘ、ｇｐ１３０－ＧＳＰＴ１（ドメイン２＋３）またはｇｐ１３０－ＧＳＰＴ２）と融合する。本発明者らは、これら基質のＣＲＢＮ（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）への動員を誘導する公知のＩＭｉＤのパネルの検出について、このＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイの評価を行った。
文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＣＲＢＮキメラ受容体融合をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）、ＭＡＰＰＩＴ ｇｐ１３０融合物をコードするプラスミド（ｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１（イソ型７）、ｇｐ１３０－標的Ｘ、ｇｐ１３０－ＧＳＰＴ１（ドメイン２＋３）またはｇｐ１３０－ＧＳＰＴ２）およびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。試験した標的蛋白質のそれぞれについて、完全長蛋白質を融合したのであるが、例外は、ＩＫＺＦ１およびＧＳＰＴ１であり、前者ではイソ型７を用い、後者では内部サブドメインを用いた。本実施例に用いたＭＡＰＰＩＴ受容体融合物は、レプチン受容体の細胞内ドメインに遺伝子的に連結した目的蛋白質（ＣＲＢＮ）であって、該レプチン受容体の細胞内ドメイン自体がエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体の細胞外ドメインに融合しているものから成る。受容体／受容体結合ＪＡＫ２活性化を促進するために、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインとレプチン受容体細胞外ドメイン（実施例２で用いられるように）を相互代替的に用いることができる（該活性化は、それぞれＥＰＯまたはレプチンによる）。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチン（ＥＰＯ）で処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図２Ａ～Ｌに示すデータは、ＭＡＰＰＩＴ動員アッセイが、公知の相互作用、ＩＭｉＤ特異性（例えば、ＣＣ－８８５によってのみ動員されるＧＳＰＴ１およびＧＳＰＴ２）、および効力傾向を再現することが可能であることを示唆している。
実施例２：ＩＭｉＤ誘導性基質動員の検出に関する、代替的なＣＲＢＮ ＭＡＰＰＩＴ派生的受容体構築物の比較
本実施例２においては、実施例１で用いたアッセイ設定を、代替的なＣＲＢＮキメラ受容体融合構築物を用いた類似のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイ構成で対照比較的に試験した。実施例１において既に言及しているように、他の代替的な受容体融合物も利用可能であり、ＥＰＯ細胞外ドメインをレプチン受容体細胞外ドメインで代替すると、ＥＰＯの代わりにレプチンで活性化されるアッセイシステムとなる。本実施例では、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（実施例１のようにｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）またはレプチン受容体細胞外ドメイン（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）のいずれかを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物に連結したＣＲＢＮをコードするプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。図３Ａ～Ｄの模式図に示されるように、これらの構築物は細胞外ドメイン以外にも、キメラ受容体の細胞内構成において相違を有する。ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ構築物の場合には、融合物が工学的に改変したレプチン受容体の細胞内ドメイン全体を含む；他方、ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ構築物の場合には、ＪＡＫ２動員部位を含むレプチン受容体の短い一部分が用いられており、またこのドメインとそれに融合したＣＲＢＮベイト蛋白質との間に付加的なＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒヒンジが配置されている。さらに、文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、部分的ｇｐ１３０ドメイン（ＩＫＺＦ１イソ型１、ＩＫＺＦ１イソ型７、ＧＳＰＴ１イソ型１またはＧＳＰＴ１ドメイン２＋３）に融合した目的の基質をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。ＩＫＺＦ１（イソ型１）ｇｐ１３０融合物の場合には、２種類の異なる構築物をＩＫＺＦ１のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合したｇｐ１３０と共に用いた。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物（ＣＣ－２２０またはＣＣ－８８５）の存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯ（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮを用いたアッセイの場合）またはレプチン（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮを用いたアッセイの場合）で処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯまたはレプチン＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図３Ａ～Ｄに示されるデータは、代替的ＭＡＰＰＩＴ受容体融合物の両方ともがＣＲＢＮとの分子糊依存性ネオ基質相互作用の検出を可能にすることを示唆している。
実施例３：ＤＤＢ１ ＭＡＰＰＩＴ派生的受容体融合構築物を用いたＣＲＢＮ化合物誘導性基質相互作用の検出
非融合型のＣＲＢＮベイトを用いて化合物誘導性ＣＲＢＮ／基質相互作用を試験することは有益であると考えられるので、ＣＲＢＮの代わりにＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物にＤＤＢ１を融合するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを開発した。ＤＤＢ１は、ＣＲＢＮをコアＥ３ユビキチンリガーゼ複合体足場サブユニットＣＵＬ４ＡまたはＣＵＬ４Ｂ（カリン４Ａまたはカリン４Ｂ）に連結するアダプター蛋白質である。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物に連結したＤＤＢ１をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１）、部分的ｇｐ１３０ドメインに融合したＣＲＢＮ基質蛋白質（実施例１でも用いたＩＫＺＦ１イソ型７または未開示標的蛋白質Ｘ１）をコードするプラスミド、およびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。さらに、異なる量の非融合ＣＲＢＮ発現構築物と共に細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のレナリドミド（ＬＥＮ）の存在下または非存在下で細胞をＥＰＯ処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図４に示されるように、共発現した非融合ＣＲＢＮの存在下においてのみ、ＩＫＺＦ１および標的Ｘとの相互作用の両方について安定したレナリドミド依存性ＭＡＰＰＩＴシグナルが得られる；このことは、該シグナルが基質ｇｐ１３０融合蛋白質のＣＲＢＮへの結合によって媒介されるものであることを示唆している。
実施例４：ＤＤＢ１の共発現によるＣＲＢＮ化合物誘導性基質相互作用の検出向上
ＤＤＢ１アダプター蛋白質はＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼ複合体の必須構成要素であり、ＣＲＢＮをＣＵＬ４ＡまたはＣＵＬ４Ｂ複合体足場蛋白質へ連結するので、ＣＲＢＮ－基質動員アッセイのＭＡＰＰＩＴ派生的融合蛋白質構成要素を発現する細胞において、内因性ＤＤＢ１レベルは限定的であると考えられる。本実施例４においては、ＣＲＢＮとＩＫＺＦ１との間のＩＭｉＤ誘導性相互作用についてＤＤＢ１共発現の効果を評価した。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＣＲＢＮ ＭＡＰＰＩＴ受容体融合物をコードするプラスミド（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１）、ＩＫＺＦ１（イソ型７）のｇｐ１３０融合物をコードするプラスミド、およびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。さらに、試験した条件の一部においては、細胞をさらに非融合ＤＤＢ１発現プラスミドで共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のＩＭｉＤ（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）の存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯ処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図５のデータは、ＤＤＢ１を共発現した試料において、試験した化合物の最大シグナルと比較して、該化合物の低濃度でシグナルが増加したことを示しており、このことはＤＤＢ１の共発現によってアッセイ感度が向上したことを示唆する。
実施例５：ＤＤＢ１－ＣＲＢＮ ＭＡＰＰＩＴキメラ受容体融合構築物を用いたＣＲＢＮ化合物誘導性基質相互作用の検出
実施例３および４において考察しているように、ＤＤＢ１はＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼ複合体の主要構成要素であり、ＣＲＢＮ仲介性基質動員およびユビキチン化にとって必須である。実施例３および４において用いたアッセイ構成に加えて、別のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイ設定において、ＤＤＢ１とＣＲＢＮの遺伝子融合を含むＭＡＰＰＩＴ受容体構築物を用いる。そのような融合物は、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＤＤＢ１－ＣＲＢＮ）を含むＭＡＰＰＩＴキメラ受容体を用いて作成して、本実施例５において用いた。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、この構築物と共にＩＫＺＦ１（イソ型７）のｇｐ１３０融合物をコードするプラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のＩＭｉＤ（サリドマイド、ＴＨＬ；レナリドミド、ＬＥＮ；ポマリドミド、ＰＯＭ；ＣＣ－１２２；ＣＣ－２２０；ＣＣ－８８５）の存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯ処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図６のデータは、ＤＤＢ１／ＣＲＢＮ遺伝子融合物がＣＲＢＮ ＩＭｉＤ誘導性基質動員を検出するＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイに利用可能であることを示唆している。
実施例６：基質のＣＲＢＮへのＰＲＯＴＡＣ－誘導性結合についての評価
本実施例６では、基質結合リガンドに化学的に連結したＣＲＢＮ結合リガンドを構成するハイブリッドリガンドであるＰｒｏｔａｃによって誘導されるＣＲＢＮ基質動員について評価した。本実施例で試験した化合物はＡＲＶ－８２５であり、これはＣＲＢＮ結合リガンドとＢＲＤ４結合性化合物の化学的融合物である。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、実施例２で用いたＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）またはレプチン受容体細胞外ドメイン（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮ）のいずれかを含む融合構築物をコードする代替的な２種類のＭＡＰＰＩＴ派生的ＣＲＢＮベイト受容体をコードするプラスミドを、ＢＲＤ４（イソ型３）のｇｐ１３０およびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のＡＲＶ－８２５の存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯ（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮで形質転換した試料の場合）またはレプチン（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮにの場合）で処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯまたはレプチン＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図７Ａ～Ｂに示すデータは、試験したアッセイ構成のそれぞれにおいて、明確な用量依存性シグナル増加を示し、このことはＭＡＰＰＩＴ派生的ＣＲＢＮ基質動員アッセイがＰＲＯＴＡＣ型の分子によって誘導される相互作用を検出可能であることを示唆している。
実施例７：化合物誘導性ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）基質相互作用の検出
本実施例では、ＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）のＭＴＯＲおよびカルシニューリンサブユニットとの化合物依存性相互作用の検出に、ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いた。ＭＡＰＰＩＴ派生的受容体およびｇｐ１３０融合をコードする以下のプラスミド構築物を用い、実験設定は実施例１に記載の方法にしたがった；ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴキメラ受容体構築物にＦＫＢＰ１Ａベイトを融合した（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰ１Ａ）；標的蛋白質を部分的ｇｐ１３０ドメイン（ＭＴＯＲ ＦＲＢドメインまたはＰＰＰ３ＣＡ）に融合した。カルシニューリン相互作用については、さらにもう１種類のアッセイ設定を用いた；すなわち、ＭＡＰＰＩＴ受容体およびｇｐ１３０融合に加えて、カルシニューリン調節サブユニットをコードする非融合ＰＰＰ３Ｒ２を発現するプラスミドを共発現した；その理由は、この調節性サブユニットがＦＫ５０６マクロライド誘導性ＦＫＢＰ１Ａ－カルシニューリン相互作用に寄与することが報告されているからである。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、表示の受容体をコードするプラスミドおよびｇｐ１３０をコードするプラスミドならびにＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量の被検化合物（ＭＴＯＲ動員についてはラパマイシンまたはエベロリムス；カルシニューリン結合についてはＦＫ５０６またはピメクロリムス）の存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯ処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。図８Ａ～Ｆに示す結果は、ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイによって、化合物誘導性ＦＫＢＰ１Ａ標的結合をモニターすることが可能であることを示唆している。カルシニューリン動員の場合には、ＰＰＰ３Ｒ２調節性サブユニットの共発現によって、シグナル強度が有意に増強した。
実施例８：化合物誘導性ＶＨＬ基質相互作用の検出
実施例６と同様に、ＶＨＬとＢＲＤ４とのＰｒｏｔａｃ依存性相互作用の検出にＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いた。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＢＲＤ４（イソ型３）のｇｐ１３０融合物およびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＶＨＬ）またはレプチン受容体細胞外ドメイン（ｐＣＬＧ－ＶＨＬ）のいずれかを含む融合構築物をコードする、代替的な２種類のＭＡＰＰＩＴ派生的ＶＨＬベイト受容体をコードするプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のＭＺ１（ＶＨＬとＢＲＤ４リガンドとの間の化学的融合物）の存在下または非存在下で、ＥＰＯ（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮで形質転換した試料の場合）またはレプチン（ｐＣＬＧ－ＣＲＢＮの場合）で細胞を処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯまたはレプチン＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図９Ａ～Ｂのグラフは、試験したアッセイ構成のそれぞれにおいて、明確な用量依存性シグナル増加を示している。
実施例９：ＩＫＺＦ１のＣＲＢＮへの新規分子糊誘導性動員の同定のための化合物ライブラリースクリーニング
本実施例では、ＣＲＢＮに対するＩＫＺＦ１の動員を誘導する化合物を同定するために、実施例１に記載のＭＡＰＰＩＴ派生的ＩＫＺＦ１－ＣＲＢＮ動員アッセイを用いて、９６種類のＩＭｉＤおよびＩＭｉＤ様分子糊から成る化合物集合体をマイクロタイタープレート形態でスクリーニングした。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、ＥＰＯ受容体細胞外ドメイン（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）およびｇｐ１３０－ＩＫＺＦ１（イソ型７）融合構築物を含むキメラＭＡＰＰＩＴ派生的受容体に連結したＣＲＢＮベイト蛋白質の融合構築物をコードするプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、細胞をＥＰＯおよび化合物（または陰性対照としてのＤＭＳＯ）で処理した。各化合物について３種類の濃度（図１０Ａ～Ｃにおいて、「低」、「中」および「高」と表示されている）を用いた：すなわち、以前に評価した化合物の細胞毒性レベルに応じて、０．８、４および２０μＭ、あるいは０．２、１および５μＭのいずれかを用い、各化合物濃度はそれぞれ２回試験した。化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１０Ａ～Ｃに示すのグラフ（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方について平均ルシフェラーゼ・シグナル（生データ）の頻度分布を示しており、またそれぞれのグラフは試験を行った３種類の化合物濃度（低、中、および高）の１つについてのデータに対応している。化合物処理試料に対応する、２峰性分布の右にシフトした部分はバックグラウンドより高いシグナルを有する化合物を表し、したがってそれらの化合物はＣＲＢＮに対するＩＫＺＦ１の動員を誘導する。３種類の試験濃度のうちの１種類以上の濃度において、バックグラウンドよりも高いレポーターシグナルを示すそのような３種類化合物に関するルシフェラーゼ・シグナルに、線（点線、破線または実線）で印付けしている；また、対応する用量応答曲線を右パネルに示す。これら用量応答曲線は、第１スクリーニングに用いたアッセイ設定およびプロトコルと同様のものを用いて得られたものであるが、ここでは表示濃度の９点の用量範囲について試験した。ここでデータ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。まとめると、本実施例に記載したＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイが、ＣＲＢＮへの公知および新規の分子糊誘導性基質動員を同定する化合物集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。図１０Ａ～Ｃは、特にＣＲＢＮに対する糊誘導性ＩＫＺＦ１動員に関する化合物スクリーニングの例示であるが、このアプローチは他の潜在的な基質のスクリーニングにも応用可能である。
実施例１０：ＭＡＰＰＩＴ派生的ＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリースクリーニングアプローチを用いた新規分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質の同定
リガンド誘導性ＣＲＢＮ基質またはネオ基質を同定する目的で、Ｌｉｅｖｅｎｓらの文献（「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの２蛋白質インタラクトミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １ ５．１２ （２０１６）： ３６２４－３６３９）に記載の方法を用いてＭＡＰＰＩＴ細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。簡単に説明すると、上記の実施例１および９に記載のＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ派生的受容体に連結したＣＲＢＮベイト蛋白質の融合構築物をコードするＣＲＢＮベイト発現プラスミド（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）と同一のプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。次いで、１５，０００種類を超えるＯＲＦを網羅するプレイｇｐ１３０融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これらの形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるｇｐ１３０－ＯＲＦ融合発現プラスミドならびにＳＴＡＴ３応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有するものであった。したがって、これらのスポット上に到達して接着したＣＲＢＮベイト形質導入細胞はいずれもｇｐ１３０－ＯＲＦプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換されるので、異なるそれぞれのマイクロアレイスポット上の細胞が異なるＣＲＢＮ－ＯＲＦの組み合わせで試験される。形質転換から２４時間後に、ＣＲＢＮリガンドＣＣ－２２０（１０μＭ）の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチンで特異的に刺激し、４８時間後にレポーターシグナル（ＧＦＰ様蛍光レポーター）を測定した。蛍光強度のデータを上記のような方法で分析してボルケーノプロットを作成した；図１１Ａ～Ｂに示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度（Ｙ軸）に基づいて算出したｑ値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数（Ｘ軸）の中央値の比に対して示す。上記の実施例１および９で用いたものと同様なアッセイ設定およびプロトコルを用いて用量応答を確認するために、強いシグナルを示す４種類のＯＲＦ ｃＤＮＡ（図１１Ａ～Ｂにおいて、ドットプロット上の矢印で示される）を選択した。対応するｇｐ１３０－ＯＲＦプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、ＣＲＢＮ受容体融合プラスミド（ｐＳＥＬ－ＣＲＢＮ）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のＣＣ－２２０の存在下または非存在下で細胞をＥＰＯ処理し、さらに２４時間後にルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。本実施例でＣＣ－２２０について例示されるように、本明細書に記載のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイが、公知および新規の分子糊誘導性ＣＲＢＮ基質を同定するＯＲＦ ｃＤＮＡ集合体をスクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
実施例１１：目的蛋白質の新規リガンドを同定するためのハイブリッドリガンド・ライブラリースクリーニング
実施例９に記載のアプローチと同様に、本実施例では、新規蛋白質リガンドの同定を目的として化合物ライブラリーのスクリーニングにＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを用いた。本実施例では、特に、トリメトプリム（ＴＭＰ）－リガンドハイブリッド分子の集合体を目的蛋白質に対する結合に関してスクリーニングした。ＴＭＰはＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）に強固に結合するので、ＴＭＰハイブリッドリガンド融合分子の一部としてリガンドをＭＡＰＰＩＴ派生的ＤＨＦＲ受容体融合物につなぎ止めるためにＴＭＰを利用することができ、したがってベイトとしてリガンドを提示することができる（図１２Ａ～Ｂの模式図を参照のこと）。本アッセイ設定においては、このＤＨＦＲ受容体融合物をＴＭＰハイブリッドリガンドおよびｇｐ１３０－ＯＲＦ融合構築物と組み合わせて三重複合体とし、レポーターシグナルを得る。本実施例では、乳癌に関連するとされている核内受容体であって転写因子であるエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）への化合物結合について、およびｐ５３腫瘍抑制因子の制御に関与する重要な癌標的であるＭＤＭ４（マウス二重微小染色体４）への化合物結合について、ハイブリッドリガンドのライブラリーをスクリーニングする。本実施例でスクリーニングした化合物集合体は、ＴＭＰ－ＴＡＭ（タモキシフェン）を混合した３２０種類によって構成される多様なハイブリッドリガンドのセットから成るものであった；タモキシフェンはＥＳＲ１の公知のリガンドである。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、レプチン受容体細胞外ドメインを含むキメラＭＡＰＰＩＴ派生的受容体に連結した（大腸菌）ＤＨＦＲアンカー蛋白質の融合構築物をコードするプラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ；図１２Ａ～Ｂ中の模式図を参照のこと）およびｇｐ１３０－ＥＳＲ１（図１２Ａ）またはｇｐ１３０－ＭＤＭ４（図１２Ｂ）のいずれかの融合構築物で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、細胞をレプチンおよび化合物（または陰性対照としてのＤＭＳＯ）で処理した。化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図１２Ａ～Ｂに示すグラフ（左パネル）は、化合物処理試料およびＤＭＳＯ処理対照の両方について、平均ルシフェラーゼ・シグナル（生データ）の頻度分布を示す。両方の分布が大きく重なり合うが、複数の化合物がバックグラウンドより高いルシフェラーゼ・シグナルを示している。これらの外れ値を、頻度曲線上に直線の目印で示した。２種類の例示的なスクリーニングの各々について、単一ヒットを用量応答分析で確認した（右パネル）。これらの用量応答曲線は、第１スクリーニングに用いたものと（実施例２に記載のＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒヒンジの代わりに、変異レプチン受容体細胞内ドメインを含む代替的なＤＨＦＲ受容体アンカー融合構築物ｐＣＬＬ－ＤＨＦＲを利用することを除き）同様なアッセイ設定およびプロトコルを用いて得られたものであるが、本実施例では表示濃度の９点から成る用量範囲を試験した。ここでデータ点は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。ＥＳＲ１標的スクリーニングの場合には、確認したヒットはＴＭＰ－ＴＡＭに対応する；ここで、ＴＡＭは公知のＥＳＲ１リガンドであり、したがってこれらのデータによってＭＡＰＰＩＴ派生的スクリーニングのアプローチの検証が成されるのである。まとめると、公知および新規のリガンド／標的相互作用を同定するハイブリッドリガンド集合体スクリーニングに、本実施例に記載のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイが利用可能であることを、これらの例は示唆している。
実施例１２：新規ハイブリッドリガンド標的の同定を目的とした、ＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイによる細胞マイクロアレイを基盤とするＯＲＦ ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
本実施例では、ハイブリッドリガンドベイト分子の新規標的蛋白質を同定する目的で、Ｌｉｅｖｅｎｓらの文献（「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの２蛋白質インタラクトミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｂｉｎａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １ ５．１２ （２０１６）： ３６２４－３６３９）に記載される方法を用いて、実施例１０に記載されるものと同様のＭＡＰＰＩＴ細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。本実施例では、標的未知の強力な抗腫瘍表現型を有する未開示化合物について、その標的を同定する目的で、本スクリーニングのアプローチを利用した。これを目的として、ＰＥＧ連結によってＴＭＰをこの化合物に連結するハイブリッドリガンド融合化合物を合成した。上記の実施例１１で用いたものと同一の（大腸菌）ＤＨＦＲ受容体アンカー融合プラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質転換した。次いで、１５，０００種類を超えるＯＲＦを網羅するプレイｇｐ１３０融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これらの形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるｇｐ１３０－ＯＲＦ融合発現プラスミドならびにＳＴＡＴ３応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有するものであった。したがって、これらのスポット上に到達して接着したＤＨＦＲアンカー融合物形質導入細胞はいずれもｇｐ１３０－ＯＲＦプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換される。形質転換から２４時間後に、ＴＭＰ／化合物ハイブリッドリガンド（最終濃度５μＭ）の存在下または非存在下で、細胞をレプチンで特異的に刺激し、４８時間後にレポーターシグナル（ＧＦＰ様蛍光レポーター）を測定した。蛍光強度のデータを上記のような方法で分析してボルケーノプロットを作成した；図１３Ａ～Ｂに示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度（Ｙ軸）に基づいて算出したｑ値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数（Ｘ軸）の中央値の比に対して示す。１種類のＯＲＦ ｃＤＮＡが強いシグナルを示したので（図１３Ａ～Ｂにおいて、ドットプロット上の矢印で示される）、用量応答の確認にこれを選択した。対応するｇｐ１３０－ＯＲＦプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、ＤＨＦＲ受容体融合プラスミド（ｐＣＬＧ－ＤＨＦＲ）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示濃度のハイブリッドリガンドの存在下または非存在下で、細胞をレプチン処理し、さらに２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、レプチン＋被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアにより、４パラメーター非線型回帰を用いて行った。本明細書に記載のＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイが、新規リガンド蛋白質標的を同定するＯＲＦ ｃＤＮＡ集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
実施例１３：ＭＴＯＲのＦＫＢＰ蛋白質へのラパマイシン誘導性動員の検出
本実施例では、ＭＴＯＲとＦＫＢＰ蛋白質ファミリー構成員（具体的にはＦＫＢＰ１Ａ（ＦＫＢＰ１２）、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ４およびＦＫＢＰ５）との間のラパマイシン誘導性結合をモニターするＭＡＰＰＩＴ派生的アッセイを開発した。図１４に示されるように、ＥＰＯ受容体細胞外ドメインを含むＭＡＰＰＩＴ受容体融合物（ｐＳＥＬ－ＦＫＢＰｘ）としてＦＫＢＰ ｃＤＮＡをクローン化し、またＭＴＯＲ（ＦＲＢドメイン）をｇｐ１３０融合物としてクローン化した。文献（Ｌｉｅｖｅｎｓら、「アレイＭＡＰＰＩＴ：哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析（Ａｒｒａｙ ＭＡＰＰＩＴ： ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ）」、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８．２ （２００９）： ８７７－８８６）に記載のように、ｇｐ１３０－ＭＴＯＲ融合プラスミドおよびＳＴＡＴ３応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド（ｐＸＰ２ｄ２－ｒＰＡＰＩ－ルシフェラーゼレポータープラスミド）と共に、ＦＫＢＰ受容体融合構築物のいずれかで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を共形質転換した。形質転換から２４時間後に、表示用量のラパマイシン存在下または非存在下で、細胞をＥＰＯ処理した。被検化合物処理から２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とＥｎｓｉｇｈｔプレートリーダー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、ＥＰＯ＋被検化合物で処理した細胞のＥＰＯまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率（三重試料）を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図から分かるように、各ＦＫＢＰ－ＭＴＯＲ相互作用について、既報文献に報告されるようなラパマイシン誘導性レポーターシグナルを得ることができた。

Claims (40)

  1. 分子相互作用を検出する方法であって、前記方法が：
    （ａ）リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
    前記リガンド依存性キメラ受容体が、
    （ｉ）第１の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
    ならびに
    （ｉｉ）第２の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインならびにそれに融合した細胞内ベイト蛋白質または足場蛋白質
    を含み、
    前記第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインが、ＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：シグナル伝達因子および転写活性化因子）の動員を低減または排除する変異を含む、
    細胞を提供すること；
    （ｂ）受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、前記受容体断片が機能的ＳＴＡＴ動員部位を含む、
    発現させること；
    ならびに
    （ｃ）分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること
    を含み、
    前記ベイト蛋白質が、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニット、セレブロン（ＣＲＢＮ）、もしくはＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）である、または
    前記第２の受容体の膜貫通ドメインおよび／細胞内ドメインに融合したベイト足場蛋白質が、Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットであるベイト蛋白質に会合し、
    前記方法が、プレイ蛋白質および／またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することを含み、前記分子相互作用が、前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質／蛋白質相互作用である、
    方法。
  2. 前記プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、前記ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員され、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達およびＳＴＡＴ分子の活性化が回復する、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞がＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 活性化した前記ＳＴＡＴ分子が核内に移行して前記ＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導し、レポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記Ｅ３リガーゼ基質結合サブユニットが、セレブロン（ＣＲＢＮ）およびフォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ：ＶＨＬ）から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記足場蛋白質が、損傷ＤＮＡ結合蛋白質１（ＤＤＢ１）、カリン４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、カリン１制御因子（ＲＯＣ１）、ＳＫＩＰ１、ＳＫＰ１相互作用パートナー（ＳＫＩＰ２）、βトランスデューシン反復配列含有蛋白質（β－ＴｒＣＰ）、二重微小染色体４蛋白質（ＭＤＭ４）、Ｘ連鎖アポトーシス抑制因子（ＸＩＡＰ）、ＤＤＢ１およびＣＵＬ４関連因子１５（ＤＣＡＦ１５）、ならびにＷＤリピートドメイン１２（ＷＤＲ１２）から選択される、
    請求項２に記載の方法。
  7. 前記分子相互作用が、前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される２種類以上の蛋白質／蛋白質相互作用である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される前記蛋白質／蛋白質相互作用が、蛋白質／蛋白質界面における前記プレイ蛋白質またはベイト蛋白質と前記低分子との間の直接結合である、または前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される前記蛋白質／蛋白質相互作用が、前記ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記低分子が、前記プレイ蛋白質との相互作用を可能にするベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記低分子が分子糊である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記分子相互作用が複合体形成である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記第１の受容体および第２の受容体が同一のまたは異なる受容体である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記第１の受容体および／または第２の受容体が多量体化受容体である、
    請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来する、および／または前記リガンド結合ドメインが１型サイトカイン受容体（ＣＲ）に由来する、または前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）もしくはレプチン受容体（ＬＲ）に由来する、および／または前記膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ベイトが前記第１の受容体および／または第２の受容体断片に対して異種である、
    請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記細胞内ドメインがＪＡＫ結合部位を含み、および／または前記受容体断片がｇｐ１３０を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ＳＴＡＴがＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３から選択される、および／または
    ＳＴＡＴの動員を低減または排除する前記変異が、１か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる、
    請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来し、前記変異がＹ９８５、Ｙ１０７７、およびＹ１１３８の位置のうちの１か所以上である、および／または前記変異が、Ｙ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆのうちの１つ以上である、またはマウスレプチン受容体（ＬＲ）のＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆと機能的に同等の変異を有する、
    請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記プレイ蛋白質が核外搬出配列（ＮＥＳ）を含み、
    前記ＮＥＳが１～４個の疎水性残基を有し、前記疎水性残基がロイシンである、および／または前記ＮＥＳが配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有し、ここでＬはロイシンであり、ｘは任意の他のアミノ酸である、
    請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記プレイ蛋白質との相互作用前に、前記ベイトが化合物に接触しており、
    前記化合物が、グルタルイミド環およびフタルイミド環を含む、および／または
    前記化合物が、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＣ－２２０、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、もしくはその誘導体もしくは類似体、またはサリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＣ－２２０、ＣＣ－１２２、ＣＣ－８８５、もしくはその誘導体もしくは類似体と同一のＣＲＢＮベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される、
    請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記方法が、
    前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質／蛋白質相互作用、
    または
    前記プレイ蛋白質およびベイト蛋白質を含む蛋白質／蛋白質相互作用を誘導、媒介、または安定化する低分子化合物、および／または分子糊またはハイブリッドリガンドである低分子化合物
    を同定する、
    請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ベイト蛋白質がＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）である、請求項１に記載の方法。
  23. 前記プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員され、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達およびＳＴＡＴ分子の活性化が回復する、
    請求項２２に記載の方法。
  24. 前記細胞がＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子を含む、および／または
    活性化したＳＴＡＴ分子が核内に移行してＳＴＡＴ応答性レポーター遺伝子の転写を誘導し、レポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）が、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ３８およびＦＫＢＰ５２から選択される、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記分子相互作用が、前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される２種類以上の蛋白質／蛋白質相互作用である、
    請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される前記蛋白質／蛋白質相互作用が、蛋白質／蛋白質界面における前記プレイ蛋白質もしくはベイト蛋白質と前記低分子との間の直接結合である、または前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される前記蛋白質／蛋白質相互作用が、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記低分子が、前記プレイ蛋白質との相互作用を可能にするベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導する、および／または
    前記低分子が分子糊である、
    請求項２２～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記分子相互作用が複合体形成である、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記第１の受容体および第２の受容体が同一のまたは異なる受容体である、および／または
    前記第１の受容体および／または第２の受容体が多量体化受容体である、および／または
    前記リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来する、および／または前記リガンド結合ドメインが１型サイトカイン受容体（ＣＲ）に由来する、または前記リガンド結合ドメインがエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）またはレプチン受容体（ＬＲ）に由来する、および／または
    前記膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来する、
    請求項２２～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記ベイトが前記第１の受容体および／または第２の受容体断片に対して異種である、
    請求項２２～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 細胞内ドメインがＪＡＫ結合部位を含む、および／または前記受容体断片がｇｐ１３０を含む、請求項２２～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記ＳＴＡＴがＳＴＡＴ１またはＳＴＡＴ３から選択される、および／または
    ＳＴＡＴの動員を低減または排除する前記変異が１か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる、請求項２２～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体（ＬＲ）に由来し、前記変異がＹ９８５、Ｙ１０７７、およびＹ１１３８の位置のうちの１か所以上である、および／または前記変異が、Ｙ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆのうちの１つ以上である、および／またはマウスレプチン受容体（ＬＲ）のＹ９８５Ｆ、Ｙ１０７７Ｆ、およびＹ１１３８Ｆと機能的に同等の変異を有する、請求項２２～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記プレイ蛋白質が核外搬出配列（ＮＥＳ）を含み、
    前記ＮＥＳが１～４個の疎水性残基を有し、前記疎水性残基がロイシンである、および／または
    前記ＮＥＳが配列ＬｘｘｘＬｘｘＬｘＬを有し、ここでＬはロイシンであり、ｘは任意の他のアミノ酸である、
    請求項２２～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記プレイ蛋白質との相互作用前に、前記ベイトが、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）もしくはその誘導体もしくは類似体、またはＦＫ５０６（タクロリムス）、ラパマイシン（シロリムス）、およびシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）もしくはその誘導体もしくは類似体と同一のＦＫＢＰベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される化合物に接触している、請求項２２～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記方法が、低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質／蛋白質相互作用を同定する、請求項２２～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ベイト蛋白質がセレブロン（ＣＲＢＮ）またはＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）である、
    請求項１に記載の方法。
  39. 前記低分子とプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される前記蛋白質／蛋白質相互作用が、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される、および／または
    前記低分子が、前記プレイ蛋白質との相互作用を可能にするベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導する、および／または
    前記低分子が分子糊化合物またはハイブリッドリガンドである、
    請求項３８に記載の方法。
  40. 前記方法が、
    前記低分子とプレイ蛋白質もしくはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質／蛋白質相互作用、または
    前記プレイ蛋白質およびベイト蛋白質を含む蛋白質／蛋白質相互作用を誘導、媒介、もしくは安定化する低分子化合物、および／または分子糊もしくはハイブリッドリガンドである低分子化合物
    を同定する、
    請求項３８に記載の方法。
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