JP2023507380A - 新規分解関連相互作用の検出 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ベイトとプレイのシステムを用いて蛋白質/蛋白質相互作用または蛋白質/低分子相互作用を検出および同定する方法に関する。本発明はまた、本明細書中に記載の方法に用いるベイトおよびプレイ蛋白質、低分子および構築物にも関する。【選択図】図1A
Description
本発明は、とりわけ蛋白質/蛋白質相互作用または蛋白質/低分子相互作用、および/または新規低分子の検出および同定に関する。
関連する出願の相互参照
本出願は、2019年12月17日付けで出願された米国仮出願番号第62/949,026号に基づく優先権を主張するものである。その優先出願の開示内容全体が本明細書に組み入れられる。
本出願は、2019年12月17日付けで出願された米国仮出願番号第62/949,026号に基づく優先権を主張するものである。その優先出願の開示内容全体が本明細書に組み入れられる。
電子提出のテキストファイルについての説明
本明細書に付帯する電子提出のテキストファイルの内容は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる:配列表のコンピューター可読性形態のコピー(ファイル名:「ORN-064PC_ST25.txt」;作成日:2020年12月7日;ファイルサイズ:10,365バイト)。
本明細書に付帯する電子提出のテキストファイルの内容は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる:配列表のコンピューター可読性形態のコピー(ファイル名:「ORN-064PC_ST25.txt」;作成日:2020年12月7日;ファイルサイズ:10,365バイト)。
蛋白質/蛋白質相互作用および蛋白質/低分子相互作用などの分子相互作用は、全ての生物学的過程ではなくとも、多くの生物学的過程にとっては重要な部分である。分子相互作用の促進または阻害は治療方略として用いることができるが、臨床的に意義のある分子相互作用の判定が問題となることが多い。
蛋白質/蛋白質相互作用(PPI)の役割に関する理解が深まったため、蛋白質間相互作用を壊したりその酵素活性を阻害したりする化学物質ではなく、蛋白質間相互作用を安定化させる/誘導する化学物質の探索が行われるようになった。分子糊は低分子PPI安定化剤を指し、蛋白質に結合して分子表面を変化させ、それによって新たな蛋白質を動員すること、あるいは弱い蛋白質/蛋白質相互作用を安定化することを可能にする。これらの化合物のうちで、とりわけ注目すべきは、E3リガーゼ蛋白質セレブロン(CRBN)と相互作用し下流の蛋白質分解を作動させる免疫調節薬剤のレナリドミドであり、各種癌の治療において卓越した効能を示す。また分子糊のなかには、蛋白質/蛋白質相互作用界面のところに形成される構造に特異的に結合して弱い蛋白質/蛋白質相互作用を安定化させることにより作用するものもある。この場合は、レナリドミドなどの分子糊がまず1種類の蛋白質に結合した後、他の蛋白質(複数可)との複合体形成を誘導または促進するという本明細書で概説するような状況とは対照的に、両方の蛋白質が相互作用している構造にのみ分子糊が結合する。
すなわち、分子相互作用を検出するための、より安定した新規の方法に対する必要性が依然として存在する。
本発明は部分的には、細胞を基盤とした、様々な分子相互作用を検出するシステムに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、標準的アッセイを用いた場合には検出可能ではない分子相互作用(例えば、蛋白質/蛋白質、蛋白質/低分子、および/または低分子によって調節される蛋白質/蛋白質相互作用)の検査/識別を可能にする方法を提供する。いくつかの実施態様においては、本明細書に開示の方法は、疾患に対する治療法の開発に利用することのできる、臨床的に意義のある、または臨床的に有意な蛋白質間分子相互作用の同定を可能にする。
いくつかの実施態様においては、本明細書に開示の方法は、単一のベイト蛋白質と複数のプレイ蛋白質を含む。そのような方法は、ベイト蛋白質と複数のプレイ蛋白質または個々のプレイ蛋白質との間の分子相互作用を識別するために用いるのであってもよい。いくつかの実施態様において、本発明は哺乳動物の蛋白質/蛋白質相互作用捕捉(MAPPIT)アッセイを利用する(MAPPITに関しては、Eyckermanらの「サイトカイン受容体を基盤とする相互作用捕捉の設計と応用(Design and application of a cytokine-receptor-based interaction trap)」 Nat Cell Biol. 2001 Dec;3(12):1114-9;およびLievensらの「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの2蛋白質インタラクトミックス(Proteome-scale binary interactomics in human cells)」Molecular & Cellular Proteomics 15.12 (2016): 3624-3639)を参照のこと;これらの参考文献はその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。しかし、本明細書中に記載のMAPPIT派生型アッセイは、ベイトまたはプレイ蛋白質と相互作用する低分子を利用することによって、ならびにいくつかの実施態様においては他の特徴を利用することによって、その性能が増大するのである。いくつかの実施態様においては、低分子(本明細書においては、「化合物」または「リガンド」または「薬剤」とも記載される)によって、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との間の分子相互作用が促進/誘導される。実施態様においては、当該低分子はハイブリッドリガンドではない化学物質である。実施態様においては、当該低分子は単一の化学物質である。実施態様においては、当該低分子はリンカーを有していない。実施態様においては、当該低分子はベイトまたはプレイ蛋白質のうちの一方のみと直接相互作用する。実施態様においては、当該低分子は、CRBN結合分子、PEGリンカー、および低分子のうちの1種類以上を有するハイブリッドリガンドである化学物質である。
様々な実施態様において、本発明は分子相互作用を検出する方法に関するが、該方法は:
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した細胞内E3リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質を有し、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、低分子のE3リガーゼ基質結合サブユニットへの結合によって、プレイ蛋白質への結合が促進され、また足場蛋白質、低分子と共に複合体を形成するE3リガーゼ基質結合サブユニット、およびプレイ蛋白質を含む蛋白質複合体の形成が促進される。
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した細胞内E3リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質を有し、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、低分子のE3リガーゼ基質結合サブユニットへの結合によって、プレイ蛋白質への結合が促進され、また足場蛋白質、低分子と共に複合体を形成するE3リガーゼ基質結合サブユニット、およびプレイ蛋白質を含む蛋白質複合体の形成が促進される。
いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質を受容体断片に融合する。いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質を受容体断片のN末端またはC末端に融合する。実施態様においては、プレイ蛋白質をgp130またはその断片に融合する。実施態様においては、プレイ蛋白質をgp130またはその断片のN末端またはC末端に融合する。
実施態様においては、該第1の受容体および第2の受容体は同一の受容体である。
実施態様においては、E3リガーゼ基質は内因性であるか、または導入遺伝子によって発現させる。
様々な実施態様において、本発明は分子相互作用を検出する方法に関するが、該方法は:
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した足場蛋白質を有し、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、該足場蛋白質はE3リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、また足場蛋白質とE3リガーゼ基質結合サブユニットとの間の複合体はプレイと相互作用する。
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した足場蛋白質を有し、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、該足場蛋白質はE3リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、また足場蛋白質とE3リガーゼ基質結合サブユニットとの間の複合体はプレイと相互作用する。
いくつかの実施態様においては、プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員されるので、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達が回復し、STAT分子の活性化が起こる。いくつかの実施態様において、該細胞はSTAT応答性レポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、活性化STAT分子は核内に移行してSTAT応答性レポーター遺伝子の転写を誘導する;レポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出および/または発見が可能になることもある。
いくつかの実施態様において、検出される相互作用は、ベイトおよび/またはプレイの2量体、3量体またはさらに高次の蛋白質複合体への動員である。
いくつかの実施態様において、該分子相互作用は蛋白質/蛋白質相互作用である。いくつかの実施態様において、該分子相互作用は低分子が仲介する蛋白質/蛋白質相互作用である(例えば、該方法はプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む)。具体的には、いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用である。例えば、本法は複合体形成を検出するものであってもよい。いくつかの実施態様において、該低分子はプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との相互作用を可能にするプレイ蛋白質またはベイト蛋白質の疎水性表面あるいは結合部位の露出を誘導する。いくつかの実施態様においては、該低分子は分子糊または二価ハイブリッドリガンド分子である(例えば、PROTACが挙げられるが、これのみに限定されるものではない)。
一例を挙げれば、いくつかの実施態様においては、検出する相互作用は、限定するものではないが例えば、免疫調節薬剤(IMiD)、例えば、サリドマイド、レナリドミドおよびポマリドミド、およびそれに関連する化合物あるいは同等または類似の構造ポケットおよび通常IMiD化合物およびそれに関連する化合物によって占有されるような低分子結合部位に結合する化合物に接触しているE3リガーゼ蛋白質を含む。
いくつかの実施態様においては、E3リガーゼ基質結合ベイト蛋白質としてVHLを用いる際に本法が利用可能である。CRBNと同様に、VHLはE3リガーゼの基質結合サブユニットである。したがって、ベイトとしてのE3リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのVHLにも同様に当てはまる。
実施態様において、E3リガーゼの代わりに、FKBP12蛋白質またはこのファミリーの構成員をベイトとして用いる際に本法が利用可能である(したがって、ベイトとしてのE3リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのFKBP蛋白質またはこのファミリーの構成員、例えばFKBP12(これのみに限定されるものではない)にも同様に当てはまる)。
いくつかの実施態様において、本法は受容体融合蛋白質として発現していないベイト蛋白質の提示を可能にする。この場合には、ベイト蛋白質と相互作用し得る別の蛋白質、すなわち足場蛋白質を受容体蛋白質に融合する。そのような蛋白質とベイトとの相互作用によって、複合体の一部としてベイト蛋白質を効果的に提示する蛋白質複合体が形成される。これによって、受容体への融合を必要としない形態でベイト蛋白質を提示する新規アプローチが提供される。一例を挙げれば(また本明細書中でも具体的に記載されているのであるが)、例えば、DDB1(またはE3リガーゼの基質認識要素と天然に相互作用する他の足場蛋白質)などのE3リガーゼ蛋白質複合体の別の構成要素を該受容体に融合する。DDB1については、この蛋白質を受容体融合物として発現させ、次いで、(例えば、非融合蛋白質として)別途発現させたCRBNベイト蛋白質に対して相互作用させ、E3リガーゼによって基質に提示する天然の様式を模倣して提示させる。分子糊および複数のプレイ蛋白質への同時曝露によって、IMiDなどの分子糊に対するCRBNの結合に応答して、DDB1/CRBN複合体と相互作用するプレイ蛋白質の発見が可能になる。同様に類推として、いくつかの実施態様においては、CRBN以外のリガンド結合性ベイト蛋白質(VHLまたは他のE3リガーゼ構成要素など)であって、発現受容体融合蛋白質ではないリガンド結合性ベイト蛋白質を含む複数蛋白質の複合体を、このような方法でベイトとして提示することができる。
いくつかの実施態様においては、ベイトおよび/または化合物との相互作用について、複数のプレイ蛋白質のスクリーニングに本法を利用することができる。
様々な実施態様において、本法は、例えば、各種のプレイ蛋白質をコードするcDNAが表面上にスポットされているアレイ型形態に関連する。様々な実施態様において、本法は、例えば、プレイ蛋白質のライブラリーを細胞に導入して、平均的には各細胞が単一プレイを発現するようにした細胞集団を基盤とした方法に関連する。そのような実施態様においては、化合物および/またはベイトと相互作用した場合に、当該コードcDNAを同定してその相互作用を明らかにする。実施態様においては、そのような同定にFACSまたは微量流体分離を用いる。
いくつかの実施態様において、プレイ蛋白質および/またはベイト蛋白質との相互作用について、複数の化合物(例えば、化合物ライブラリー)のスクリーニングに本法を利用することができる。化合物がリンカーを含んでいない(例えば、ハイブリッドリガンドではない)実施態様においては、本法によって、リンカー付加に起因する化合物相互作用部分の妨害の可能性のないスクリーニングが可能となる。
いくつかの実施態様においては、E3リガーゼ基質結合ベイト蛋白質としてVHLを用いる際に本法が利用可能である。CRBNと同様に、VHLはE3リガーゼの基質結合サブユニットである(したがって、ベイトとしてのE3リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのVHLにも同様に当てはまる)。
いくつかの実施態様において、E3リガーゼの代わりに、FKBPまたはこのファミリーの構成員を受容体融合物ではないベイトとして用いる場合には、本法が利用可能である(したがって、受容体融合物ではないベイトとしてのE3リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのFKBPまたはこのファミリーの構成員、例えば、FKBP12にも同様に当てはまる)。
本開示は、細胞を基盤とするシステムおよび方法であって、標準的アッセイを用いた場合には検出可能ではない分子相互作用(例えば、蛋白質/蛋白質、蛋白質/低分子、および/または低分子によって調節される蛋白質/蛋白質相互作用)の検査を可能にするシステムおよび方法の発見に部分的には基づくものである。
一局面において、本法は分子相互作用を検出する方法を可能にし、該方法は:
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が:
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した細胞内E3リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質を有し、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT動員を低減または排除する変異を含む、
該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
を含む。
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が:
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した細胞内E3リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質を有し、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT動員を低減または排除する変異を含む、
該第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
を含む。
様々な実施態様において、本発明は分子相互作用を検出する方法に関するが、該方法は:
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、およびそれに融合した足場蛋白質を有する膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(シグナル伝達因子および転写活性化因子)動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン
を含み;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、該足場蛋白質はE3リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、該足場蛋白質とE3リガーゼ基質結合サブユニットの間の複合体はプレイと相互作用する。
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を有する細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、およびそれに融合した足場蛋白質を有する膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(シグナル伝達因子および転写活性化因子)動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン
を含み;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
によって分子相互作用を検出する。実施態様においては、該足場蛋白質はE3リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、該足場蛋白質とE3リガーゼ基質結合サブユニットの間の複合体はプレイと相互作用する。
いくつかの局面において、本法は分子相互作用を検出する方法を可能にし、該方法は:
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が:
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)そのような第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した1種類の蛋白質(または複数種類の蛋白質)を有し、
細胞内E3リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質と相互作用可能であり、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含み;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
を含む。実施態様においては、該ベイト蛋白質が足場蛋白質およびE3リガーゼ基質結合サブユニットベイトに会合する。実施態様においては、該ベイト蛋白質を該膜貫通蛋白質に直接的に融合する。
(a)リガンドを基盤とするキメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該キメラ受容体が:
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)そのような第1の受容体または第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインであって、
それに融合した1種類の蛋白質(または複数種類の蛋白質)を有し、
細胞内E3リガーゼ基質結合サブユニットベイト蛋白質と相互作用可能であり、
ここで該受容体構築物の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含み;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること、
を含む。実施態様においては、該ベイト蛋白質が足場蛋白質およびE3リガーゼ基質結合サブユニットベイトに会合する。実施態様においては、該ベイト蛋白質を該膜貫通蛋白質に直接的に融合する。
いくつかの実施態様においては、本明細書中に記載のようなシステムにおけるプレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、プレイ蛋白質に融合した受容体断片を含む蛋白質複合体の形成が起こる。そのような受容体断片の複合体への動員によって、受容体結合JAKキナーゼ(例えば、JAK2)の利用可能な基質として配置されるので、リガンド依存性受容体シグナル伝達およびSTAT分子の活性化を回復する。いくつかの実施態様において、該細胞はSTAT応答性レポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、活性化したSTAT分子は核内に移行してSTAT応答性レポーター遺伝子の転写を誘導し、場合によっては、該レポーター遺伝子シグナルにより分子相互作用の検出および/または発見が可能になることもある。
いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は蛋白質/蛋白質相互作用である。いくつかの実施態様においては、ベイトおよびプレイはいずれも蛋白質である。
本発明はまた、化合物ライブラリーを分析することを含む。実施態様においては、ベイトが化合物に結合するが、このベイト/化合物複合体はプレイと相互作用するのであってもよい。したがって、実施態様において、本法は化合物仲介性の新規の蛋白質/蛋白質相互作用および/または新規の蛋白質/化合物相互作用の検出および/または発見を可能にする。実施態様において、本法は分子糊として働く新規化合物の検出および/または発見を可能にする。実施態様において、本法は弱いベイト/プレイ相互作用を強いベイト/プレイ相互作用に変換する新規化合物の検出および/または発見を可能にする。
いくつかの実施態様において、ベイトはユビキチンプロテアソームシステムを調節する蛋白質であるか、または調節する蛋白質を含む。いくつかの実施態様において、ベイトはE3リガーゼ蛋白質またはE3リガーゼ蛋白質を調節する蛋白質であるか、またはE3リガーゼ蛋白質またはE3リガーゼ蛋白質を調節する蛋白質を含む。いくつかの実施態様において、ベイトはカリンリングリガーゼ(CRL)蛋白質またはCRL蛋白質を調節する蛋白質であるか、またはカリンリングリガーゼ(CRL)蛋白質またはCRL蛋白質を調節する蛋白質を含む。様々な実施態様において、ベイトはCRL4蛋白質またはCRL4蛋白質を調節する蛋白質であるか、またはCRL4蛋白質またはCRL4蛋白質を調節する蛋白質を含む。いくつかの実施態様においては、ベイトはDDB1-CUL4-関連因子(DCAF)蛋白質またはDCAFを調節する蛋白質であるか、またはDDB1-CUL4-関連因子(DCAF)蛋白質またはDCAFを調節する蛋白質を含む。
いくつかの実施態様において、ベイトはセレブロン(CRBN)およびフォン・ヒッペル・リンドウ(Von Hippel Lindau:VHL)のうちの1種類以上であるか、あるいは1種類以上を含む。
実施態様においては、CRBNまたはVHLを本明細書中に記載のような膜貫通ドメインに融合させる。実施態様においては、CRBNまたはVHLを本明細書中に記載のような膜貫通ドメインには融合させない;例えば、本明細書中に記載のような膜貫通ドメインに融合した足場蛋白質と相互作用した時に、ベイトとして働く。
実施態様において、ベイトはE3リガーゼ基質結合サブユニットである。
実施態様においては、該E3リガーゼ基質結合サブユニットは以下の遺伝子によってコードされる蛋白質から選択される:
AMFR、ANAPC11、APG16L、ARIH1、ARIH2、ARPC1A、ARPC1B、ASB2、ASB2、ATG16L1、BAF250、BARD1、BIRC2、BIRC3、BIRC4、BIRC7、BMI1、BRAP、BRCA1、bTrCP、CBL、CBLB、CBLC、CBLL1、CCIN、CCIN、CCNB1IP1、CRBN、CHFR、CHIP、CNOT4、COP1、CSA、DCAF1、DCAF10、DCAF11、DCAF12、DCAF13、DCAF14、DCAF15、DCAF16、DCAF17、DCAF19、DCAF2、DCAF3、DCAF4、DCAF5、DCAF6、DCAF7、DCAF8、DCAF9、Dda1、DDB2、DET1、DNAI2、DTX3、DZIP3、E6AP、EDD、EED、ENC1、ENC1、FANCL、FBXL1、FBXL10、FBXL11、FBXL12、FBXL13、FBXL14、FBXL15、FBXL16、FBXL17、FBXL18、FBXL19、FBXL20、FBXL21、FBXL22、FBXL3、FBXL4、FBXL5、FBXL7、FBXL8、FBXO1、FBXO10、FBXO11、FBXO12、FBXO13、FBXO14、FBXO15、FBXO16、FBXO17、FBXO18、FBXO19、FBXO2、FBXO20、FBXO21、FBXO22、FBXO3、FBXO4、FBXO5、FBXO6、FBXO7、FBXO8、FBXW1、FBXW10、FBXW11、FBXW12、FBXW5、FBXW7、FBXW8、FBXW9、FEM1A、FEM1B、FEM1C、GAN、GAN、GNB1、GNB2、GNB5、GRWD1、GTF2H2、GTF3C2、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HERC5、HERC6、HLTF、HOIP、HUWE1、IBRDC2、IBRDC3、IFRG15、IPP、IPP、ITCH、IVNS1ABP、IVNS1ABP、KATNB1、KBTBD10、KBTBD10、KBTBD11、KBTBD11、KBTBD12、KBTBD12、KBTBD13、KBTBD13、KBTBD2、KBTBD2、KBTBD3、KBTBD3、KBTBD4、KBTBD4、KBTBD5、KBTBD5、KBTBD6、KBTBD6、KBTBD7、KBTBD7、KBTBD8、KBTBD8、KCTD5、KEAP、KEAP1、KIAA0317、KIAA0614、KLHDC5、KLHL1、KLHL1、KLHL10、KLHL10、KLHL11、KLHL11、KLHL12、KLHL12、KLHL13、KLHL13、KLHL14、KLHL14、KLHL15、KLHL15、KLHL17、KLHL17、KLHL18、KLHL18、KLHL2、KLHL2、KLHL20、KLHL21、KLHL21、KLHL22、KLHL22、KLHL23、KLHL23、KLHL24、KLHL24、KLHL25、KLHL25、KLHL26、KLHL26、KLHL28、KLHL28、KLHL29、KLHL29、KLHL3、KLHL3、KLHL30、KLHL30、KLHL31、KLHL31、KLHL32、KLHL32、KLHL33、KLHL33、KLHL34、KLHL34、KLHL35、KLHL35、KLHL36、KLHL36、KLHL38、KLHL38、KLHL4、KLHL4、KLHL5、KLHL5、KLHL6、KLHL6、KLHL7、KLHL7、KLHL8、KLHL8、KLHL9、KLHL9、LINCR、LNX1、LRR1、LRRC41、LRSAM1、LZTR1、LZTR1、MAGEA1、MAGE-A1、MAGEA2、MAGE-A2、MAGEA3、MAGE-A3、MAGEA6、MAGE-A6、MAGEB18、MAGE-B18、MAGEB2、MAGE-B2、MAGEC2、MAGE-C2、MALIN、MAP3K1、MARCH1、MARCH11、MARCH2、MARCH4、MARCH5、MARCH6、MARCH7、MARCH8、MARCH9、MDM2、MDM4、MEX、MGRN1、MIB1、MIB2、MID1、MKRN1、MNAT1、MUF1、MULAN、MURF、MYCBP2、MYLIP、Nedd4、NEDD4L、NEDL1、NEDL2、NEURL、NEURL2、NLE1、NUP43、OSTM1、PAFAH1B1、PARC、PARK2、PCGF1、PCGF2、PDZRN3、PEX10、PEX7、PJA1、PJA2、POC1A、PPIL2、PRAME、PRPF19、PWP1、RACK1、RAD18、RAE1、RAG1、RBBP4、RBBP5、RBBP6、RBBP7、RBCK1、RBX1、RCHY1、RFFL、RFPL4A、RFWD2、RING1、RNF103、RNF11、RNF111、RNF114、RNF12、RNF123、RNF125、RNF128、RNF13、RNF130、RNF133、RNF135、RNF138、RNF139、RNF14、RNF144A、RNF167、RNF168、RNF180、RNF181、RNF182、RNF185、RNF19、RNF2、RNF20、RNF20、RNF216、RNF25、RNF34、RNF4、RNF40、RNF41、RNF43、RNF43、RNF5、RNF6、RNF7、RNF8、RNF85、RPTOR、SCAP、SH3RF1、SHPRH、SIAH1、SIAH2、SMU1、SMURF1、SMURF2、SOCS1、SOCS3、SPOP、SPSB1、SPSB1、SPSB2、SPSB2、SPSB4、SPSB4、STXBP5L、SYVN1、TAF5L、TBL1Y、THOC3、TLE1、TLE2、TLE3、TOPORS、TRAF2、TRAF6、TRAF7、TRAIP、TRIAD3、TRIM1、TRIM10、TRIM11、TRIM12、TRIM13、TRIM14、TRIM15、TRIM16、TRIM17、TRIM18、TRIM2、TRIM21、TRIM22、TRIM23、TRIM24、TRIM25、TRIM26、TRIM27、TRIM28、TRIM29、TRIM29、TRIM3、TRIM31、TRIM32、TRIM33、TRIM36、TRIM37、TRIM39、TRIM40、TRIM41、TRIM44、TRIM45、TRIM47、TRIM5、TRIM50、TRIM52、TRIM54、TRIM55、TRIM58、TRIM59、TRIM62、TRIM65、TRIM66、TRIM7、TRIM71、TRIM8、TRIM9、TRIP12、TRPC4AP、TSSC1、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR1、UBR2、UBR3、UBR4、UHRF1、UHRF2、VHL、VPS18、WDR12、WDR23、WDR26、WDR3、WDR31、WDR37、WDR39、WDR4、WDR47、WDR48、WDR5、WDR51B、WDR53、WDR57、WDR59、WDR5B、WDR61、WDR76、WDR77、WDR82、WDR83、WDR86、WSB1、WSB2、WWP1、WWP2、ZNF294、ZNF313、ZNF364、ZNRF1、ZNRF2、ZYG11A、ZYG11B、またはZYG11BL。
AMFR、ANAPC11、APG16L、ARIH1、ARIH2、ARPC1A、ARPC1B、ASB2、ASB2、ATG16L1、BAF250、BARD1、BIRC2、BIRC3、BIRC4、BIRC7、BMI1、BRAP、BRCA1、bTrCP、CBL、CBLB、CBLC、CBLL1、CCIN、CCIN、CCNB1IP1、CRBN、CHFR、CHIP、CNOT4、COP1、CSA、DCAF1、DCAF10、DCAF11、DCAF12、DCAF13、DCAF14、DCAF15、DCAF16、DCAF17、DCAF19、DCAF2、DCAF3、DCAF4、DCAF5、DCAF6、DCAF7、DCAF8、DCAF9、Dda1、DDB2、DET1、DNAI2、DTX3、DZIP3、E6AP、EDD、EED、ENC1、ENC1、FANCL、FBXL1、FBXL10、FBXL11、FBXL12、FBXL13、FBXL14、FBXL15、FBXL16、FBXL17、FBXL18、FBXL19、FBXL20、FBXL21、FBXL22、FBXL3、FBXL4、FBXL5、FBXL7、FBXL8、FBXO1、FBXO10、FBXO11、FBXO12、FBXO13、FBXO14、FBXO15、FBXO16、FBXO17、FBXO18、FBXO19、FBXO2、FBXO20、FBXO21、FBXO22、FBXO3、FBXO4、FBXO5、FBXO6、FBXO7、FBXO8、FBXW1、FBXW10、FBXW11、FBXW12、FBXW5、FBXW7、FBXW8、FBXW9、FEM1A、FEM1B、FEM1C、GAN、GAN、GNB1、GNB2、GNB5、GRWD1、GTF2H2、GTF3C2、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HERC5、HERC6、HLTF、HOIP、HUWE1、IBRDC2、IBRDC3、IFRG15、IPP、IPP、ITCH、IVNS1ABP、IVNS1ABP、KATNB1、KBTBD10、KBTBD10、KBTBD11、KBTBD11、KBTBD12、KBTBD12、KBTBD13、KBTBD13、KBTBD2、KBTBD2、KBTBD3、KBTBD3、KBTBD4、KBTBD4、KBTBD5、KBTBD5、KBTBD6、KBTBD6、KBTBD7、KBTBD7、KBTBD8、KBTBD8、KCTD5、KEAP、KEAP1、KIAA0317、KIAA0614、KLHDC5、KLHL1、KLHL1、KLHL10、KLHL10、KLHL11、KLHL11、KLHL12、KLHL12、KLHL13、KLHL13、KLHL14、KLHL14、KLHL15、KLHL15、KLHL17、KLHL17、KLHL18、KLHL18、KLHL2、KLHL2、KLHL20、KLHL21、KLHL21、KLHL22、KLHL22、KLHL23、KLHL23、KLHL24、KLHL24、KLHL25、KLHL25、KLHL26、KLHL26、KLHL28、KLHL28、KLHL29、KLHL29、KLHL3、KLHL3、KLHL30、KLHL30、KLHL31、KLHL31、KLHL32、KLHL32、KLHL33、KLHL33、KLHL34、KLHL34、KLHL35、KLHL35、KLHL36、KLHL36、KLHL38、KLHL38、KLHL4、KLHL4、KLHL5、KLHL5、KLHL6、KLHL6、KLHL7、KLHL7、KLHL8、KLHL8、KLHL9、KLHL9、LINCR、LNX1、LRR1、LRRC41、LRSAM1、LZTR1、LZTR1、MAGEA1、MAGE-A1、MAGEA2、MAGE-A2、MAGEA3、MAGE-A3、MAGEA6、MAGE-A6、MAGEB18、MAGE-B18、MAGEB2、MAGE-B2、MAGEC2、MAGE-C2、MALIN、MAP3K1、MARCH1、MARCH11、MARCH2、MARCH4、MARCH5、MARCH6、MARCH7、MARCH8、MARCH9、MDM2、MDM4、MEX、MGRN1、MIB1、MIB2、MID1、MKRN1、MNAT1、MUF1、MULAN、MURF、MYCBP2、MYLIP、Nedd4、NEDD4L、NEDL1、NEDL2、NEURL、NEURL2、NLE1、NUP43、OSTM1、PAFAH1B1、PARC、PARK2、PCGF1、PCGF2、PDZRN3、PEX10、PEX7、PJA1、PJA2、POC1A、PPIL2、PRAME、PRPF19、PWP1、RACK1、RAD18、RAE1、RAG1、RBBP4、RBBP5、RBBP6、RBBP7、RBCK1、RBX1、RCHY1、RFFL、RFPL4A、RFWD2、RING1、RNF103、RNF11、RNF111、RNF114、RNF12、RNF123、RNF125、RNF128、RNF13、RNF130、RNF133、RNF135、RNF138、RNF139、RNF14、RNF144A、RNF167、RNF168、RNF180、RNF181、RNF182、RNF185、RNF19、RNF2、RNF20、RNF20、RNF216、RNF25、RNF34、RNF4、RNF40、RNF41、RNF43、RNF43、RNF5、RNF6、RNF7、RNF8、RNF85、RPTOR、SCAP、SH3RF1、SHPRH、SIAH1、SIAH2、SMU1、SMURF1、SMURF2、SOCS1、SOCS3、SPOP、SPSB1、SPSB1、SPSB2、SPSB2、SPSB4、SPSB4、STXBP5L、SYVN1、TAF5L、TBL1Y、THOC3、TLE1、TLE2、TLE3、TOPORS、TRAF2、TRAF6、TRAF7、TRAIP、TRIAD3、TRIM1、TRIM10、TRIM11、TRIM12、TRIM13、TRIM14、TRIM15、TRIM16、TRIM17、TRIM18、TRIM2、TRIM21、TRIM22、TRIM23、TRIM24、TRIM25、TRIM26、TRIM27、TRIM28、TRIM29、TRIM29、TRIM3、TRIM31、TRIM32、TRIM33、TRIM36、TRIM37、TRIM39、TRIM40、TRIM41、TRIM44、TRIM45、TRIM47、TRIM5、TRIM50、TRIM52、TRIM54、TRIM55、TRIM58、TRIM59、TRIM62、TRIM65、TRIM66、TRIM7、TRIM71、TRIM8、TRIM9、TRIP12、TRPC4AP、TSSC1、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR1、UBR2、UBR3、UBR4、UHRF1、UHRF2、VHL、VPS18、WDR12、WDR23、WDR26、WDR3、WDR31、WDR37、WDR39、WDR4、WDR47、WDR48、WDR5、WDR51B、WDR53、WDR57、WDR59、WDR5B、WDR61、WDR76、WDR77、WDR82、WDR83、WDR86、WSB1、WSB2、WWP1、WWP2、ZNF294、ZNF313、ZNF364、ZNRF1、ZNRF2、ZYG11A、ZYG11B、またはZYG11BL。
実施態様において、該E3リガーゼ基質結合サブユニットはCRBNまたはVHLである。
実施態様において、該足場蛋白質はE3リガーゼ基質結合サブユニットと相互作用し、該足場蛋白質とE3リガーゼ基質結合サブユニットとの間の複合体はプレイと相互作用する。
実施態様において、該足場は以下から選択される:
BIRC6、CUL3、DDB1、ELOB、ELOC、RBX1、SKP1、UBCH5A、UBE2A、UBE2B、UBE2B2、UBE2C、UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3、UBE2D4、UBE2E1、UBE2E2、UBE2E3、UBE2F、UBE2G1、UBE2G2、UBE2H、UBE2J1、UBE2J2、UBE2K、UBE2L3、UBE2L6、UBE2M、UBE2N、UBE2NL、UBE2O、UBE2Q1、UBE2Q2、UBE2QL、UBE2R1、UBE2R2、UBE2S、UBE2T、UBE2U、UBE2V1、UBE2V1、UBE2V2、およびUBE2W。
BIRC6、CUL3、DDB1、ELOB、ELOC、RBX1、SKP1、UBCH5A、UBE2A、UBE2B、UBE2B2、UBE2C、UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3、UBE2D4、UBE2E1、UBE2E2、UBE2E3、UBE2F、UBE2G1、UBE2G2、UBE2H、UBE2J1、UBE2J2、UBE2K、UBE2L3、UBE2L6、UBE2M、UBE2N、UBE2NL、UBE2O、UBE2Q1、UBE2Q2、UBE2QL、UBE2R1、UBE2R2、UBE2S、UBE2T、UBE2U、UBE2V1、UBE2V1、UBE2V2、およびUBE2W。
いくつかの実施態様において、該足場蛋白質は、損傷DNA結合蛋白質1(DDB1)、カリン4A(CUL4A)、およびカリン1の制御因子(ROC1)から選択される。
様々な実施態様において、ベイトは、セレブロン(CRBN)、損傷DNA結合蛋白質1(DDB1)、カリン4A(CUL4A)、カリン1の制御因子(ROC1)、およびフォン・ヒッペル・リンドウ(Von Hippel Lindau:VHL)のうちの1種類以上を含む。
いくつかの実施態様において、プレイはCRBNの基質および/またはネオ基質である。実施態様において、CRBNの基質および/またはネオ基質は、iの側鎖とi+3のバックボーンNHとの間、およびiのバックボーンのカルボニル酸素とi+4のバックボーンNHとの間に水素結合を有するAsxまたはSTモチーフなどの、水素結合受容体を有する側鎖を含むi-残基を有するb-ヘアピンa-ターンを含む。実施態様において、i+4残基はグリシンである(GSPT1、CK1aが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない)。実施態様において、CRBNの基質および/またはネオ基質は、システインである残基iおよびi+3ならびにグリシンであるi+4残基を含むb-ヘアピンa-ターンを有する。該2つのCys残基は亜鉛イオンに結合して、ターンの形態を強化する(IKZF1、ZnF692および以下の参考文献に報告されている全ての基質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない:「CRBNによってサリドマイド類似体の標的となるヒトC2H2ジンクフィンガーデグロムを絞り込む(Defining the human C2H2 zinc finger degrome targeted by thalidomide analogs through CRBN)」、Sieversら、Science Vol.362、Issue 6414、DOI: 1 0.1126/science. aat0572 (2018);本参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる)。実施態様においては、CRBNの基質および/またはネオ基質は、i+3の位置にグリシンを含むb-ヘアピンb-ターンである「偽性ループ」を有する。ターン構造は、i-1の側鎖の水素結合受容体とi+3グリシンのカルボニルとの間の水素結合によって強化され得る。
実施態様においては、CRBNは、ヒトCRBN蛋白質(例えば、ヒトCRBNイソ型1(GenBankアクセッション番号:NP_057386);またはヒトCRBNイソ型2(GenBankアクセッション番号:NP_001166953)など、いずれかのCRBNのアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチド(そのSNP変異体を含む)を指す;上記の各参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。関連CRBNポリペプチドは、対立遺伝子変異体(例えば、SNP変異体);スプライス変異体;断片;誘導体;置換、欠失、および挿入変異体;融合ポリペプチド;および生物種相同体を含み、これらは、特定の実施態様においては、CRBN活性を保持し、および/または抗CRBN免疫応答を充分起こし得るものである。
いくつかの実施態様において、プレイは、イカロス(Ikaros)(IKZF1)、ヘリオス(Helios)(IKZF2)、アイオロス(Aiolos)(IKZF3)、Eos(IKZF4)、ペガサス(Pegasus)(IKZF5)、SALL4、CSNK1A、CK1a、およびZFP91のうちの1種類以上である。様々な実施態様において、プレイは、イカロス(Ikaros)(IKZF1)、ヘリオス(Helios)(IKZF2)、アイオロス(Aiolos)(IKZF3)、Eos(IKZF4)、ペガサス(Pegasus)(IKZF5)、SALL4、CSNK1A、CK1a、およびZFP91のうちの1種類以上である。いくつかの実施態様においては、プレイは、イカロス(Ikaros)(IKZF1)、ヘリオス(Helios)(IKZF2)、アイオロス(Aiolos)(IKZF3)、Eos(IKZF4)、ペガサス(Pegasus)(IKZF5)、SALL4、CSNK1A、CK1a、およびZFP91のうちの1種類以上である。
いくつかの実施態様において、本法は、1種類以上のE3リガーゼ基質結合サブユニット(CRBNおよびVHLなどが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない)をベイト(またはDDB1、CUL4A、およびROC1などの足場蛋白質と会合し、CRBNまたはVHLに接触しているベイト)として含み、該ベイトと相互作用する蛋白質プレイを発見するために、該ベイトを本明細書中に記載の化合物(例えば、1種類以上のE3リガーゼ基質結合サブユニット(CRBNおよびVHLなどが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない)に結合する化合物(例えば、IMiD)に接触させる;その理由は、ベイトが該化合物によって調節されるからである。例えば、該方法では、該化合物によって調節されるベイトに接触し相互作用するプレイを同定する。いくつかの実施態様においては、ベイトとの相互作用により、該プレイが動員および/または分解される。そのような実施態様おいては、プレイが該化合物と直接に相互作用するのではないことが挙げられるが、それのみに限定されるものではない。
いくつかの実施態様において、本法はCRBNの新規の基質またはネオ基質の同定を可能にする。
いくつかの実施態様において、本法は、1種類以上のE3リガーゼ基質結合サブユニット(CRBNおよびVHLなどが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない)をベイト(またはDDB1、CUL4A、およびROC1などの足場蛋白質と会合し、CRBNまたはVHLに接触しているベイト)として含み、低分子によって調節される新規の蛋白質/蛋白質相互作用を検出するために、該ベイト(例えば、E3リガーゼ基質結合サブユニットの基質またはネオ基質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない)と相互作用する蛋白質プレイの存在下で、該ベイトを被検化合物に接触させる。例えば、該方法では、E3リガーゼ基質結合サブユニットの基質またはネオ基質を含む、そのようなベイトとの複合体において、E3リガーゼ基質結合サブユニットベイトと相互作用可能なものとして、化合物を同定する。例えば、該方法では、E3リガーゼ基質結合サブユニットベイトと相互作用可能で、第2の蛋白質(例えば、プレイ、例えば、E3リガーゼ基質結合サブユニットの基質またはネオ基質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない)の動員および/またはユビキチン化および/または分解を調節可能なものとして、化合物を同定する。
いくつかの実施態様において、本発明のベイト蛋白質はE3リガーゼ基質結合サブユニットである。E3リガーゼ(ユビキチンリガーゼともよばれる)は、多様な一群の蛋白質であり、機能的にはいずれも標的蛋白質を認識して、標的蛋白質とユビキチン部分との間の共有結合を仲介する。これらの蛋白質は、標的特異性とユビキチン化プロセスの固有性を提供する。E3リガーゼは、ユビキチンが負荷されたE2ユビキチン結合酵素を動員し、標的蛋白質を認識して、E2から蛋白質基質へのユビキチン転移を支援または直接的に触媒する。
本発明に記載の方法は、当該技術分野で公知のE3リガーゼを用いて実施することができる。いくつかの実施態様においては、本発明のE3リガーゼは、E2ユビキチンチオエステルおよび基質蛋白質の両者と相互作用し標的蛋白質のリジン残基(ポリユビキチン鎖開始)への効率的なユビキチン転移またはユビキチン伸長鎖のユビキチンへの効率的なユビキチン転移を触媒する蛋白質を含む。いくつかの実施態様においては、本発明の方法はE3リガーゼのサブユニットを含む。本発明のE3リガーゼサブユニットは、機能的E3リガーゼまたは機能的E3リガーゼの非機能的部分であり得る。
いくつかの実施態様においては、本発明のE3リガーゼまたはそのサブユニットは、セレブロン(CRBN)およびフォン・ヒッペル・リンドウ(Von Hippel Lindau:VHL)から選択される。
一実施態様においては、本発明のE3リガーゼは、セレブロンまたはそのサブユニットである。
いくつかの実施態様においては、該足場蛋白質は、損傷DNA結合蛋白質1(DDB1)、カリン4A(CUL4A)、カリン1の制御因子(ROC1)、SKP1、SKP1相互作用パートナー(SKIP2)、βトランスデューシン反復配列含有蛋白質(β-TrCP)、二重微小染色体4蛋白質(MDM4)、X連鎖アポトーシス抑制因子(XIAP)、DDB1およびCUL4関連因子15(DCAF15)、およびWDリピートドメイン12(WDR12)またはそのサブユニットである。
いくつかの実施態様において、本法は、新規相互作用パートナー、例えば、化合物に結合する蛋白質の基質またはネオ基質の同定を可能にするが、ここで該蛋白質は、該化合物のグルタルイミド環と、例えば、水素結合によって相互作用することのできる、カゴ(cage)状配置をとる3つのトリプトファン残基を有する。いくつかの実施態様において、該相互作用パートナー(例えば、基質および/またはネオ基質)は、表面β-ヘアピンループを有し、該表面β-ヘアピンループは、ターンの先端に3つのバックボーン水素結合受容体とそれに続くグリシン残基の配置を有するのであってもよい。いくつかの実施態様において、該相互作用パートナー(例えば、基質および/またはネオ基質)はデグロンモチーフを有する(Meszarosら、Sci Signal 2017:10、470を参照のこと;本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる)。
いくつかの実施態様において、該ベイトは、該化合物(免疫調節薬剤または免疫調節性イミド薬剤(IMiD)など)のグルタルイミド環と、例えば、水素結合によって相互作用することのできる、カゴ(cage)状配置をとる3つのトリプトファン残基を有する蛋白質である。
いくつかの実施態様においては、該プレイ(例えば、基質および/またはネオ基質)は、表面β-ヘアピンループを有し、該表面β-ヘアピンループは、ターンの先端に3つのバックボーン水素結合受容体とそれに続くグリシン残基の配置を有するのであってもよい。いくつかの実施態様においては、該プレイ(例えば、基質および/またはネオ基質)はデグロンモチーフを有する(Meszarosら、Sci Signal 2017:10、470を参照のこと;本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる)。
様々な実施態様においては、本開示の方法によって、低分子のプレイ蛋白質またはベイトとの結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用を同定する。いくつかの実施態様において、該方法は、プレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む。いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と結合することによって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用である。
いくつかの実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と結合することによって仲介される2種類以上の蛋白質/蛋白質相互作用である。一実施態様において、該低分子はベイト蛋白質に結合し、この結合によってベイト蛋白質に変化が生じるが、該低分子との結合後にベイト蛋白質がプレイ蛋白質に結合することができるようになる。例えば、一実施態様においては、該低分子のベイト蛋白質への結合によって、ベイト蛋白質にコンフォメーション変化が起こる;例えば、プレイ蛋白質がベイト蛋白質に結合できるようにベイト蛋白質の結合部位が接触可能になる。別の一実施態様においては、該低分子のベイト蛋白質への結合によって、ベイト蛋白質内部の疎水性結合部位が開く、または露出するので、プレイ蛋白質がベイト蛋白質の疎水性結合部位に結合可能になる。
他の実施態様においては、該低分子がプレイ蛋白質に結合し、この結合によってプレイ蛋白質に変化が生じるが、それによってプレイ蛋白質はベイト蛋白質に相互作用/結合できるようになる。いくつかの実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質への結合によって、プレイ蛋白質にコンフォメーション変化が起こり、それによってプレイ蛋白質の結合部位がベイト蛋白質に接触できるようになり、ベイト蛋白質がプレイ蛋白質に結合可能となる。他の実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質への結合によって、プレイ蛋白質内部の疎水性結合部位が開く、または露出するので、ベイト蛋白質がプレイ蛋白質の疎水性結合部位に結合可能になる。
さらに別の実施態様において、本法は、ベイト蛋白質にもプレイ蛋白質にも結合しないが、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との間の複合体には結合する低分子を含む。例えば、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との間の相互作用によって、低分子結合部位が再構成または形成され得る。いくつかの実施態様においては、該低分子結合部位がベイト蛋白質に存在し、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との複合体形成によってその部位が露出する。他の実施態様においては、該低分子結合部位がプレイ蛋白質に存在し、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との複合体形成によってその部位が露出する。いくつかの実施態様においては、ベイト蛋白質とプレイ蛋白質との相互作用によって、既存の低分子結合部位が露出する、あるいは該相互作用が低分子結合部位の形成を誘導する。
いくつかの実施態様において、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用は、蛋白質/蛋白質界面の部位、または該蛋白質内部におけるプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と低分子との間の直接結合である。例えば、一実施態様においては、該低分子が、ベイト蛋白質/低分子複合体を直接形成するベイト蛋白質に結合できる。別の一実施態様においては、該低分子が、プレイ蛋白質/低分子複合体を直接形成するプレイ蛋白質に結合できる。
本発明ではまた、該低分子、プレイ蛋白質およびベイト蛋白質が互いに同時に相互作用する分子相互作用についても意図する。例えば、一実施態様においては、該低分子がベイト蛋白質およびプレイ蛋白質の両方に直接結合する。いくつかの実施態様においては、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用は、プレイ蛋白質またはベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される。いくつかの実施態様においては、該低分子のベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用は、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される。
いくつかの実施態様においては、該低分子がベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによってプレイ蛋白質との相互作用が可能になる。いくつかの実施態様においては、該低分子がプレイ蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、それによってベイト蛋白質との相互作用が可能になる。
いくつかの実施態様においては、該低分子は分子糊である。分子糊は、場合によっては、蛋白質の非天然の会合であって治療効果を発揮する会合を促進する分子のこともある。いくつかの実施態様においては、分子糊はリンカーによって2種類の低分子が一緒に連結された分子である。例えば、実施態様において、該化合物は、CRBN、VHL、およびFKBPの1種類と相互作用する化合物を含むハイブリッドリガンドである。
他の実施態様において、分子糊は単一の低分子であって、該低分子を他の低分子に連結するリンカーを有していない低分子である。いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は複合体形成である。いくつかの実施態様においては、該分子相互作用は低分子/蛋白質相互作用である。
いくつかの実施態様において、該低分子または化合物は免疫調節物質である。いくつかの実施態様において、該化合物は、グルタルイミド環を含み、かつ任意選択的にフタルイミド環を含んでいてもよいグルタミン酸誘導体である。いくつかの実施態様において、該フタルイミド環は化学的に修飾される。いくつかの実施態様において、該グルタミン酸誘導体は本開示の実施態様にしたがう特性を有する合成誘導体であり得る。いくつかの実施態様において、該化合物は免疫調節薬剤または免疫調節性イミド薬剤(IMiD)として知られる化合物群の構成員である。実施態様において、該化合物はIMiD様グルタルイミド環を含むが、それ以外は化学構造的に異なっており、CRBNのグルタルアミド-IMiD(CRBNのIMiD結合ポケット)と同一の低分子結合ポケットに結合する。実施態様において、該化合物はグルタルアミド環を含まずにCRBNのIMiDポケットに結合することができる。実施態様において、該化合物はCRBNに結合するがIMiDポケットには結合しない。実施態様においては、IMiDポケットがCRBNのCULT(細胞リガンドとサリドマイドを結合する、活性未知のセレブロンドメイン(cereblon domain of unknown activity, binding cellular ligands and thalidomide))ドメイン内部に含まれる;PDBのエントリー:4TZ4、5FQD、5HXB、5V3O、6H0F、および6H0G、ならびにPLoS Comput Biol. 2015 Jan; 11(1): e1004023を参照のこと;これらの各参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施態様において、該化合物は、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、CC-220、CC-122、CC-885、またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体である。
いくつかの実施態様において、該化合物は、アバドミド、エンドミド、イベルドミド、レナリドミド、ミチンドミド、ポマリドミド、およびサリドマイド、またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、はたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体である。
様々な実施態様において、該第1の受容体および第2の受容体は同一の受容体である。様々な実施態様において、該第1の受容体および第2の受容体は異なる受容体である。
いくつかの実施態様において、該リガンド結合ドメインはサイトカイン受容体に由来する。いくつかの実施態様において、該リガンド結合ドメインは1型サイトカイン受容体(CR)に由来する。他の実施態様においては、該リガンド結合ドメインはエリスロポエチン受容体(EpoR)またはレプチン受容体(LR)に由来する。いくつかの実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体に由来する。
いくつかの実施態様において、該ベイトは、該第1の受容体および/または第2の受容体断片に対して異種である。いくつかの実施態様において、該細胞内ドメインはJAK結合部位を含む。いくつかの実施態様において、該細胞内ドメインは糖蛋白質130(gp130)を含む。いくつかの実施態様において、該受容体断片は糖蛋白質130(gp130)を含む。いくつかの実施態様において、該STATはSTAT1またはSTAT3から選択される。
いくつかの実施態様において、STATの動員を低減または排除する変異は、1か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる。いくつかの実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体に由来し、該変異はY985、Y1077、およびY1138の位置のうちの1か所以上である。いくつかの実施態様において、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体に由来し該変異はY985F、Y1077F、およびY1138Fである。いくつかの実施態様において、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体のY985F、Y1077F、およびY1138Fと機能的に同等の変異を有する。
いくつかの実施態様においては、膜貫通ドメインの欠失が提供されるが、JAK結合については保持される。
マウスレプチン受容体のアミノ酸配列は以下である:
MMCQKFYVVLLHWEFLYVIAALNLAYPISPWKFKLFCGPPNTTDDSFLSPAGAPNNASALKGASEAIVEAKFNSSGIYVPELSKTVFHCCFGNEQGQNCSALTDNTEGKTLASVVKASVFRQLGVNWDIECWMKGDLTLFICHMEPLPKNPFKNYDSKVHLLYDLPEVIDDSPLPPLKDSFQTVQCNCSLRGCECHVPVPRAKLNYALLMYLEITSAGVSFQSPLMSLQPMLVVKPDPPLGLHMEVTDDGNLKISWDSQTMAPFPLQYQVKYLENSTIVREAAEIVSATSLLVDSVLPGSSYEVQVRSKRLDGSGVWSDWSSPQVFTTQDVVYFPPKILTSVGSNASFHCIYKNENQIISSKQIVWWRNLAEKIPEIQYSIVSDRVSKVTFSNLKATRPRGKFTYDAVYCCNEQACHHRYAELYVIDVNINISCETDGYLTKMTCRWSPSTIQSLVGSTVQLRYHRRSLYCPDSPSIHPTSEPKNCVLQRDGFYECVFQPIFLLSGYTMWIRINHSLGSLDSPPTCVLPDSVVKPLPPSNVKAEITVNTGLLKVSWEKPVFPENNLQFQIRYGLSGKEIQWKTHEVFDAKSKSASLLVSDLCAVYVVQVRCRRLDGLGYWSNWSSPAYTLVMDVKVPMRGPEFWRKMDGDVTKKERNVTLLWKPLTKNDSLCSVRRYVVKHRTAHNGTWSEDVGNRTNLTFLWTEPAHTVTVLAVNSLGASLVNFNLTFSWPMSKVSAVESLSAYPLSSSCVILSWTLSPDDYSLLYLVIEWKILNEDDGMKWLRIPSNVKKFYIHDNFIPIEKYQFSLYPVFMEGVGKPKIINGFTKDAIDKQQNDAGLYVIVPIIISSCVLLLGTLLISHQRMKKLFWDDVPNPKNCSWAQGLNFQKPETFEHLFTKHAESVIFGPLLLEPEPISEEISVDTAWKNKDEMVPAAMVSLLLTTPDPESSSICISDQCNSANFSGSQSTQVTCEDECQRQPSVKYATLVSNDKLVETDEEQGFIHSPVSNCISSNHSPLRQSFSSSSWETEAQTFFLLSDQQPTMISPQLSFSGLDELLELEGSFPEENHREKSVCYLGVTSVNRRESGVLLTGEAGILCTFPAQCLFSDIRILQERCSHFVENNLSLGTSGENFVPYMPQFQTCSTHSHKIMENKMCDLTV(配列番号:1)。
MMCQKFYVVLLHWEFLYVIAALNLAYPISPWKFKLFCGPPNTTDDSFLSPAGAPNNASALKGASEAIVEAKFNSSGIYVPELSKTVFHCCFGNEQGQNCSALTDNTEGKTLASVVKASVFRQLGVNWDIECWMKGDLTLFICHMEPLPKNPFKNYDSKVHLLYDLPEVIDDSPLPPLKDSFQTVQCNCSLRGCECHVPVPRAKLNYALLMYLEITSAGVSFQSPLMSLQPMLVVKPDPPLGLHMEVTDDGNLKISWDSQTMAPFPLQYQVKYLENSTIVREAAEIVSATSLLVDSVLPGSSYEVQVRSKRLDGSGVWSDWSSPQVFTTQDVVYFPPKILTSVGSNASFHCIYKNENQIISSKQIVWWRNLAEKIPEIQYSIVSDRVSKVTFSNLKATRPRGKFTYDAVYCCNEQACHHRYAELYVIDVNINISCETDGYLTKMTCRWSPSTIQSLVGSTVQLRYHRRSLYCPDSPSIHPTSEPKNCVLQRDGFYECVFQPIFLLSGYTMWIRINHSLGSLDSPPTCVLPDSVVKPLPPSNVKAEITVNTGLLKVSWEKPVFPENNLQFQIRYGLSGKEIQWKTHEVFDAKSKSASLLVSDLCAVYVVQVRCRRLDGLGYWSNWSSPAYTLVMDVKVPMRGPEFWRKMDGDVTKKERNVTLLWKPLTKNDSLCSVRRYVVKHRTAHNGTWSEDVGNRTNLTFLWTEPAHTVTVLAVNSLGASLVNFNLTFSWPMSKVSAVESLSAYPLSSSCVILSWTLSPDDYSLLYLVIEWKILNEDDGMKWLRIPSNVKKFYIHDNFIPIEKYQFSLYPVFMEGVGKPKIINGFTKDAIDKQQNDAGLYVIVPIIISSCVLLLGTLLISHQRMKKLFWDDVPNPKNCSWAQGLNFQKPETFEHLFTKHAESVIFGPLLLEPEPISEEISVDTAWKNKDEMVPAAMVSLLLTTPDPESSSICISDQCNSANFSGSQSTQVTCEDECQRQPSVKYATLVSNDKLVETDEEQGFIHSPVSNCISSNHSPLRQSFSSSSWETEAQTFFLLSDQQPTMISPQLSFSGLDELLELEGSFPEENHREKSVCYLGVTSVNRRESGVLLTGEAGILCTFPAQCLFSDIRILQERCSHFVENNLSLGTSGENFVPYMPQFQTCSTHSHKIMENKMCDLTV(配列番号:1)。
いくつかの実施態様において、該ドメインはマウスレプチン受容体に由来し、マウスレプチン受容体の配列のアミノ酸839~1162に由来するものである。
いくつかの実施態様において、該プレイ蛋白質は核外搬出配列(NES)を含む。例えば、実施態様において、該プレイ蛋白質は核内蛋白質であるが、該NESによって細胞質中に存在可能となる(すなわち、ベイトが利用できる場合には、ベイトと接触させることができる)。したがって、実施態様においては、強力な核局在化シグナルが存在する場合であっても、該NESシグナルは、プレイポリペプチドが細胞質内に存在する状態を支援するので、ベイト蛋白質との相互作用が促進される。
いくつかの実施態様においては、該NESは1~4個の疎水性残基を有する。いくつかの実施態様においては、該疎水性残基はロイシンである。いくつかの実施態様においては、該NESは配列LxxxLxxLxLを有するが、ここでLは疎水性残基であり、xは他の任意のアミノ酸である。いくつかの実施態様においては、該NESは配列LxxxLxxLxLを有するが、ここでLはロイシンであり、xは他の任意のアミノ酸である。
いくつかの実施態様において、該NESは、cAMP依存性蛋白質キナーゼの熱安定阻害因子のアミノ酸37~46を含むが、これは強力な核局在化シグナルを無効化することが示されている(Wileyら、(1999)、J. Biol. Chem. 274:6381-6387;本参考文献は参照としてその全内容が本明細書に組み入れられる)。
いくつかの実施態様においては、ベイト蛋白質、低分子およびプレイ蛋白質の間の相互作用、またはそれらの組み合わせを、プロテアソーム阻害剤の存在下でモニターまたは検出する。一実施態様において、該方法はプロテアソーム阻害剤を細胞に提供することを含む。いくつかの実施態様においては、E3リガーゼ構成要素を含むベイト蛋白質とプレイ蛋白質とが相互作用した時にプレイ蛋白質が修飾を受ける場合に、そのような事象におけるプレイ蛋白質の潜在的分解を、該プロテアソーム阻害剤が阻害する。本明細書に開示の方法に利用するプロテアソーム阻害剤は、カルフィルゾミブ(カイプロリス:Kyprolis)、ボルテゾミブ(Velcade)、イキサゾミブ(Ninlaro)、およびマリゾミブから選択することができる。一実施態様において、該プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブ(Velcade)である。
様々な実施態様において、本法は新規分子相互作用を同定する。様々な実施態様において、本法は新規蛋白質/蛋白質相互作用を同定する。様々な実施態様においては、本法は低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質/蛋白質相互作用を同定する。
様々な実施態様において、本法は分子相互作用を同定するが、その際ハイブリッドリガンド(または低分子または化合物)または2種類の低分子物質がリンカーで共に連結されているリガンドの利用を必要とはしない。実施態様において、該低分子は単一の化学物質である。実施態様において、該低分子はリンカーを有していない。
実施態様において、該低分子はベイトまたはプレイ蛋白質のうちの一方のみに直接相互作用する。実施態様において、ベイトまたはプレイ蛋白質の存在下でのみ、該低分子はベイトおよび/またはプレイ蛋白質と直接相互作用する;例えば、ベイト蛋白質の存在下でのみ、該低分子はプレイ蛋白質と直接相互作用する、あるいは該低分子は、プレイ蛋白質の存在下でのみ、ベイト蛋白質と直接相互作用する、あるいは該低分子は、ベイトまたはプレイ蛋白質の存在下でのみ、ベイトまたはプレイ蛋白質の両方と直接相互作用する。
いくつかの実施態様においては、E3リガーゼ基質結合ベイト蛋白質としてVHLを用いる際に本法が利用可能である。CRBNと同様に、VHLはE3リガーゼの基質結合サブユニットである。したがって、ベイトとしてのE3リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのVHLにも同様に当てはまる。
実施態様においては、E3リガーゼの代わりに、FKBP12蛋白質またはこのファミリーの構成員(例えば、FK506結合蛋白質)をベイトとして用いる際に本法が利用可能である(したがって、ベイトとしてのE3リガーゼに関連する全ての実施態様が、ベイトとしてのFKBP12蛋白質またはこのファミリーの構成員にも同様に当てはまる)。
FKBP12は免疫抑制剤分子であるタクロリムス(FK506)に結合することが知られている。実施態様において、該低分子は、FK506またはその誘導体、類似体、光学異性体または光学異性体の混合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、クラスレート、または多形体である。
以下の非限定的例によって本発明をさらに説明する。
実施態様においては、分子相互作用を検出する方法を提供するが、該方法は:
(a)リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンド依存性キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内ベイト蛋白質、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む、
発現させること、
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質がFK506結合蛋白質(FKBP)である、
シグナルを検出すること、
を含む。
(a)リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンド依存性キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内ベイト蛋白質、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
ここで該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む、
発現させること、
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質がFK506結合蛋白質(FKBP)である、
シグナルを検出すること、
を含む。
実施態様においては、プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員されるので、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達が回復し、STAT分子の活性化が起こる。
実施態様においては、該細胞はSTAT応答性レポーター遺伝子を含む。
実施態様においては、活性化したSTAT分子は核内に移行してSTAT応答性レポーター遺伝子の転写を誘導するので、このレポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる。
実施態様において、該FK506結合蛋白質(FKBP)はFKBP12、FKBP38およびFKBP52から選択される。
実施態様において、該方法は、プレイ蛋白質および/またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む。
実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用である。
実施態様において、該分子相互作用は、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される2種類以上の蛋白質/蛋白質相互作用である。
実施態様において、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用は、蛋白質/蛋白質界面の部位におけるプレイ蛋白質またはベイト蛋白質と該低分子との間の直接結合である。
実施態様において、低分子がプレイ蛋白質またはベイト蛋白質に結合することによって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用は、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される。
実施態様において、該低分子はベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、該プレイ蛋白質との相互作用を可能にする。
実施態様において、該低分子は分子糊である。
実施態様において、該分子相互作用は複合体形成である。
実施態様において、該分子相互作用は低分子/蛋白質相互作用である。
実施態様において、該第1の受容体および第2の受容体は同一の受容体である。
実施態様において、該第1の受容体および第2の受容体は異なる受容体である。
実施態様において、該第1の受容体および/または第2の受容体は多量体化受容体である。
実施態様において、該リガンド結合ドメインはサイトカイン受容体に由来する。
実施態様においては、該リガンド結合ドメインは1型サイトカイン受容体(CR)に由来する。
実施態様においては、該リガンド結合ドメインはエリスロポエチン受容体(EpoR)またはレプチン受容体(LR)に由来する。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体(LR)に由来する。
実施態様においては、該ベイトは、該第1の受容体および/または第2の受容体断片に対して異種である。
実施態様においては、該細胞内ドメインはJAK結合部位を含み、および/または該受容体断片はgp130を含む。
実施態様においては、該STATはSTAT1またはSTAT3から選択される。
実施態様においては、STATの動員を低減または排除する変異は、1か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインはマウスレプチン受容体(LR)に由来し、該変異はY985、Y1077、およびY1138の位置のうちの1か所以上である。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体(LR)に由来し該変異はY985F、Y1077F、およびY1138Fである。
実施態様においては、該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、マウスレプチン受容体(LR)のY985F、Y1077F、およびY1138Fと機能的に同等の変異を有する。
実施態様においては、該プレイ蛋白質は核外搬出配列(NES)を含む。
実施態様においては、該NESは1~4個の疎水性残基を有する。
実施態様においては、該疎水性残基はロイシンである。
実施態様においては、該NESは配列LxxxLxxLxLを有するが、ここでLは疎水性残基であり、xは他の任意のアミノ酸である。
実施態様においては、該NESは配列LxxxLxxLxLを有するが、ここでLはロイシンであり、xは他の任意のアミノ酸である。
実施態様においては、該プレイ蛋白質との相互作用前に、該ベイトが化合物に接触している。
実施態様においては、該化合物は、FK506(タクロリムス)、ラパマイシン(シロリムス)、およびシクロスポリンA(CsA)またはその誘導体または類似体;あるいはFK506(タクロリムス)、ラパマイシン(シロリムス)、およびシクロスポリンA(CsA)またはその誘導体または類似体と同一のFKBPベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される。
実施態様において、該方法は、低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質/蛋白質相互作用を同定する。
実施例
実施例1:分子糊誘導性CRBN基質相互作用の検出に関するMAPPIT派生的アッセイ構成の評価
本実施例では、リガンド誘導性CRBN基質またはネオ基質を同定する目的で、Lemmensら、「MAPPIT、蛋白質/蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物2ハイブリッド法(MAPPIT, a mammalian two-hybrid method for in-cell detection of protein-protein interactions)」Methods Mol Biol. 2015;1278:447-55に記載の方法を利用するMAPPITアッセイの派生法を用いる。従来型のMAPPITアッセイは蛋白質/蛋白質相互作用をモニターするために用いられていた。ベイト蛋白質(蛋白質A)を融合蛋白質として発現するが、該融合蛋白質では蛋白質Aが、レプチン受容体の工学的に改変した細胞内受容体ドメインと遺伝子的に融合されており、該細胞内受容体ドメインはそれ自身がエリスロポエチン(Epo)受容体の細胞外ドメインに融合されている。該Epo受容体構成要素にEpoリガンドが結合することによって、受容体結合細胞内JAK2を活性化する。しかし、活性化JAK2は、STAT3結合およびそのリン酸化を引き起こすレプチン受容体を活性化できない;理由は、正常であれば活性化JAK2によってリン酸化されるそのチロシン残基に変異が導入されているからである。代わりに蛋白質Bと蛋白質Aの相互作用によって、JAK2リン酸化可能STAT3ドッキング部位の再構成を行う;これにより、蛋白質Bはgp130受容体の細胞内ドメインに融合する(活性化JAK2キナーゼが認識する適正なチロシン残基を含むことになる)。すなわち、蛋白質Aと蛋白質Bの物理的相互作用によって、EPOが惹起するJAK2-STAT3シグナル伝達経路の活性化が再構成される。STAT3の活性化は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子または蛍光マーカー(GFPまたは他の種類の蛍光蛋白質(EGFPなど)など)をコードする遺伝子を含むSTAT3応答性レポーター遺伝子を導入することによってモニターできる。このようにして、MAPPITアッセイは無損傷細胞におけるそのような組換え蛋白質/蛋白質相互作用を評価する汎用アッセイを提供する。
実施例1:分子糊誘導性CRBN基質相互作用の検出に関するMAPPIT派生的アッセイ構成の評価
本実施例では、リガンド誘導性CRBN基質またはネオ基質を同定する目的で、Lemmensら、「MAPPIT、蛋白質/蛋白質相互作用の細胞内検出に関する哺乳動物2ハイブリッド法(MAPPIT, a mammalian two-hybrid method for in-cell detection of protein-protein interactions)」Methods Mol Biol. 2015;1278:447-55に記載の方法を利用するMAPPITアッセイの派生法を用いる。従来型のMAPPITアッセイは蛋白質/蛋白質相互作用をモニターするために用いられていた。ベイト蛋白質(蛋白質A)を融合蛋白質として発現するが、該融合蛋白質では蛋白質Aが、レプチン受容体の工学的に改変した細胞内受容体ドメインと遺伝子的に融合されており、該細胞内受容体ドメインはそれ自身がエリスロポエチン(Epo)受容体の細胞外ドメインに融合されている。該Epo受容体構成要素にEpoリガンドが結合することによって、受容体結合細胞内JAK2を活性化する。しかし、活性化JAK2は、STAT3結合およびそのリン酸化を引き起こすレプチン受容体を活性化できない;理由は、正常であれば活性化JAK2によってリン酸化されるそのチロシン残基に変異が導入されているからである。代わりに蛋白質Bと蛋白質Aの相互作用によって、JAK2リン酸化可能STAT3ドッキング部位の再構成を行う;これにより、蛋白質Bはgp130受容体の細胞内ドメインに融合する(活性化JAK2キナーゼが認識する適正なチロシン残基を含むことになる)。すなわち、蛋白質Aと蛋白質Bの物理的相互作用によって、EPOが惹起するJAK2-STAT3シグナル伝達経路の活性化が再構成される。STAT3の活性化は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子または蛍光マーカー(GFPまたは他の種類の蛍光蛋白質(EGFPなど)など)をコードする遺伝子を含むSTAT3応答性レポーター遺伝子を導入することによってモニターできる。このようにして、MAPPITアッセイは無損傷細胞におけるそのような組換え蛋白質/蛋白質相互作用を評価する汎用アッセイを提供する。
本実施例1では、本発明者らが開発した、特にCRBNリガンド誘導性蛋白質相互作用の判定に用いる(すなわち、特異的なCRBNベイト蛋白質を利用し、蛋白質複合体形成のリガンド依存性誘導についてアッセイする)MAPPITアッセイ派生法を用いた。CRBNベイト蛋白質をMAPPITキメラ膜受容体との融合物として発現し、相互作用する標的蛋白質は細胞内gp130受容体断片(gp130-IKZF1(イソ型7)、gp130-標的X、gp130-GSPT1(ドメイン2+3)またはgp130-GSPT2)と融合する。本発明者らは、これら基質のCRBN(サリドマイド、THL;レナリドミド、LEN;ポマリドミド、POM;CC-122;CC-220;CC-885)への動員を誘導する公知のIMiDのパネルの検出について、このMAPPIT派生的アッセイの評価を行った。
文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、CRBNキメラ受容体融合をコードするプラスミド(pSEL-CRBN)、MAPPIT gp130融合物をコードするプラスミド(gp130-IKZF1(イソ型7)、gp130-標的X、gp130-GSPT1(ドメイン2+3)またはgp130-GSPT2)およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)でHEK293T細胞を形質転換した。試験した標的蛋白質のそれぞれについて、完全長蛋白質を融合したのであるが、例外は、IKZF1およびGSPT1であり、前者ではイソ型7を用い、後者では内部サブドメインを用いた。本実施例に用いたMAPPIT受容体融合物は、レプチン受容体の細胞内ドメインに遺伝子的に連結した目的蛋白質(CRBN)であって、該レプチン受容体の細胞内ドメイン自体がエリスロポエチン(EPO)受容体の細胞外ドメインに融合しているものから成る。受容体/受容体結合JAK2活性化を促進するために、EPO受容体細胞外ドメインとレプチン受容体細胞外ドメイン(実施例2で用いられるように)を相互代替的に用いることができる(該活性化は、それぞれEPOまたはレプチンによる)。形質転換から24時間後に、表示用量の被検化合物の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチン(EPO)で処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。図2A~Lに示すデータは、MAPPIT動員アッセイが、公知の相互作用、IMiD特異性(例えば、CC-885によってのみ動員されるGSPT1およびGSPT2)、および効力傾向を再現することが可能であることを示唆している。
実施例2:IMiD誘導性基質動員の検出に関する、代替的なCRBN MAPPIT派生的受容体構築物の比較
本実施例2においては、実施例1で用いたアッセイ設定を、代替的なCRBNキメラ受容体融合構築物を用いた類似のMAPPIT派生的アッセイ構成で対照比較的に試験した。実施例1において既に言及しているように、他の代替的な受容体融合物も利用可能であり、EPO細胞外ドメインをレプチン受容体細胞外ドメインで代替すると、EPOの代わりにレプチンで活性化されるアッセイシステムとなる。本実施例では、EPO受容体細胞外ドメイン(実施例1のようにpSEL-CRBN)またはレプチン受容体細胞外ドメイン(pCLG-CRBN)のいずれかを含むMAPPIT受容体融合物に連結したCRBNをコードするプラスミドでHEK293T細胞を形質転換した。図3A~Dの模式図に示されるように、これらの構築物は細胞外ドメイン以外にも、キメラ受容体の細胞内構成において相違を有する。pSEL-CRBN構築物の場合には、融合物が工学的に改変したレプチン受容体の細胞内ドメイン全体を含む;他方、pCLG-CRBN構築物の場合には、JAK2動員部位を含むレプチン受容体の短い一部分が用いられており、またこのドメインとそれに融合したCRBNベイト蛋白質との間に付加的なGly-Gly-Serヒンジが配置されている。さらに、文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、部分的gp130ドメイン(IKZF1イソ型1、IKZF1イソ型7、GSPT1イソ型1またはGSPT1ドメイン2+3)に融合した目的の基質をコードするプラスミドおよびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)でHEK293T細胞を共形質転換した。IKZF1(イソ型1)gp130融合物の場合には、2種類の異なる構築物をIKZF1のN末端またはC末端のいずれかに融合したgp130と共に用いた。形質転換から24時間後に、表示用量の被検化合物(CC-220またはCC-885)の存在下または非存在下で、細胞をEPO(pSEL-CRBNを用いたアッセイの場合)またはレプチン(pCLG-CRBNを用いたアッセイの場合)で処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPOまたはレプチン+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図3A~Dに示されるデータは、代替的MAPPIT受容体融合物の両方ともがCRBNとの分子糊依存性ネオ基質相互作用の検出を可能にすることを示唆している。
本実施例2においては、実施例1で用いたアッセイ設定を、代替的なCRBNキメラ受容体融合構築物を用いた類似のMAPPIT派生的アッセイ構成で対照比較的に試験した。実施例1において既に言及しているように、他の代替的な受容体融合物も利用可能であり、EPO細胞外ドメインをレプチン受容体細胞外ドメインで代替すると、EPOの代わりにレプチンで活性化されるアッセイシステムとなる。本実施例では、EPO受容体細胞外ドメイン(実施例1のようにpSEL-CRBN)またはレプチン受容体細胞外ドメイン(pCLG-CRBN)のいずれかを含むMAPPIT受容体融合物に連結したCRBNをコードするプラスミドでHEK293T細胞を形質転換した。図3A~Dの模式図に示されるように、これらの構築物は細胞外ドメイン以外にも、キメラ受容体の細胞内構成において相違を有する。pSEL-CRBN構築物の場合には、融合物が工学的に改変したレプチン受容体の細胞内ドメイン全体を含む;他方、pCLG-CRBN構築物の場合には、JAK2動員部位を含むレプチン受容体の短い一部分が用いられており、またこのドメインとそれに融合したCRBNベイト蛋白質との間に付加的なGly-Gly-Serヒンジが配置されている。さらに、文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、部分的gp130ドメイン(IKZF1イソ型1、IKZF1イソ型7、GSPT1イソ型1またはGSPT1ドメイン2+3)に融合した目的の基質をコードするプラスミドおよびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)でHEK293T細胞を共形質転換した。IKZF1(イソ型1)gp130融合物の場合には、2種類の異なる構築物をIKZF1のN末端またはC末端のいずれかに融合したgp130と共に用いた。形質転換から24時間後に、表示用量の被検化合物(CC-220またはCC-885)の存在下または非存在下で、細胞をEPO(pSEL-CRBNを用いたアッセイの場合)またはレプチン(pCLG-CRBNを用いたアッセイの場合)で処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPOまたはレプチン+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図3A~Dに示されるデータは、代替的MAPPIT受容体融合物の両方ともがCRBNとの分子糊依存性ネオ基質相互作用の検出を可能にすることを示唆している。
実施例3:DDB1 MAPPIT派生的受容体融合構築物を用いたCRBN化合物誘導性基質相互作用の検出
非融合型のCRBNベイトを用いて化合物誘導性CRBN/基質相互作用を試験することは有益であると考えられるので、CRBNの代わりにMAPPITキメラ受容体構築物にDDB1を融合するMAPPIT派生的アッセイを開発した。DDB1は、CRBNをコアE3ユビキチンリガーゼ複合体足場サブユニットCUL4AまたはCUL4B(カリン4Aまたはカリン4B)に連結するアダプター蛋白質である。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、EPO受容体細胞外ドメインを含むMAPPIT受容体融合物に連結したDDB1をコードするプラスミド(pSEL-DDB1)、部分的gp130ドメインに融合したCRBN基質蛋白質(実施例1でも用いたIKZF1イソ型7または未開示標的蛋白質X1)をコードするプラスミド、およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。さらに、異なる量の非融合CRBN発現構築物と共に細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のレナリドミド(LEN)の存在下または非存在下で細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図4に示されるように、共発現した非融合CRBNの存在下においてのみ、IKZF1および標的Xとの相互作用の両方について安定したレナリドミド依存性MAPPITシグナルが得られる;このことは、該シグナルが基質gp130融合蛋白質のCRBNへの結合によって媒介されるものであることを示唆している。
非融合型のCRBNベイトを用いて化合物誘導性CRBN/基質相互作用を試験することは有益であると考えられるので、CRBNの代わりにMAPPITキメラ受容体構築物にDDB1を融合するMAPPIT派生的アッセイを開発した。DDB1は、CRBNをコアE3ユビキチンリガーゼ複合体足場サブユニットCUL4AまたはCUL4B(カリン4Aまたはカリン4B)に連結するアダプター蛋白質である。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、EPO受容体細胞外ドメインを含むMAPPIT受容体融合物に連結したDDB1をコードするプラスミド(pSEL-DDB1)、部分的gp130ドメインに融合したCRBN基質蛋白質(実施例1でも用いたIKZF1イソ型7または未開示標的蛋白質X1)をコードするプラスミド、およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。さらに、異なる量の非融合CRBN発現構築物と共に細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のレナリドミド(LEN)の存在下または非存在下で細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図4に示されるように、共発現した非融合CRBNの存在下においてのみ、IKZF1および標的Xとの相互作用の両方について安定したレナリドミド依存性MAPPITシグナルが得られる;このことは、該シグナルが基質gp130融合蛋白質のCRBNへの結合によって媒介されるものであることを示唆している。
実施例4:DDB1の共発現によるCRBN化合物誘導性基質相互作用の検出向上
DDB1アダプター蛋白質はCRBN E3リガーゼ複合体の必須構成要素であり、CRBNをCUL4AまたはCUL4B複合体足場蛋白質へ連結するので、CRBN-基質動員アッセイのMAPPIT派生的融合蛋白質構成要素を発現する細胞において、内因性DDB1レベルは限定的であると考えられる。本実施例4においては、CRBNとIKZF1との間のIMiD誘導性相互作用についてDDB1共発現の効果を評価した。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、EPO受容体細胞外ドメインを含むCRBN MAPPIT受容体融合物をコードするプラスミド(pSEL-DDB1)、IKZF1(イソ型7)のgp130融合物をコードするプラスミド、およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。さらに、試験した条件の一部においては、細胞をさらに非融合DDB1発現プラスミドで共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のIMiD(サリドマイド、THL;レナリドミド、LEN;ポマリドミド、POM;CC-122;CC-220;CC-885)の存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図5のデータは、DDB1を共発現した試料において、試験した化合物の最大シグナルと比較して、該化合物の低濃度でシグナルが増加したことを示しており、このことはDDB1の共発現によってアッセイ感度が向上したことを示唆する。
DDB1アダプター蛋白質はCRBN E3リガーゼ複合体の必須構成要素であり、CRBNをCUL4AまたはCUL4B複合体足場蛋白質へ連結するので、CRBN-基質動員アッセイのMAPPIT派生的融合蛋白質構成要素を発現する細胞において、内因性DDB1レベルは限定的であると考えられる。本実施例4においては、CRBNとIKZF1との間のIMiD誘導性相互作用についてDDB1共発現の効果を評価した。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、EPO受容体細胞外ドメインを含むCRBN MAPPIT受容体融合物をコードするプラスミド(pSEL-DDB1)、IKZF1(イソ型7)のgp130融合物をコードするプラスミド、およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。さらに、試験した条件の一部においては、細胞をさらに非融合DDB1発現プラスミドで共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のIMiD(サリドマイド、THL;レナリドミド、LEN;ポマリドミド、POM;CC-122;CC-220;CC-885)の存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図5のデータは、DDB1を共発現した試料において、試験した化合物の最大シグナルと比較して、該化合物の低濃度でシグナルが増加したことを示しており、このことはDDB1の共発現によってアッセイ感度が向上したことを示唆する。
実施例5:DDB1-CRBN MAPPITキメラ受容体融合構築物を用いたCRBN化合物誘導性基質相互作用の検出
実施例3および4において考察しているように、DDB1はCRBN E3リガーゼ複合体の主要構成要素であり、CRBN仲介性基質動員およびユビキチン化にとって必須である。実施例3および4において用いたアッセイ構成に加えて、別のMAPPIT派生的アッセイ設定において、DDB1とCRBNの遺伝子融合を含むMAPPIT受容体構築物を用いる。そのような融合物は、EPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-DDB1-CRBN)を含むMAPPITキメラ受容体を用いて作成して、本実施例5において用いた。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、この構築物と共にIKZF1(イソ型7)のgp130融合物をコードするプラスミドおよびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のIMiD(サリドマイド、THL;レナリドミド、LEN;ポマリドミド、POM;CC-122;CC-220;CC-885)の存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図6のデータは、DDB1/CRBN遺伝子融合物がCRBN IMiD誘導性基質動員を検出するMAPPIT派生的アッセイに利用可能であることを示唆している。
実施例3および4において考察しているように、DDB1はCRBN E3リガーゼ複合体の主要構成要素であり、CRBN仲介性基質動員およびユビキチン化にとって必須である。実施例3および4において用いたアッセイ構成に加えて、別のMAPPIT派生的アッセイ設定において、DDB1とCRBNの遺伝子融合を含むMAPPIT受容体構築物を用いる。そのような融合物は、EPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-DDB1-CRBN)を含むMAPPITキメラ受容体を用いて作成して、本実施例5において用いた。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、この構築物と共にIKZF1(イソ型7)のgp130融合物をコードするプラスミドおよびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のIMiD(サリドマイド、THL;レナリドミド、LEN;ポマリドミド、POM;CC-122;CC-220;CC-885)の存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図6のデータは、DDB1/CRBN遺伝子融合物がCRBN IMiD誘導性基質動員を検出するMAPPIT派生的アッセイに利用可能であることを示唆している。
実施例6:基質のCRBNへのPROTAC-誘導性結合についての評価
本実施例6では、基質結合リガンドに化学的に連結したCRBN結合リガンドを構成するハイブリッドリガンドであるProtacによって誘導されるCRBN基質動員について評価した。本実施例で試験した化合物はARV-825であり、これはCRBN結合リガンドとBRD4結合性化合物の化学的融合物である。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、実施例2で用いたEPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-CRBN)またはレプチン受容体細胞外ドメイン(pCLG-CRBN)のいずれかを含む融合構築物をコードする代替的な2種類のMAPPIT派生的CRBNベイト受容体をコードするプラスミドを、BRD4(イソ型3)のgp130およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に用いて、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のARV-825の存在下または非存在下で、細胞をEPO(pSEL-CRBNで形質転換した試料の場合)またはレプチン(pCLG-CRBNにの場合)で処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPOまたはレプチン+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図7A~Bに示すデータは、試験したアッセイ構成のそれぞれにおいて、明確な用量依存性シグナル増加を示し、このことはMAPPIT派生的CRBN基質動員アッセイがPROTAC型の分子によって誘導される相互作用を検出可能であることを示唆している。
本実施例6では、基質結合リガンドに化学的に連結したCRBN結合リガンドを構成するハイブリッドリガンドであるProtacによって誘導されるCRBN基質動員について評価した。本実施例で試験した化合物はARV-825であり、これはCRBN結合リガンドとBRD4結合性化合物の化学的融合物である。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、実施例2で用いたEPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-CRBN)またはレプチン受容体細胞外ドメイン(pCLG-CRBN)のいずれかを含む融合構築物をコードする代替的な2種類のMAPPIT派生的CRBNベイト受容体をコードするプラスミドを、BRD4(イソ型3)のgp130およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に用いて、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のARV-825の存在下または非存在下で、細胞をEPO(pSEL-CRBNで形質転換した試料の場合)またはレプチン(pCLG-CRBNにの場合)で処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPOまたはレプチン+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図7A~Bに示すデータは、試験したアッセイ構成のそれぞれにおいて、明確な用量依存性シグナル増加を示し、このことはMAPPIT派生的CRBN基質動員アッセイがPROTAC型の分子によって誘導される相互作用を検出可能であることを示唆している。
実施例7:化合物誘導性FKBP1A(FKBP12)基質相互作用の検出
本実施例では、FKBP1A(FKBP12)のMTORおよびカルシニューリンサブユニットとの化合物依存性相互作用の検出に、MAPPIT派生的アッセイを用いた。MAPPIT派生的受容体およびgp130融合をコードする以下のプラスミド構築物を用い、実験設定は実施例1に記載の方法にしたがった;EPO受容体細胞外ドメインを含むMAPPITキメラ受容体構築物にFKBP1Aベイトを融合した(pSEL-FKBP1A);標的蛋白質を部分的gp130ドメイン(MTOR FRBドメインまたはPPP3CA)に融合した。カルシニューリン相互作用については、さらにもう1種類のアッセイ設定を用いた;すなわち、MAPPIT受容体およびgp130融合に加えて、カルシニューリン調節サブユニットをコードする非融合PPP3R2を発現するプラスミドを共発現した;その理由は、この調節性サブユニットがFK506マクロライド誘導性FKBP1A-カルシニューリン相互作用に寄与することが報告されているからである。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、表示の受容体をコードするプラスミドおよびgp130をコードするプラスミドならびにSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量の被検化合物(MTOR動員についてはラパマイシンまたはエベロリムス;カルシニューリン結合についてはFK506またはピメクロリムス)の存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。図8A~Fに示す結果は、MAPPIT派生的アッセイによって、化合物誘導性FKBP1A標的結合をモニターすることが可能であることを示唆している。カルシニューリン動員の場合には、PPP3R2調節性サブユニットの共発現によって、シグナル強度が有意に増強した。
本実施例では、FKBP1A(FKBP12)のMTORおよびカルシニューリンサブユニットとの化合物依存性相互作用の検出に、MAPPIT派生的アッセイを用いた。MAPPIT派生的受容体およびgp130融合をコードする以下のプラスミド構築物を用い、実験設定は実施例1に記載の方法にしたがった;EPO受容体細胞外ドメインを含むMAPPITキメラ受容体構築物にFKBP1Aベイトを融合した(pSEL-FKBP1A);標的蛋白質を部分的gp130ドメイン(MTOR FRBドメインまたはPPP3CA)に融合した。カルシニューリン相互作用については、さらにもう1種類のアッセイ設定を用いた;すなわち、MAPPIT受容体およびgp130融合に加えて、カルシニューリン調節サブユニットをコードする非融合PPP3R2を発現するプラスミドを共発現した;その理由は、この調節性サブユニットがFK506マクロライド誘導性FKBP1A-カルシニューリン相互作用に寄与することが報告されているからである。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、表示の受容体をコードするプラスミドおよびgp130をコードするプラスミドならびにSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)で、HEK293T細胞を形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量の被検化合物(MTOR動員についてはラパマイシンまたはエベロリムス;カルシニューリン結合についてはFK506またはピメクロリムス)の存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。図8A~Fに示す結果は、MAPPIT派生的アッセイによって、化合物誘導性FKBP1A標的結合をモニターすることが可能であることを示唆している。カルシニューリン動員の場合には、PPP3R2調節性サブユニットの共発現によって、シグナル強度が有意に増強した。
実施例8:化合物誘導性VHL基質相互作用の検出
実施例6と同様に、VHLとBRD4とのProtac依存性相互作用の検出にMAPPIT派生的アッセイを用いた。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、BRD4(イソ型3)のgp130融合物およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、EPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-VHL)またはレプチン受容体細胞外ドメイン(pCLG-VHL)のいずれかを含む融合構築物をコードする、代替的な2種類のMAPPIT派生的VHLベイト受容体をコードするプラスミドで、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のMZ1(VHLとBRD4リガンドとの間の化学的融合物)の存在下または非存在下で、EPO(pSEL-CRBNで形質転換した試料の場合)またはレプチン(pCLG-CRBNの場合)で細胞を処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPOまたはレプチン+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図9A~Bのグラフは、試験したアッセイ構成のそれぞれにおいて、明確な用量依存性シグナル増加を示している。
実施例6と同様に、VHLとBRD4とのProtac依存性相互作用の検出にMAPPIT派生的アッセイを用いた。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、BRD4(イソ型3)のgp130融合物およびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、EPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-VHL)またはレプチン受容体細胞外ドメイン(pCLG-VHL)のいずれかを含む融合構築物をコードする、代替的な2種類のMAPPIT派生的VHLベイト受容体をコードするプラスミドで、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のMZ1(VHLとBRD4リガンドとの間の化学的融合物)の存在下または非存在下で、EPO(pSEL-CRBNで形質転換した試料の場合)またはレプチン(pCLG-CRBNの場合)で細胞を処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPOまたはレプチン+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図9A~Bのグラフは、試験したアッセイ構成のそれぞれにおいて、明確な用量依存性シグナル増加を示している。
実施例9:IKZF1のCRBNへの新規分子糊誘導性動員の同定のための化合物ライブラリースクリーニング
本実施例では、CRBNに対するIKZF1の動員を誘導する化合物を同定するために、実施例1に記載のMAPPIT派生的IKZF1-CRBN動員アッセイを用いて、96種類のIMiDおよびIMiD様分子糊から成る化合物集合体をマイクロタイタープレート形態でスクリーニングした。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、STAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、EPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-CRBN)およびgp130-IKZF1(イソ型7)融合構築物を含むキメラMAPPIT派生的受容体に連結したCRBNベイト蛋白質の融合構築物をコードするプラスミドで、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、細胞をEPOおよび化合物(または陰性対照としてのDMSO)で処理した。各化合物について3種類の濃度(図10A~Cにおいて、「低」、「中」および「高」と表示されている)を用いた:すなわち、以前に評価した化合物の細胞毒性レベルに応じて、0.8、4および20μM、あるいは0.2、1および5μMのいずれかを用い、各化合物濃度はそれぞれ2回試験した。化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図10A~Cに示すのグラフ(左パネル)は、化合物処理試料およびDMSO処理対照の両方について平均ルシフェラーゼ・シグナル(生データ)の頻度分布を示しており、またそれぞれのグラフは試験を行った3種類の化合物濃度(低、中、および高)の1つについてのデータに対応している。化合物処理試料に対応する、2峰性分布の右にシフトした部分はバックグラウンドより高いシグナルを有する化合物を表し、したがってそれらの化合物はCRBNに対するIKZF1の動員を誘導する。3種類の試験濃度のうちの1種類以上の濃度において、バックグラウンドよりも高いレポーターシグナルを示すそのような3種類化合物に関するルシフェラーゼ・シグナルに、線(点線、破線または実線)で印付けしている;また、対応する用量応答曲線を右パネルに示す。これら用量応答曲線は、第1スクリーニングに用いたアッセイ設定およびプロトコルと同様のものを用いて得られたものであるが、ここでは表示濃度の9点の用量範囲について試験した。ここでデータ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。まとめると、本実施例に記載したMAPPIT派生的アッセイが、CRBNへの公知および新規の分子糊誘導性基質動員を同定する化合物集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。図10A~Cは、特にCRBNに対する糊誘導性IKZF1動員に関する化合物スクリーニングの例示であるが、このアプローチは他の潜在的な基質のスクリーニングにも応用可能である。
本実施例では、CRBNに対するIKZF1の動員を誘導する化合物を同定するために、実施例1に記載のMAPPIT派生的IKZF1-CRBN動員アッセイを用いて、96種類のIMiDおよびIMiD様分子糊から成る化合物集合体をマイクロタイタープレート形態でスクリーニングした。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、STAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、EPO受容体細胞外ドメイン(pSEL-CRBN)およびgp130-IKZF1(イソ型7)融合構築物を含むキメラMAPPIT派生的受容体に連結したCRBNベイト蛋白質の融合構築物をコードするプラスミドで、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、細胞をEPOおよび化合物(または陰性対照としてのDMSO)で処理した。各化合物について3種類の濃度(図10A~Cにおいて、「低」、「中」および「高」と表示されている)を用いた:すなわち、以前に評価した化合物の細胞毒性レベルに応じて、0.8、4および20μM、あるいは0.2、1および5μMのいずれかを用い、各化合物濃度はそれぞれ2回試験した。化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図10A~Cに示すのグラフ(左パネル)は、化合物処理試料およびDMSO処理対照の両方について平均ルシフェラーゼ・シグナル(生データ)の頻度分布を示しており、またそれぞれのグラフは試験を行った3種類の化合物濃度(低、中、および高)の1つについてのデータに対応している。化合物処理試料に対応する、2峰性分布の右にシフトした部分はバックグラウンドより高いシグナルを有する化合物を表し、したがってそれらの化合物はCRBNに対するIKZF1の動員を誘導する。3種類の試験濃度のうちの1種類以上の濃度において、バックグラウンドよりも高いレポーターシグナルを示すそのような3種類化合物に関するルシフェラーゼ・シグナルに、線(点線、破線または実線)で印付けしている;また、対応する用量応答曲線を右パネルに示す。これら用量応答曲線は、第1スクリーニングに用いたアッセイ設定およびプロトコルと同様のものを用いて得られたものであるが、ここでは表示濃度の9点の用量範囲について試験した。ここでデータ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。まとめると、本実施例に記載したMAPPIT派生的アッセイが、CRBNへの公知および新規の分子糊誘導性基質動員を同定する化合物集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。図10A~Cは、特にCRBNに対する糊誘導性IKZF1動員に関する化合物スクリーニングの例示であるが、このアプローチは他の潜在的な基質のスクリーニングにも応用可能である。
実施例10:MAPPIT派生的ORF cDNAライブラリースクリーニングアプローチを用いた新規分子糊誘導性CRBN基質の同定
リガンド誘導性CRBN基質またはネオ基質を同定する目的で、Lievensらの文献(「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの2蛋白質インタラクトミックス(Proteome-scale binary interactomics in human cells)」Molecular & Cellular Proteomics 1 5.12 (2016): 3624-3639)に記載の方法を用いてMAPPIT細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。簡単に説明すると、上記の実施例1および9に記載のEPO受容体細胞外ドメインを含むキメラMAPPIT派生的受容体に連結したCRBNベイト蛋白質の融合構築物をコードするCRBNベイト発現プラスミド(pSEL-CRBN)と同一のプラスミドで、HEK293T細胞を形質転換した。次いで、15,000種類を超えるORFを網羅するプレイgp130融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これらの形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるgp130-ORF融合発現プラスミドならびにSTAT3応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有するものであった。したがって、これらのスポット上に到達して接着したCRBNベイト形質導入細胞はいずれもgp130-ORFプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換されるので、異なるそれぞれのマイクロアレイスポット上の細胞が異なるCRBN-ORFの組み合わせで試験される。形質転換から24時間後に、CRBNリガンドCC-220(10μM)の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチンで特異的に刺激し、48時間後にレポーターシグナル(GFP様蛍光レポーター)を測定した。蛍光強度のデータを上記のような方法で分析してボルケーノプロットを作成した;図11A~Bに示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度(Y軸)に基づいて算出したq値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数(X軸)の中央値の比に対して示す。上記の実施例1および9で用いたものと同様なアッセイ設定およびプロトコルを用いて用量応答を確認するために、強いシグナルを示す4種類のORF cDNA(図11A~Bにおいて、ドットプロット上の矢印で示される)を選択した。対応するgp130-ORFプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、CRBN受容体融合プラスミド(pSEL-CRBN)でHEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示濃度のCC-220の存在下または非存在下で細胞をEPO処理し、さらに24時間後にルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。本実施例でCC-220について例示されるように、本明細書に記載のMAPPIT派生的アッセイが、公知および新規の分子糊誘導性CRBN基質を同定するORF cDNA集合体をスクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
リガンド誘導性CRBN基質またはネオ基質を同定する目的で、Lievensらの文献(「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの2蛋白質インタラクトミックス(Proteome-scale binary interactomics in human cells)」Molecular & Cellular Proteomics 1 5.12 (2016): 3624-3639)に記載の方法を用いてMAPPIT細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。簡単に説明すると、上記の実施例1および9に記載のEPO受容体細胞外ドメインを含むキメラMAPPIT派生的受容体に連結したCRBNベイト蛋白質の融合構築物をコードするCRBNベイト発現プラスミド(pSEL-CRBN)と同一のプラスミドで、HEK293T細胞を形質転換した。次いで、15,000種類を超えるORFを網羅するプレイgp130融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これらの形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるgp130-ORF融合発現プラスミドならびにSTAT3応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有するものであった。したがって、これらのスポット上に到達して接着したCRBNベイト形質導入細胞はいずれもgp130-ORFプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換されるので、異なるそれぞれのマイクロアレイスポット上の細胞が異なるCRBN-ORFの組み合わせで試験される。形質転換から24時間後に、CRBNリガンドCC-220(10μM)の存在下または非存在下で、細胞をエリスロポエチンで特異的に刺激し、48時間後にレポーターシグナル(GFP様蛍光レポーター)を測定した。蛍光強度のデータを上記のような方法で分析してボルケーノプロットを作成した;図11A~Bに示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度(Y軸)に基づいて算出したq値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数(X軸)の中央値の比に対して示す。上記の実施例1および9で用いたものと同様なアッセイ設定およびプロトコルを用いて用量応答を確認するために、強いシグナルを示す4種類のORF cDNA(図11A~Bにおいて、ドットプロット上の矢印で示される)を選択した。対応するgp130-ORFプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、CRBN受容体融合プラスミド(pSEL-CRBN)でHEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示濃度のCC-220の存在下または非存在下で細胞をEPO処理し、さらに24時間後にルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。本実施例でCC-220について例示されるように、本明細書に記載のMAPPIT派生的アッセイが、公知および新規の分子糊誘導性CRBN基質を同定するORF cDNA集合体をスクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
実施例11:目的蛋白質の新規リガンドを同定するためのハイブリッドリガンド・ライブラリースクリーニング
実施例9に記載のアプローチと同様に、本実施例では、新規蛋白質リガンドの同定を目的として化合物ライブラリーのスクリーニングにMAPPIT派生的アッセイを用いた。本実施例では、特に、トリメトプリム(TMP)-リガンドハイブリッド分子の集合体を目的蛋白質に対する結合に関してスクリーニングした。TMPはDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)に強固に結合するので、TMPハイブリッドリガンド融合分子の一部としてリガンドをMAPPIT派生的DHFR受容体融合物につなぎ止めるためにTMPを利用することができ、したがってベイトとしてリガンドを提示することができる(図12A~Bの模式図を参照のこと)。本アッセイ設定においては、このDHFR受容体融合物をTMPハイブリッドリガンドおよびgp130-ORF融合構築物と組み合わせて三重複合体とし、レポーターシグナルを得る。本実施例では、乳癌に関連するとされている核内受容体であって転写因子であるエストロゲン受容体(ESR1)への化合物結合について、およびp53腫瘍抑制因子の制御に関与する重要な癌標的であるMDM4(マウス二重微小染色体4)への化合物結合について、ハイブリッドリガンドのライブラリーをスクリーニングする。本実施例でスクリーニングした化合物集合体は、TMP-TAM(タモキシフェン)を混合した320種類によって構成される多様なハイブリッドリガンドのセットから成るものであった;タモキシフェンはESR1の公知のリガンドである。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、STAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、レプチン受容体細胞外ドメインを含むキメラMAPPIT派生的受容体に連結した(大腸菌)DHFRアンカー蛋白質の融合構築物をコードするプラスミド(pCLG-DHFR;図12A~B中の模式図を参照のこと)およびgp130-ESR1(図12A)またはgp130-MDM4(図12B)のいずれかの融合構築物で、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、細胞をレプチンおよび化合物(または陰性対照としてのDMSO)で処理した。化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図12A~Bに示すグラフ(左パネル)は、化合物処理試料およびDMSO処理対照の両方について、平均ルシフェラーゼ・シグナル(生データ)の頻度分布を示す。両方の分布が大きく重なり合うが、複数の化合物がバックグラウンドより高いルシフェラーゼ・シグナルを示している。これらの外れ値を、頻度曲線上に直線の目印で示した。2種類の例示的なスクリーニングの各々について、単一ヒットを用量応答分析で確認した(右パネル)。これらの用量応答曲線は、第1スクリーニングに用いたものと(実施例2に記載のGly-Gly-Serヒンジの代わりに、変異レプチン受容体細胞内ドメインを含む代替的なDHFR受容体アンカー融合構築物pCLL-DHFRを利用することを除き)同様なアッセイ設定およびプロトコルを用いて得られたものであるが、本実施例では表示濃度の9点から成る用量範囲を試験した。ここでデータ点は、レプチン+被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。ESR1標的スクリーニングの場合には、確認したヒットはTMP-TAMに対応する;ここで、TAMは公知のESR1リガンドであり、したがってこれらのデータによってMAPPIT派生的スクリーニングのアプローチの検証が成されるのである。まとめると、公知および新規のリガンド/標的相互作用を同定するハイブリッドリガンド集合体スクリーニングに、本実施例に記載のMAPPIT派生的アッセイが利用可能であることを、これらの例は示唆している。
実施例9に記載のアプローチと同様に、本実施例では、新規蛋白質リガンドの同定を目的として化合物ライブラリーのスクリーニングにMAPPIT派生的アッセイを用いた。本実施例では、特に、トリメトプリム(TMP)-リガンドハイブリッド分子の集合体を目的蛋白質に対する結合に関してスクリーニングした。TMPはDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)に強固に結合するので、TMPハイブリッドリガンド融合分子の一部としてリガンドをMAPPIT派生的DHFR受容体融合物につなぎ止めるためにTMPを利用することができ、したがってベイトとしてリガンドを提示することができる(図12A~Bの模式図を参照のこと)。本アッセイ設定においては、このDHFR受容体融合物をTMPハイブリッドリガンドおよびgp130-ORF融合構築物と組み合わせて三重複合体とし、レポーターシグナルを得る。本実施例では、乳癌に関連するとされている核内受容体であって転写因子であるエストロゲン受容体(ESR1)への化合物結合について、およびp53腫瘍抑制因子の制御に関与する重要な癌標的であるMDM4(マウス二重微小染色体4)への化合物結合について、ハイブリッドリガンドのライブラリーをスクリーニングする。本実施例でスクリーニングした化合物集合体は、TMP-TAM(タモキシフェン)を混合した320種類によって構成される多様なハイブリッドリガンドのセットから成るものであった;タモキシフェンはESR1の公知のリガンドである。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、STAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、レプチン受容体細胞外ドメインを含むキメラMAPPIT派生的受容体に連結した(大腸菌)DHFRアンカー蛋白質の融合構築物をコードするプラスミド(pCLG-DHFR;図12A~B中の模式図を参照のこと)およびgp130-ESR1(図12A)またはgp130-MDM4(図12B)のいずれかの融合構築物で、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、細胞をレプチンおよび化合物(または陰性対照としてのDMSO)で処理した。化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。図12A~Bに示すグラフ(左パネル)は、化合物処理試料およびDMSO処理対照の両方について、平均ルシフェラーゼ・シグナル(生データ)の頻度分布を示す。両方の分布が大きく重なり合うが、複数の化合物がバックグラウンドより高いルシフェラーゼ・シグナルを示している。これらの外れ値を、頻度曲線上に直線の目印で示した。2種類の例示的なスクリーニングの各々について、単一ヒットを用量応答分析で確認した(右パネル)。これらの用量応答曲線は、第1スクリーニングに用いたものと(実施例2に記載のGly-Gly-Serヒンジの代わりに、変異レプチン受容体細胞内ドメインを含む代替的なDHFR受容体アンカー融合構築物pCLL-DHFRを利用することを除き)同様なアッセイ設定およびプロトコルを用いて得られたものであるが、本実施例では表示濃度の9点から成る用量範囲を試験した。ここでデータ点は、レプチン+被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。ESR1標的スクリーニングの場合には、確認したヒットはTMP-TAMに対応する;ここで、TAMは公知のESR1リガンドであり、したがってこれらのデータによってMAPPIT派生的スクリーニングのアプローチの検証が成されるのである。まとめると、公知および新規のリガンド/標的相互作用を同定するハイブリッドリガンド集合体スクリーニングに、本実施例に記載のMAPPIT派生的アッセイが利用可能であることを、これらの例は示唆している。
実施例12:新規ハイブリッドリガンド標的の同定を目的とした、MAPPIT派生的アッセイによる細胞マイクロアレイを基盤とするORF cDNAライブラリースクリーニング
本実施例では、ハイブリッドリガンドベイト分子の新規標的蛋白質を同定する目的で、Lievensらの文献(「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの2蛋白質インタラクトミックス(Proteome-scale binary interactomics in human cells)」Molecular & Cellular Proteomics 1 5.12 (2016): 3624-3639)に記載される方法を用いて、実施例10に記載されるものと同様のMAPPIT細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。本実施例では、標的未知の強力な抗腫瘍表現型を有する未開示化合物について、その標的を同定する目的で、本スクリーニングのアプローチを利用した。これを目的として、PEG連結によってTMPをこの化合物に連結するハイブリッドリガンド融合化合物を合成した。上記の実施例11で用いたものと同一の(大腸菌)DHFR受容体アンカー融合プラスミド(pCLG-DHFR)で、HEK293T細胞を形質転換した。次いで、15,000種類を超えるORFを網羅するプレイgp130融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これらの形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるgp130-ORF融合発現プラスミドならびにSTAT3応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有するものであった。したがって、これらのスポット上に到達して接着したDHFRアンカー融合物形質導入細胞はいずれもgp130-ORFプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換される。形質転換から24時間後に、TMP/化合物ハイブリッドリガンド(最終濃度5μM)の存在下または非存在下で、細胞をレプチンで特異的に刺激し、48時間後にレポーターシグナル(GFP様蛍光レポーター)を測定した。蛍光強度のデータを上記のような方法で分析してボルケーノプロットを作成した;図13A~Bに示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度(Y軸)に基づいて算出したq値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数(X軸)の中央値の比に対して示す。1種類のORF cDNAが強いシグナルを示したので(図13A~Bにおいて、ドットプロット上の矢印で示される)、用量応答の確認にこれを選択した。対応するgp130-ORFプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、DHFR受容体融合プラスミド(pCLG-DHFR)で、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示濃度のハイブリッドリガンドの存在下または非存在下で、細胞をレプチン処理し、さらに24時間後に、ルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、レプチン+被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。本明細書に記載のMAPPIT派生的アッセイが、新規リガンド蛋白質標的を同定するORF cDNA集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
本実施例では、ハイブリッドリガンドベイト分子の新規標的蛋白質を同定する目的で、Lievensらの文献(「ヒト細胞におけるプロテオームスケールの2蛋白質インタラクトミックス(Proteome-scale binary interactomics in human cells)」Molecular & Cellular Proteomics 1 5.12 (2016): 3624-3639)に記載される方法を用いて、実施例10に記載されるものと同様のMAPPIT細胞マイクロアレイ・スクリーニングを実施した。本実施例では、標的未知の強力な抗腫瘍表現型を有する未開示化合物について、その標的を同定する目的で、本スクリーニングのアプローチを利用した。これを目的として、PEG連結によってTMPをこの化合物に連結するハイブリッドリガンド融合化合物を合成した。上記の実施例11で用いたものと同一の(大腸菌)DHFR受容体アンカー融合プラスミド(pCLG-DHFR)で、HEK293T細胞を形質転換した。次いで、15,000種類を超えるORFを網羅するプレイgp130融合発現プラスミド集合体を含むマイクロアレイ・スクリーニングプレートに、これらの形質転換細胞を添加した。マイクロアレイの各スポットは、異なるgp130-ORF融合発現プラスミドならびにSTAT3応答性蛍光蛋白質をコードするレポータープラスミドを含有するものであった。したがって、これらのスポット上に到達して接着したDHFRアンカー融合物形質導入細胞はいずれもgp130-ORFプレイプラスミドおよびレポータープラスミドで形質転換される。形質転換から24時間後に、TMP/化合物ハイブリッドリガンド(最終濃度5μM)の存在下または非存在下で、細胞をレプチンで特異的に刺激し、48時間後にレポーターシグナル(GFP様蛍光レポーター)を測定した。蛍光強度のデータを上記のような方法で分析してボルケーノプロットを作成した;図13A~Bに示されるように、このプロットでは、各マイクロアレイの細胞クラスターの積算蛍光強度(Y軸)に基づいて算出したq値を、対応する細胞クラスターの蛍光粒子数(X軸)の中央値の比に対して示す。1種類のORF cDNAが強いシグナルを示したので(図13A~Bにおいて、ドットプロット上の矢印で示される)、用量応答の確認にこれを選択した。対応するgp130-ORFプラスミドおよびルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、DHFR受容体融合プラスミド(pCLG-DHFR)で、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示濃度のハイブリッドリガンドの存在下または非存在下で、細胞をレプチン処理し、さらに24時間後に、ルシフェラーゼ活性を判定した。用量応答曲線は、レプチン+被検化合物で処理した細胞のレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表し、曲線のフィッティングはGRAPHPAD PRISMソフトウエアにより、4パラメーター非線型回帰を用いて行った。本明細書に記載のMAPPIT派生的アッセイが、新規リガンド蛋白質標的を同定するORF cDNA集合体スクリーニングに利用可能であることを、本実施例は示唆している。
実施例13:MTORのFKBP蛋白質へのラパマイシン誘導性動員の検出
本実施例では、MTORとFKBP蛋白質ファミリー構成員(具体的にはFKBP1A(FKBP12)、FKBP3、FKBP4およびFKBP5)との間のラパマイシン誘導性結合をモニターするMAPPIT派生的アッセイを開発した。図14に示されるように、EPO受容体細胞外ドメインを含むMAPPIT受容体融合物(pSEL-FKBPx)としてFKBP cDNAをクローン化し、またMTOR(FRBドメイン)をgp130融合物としてクローン化した。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、gp130-MTOR融合プラスミドおよびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、FKBP受容体融合構築物のいずれかで、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のラパマイシン存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図から分かるように、各FKBP-MTOR相互作用について、既報文献に報告されるようなラパマイシン誘導性レポーターシグナルを得ることができた。
本実施例では、MTORとFKBP蛋白質ファミリー構成員(具体的にはFKBP1A(FKBP12)、FKBP3、FKBP4およびFKBP5)との間のラパマイシン誘導性結合をモニターするMAPPIT派生的アッセイを開発した。図14に示されるように、EPO受容体細胞外ドメインを含むMAPPIT受容体融合物(pSEL-FKBPx)としてFKBP cDNAをクローン化し、またMTOR(FRBドメイン)をgp130融合物としてクローン化した。文献(Lievensら、「アレイMAPPIT:哺乳動物細胞における高速大量処理インタラクトーム分析(Array MAPPIT: high-throughput interactome analysis in mammalian cells)」、 Journal of Proteome Research 8.2 (2009): 877-886)に記載のように、gp130-MTOR融合プラスミドおよびSTAT3応答性のルシフェラーゼをコードするレポータープラスミド(pXP2d2-rPAPI-ルシフェラーゼレポータープラスミド)と共に、FKBP受容体融合構築物のいずれかで、HEK293T細胞を共形質転換した。形質転換から24時間後に、表示用量のラパマイシン存在下または非存在下で、細胞をEPO処理した。被検化合物処理から24時間後に、ルシフェラーゼアッセイシステムキット(PROMEGA、Madison、WI)とEnsightプレートリーダー(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES、Waltham、MA)を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。データ点は、EPO+被検化合物で処理した細胞のEPOまたはレプチンのみで処理した細胞に対する平均ルシフェラーゼ活性の誘導倍率(三重試料)を表している。誤差棒は標準偏差を表す。図から分かるように、各FKBP-MTOR相互作用について、既報文献に報告されるようなラパマイシン誘導性レポーターシグナルを得ることができた。
Claims (80)
- 分子相互作用を検出する方法であって、該方法が:
(a)リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンド依存性キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内ベイト蛋白質、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質がE3リガーゼ基質結合サブユニットである、シグナルを検出すること、
を含む、方法。 - 分子相互作用を検出する方法であって、該方法が:
(a)リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンド依存性キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内ベイト足場蛋白質、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/細胞内ドメインに融合したベイト足場蛋白質がE3リガーゼ基質結合サブユニットであるベイト蛋白質に会合する、
検出すること、
を含む、方法。 - 請求項1または2の方法であって、ここで該プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、該ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員されるので、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達が回復し、STAT分子の活性化が起こる、方法。
- 請求項3の方法であって、ここで該細胞がSTAT応答性レポーター遺伝子を含む、方法。
- 請求項4の方法であって、ここで該活性化したSTAT分子が核内に移行してSTAT応答性レポーター遺伝子の転写を誘導するので、このレポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる、方法。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該E3リガーゼ基質結合サブユニットが、セレブロン(CRBN)およびフォン・ヒッペル・リンドウ(Von Hippel Lindau:VHL)から選択される、方法。
- 請求項2~6のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該足場蛋白質が、損傷DNA結合蛋白質1(DDB1)、カリン4A(CUL4A)、カリン1の制御因子(ROC1)、SKIP1、SKP1相互作用パートナー(SKIP2)、βトランスデューシン反復配列含有蛋白質(β-TrCP)、二重微小染色体4蛋白質(MDM4)、X連鎖アポトーシス抑制因子(XIAP)、DDB1およびCUL4関連因子15(DCAF15)、およびWDリピートドメイン12(WDR12)から選択される、方法。
- 前記請求項のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該方法がプレイ蛋白質および/またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む、方法。
- 請求項8の方法であって、ここで該分子相互作用が、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用である、方法。
- 前記請求項のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該分子相互作用が、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される2種類以上の蛋白質/蛋白質相互作用である、方法。
- 請求項8~10のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される該蛋白質/蛋白質相互作用が、蛋白質/蛋白質界面の部位における該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質と該低分子との間の直接結合である、方法。
- 請求項8~10のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用が、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される、方法。
- 請求項12の方法であって、ここで該低分子がベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、該プレイ蛋白質との相互作用を可能にする、方法。
- 請求項8~13のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該低分子が分子糊である、方法。
- 請求項1または2の方法であって、ここで該分子相互作用が複合体形成である、方法。
- 請求項1または2の方法であって、ここで該分子相互作用が低分子/蛋白質相互作用である、方法。
- 請求項1~16のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該第1の受容体および第2の受容体が同一の受容体である、方法。
- 請求項1~16のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該第1の受容体および第2の受容体が異なる受容体である、方法。
- 請求項1~18のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該第1の受容体および/または第2の受容体が多量体化受容体である、方法。
- 請求項1~19のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来する、方法。
- 請求項1~20のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインが1型サイトカイン受容体(CR)に由来する、方法。
- 請求項1~20のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインがエリスロポエチン受容体(EpoR)またはレプチン受容体(LR)に由来する、方法。
- 請求項22の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体(LR)に由来する、方法。
- 請求項1~23のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該ベイトが該第1の受容体および/または第2の受容体断片に対して異種である、方法。
- 請求項1~24のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該細胞内ドメインがJAK結合部位を含み、および/または該受容体断片がgp130を含む、方法。
- 請求項1~25のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該STATがSTAT1またはSTAT3から選択される、方法。
- 請求項1~26のいずれか1項に記載の方法であって、ここでSTATの動員を低減または排除する該変異が1か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる、方法。
- 請求項1~27のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体(LR)に由来し、該変異がY985、Y1077、およびY1138の位置のうちの1か所以上である、方法。
- 請求項1~28のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体(LR)に由来し該変異がY985F、Y1077F、およびY1138Fである、方法。
- 請求項1~29のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体(LR)のY985F、Y1077F、およびY1138Fと機能的に同等の変異を有する、方法。
- 請求項1~30のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該プレイ蛋白質が核外搬出配列(NES)を含む、方法。
- 請求項31の方法であって、ここで該NESが1~4個の疎水性残基を有する、方法。
- 請求項32の方法であって、ここで該疎水性残基がロイシンである、方法。
- 請求項32~33のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該NESが配列LxxxLxxLxLを有し、ここでLが疎水性残基であり、xは他の任意のアミノ酸である、方法。
- 請求項32~34のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該NESが配列LxxxLxxLxLを有し、ここでLがロイシンであり、xは他の任意のアミノ酸である、方法。
- 前記請求項のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該プレイ蛋白質との相互作用前に、該ベイトが化合物に接触している、方法。
- 請求項36の方法であって、ここで該化合物がグルタルイミド環およびフタルイミド環を含む、方法。
- 請求項37の方法であって、ここで該化合物が、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、CC-220、CC-122、CC-885、またはその誘導体または類似体;あるいはサリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、CC-220、CC-122、CC-885、またはその誘導体または類似体と同一のCRBNベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される、方法。
- 前記請求項のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該方法が:
該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質/蛋白質相互作用;
または
該プレイ蛋白質およびベイト蛋白質を含む蛋白質/蛋白質相互作用を誘導、媒介、または安定化する低分子化合物であって、該低分子化合物が分子糊またはハイブリッドリガンドであってもよい、低分子化合物、
を同定する、
方法。 - 分子相互作用を検出する方法であって、該方法が:
(a)リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、
該リガンド依存性キメラ受容体が、
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内ベイト蛋白質、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含む、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
および
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出することであって、
ここで該ベイト蛋白質がFK506結合蛋白質(FKBP)である、シグナルを検出すること、
を含む、方法。 - 請求項40の方法であって、ここで該プレイ蛋白質とベイト蛋白質との間の相互作用によって、ベイト蛋白質に融合した受容体断片が膜貫通キメラ受容体蛋白質へ動員されるので、リガンド依存性膜貫通キメラ受容体シグナル伝達が回復し、STAT分子の活性化が起こる、方法。
- 請求項41の方法であって、ここで該細胞がSTAT応答性レポーター遺伝子を含む、方法。
- 請求項42の方法であって、ここで活性化したSTAT分子が核内に移行してSTAT応答性レポーター遺伝子の転写を誘導するので、このレポーター遺伝子シグナルによって分子相互作用の検出が可能となる、方法。
- 請求項40~43のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該FK506結合蛋白質(FKBP)がFKBP12、FKBP38およびFKBP52から選択される、方法。
- 請求項40~44のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該方法がプレイ蛋白質および/またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することをさらに含む、方法。
- 請求項45の方法であって、ここで該分子相互作用が、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用である、方法。
- 請求項40~46のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該分子相互作用が、該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される2種類以上の蛋白質/蛋白質相互作用である、方法。
- 請求項45~47のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される該蛋白質/蛋白質相互作用が、蛋白質/蛋白質界面の部位における該プレイ蛋白質またはベイト蛋白質と該低分子との間の直接結合である、方法。
- 請求項45~47のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用が、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される、方法。
- 請求項49の方法であって、ここで該低分子がベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、該プレイ蛋白質との相互作用を可能にする、方法。
- 請求項45~50のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該低分子が分子糊である、方法。
- 請求項40または41の方法であって、ここで該分子相互作用が複合体形成である、方法。
- 請求項40または41の方法であって、ここで該分子相互作用が低分子/蛋白質相互作用である、方法。
- 請求項40~53のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該第1の受容体および第2の受容体が同一の受容体である、方法。
- 請求項40~54のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該第1の受容体および第2の受容体が異なる受容体である、方法。
- 請求項40~55のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該第1の受容体および/または第2の受容体が多量体化受容体である、方法。
- 請求項40~56のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインがサイトカイン受容体に由来する、方法。
- 請求項40~57のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインが1型サイトカイン受容体(CR)に由来する、方法。
- 請求項40~57のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該リガンド結合ドメインがエリスロポエチン受容体(EpoR)またはレプチン受容体(LR)に由来する、方法。
- 請求項59の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体(LR)に由来する、方法。
- 請求項40~60のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該ベイトが該第1の受容体および/または第2の受容体断片に対して異種である、方法。
- 請求項40~61のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該細胞内ドメインがJAK結合部位を含み、および/または該受容体断片がgp130を含む、方法。
- 請求項40~62のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該STATがSTAT1またはSTAT3から選択される、方法。
- 請求項40~63のいずれか1項に記載の方法であって、ここでSTATの動員を低減または排除する該変異が1か所以上のチロシンリン酸化部位において起こる、方法。
- 請求項40~64のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体(LR)に由来し、該変異がY985、Y1077、およびY1138の位置のうちの1か所以上である、方法。
- 請求項40~65のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインがマウスレプチン受容体(LR)に由来し該変異がY985F、Y1077F、およびY1138Fである、方法。
- 請求項40~66のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが、マウスレプチン受容体(LR)のY985F、Y1077F、およびY1138Fと機能的に同等の変異を有する、方法。
- 請求項40~67のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該プレイ蛋白質が核外搬出配列(NES)を含む、方法。
- 請求項68の方法であって、ここで該NESが1~4個の疎水性残基を有する、方法。
- 請求項69の方法であって、ここで該疎水性残基がロイシンである、方法。
- 請求項69~70のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該NESが配列LxxxLxxLxLを有し、ここでLが疎水性残基であり、xは他の任意のアミノ酸である、方法。
- 請求項69~71のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該NESが配列LxxxLxxLxLを有し、ここでLがロイシンであり、xは他の任意のアミノ酸である、方法。
- 請求項40~72のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該プレイ蛋白質との相互作用前に、該ベイトが化合物に接触している、方法。
- 請求項73の方法であって、ここで該合物が、FK506(タクロリムス)、ラパマイシン(シロリムス)、およびシクロスポリンA(CsA)またはその誘導体または類似体;あるいはFK506(タクロリムス)、ラパマイシン(シロリムス)、およびシクロスポリンA(CsA)またはその誘導体または類似体と同一のFKBPベイト結合部位に競争的に結合する化合物から選択される、方法。
- 請求項40~74のいずれか1項に記載の方法であって、ここで該方法によって、低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質/蛋白質相互作用を同定する、方法。
- 分子相互作用を検出する方法であって、該方法が:
(a)リガンド依存性キメラ受容体を含む細胞を提供することであって、該リガンド依存性キメラ受容体が:
(i)第1の受容体に由来するリガンド結合ドメインの細胞外部分、
および
(ii)第2の受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインおよびそれに融合した細胞内ベイト蛋白質、
ここで該第2の受容体の膜貫通ドメインおよび/または細胞内ドメインがSTAT(Signal Transducer and Activator of Transcription:シグナル伝達因子および転写活性化因子)の動員を低減または排除する変異を含む、
膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、
を含み、
ここで該ベイト蛋白質がセレブロン(CRBN)またはFK506結合蛋白質(FKBP)である、
細胞を提供すること;
(b)受容体断片に融合したプレイ蛋白質を細胞中で発現させることであって、
該受容体断片が機能的STAT動員部位を含む受容体断片である、
発現させること;
(c)分子相互作用の存在を示唆するシグナルを検出すること;
および
(d)該プレイ蛋白質および/またはベイト蛋白質に結合する低分子を導入することであって、
ここで該分子相互作用が低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用である、
低分子を導入すること、
を含む、方法。 - 請求項76の方法であって、ここで該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される蛋白質/蛋白質相互作用が、ベイト蛋白質の蛋白質表面のアロステリック修飾によって媒介される、方法。
- 請求項77の方法であって、ここで該低分子がベイト蛋白質の疎水性表面露出を誘導し、該プレイ蛋白質との相互作用を可能にする、方法。
- 請求項78の方法であって、ここで該低分子が分子糊化合物またはハイブリッドリガンドである、方法。
- 請求項78の方法であって、ここで該方法が:
該低分子のプレイ蛋白質またはベイト蛋白質との結合によって仲介される新規蛋白質/蛋白質相互作用;
または
該プレイ蛋白質およびベイト蛋白質を含む蛋白質/蛋白質相互作用を誘導、媒介、または安定化する低分子化合物であって、該低分子化合物が分子糊またはハイブリッドリガンドであってもよい、低分子化合物、
を同定する、
方法。
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